CN1548048A

CN1548048A - 用于提升免疫力的医药组合物及茯苓萃取物

Info

Publication number: CN1548048A
Application number: CNA031360203A
Authority: CN
Inventors: 林汉钦; 曾哲明; 丁秀玉; 张温良; 赵建良; 黄信文
Original assignee: XINGHUI MEDICINE INDUSTRY Co Ltd
Current assignee: Sinphar Tian Li Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-05-18
Filing date: 2003-05-18
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2023-05-18
Also published as: CN1251678C

Abstract

一种用以提升人体免疫力的医药组合物，此组合物含羊毛甾烷(lanostane)类化合物作为有效成分。本发明亦提供一种提升人体免疫力的茯苓萃取物，包含5～60重量％的羊毛甾烷类化合物且实质上不含开环羊毛甾烷(secolanostane)类化合物。该萃取物是萃取自多孔菌科植物茯苓菌(Poreacocos(Schw)Wolf)的代谢产物或酸酵产物或茯苓菌菌丝。

Description

用于提升免疫力的医药组合物及茯苓萃取物

技术领域

本发明是有关一种含有羊毛甾烷类化合物作为有效成分以提升人体免疫力的医药组合物。本发明亦有关一种可提升人体免疫力的茯苓萃取物。

背景技术

茯苓味性甘淡，有益脾胃，中医/药界归类为镇静剂和利尿剂，以及补气药处方中的主要成份之一。但依据多年研究和试验，发现茯苓另具其它疗效，包括具抗肿瘤之疗效、和有助益于慢性病人的免疫及肠胃系统等。

例如，日本专利第55-111791号及第57-38794号中，就揭示由人工培养茯苓菌丝体，经萃取成分，用来作为抗肿瘤用途。日本专利第55-111422号中，亦揭示由茯苓原材直接萃取成份，用来作为抗肿瘤用途。日本专利第8-119864号案，则揭示茯苓原材直接经由甲醇进行萃取，并经过分离后，得到羊毛甾烷(lanostane)类成分及及开环羊毛甾烷(secolanostane)类成分等三帖类化合物，用来作为镇吐剂用途。日本专利第9-025232号公开案，又揭示日本产地的茯苓经甲醇萃取分离后，得到三帖类化合物，可作为促癌生成作用的抑制剂。日本专利第9-176184号中，再揭示将茯苓甲醇萃取后，再分离精制成三帖类化合物，可作为抗炎及促癌生成作用抑制剂。

而中国公开号为1008183的专利，揭示一种制造含三帖类化合物的茯苓萃取物的方法，以茯苓粉末经酸性酒精溶剂萃取后，并用酸碱方式抽提处理，所制得茯苓萃取物具抗肿瘤及免疫活化作用的生物活性。

发明内容

本发明的主要目的即在于提供一种从茯苓制备具有改善的生物活性的有效成分的方法及含有该有效成分的茯苓萃取物。

本发明的另一目的即在于提供一种从茯苓制备具有改善的提升哺乳类动物免疫力的有效成分的方法及含有该有效成分的茯苓萃取物。

本发明的另一目的即在于提供一种羊毛甾烷(lanostane)用于提升哺乳类动物免疫力的新用途。此用途的一具体例子为一提升免疫力的医药组合物。本发明的医药组合物可含单一或二种以上的羊毛甾烷化合物，可使用于免疫调节或增强用途，而且其剂型可以是经皮吸收、口服剂型、注射剂型或缓释剂型。

本发明以免疫试验来确认茯苓粗萃取物中具有医疗活性的有效成分就是低极性部位(PCM)，而且PCM所含主要化合物为K1、K2、K3、K4及微量K4a、K4b、K5、K6a、K6b，均为羊毛甾烷(lanostane)类化合物，该PCM中含量较高的K1、K2、K3、K4均具有增强免疫的效能。

本发明所揭示的从茯苓制备具有改善的生物活性的有效成分的方法，是利用传统萃取法萃取茯苓得到一粗萃取物，再经由层析法，分成极性小的羊毛甾烷(lanostane)类部位(以二氯甲烷∶甲醇(96∶4)为提取液)和极性大的开环羊毛甾烷(secolanostane)类部位(以二氯甲烷∶甲醇(90∶10或0∶100)为提取液)，其中，利用硅胶薄层层析法，显示出羊毛甾烷(lanostane)类部位的所在位置，即展开溶媒为二氯甲烷-甲醇(96∶4)时，层析值(Rf)为≥0.1；至于开环羊毛甾烷(secolanostane)类成分，则层析值小于0.1。用硅胶管柱层析法可进一步分离该羊毛甾烷类部位，其中提取液使用二氯甲烷∶甲醇(97∶3至95∶5)，分离出数种羊毛甾烷(lanostane)类化合物。

依据本发明的制备方法，每公斤茯苓可制得2.6克PCM。前述中国专利公开号为1008183的制法每公斤茯苓可制得3克的粗萃取物，若将该粗萃取物以本发明方法进一步纯化仅可制得1克PCM。

实施方式

根据本申请的发明人重复中国公开号为1008183专利的实验，以中国云南产地的茯苓，经酸碱处理方式萃取，平均一公斤茯苓可得3g茯苓三帖类粗萃取物(符合该专利所揭示的范围2.5g±0.5g)。但发明人再经层析，可得1g的低极性部位PCM，进一步分离可得纯化的羊毛甾烷(lanostane)类成分约400mg。换言之，按照中国专利之所制得的萃取物其羊毛甾烷部位(lanostane fraction)类成分占萃取物约13％，萃取物的百分之八十七是开环羊毛甾烷部位(secolanostane fraction)及其它未鉴定出的化合物。

经过本申请发明人进一步试验结果，发现羊毛甾烷(lanostane)对人体无毒性作用，而且具有疗效。但开环(A环)羊毛甾烷(secolanostane)，却对人类细胞呈毒性作用，不适合人类需要和服用。

本发明揭示一种提升哺乳类动物(例如人类)免疫力的医药组合物，包含一提升哺乳类动物免疫力有效量作为有效成分的具下列化学式(I)的羊毛甾烷；及与该有效成分共同使用的医药允许载体或稀释剂：

于式中R₁为H或CH₃；R₂为OCOCH₃，C＝O或OH；R₃为H或OH；R₄为-C(＝CH₂)-C(CH₃)₂R₄，其中R_a为H或OH，或-CH＝C(CH₃)-R_b，其中R_b为CH₃或CH₂OH；R₅为H或OH；及R₆为CH₃或CH₂OH。

较佳的，该医药组合物含有1～60重量％的羊毛甾烷。

较佳的，该医药组合物为口服的。

本发明亦揭示一种提升哺乳类动物免疫力的茯苓萃取物，包含5～60重量％，较佳的10～20重量％，前述羊毛甾烷(I)且实质上不含开环羊毛甾烷。

一适合用于制备该茯苓萃取物的方法包含下列步骤：

a)以一水，甲醇，乙醇或它们的混合溶剂萃取茯苓菌的代谢物，茯苓菌的酸酵产物或茯苓菌菌丝；

b)浓缩步骤a)萃取所获得的液体；

c)将步骤a)所获得的浓缩物导入一硅胶管柱；

d)以一低极性洗脱液(eluent)冲洗该硅胶管柱，及收集所产生的洗脱液(eluate)；及

e)浓缩步骤d)的洗脱液。

较佳的，从步骤e)所获得的洗脱液的浓缩物以硅胶薄层层析法分析具有一层析值(Rf)≥0.1，其中以紫外光灯及碘作检侧，展开液为二氯甲烷∶甲醇＝96∶4。

较佳的，步骤a)的萃取所使用的溶剂为95％酒精。

较佳的，步骤b)的浓缩物被进一步以一体积比为1∶1的甲醇及正己烷的两相溶剂萃取；分离出甲醇层；及浓缩该甲醇层，所获得的浓缩物被用作为步骤c)的硅胶管柱的进料。

较佳的，步骤d)的低极性洗脱液为体积比为96.5∶3.5的二氯甲烷及甲醇的混合溶剂。

较佳的，该羊毛甾烷(I)具有具下列化学式：

或

本发明还提供具上述化学式(I)的羊毛甾烷作为活性成分在制备提升哺乳类动物免疫力药物中的应用。

本发明还提供本发明的茯苓萃取物作为活性成分在制备提升哺乳类动物免疫力药物中的应用。

附图说明

图1.为依本发明的一实施例从茯苓制备具有改善的生物活性的低极性部位(PCM)，及分离该PCM所含羊毛甾烷(lanostane)类化合物的流程图。

图2.为依中国公开号为1008183专利所揭示的方法从茯苓制备一种含三帖类化合物的萃取物的流程图。

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但不以此限制本发明。

具体实施方式

实施例1.

请参阅图1所示的流程图。以云南产茯苓30公斤，磨成粉后，利用120L酒精(浓度95％)萃取24小时，及过滤分离。再重复前述萃取及固液分离三次。合并滤液，并将其浓缩后得干燥萃取物265.2克。再利用一两相萃取剂(己烷∶95％甲醇＝1∶1)对该干燥萃取物进行分配萃取。取出甲醇层并加予浓缩后得到干燥固体246.9克。利用硅胶管柱层析对该干燥固体进行分离，该硅胶管柱填充有该干燥固体重量10～40倍的硅胶，是购自Merck公司，Silica gel 60，70-230mesh。以二氯甲烷/甲醇混合液作为洗脱液(eluent)，依序以96∶4、90∶10、0∶100比例的混合液进行冲洗，洗脱液(eluate)以硅胶薄层层析法(Thin Layer Chromatography)(紫外光灯及碘作检测，展开液为二氯甲烷∶甲醇＝96∶4)检测成分，将相同成分合并。

以二氯甲烷-甲醇(96∶4)混合液进行硅胶管柱层析，可得到属PCM部份78克，PCM部份依上述硅胶薄层层析法可明显看到6个迹点。以二氯甲烷∶甲醇(90∶10)及(0∶100)提取液层析合并可得到PCW部份168克。

PCM部份进一步以二氯甲烷∶甲醇(96.5∶3.5)作为洗脱液进行硅胶管柱层析(同上述硅胶管柱)，洗脱液依硅胶薄层层析分析结果可合并得到三个部位，分别为K1(Rf＝0.64)、PCM-1(含微量K1，K3(Rf＝0.55)，K5(Rf＝0.49))和PCM-2(含K2(Rf＝0.30)，K4(Rf＝0.24)，K6(Rf＝0.19))。管柱层析所得K1部位(3.5g)，进一步经高效液相层析(碳-C18管柱、移动相为甲醇-水(90∶10))纯化可得K1成分3.0g。

PCM-1部位利用相同高效液相层析，以甲醇-水(87∶13)冲洗可得K3，K5及微量K1成分。K3成分利用相同高效液相层析，以甲醇-水(84∶16)冲洗可得K3(1.93g)。K5成分利用相同高效液相层析，以甲醇-水(93∶7)及(91∶9)依序纯化可得K5(47.6mg)。

而PCM-2的成分，利用相同高效液相层析法，以甲醇-水(87∶13)冲洗可得K6微量成分(K6a+K6b)，K4微量成分(K4a+K4b)，K2成分及K4成分。后二者K2成分及K4成分利用相同高效液相层析，以甲醇-水(84∶16)冲洗分别得K2(6.2g)及K4(0.55g)。

K6微量成分则利用相同高效液相层析以MeCN-H₂O(68∶32)纯化得到K6a(21.4 mg)及K6b(90.7mg)；K4微量成分则利用相同高效液相层析以甲醇-水(76∶24)纯化分离得到K4a(66.0mg)及K4b(86.8mg)。

上述的K1至K6化合物，其分析数据如下：

K1：混合物，EI-MS：主成分，528[M]⁺；微量成分，526[M]⁺

K1(主成分)：¹³C-NMR(δc)：35.4(c-1)，24.5(c-2)，80.6(c-3)，38.0(c-4)，50.7(c-5)，18.4(c-6)，26.8(c-7)，135.0(c-8)，134.4(c-9)，37.2(c-10)，20.9(c-11)，29.7(c-12)，48.8(c-13)，46.3(c-14)，43.6(c-15)，26.6(c-16)，57.3(c-17)，17.8(c-18)，19.2(c-19)，48.6(c-20)，178.6(c-21)，31.6(c-22)，33.2(c-23)，156.1(c-24)，34.1(c-25)，22.0(c-26)，21.9(c-27)，28.0(c-28)，16.8(c-29)，25.4(c-30)，107.0(c-31)，21.1(CH₃COO-)，170.5(CH₃COO-)

K1(微量成分)：¹³C-NMR(δc)：35.6(c-1)，24.5(c-2)，80.6(c-3)，37.8(c-4)，49.7(c-5)，23.1(c-6)，120.6(c-7)，142.8(c-8)，145.8(c-9)，37.6(c-10)，117.0(c-11)，36.3(c-12)，49.4(c-13)，45.1(c-14)，44.4(c-15)，76.4(c-16)，57.6(c-17)，17.6(c-18)，22.8(c-19)，48.4(c-20)，178.5(c-21)，31.4(c-22)，33.2(c-25)，156.0(c-24)，34.1(c-25)，22.0(c-26)，21.9(c-27)，28.2(c-28)，17.1(c-29)，26.5(c-30)，107.0(c-31)，21.1(CH₃COO-)，170.4(CH₃COO-)

K2：混合物，EI-MS：主成分，486[M]^-；微量成分，484[M]⁺

K2(主成分)：¹³C-NMR(δc)：36.6(c-1)，29.1(c-2)，78.5(c-3)，40.0(c-4)，51.4(c-5)，19.2(c-6)，27.4(c-7)，135.4(c-8)，135.3(c-9)，37.9(c-10)，21.4(c-11)，30.2(c-12)，49.3(c-13)，46.7(c-14)，44.2(c-15)，77.1(c-16)，57.8(c-17)，18.2(c-18)，19.8(c-19)，49.2(c-20)，179.4(c-21)，32.1(c-22)，33.7(c-23)，156.5(c-24)，34.6(c-25)，22.5(c-26)，22.4(c-27)，29.1(c-28)，16.8(c-29)，25.9(c-30)，107.5(c-31)

K2(微量成分)：¹³C-NMR(δc)：36.7(c-1)，29.1(c-2)，78.5(c-3)，40.0(c-4)，49.8(c-5)，24.3(c-6)，121.2(c-7)，143.3(c-8)，145.2(c-9)，38.0(c-10)，118.1(c-11)，37.2(c-12)，45.5(c-13)，49.1(c-14)，44.8(c-15)，76.8(c-16)，58.0(c-17)，18.1(c-18)，22.9(c-19)，48.0(c-20)，179.4(c-21)，31.9(c-22)，33.7(c-23)，156.5(c-24)，34.6(c-25)，22.9(c-26)，22.4(c-27)，29.1(c-28)，16.8(c-29)，26.8(c-30)，107.5(c-31)

K3：mp：278-280℃

[α]_D ²⁴+3 (c0.6，Pyridine)

EI-MS m/z：482[M]⁺，¹³C-NMR(δc)：37.5(c-1)，35.7(c-2)，216.7(c-3)，48.3(c-4)，51.8(c-5)，24.6(c-6)，121.4(c-7)，143.5(c-8)，145.4(c-9)，38.2(c-10)，118.3(c-11)，36.9(c-12)，45.7(c-13)，50.0(c-14)，44.9(c-15)，77.2(c-16)，58.1(c-17)，18.3(c-18)，22.7(c-19)，49.2(c-20)，179.6(c-21)，32.0(c-22)，33.8(c-23)，156.7(c-24)，34.8(c-25)，22.7(c-26)，22.6(c-27)，26.3(c-28)，23.1(c-29)，27.1(c-30)，107.8(c-31)

K4：mp：＞300℃

[α]_D ²⁴+18 (c 0.5，Pyridine)

EI-MS m/z：484[M]⁺，¹³C-NMR(δc)：31.4(c-1)，27.4(c-2)，76.0(c-3)，38.6(c-4)，44.5(c-5)，24.2(c-6)，122.0(c-7)，143.5(c-8)，147.4(c-9)，38.6(c-10)，116.9(c-11)，37.0(c-12)，45.9(c-13)，50.2(c-14)，45.1(c-15)，77.3(c-16)，58.2(c-17)，18.4(c-18)，23.7(c-19)，49.3(c-20)，179.8(c-21)，32.1(c-22)，33.9(c-23)，156.7(c-24)，34.9(c-25)，22.8(c-26)，22.6(c-27)，29.9(c-28)，23.9(c-29)，27.3(c-30)，107.9(c-31)

K4a：mp：284-287℃

[α]_D ²⁴+44 (c 0.5，Pyridine)

EI-MS m/z：498[M]⁺，¹³C-NMR(δc)：35.9(c-1)，37.1(c-2)，217.3(c-3)，53.5(c-4)，43.9(c-5)，24.5(c-6)，121.5(c-7)，143.7(c-8)，144.9(c-9)，37.9(c-10)，119.0(c-11)，36.9(c-12)，45.9(c-13)，50.0(c-14)，45.0(c-15)，77.3(c-16)，58.2(c-17)，18.5(c-18)，23.3(c-19)，49.4(c-20)，179.9(c-21)，32.2(c-22)，34.1(c-23)，157.0(c-24)，34.9(c-25)，22.8(c-26)，22.7(c-27)，19.4(c-28)，67.5(c-29)，26.9(c-30)，107.8(c-31)

K4b：mp：230-232℃

[α]_D ²⁴+38 (c 0.5，Pyridine)

EI-MS m/z：542[M]⁺，¹³C-NMR(δc)：

36.6(c-1)，25.0(c-2)，82.1(c-3)，39.4(c-4)，56.7(c-5)，68.9(c-6)，129.2(c-7)，142.1(c-8)，145.8(c-9)，39.2(c-10)，117.9(c-11)，36.9(c-12)，45.8(c-13)，49.9(c-14)，44.9(c-15)，77.3(c-16)，58.1(c-17)，18.4(c-18)，24.8(c-19)，49.3(c-20)，179.9(c-21)，32.1(c-22)，33.9(c-23)，156.7(c-24)，34.9(c-25)，22.8(c-26)，22.7(c-27)，31.9(c-28)，18.1(c-29)，27.1(c-30)，107.9(c-31)，22.0(CH₃COO-)，172.0(CH₃COO-)

K5：mp：274-275℃

[α]_D ²⁴+10 (c 0.5，Pyridine)

EI-MS m/z：454[M]⁺，¹³C-NMR(δc)：

36.8(c-1)，29.6(c-2)，79.0(c-3)，38.6(c-4)，50.6(c-5)，24.3(c-6)，122.1(c-7)，143.6(c-8)，147.3(c-9)，37.2(c-10)，117.5(c-11)，34.1(c-12)，45.0(c-13)，51.3(c-14)，30.8(c-15)，28.1(c-16)，48.9(c-17)，17.4(c-18)，23.7(c-19)，49.9(c-20)，179.9(c-21)，32.4(c-22)，27.5(c-23)，124.3(c-24)，132.7(c-25)，26.6(c-26)，18.6(c-27)，29.2(c-28)，17.1(c-29)，26.7(c-30)

K6a：mp：248-250℃

[α]_D ²⁴+63 (c 0.4，Pyridine)

EI-MS m/z：498[M]+，¹³C-NMR(δc)：37.1(c-1)，35.0(c-2)，219.0(c-3)，

48.4(c-4)，57.0(c-5)，68.0(c-6)，128.6(c-7)，141.8(c-8)，144.2(c-9)，38.3(c-10)，120.2(c-11)，36.6(c-12)，45.8(c-13)，49.7(c-14)，44.8(c-15)，77.2(c-16)，58.1(c-17)，18.4(c-18)，22.7(c-19)，49.4(c-20)，179.6(c-21)，32.1(c-22)，33.9(c-23)，156.8(c-24)，34.9(c-25)，22.8(c-26)，22.7(c-27)，31.5(c-28)，24.5(c-269)，26.6(c-30)，107.9(c-31)

K6b：mp：267-270℃

[α]_D ²⁴+68 (c 0.3，Pyridine)

EI-MS m/z：516[M]⁺，¹³C-NMR(δc)：34.4(c-1)，29.4(c-2)，74.1(c-3)，42.6(c-4)，87.7(c-5)，133.1(c-6)，134.7(c-7)，79.6(c-8)，145.8(c-9)，42.1(c-10)，120.7(c-11)，36.8(c-12)，49.1(c-13)，48.7(c-14)，42.7(c-15)，76.8(c-16)，57.6(c-17)，19.0(c-18)，29.3(c-19)，49.1(c-20)，179.6(c-21)，32.2(c-22)，33.9(c-23)，156.8(c-24)，34.9(c-25)，22.9(c-26)，22.7(c-27)，25.1(c-28)，20.3(c-29)，20.8(c-30)，107.9(c-31)

上述的K1至K6化合物，其结构如下：

K1：R₂＝OCOCH₃，主成分 K1：R₂＝OCOCH₃，微量成分

K2：R₂＝OH，主成分 K2：R₂＝OH，微量成分

K3：R₆＝CH₃ R₅＝H K4：R₂＝α-OH R₅＝H

K4a：R₆＝CH₂OH R₅＝H K4b：R₂＝β-OCOCH₃ R₅＝OH

K6a：R₆＝CH₃ R₅＝OH

实施例2.

将2公斤与实施例1相同的云南茯苓粉末，以中国公开号为1008183的方法，参阅图2可得萃取物6.0克。重复实施例1步骤对6.0g萃取物进一步以二氯甲烷-甲醇(96∶4)混合液作为洗脱液进行硅胶管柱层析，可得到属PCM-E部份2.0g。以二氯甲烷∶甲醇(90∶10)及(0∶100)混合液进行冲洗，合并可得到PCW-E部份2.3g。

对照结果

将实施例2的PCM-E及PCW-E，以40mg/kg/day口服(喂食)给予动物，分别检测此二部位成分对动物脾脏细胞(免疫细胞)生长是否有促进作用或者产生抑制作用，如促进细胞增生显示有利于免疫反应，如抑制细胞增生不利于免疫反应，即对细胞产生毒性作用。

经由下述免疫学研究方法，取得(动物)离体脾脏细胞，培养5天，再以MTT assay检测(参考下述免疫学研究方法)，比较细胞生长情形。

结果如表一所示，喂食PCM-E的小鼠，在第三天及第四天其脾脏细胞有增加情形，在统计上与控制组无显著差异；不过喂食PCW-E的小鼠，其脾脏细胞培养三天及四天后，活细胞数显著低于控制组，显示PCW-E有细胞毒性，减少存活细胞数。

因此，可说明含羊毛甾烷(lanostane)的低极性部位，不具脾脏细胞毒性作用，相反的是有脾脏细胞增加情形：而含开环羊毛甾烷(secol anostane)的高极性部位(Rf＜0.1)则为对脾脏细胞有毒性作用。亦即，已知方法所得到的茯苓萃取物含有对脾脏细胞具毒性的极性部位(PCW-E)。

表一脾脏细胞生长情形-PCM、PCW、PCM-E、PCW-E的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 0.608±0.042^a 0.777±0.141 0.515±0.055

PCM-E 40 0.890±0.195 0.857±0.137 0.449±0.083

PCW-E 40 0.245±0.072* 0.451±0.020** 0.344±0.132

a：表中数据为5次实验的Mean±S.E.M；

*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

由以上实施例及对照例的结果，可证实以下事项：

1.茯苓的有效成分为含有羊毛甾烷(lanostane)类化合物的低极性部位，得用来提升人体的免疫效果。

2.有效成分和毒性成分(开环羊毛甾烷或其它极性大的分子)，可借助硅胶薄层层析法鉴定及以硅胶管柱层析法分离。

3.以本发明的制备方法制得的低极性部位(PCM)含有羊毛甾烷类化合物的，且去除开环羊毛甾烷类毒性成分，因此提升免疫力效果及安全性显著增强，远优于传统已知萃取法所萃取出的茯苓萃取物。

4.上述动物实验是经由口服吸收后，再检验对于脾脏细胞的作用，与传统利用体外细胞试验有不同意义。因体外细胞实验避开药物吸收，体内分布和代谢对药物的影响，无法反应药物真正作用，因此，体内实验意义较体外所显示意义更为可信赖。

由于免疫反应为一复杂过程，本发明的萃取物及层析纯化物，是依据免疫试验按照下列几项研究而测得具免疫功能：

1.由动物的血清中得知抗体变化情形。

2.利用脾脏细胞(含免疫细胞)测定

(1)淋巴球增加(或减少)；

(2)淋巴球类族群变化；

(3)自然杀手细胞活性；

(4)抗体的分泌；及

(5)细胞激素的分泌。

3.腹腔巨噬细胞吞噬力。

如实施例1所示，本发明经硅胶管柱层析及高效液相层析，可分离或纯化出云南产茯苓的羊毛甾烷类成分，K1、K2、K3、K4、K4a、K4b、K5、K6a及K6b(其中K1及K2因化合物性质，虽使用高效液相层析仍无法分离其内的微量成分)，将硅胶层析的K1及高效液相层析所得的K2、K3及K4进行免疫增强研究(如免疫学研究项下)，由表二至表十实验结果，显示K1、K2、K3及K4化合物在实验最低浓度(2.5mg/kg或5mg/kg)下，就能对免疫细胞(T细胞/B细胞)，出现免疫增强作用。

据此，可确认茯苓的有效成分，是羊毛甾烷类成分，其中PCM及主要成分K1、K2、K3、K4均具有加强免疫细胞的效能。

研究方法：(免疫学研究)

实验动物

BALB/c小白鼠：6-8周大，雄性，购自国家动物中心，饲养于国立台湾师范大学生物系动物房，饲养环境采用标准无特殊病源动物(SPF)、独立吹尘式无菌动物笼架(Individual Ventilation Cage System，IVC)，所饲养动物所用的饮水、木屑及饲料皆经高温高压灭菌处理，温度保持在24～26℃，湿度保持在30～70％，照明使用定时器以确保规律的光照周期，以一天12小时日12小时夜循环，饲料购自台大动物中心(粗蛋白23.5％以上；粗脂肪4.5％以上；粗纤维6％以下；水份12％以下；灰份9％以上)，饲养两周后，即进行实验。

动物处理

动物被分成4组(或3组)，喂食给药1毫升的萃取物或纯化成分，4天药物剂量范围如为PCM则剂量为10、40、80mg/kg/day，如为纯化物K1及K2，剂量为上述4分之一，即2.5、5、10、20mg/kg/day，对照控制组则不给药而以等体积无菌水取代，老鼠在第五天牺牲后，收集其血清及脾脏细胞作研究材料，血清部份则测其抗体，即IgG、IgM和IgA、脾脏细胞则被置入10公分直径的培养皿，然后于37℃下培养3小时，去除附着性细胞，非附着性细胞包括T、B、NK等细胞，收集后按下列各项实验指示处理。

药物处理

茯苓成分加入无菌水，使用超音波处理使成悬浮状溶液。

分离脾脏淋巴球

经断颈及70％酒精喷洒消毒后，先以23Gneedle心脏抽血，待凝血后，离心分离出血清备用，再用剪刀剪开其皮肤及腹膜，取出脾脏。脾脏取出后，打开胸腔，直接由心脏取血，制备血清，以备进一步实验。另准备一盛有10ml RPMI-1640细胞培养液的培养皿，其中放入细胞研磨器，将脾脏置于细网上以研磨器磨碎，使细胞分离而悬浮于培养液中。如此收集到的脾脏细胞自培养皿吸出，装入50ml离心管中，放置离心机，以1300rpm离心10分钟。加1ml cold RBC lysing buffer(EDTA-NH₄Cl)处理10分钟，以去除红血球。离心清洗三次后，将细胞移至培养皿中，于二氧化碳培养箱(37℃、5％CO₂、100％饱和湿度)放置三小时，使附着性细胞附着于培养皿上，随后收集非附着性细胞，其中主要含脾脏淋巴球。

MTT法

MTT法是分析细胞存活数或活性常用方法，基本原理是利用活细胞中粒线体的氧化还原酵素对受质作用，产生颜色的变化，再进一步测定其吸光值((Mosmann，J.Immunol.Method.，65，55-63(1983))。详细方法如下：

将分离好的脾脏淋巴球调成5×10⁶cell/ml，置入96well的培养盘中，每well加100μl。一个sample加5个格，并每个well加入1μlConA(1mg/ml)(Sigma，MO.USA)，最后置于37℃、5％CO₂、100％饱和湿度培养箱中培养，于第三天、第四天及第五天以MTT法测试

方法如下：先加入MTT试剂(3-「4，5-dimethylthiazol-2-yl」-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)(Sigma，MO.USA)20μl后，放在培养箱中作用4小时。4小时后取出培养盘，每个格加入acid-isopropanol(0.04N HCl in isopropanol)120μl，充分混合以溶解培养底部深蓝色结晶。再置于培养箱20分钟，20分钟后以ELISA测读仪(波长570nm)读取吸光值，以分析细胞存活数。

酵素免疫分析法测定免疫球蛋白

本研究采用sandwich ELISA方法，简述如下：将分离好的脾脏淋巴细胞悬浮在含10％胎牛血清，2mM glutamine，100u/mlPenicillin/Streptomycin及5ug/ml脂多醣(LPS)的RPMI 1640培养基中(称为完全培养基)，调成5×10⁵cell/ml，细胞随后置入24-well的培养盘中，每格加入1ml，在37℃、5％CO₂、100％饱和湿度中培养5天，然后收集上清液作ELISA测试。

1.测IgG：

首先将goat anti-Mouse IgG+A+M(H+L)(Zymed，CA USA)，1mg/ml稀释成1/1000加入96格的ELISA plate(Nunc，Denmark)，每格加入100μl，放在4℃中隔夜，翌日，拿出plate用0.05％PBS-Tween20洗三次，吸干。以1％PBS-gelatin进行blocking，每格加入100μl，放在37℃下作用60分钟。将血清样品用RPMI 1640稀释十万倍(1/10⁵)，而培养脾脏细胞的上清液样品则不稀释。IgG标准液序列稀释为：0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0.0078、0.0039、0μg/ml等各浓度。取出放在37℃培养箱中的plate，以0.05％PBS-Tween20清洗三次并吸干，随后分别加入待测样品及标准液各100μl，在37℃培养箱中作用二小时。拿出ELISA plate，续用0.05％PBS-Tween20清洗三次并吸干后，再加入goat anti-mouseIgG-HRP(稀释1/1000)每格加入100μl，续于37℃中作用60分钟，最后再用0.05％PBS-Tween20洗三次，并加入100μl的受质(0.1％O-phenylenediamine；0.1M citrate buffer，pH 4.5；0.03％H₂O₂)，于室温中作用30分钟。最后用ELISA reader(主波长490nm，辅波长630nm)读O.D.值。参考标准曲线，算出各待测样品所含IgG的浓度。

2.测IgM：

IgM的测试方法与IgG相似，血清样品用RPMI 1640稀释一万倍(1/10⁴)，上清液样品则不稀释。IgM标准液序列稀释为：1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0μg/ml等各浓度。二次抗体使用goatanti-mouse IgM-HRP(稀释1/1000)。

3.测IgA：

IgA测试方法与IgG相似，ELISA plate附上sheep anti-mouse IgA(稀释成1/1000)，血清样品用RPMI 1640稀释一万倍(1/10⁴)，上清液样品则不稀释。IgA标准液序列稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0μg/ml等各浓度。二次抗体使用goat anti-mouse IgA-HRP(稀释1/1000)。

酵素免疫分析法测定细胞激素(IL-10及IFN-γ)

将分离好的脾脏淋巴细胞以完全培养基调成1×10⁶cell/ml，不过以ConA(1μg/ml)取代LPS，随后细胞置入24-well培养盘中，每格加入1ml，在37℃、5％CO₂，100％饱和湿度下培养3天，第3天取上清液测IL-10及IFN-γ。

1.测IL-10

以Cyto Set ELISA kit(R & D Systems，MN，USA)测定之，方法简述如下：以抗mIL-10单株抗体为一次抗体附在ELISA plate上，每格加入100ul的mIL-10标准品浓度由500pg/ml序列稀释至15.6pg/ml或待测样品，37℃中作用20分钟后，以冲洗液冲洗五次，每格再加入100ul的biotinylated conjugated anti-IL-10(二次抗体)，37℃中作用20分钟，以冲洗液冲洗五次，每格再加入100μl的HRP conjugatedstreptoavidin，37℃中作用20min后，以冲洗液冲洗五次，每格再加入50μl的substrate solution(含H₂O₂及tetramethylbenezidine；TMB)，以ELISA Reader(450nm)测O.D值，再以标准曲线求样品的IL-10浓度。

2.测IFN-γ

以Cyto Set ELISA kit(R & D Systems，MN，USA)测试方法与mlL-10相似，ELISA plate附上以抗m IFN-γ单株抗体(一次抗体)，二次抗体为biotinylated conjugated anti-IFN-γ，标准品浓度由600pg/ml序列稀释至18.8pg/ml。

T细胞CD4 ⁺ 及CD8 ⁺ 次族群分析

将已经收集好的脾脏淋巴球放入Falcon tube，将细胞调成1×10⁶cell/ml，加入各1μl的Phycoerythin(PE)-conjugated anti-mouse CD4、Fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated anti-mouse CD8，在室温避光环境下作用15分钟后，加入3ml无菌冷却的PBS，以1300rpm离心10分钟，离心后吸除上清液，均匀打散细胞，加入0.5ml含1.0％paraformaldehyde的冷却PBS，并轻微地振荡混合，随即用流式细胞仪(Flow cytometry；Becton Dickinson FACS，Sam，CA)进行萤光阳性细胞比例分析。

自然杀手细胞活性分析

为了测定动物的自然杀手细胞活性，须先培养自然杀手细胞的目标细胞(YAC-1细胞株)，将生长良好的YAC-1细胞株配制成1×10⁵cell/ml加入2μl DiOC18(绿色萤光标示目标细胞)，于二氧化碳于培养箱中培养20分钟。20分钟后，取200μl YAC-1(Target cells)及200μl分离好的脾脏淋巴球(Effector cells)，配成T∶E比例分别为1∶50、1∶25、1∶12.5的细胞混合液，另一管只加YAC-1当作负控制组，细胞混合液放入二氧化碳培养箱放置2小时，2小时后加入50μl Propidium Iodide(红色萤光，渗入死亡细胞中，标示细胞核)，置于冰浴中10分钟，在4℃避光环境下立即用流式细胞仪分析。

吞噬细胞活性分析

先制备老鼠腹腔巨噬细胞，方法如下：老鼠牺牲前三天以腹腔注射10％2.5ml proteose peptone，三天后断颈将老鼠致死，用剪刀把腹腔表皮剪开，打入3.0ml无胎牛血清的DMEM，用镊子轻拍腹腔约3分钟后，用空针取出腹腔液，以DMEM加至10ml，即以1300rpm离心10分钟，收集的腹腔细胞调成1×10⁷/ml。

一个sample准备二根falcon tube，各加入100μl巨噬细胞悬浮液，放置冰上10分钟，随后加入100μl FITC-conjugated Escherichiacoli(K-12) 5×10⁷ cells/ml，两管中一管放置冰上15分钟(负控制组)，另一管放置37℃15分钟，作用结束后各加入100μl trypan blue混合均匀，以cold PBS 3ml于1300rpm离心5分钟，如此将细胞清洗两次后，加入500μl 1％paraformaldehyde，即可用流式细胞仪分析，有吞噬E.coli的巨噬细胞发出黄绿色萤光。

统计方式

以Mann-Whitney Rank Sum Test，分析服药组与控制组之间的关系，P值≤0.05视为显著差异。

研究结果：

(1)脾脏细胞生长情形-PCM、K1、K2、K3及K4的作用如表二所示，口服PCM、K1、K2、K3及K4的小鼠脾脏细胞与控制组(喂食无菌水)相较结果：服用PCM 40mg/kg/day的小鼠在培养第三天后，活细胞显著多于控制组。而K1、K3及K4服用5mg/kg/day以上，K2服用10mg/kg/day以上在培养第三天，活细胞显著多于控制组。

表二～1脾脏细胞生长情形-PCM，K1，K2的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 0.359±0.076^a 0.481±0.044 0.414±0.067

PCM 10 0.453±0.028 0.398±0.057 0.301±0.059

PCM 40 0.551±0.040* 0.401±0.031 0.445±0.055

PCM 80 0.475±0.083 0.410±0.083 0.447±0.075

K1 2.5 0.497±0.080 0.533±0.070 0.584±0.060*

K1 5 0.642±0.078** 0.652±0.077 0.469±0.054

K1 10 0.743±0.083** 0.733±0.035*** 0.562±0.025*

K1 20 0.634±0.048** 0.571±0.091 0.452±0.049

K2 2.5 0.533±0.069* 0.460±0.052 0.414±0.054

K2 5 0.489±0.087 0.480±0.072 0.527±0.062

K2 10 0.928±0.078*** 0.931±0.065*** 0.585±0.041*

K2 20 0.655±0.075** 0.605±0.072 0.530±0.057

a：表中数据为MTT测试所获得的570nm波长吸光值(O.D.)；数据为10次实验的Mean±S.E.M；

*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

表二～2脾脏细胞生长情形-K3，K4的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 0.373±0.070 0.404±0.033 0.431±0.044

K3 5 1.154±0.172*** 0.841±0.160* 0.864±0.194

K3 10 1.020±0.090*** 0.900±0.193** 0.957±0.200*

K3 20 1.103±0.081*** 1.068±0.132*** 0.943±0.159**

K4 5 0.949±0.101** 0.981±0.087*** 0.862±0.085**

K4 10 1.198±0.101*** 1.273±0.147*** 1.177±0.078***

K4 20 1.233±0.040*** 1.263±0.041*** 1.061±0.124***

a：表中数据为MTT测试所获得的570nm波长吸光值(O.D.)；数据为6次实验的Mean±S.E.M；

*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

(2)血清中免疫球蛋白浓度变化-PCM、K1、K2、K3及K4的作用如表三所示，口服40mg/kg/day以上的PCM显著提升小鼠血清中IgG的浓度，而喂食K1、K2及K45mg/kg/day以上的血清IgG浓度显著高于控制组；相反的，喂食5mg/kg/day以上的K3则IgG血清浓度显著低于控制组。喂食PCM 40mg/kg/day、K1 10mg/kg/day、K22.5mg/kg/day、K3 5mg/kg/day及K4 5mg/kg/day以上的血清IgM浓度显著高于控制组。口服80mg/kg/day的PCM显著抑低小鼠血清中IgA的浓度。然而，K1 10mg/kg/day则显著提高IgA浓度，K2、K3及K4于所测试浓度下对IgA并无影响。

表三～1血清免疫球蛋白浓度-PCM，K1，K2的作用

成分剂量免疫球蛋白浓度(mg/ml)

(mg/kg/day) IgG IgM IgA

控制组 1.81±0.19^a 0.90±0.18 3.67±0.54

PCM 10 2.38±0.28 1.31±0.13 3.40±0.25

PCM 40 4.36±0.88* 1.96±0.18*** 2.54±0.28

PCM 80 4.53±0.92* 2.07±0.21*** 2.26±0.26*

K1 2.5 1.57±0.32 1.27±0.22 3.51±0.33

K1 5 2.83±0.41* 1.38±0.24 4.03±0.47

K1 10 3.00±0.53** 3.27±0.47*** 6.57±0.71**

K1 20 3.74±0.62** 1.46±0.27 3.79±0.35

K2 2.5 1.69±0.24 2.82±0.41*** 2.85±0.36

K2 5 2.95±0.17** 3.46±0.61*** 2.81±0.28

K2 10 3.75±0.54*** 2.58±0.38*** 4.33±0.33

K2 20 5.11±0.72*** 5.13±0.95*** 5.02±0.65

a：表中数据为10次实验的Mean±S.E.M；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

表三～2血清免疫球蛋白浓度-K3，K4的作用

成分剂量免疫球蛋白浓度(mg/ml)

(mg/kg/day) IgG IgM IgA

控制组 1.80±0.11 1.11±0.13 3.15±0.48

K3 5 1.32±0.09** 1.63±0.11** 3.65±0.26

K3 10 1.28±0.13** 1.53±0.14* 3.81±0.46

K3 20 1.14±0.11** 1.53±0.13* 3.55±0.37

K4 5 3.75±0.18*** 2.65±0.21** 3.33±0.13

K4 10 4.33±0.29*** 2.86±0.16** 3.39±0.25

K4 20 4.18±0.25*** 2.36±0.16** 3.54±0.12

a：表中数据为6次实验的Mean±S.E.M；

*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

(3)离体培养下，脾脏细胞分泌抗体的能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用

3-1：离体培养下，脾脏细胞分泌IgG的能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用，如表四所示，口服40mg/kg/day PCM小鼠脾脏细胞培养三天后，IgG分泌有显著增加，而K1 5mg/kg/day以上及K2 10mg/kg/day以上则IgG分泌有显著增加，相反的，K3 5mg/kg/day以上IgG分泌有显著抑制，而K4 5mg/kg/day以上，培养至第五天，IgG分泌有显著增加。

表四～1脾脏细胞分泌IgG(ng/ml)的能力-PCM，K1，K2的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 7.40±1.07^a 10.00±1.42 11.21±1.31

PCM 10 4.24±0.69 6.00±0.97* 6.46±0.94*

PCM 40 16.37±3.11* 17.42±3.41 13.67±3.73

PCM 80 10.84±3.42 8.67±3.33 9.20±3.18

K1 2.5 19.65±5.73 19.88±5.26 13.34±3.66

K1 5 41.53±8.68*** 32.94±8.84*** 33.27±6.14**

K1 10 38.43±11.09*** 30.01±7.40*** 34.49±8.27***

K1 20 59.53±13.04*** 65.55±17.30*** 70.58±20.47***

K2 2.5 8.32±2.53 15.32±3.67 9.02±2.34

K2 5 5.97±2.70 10.48±3.77 13.34±3.83

K2 10 12.95±2.17* 11.94±2.24 17.97±2.07**

K2 20 25.93±10.15* 27.41±10.98* 22.82±5.96*

a：表中数据为10次实验的Mean±S.E.M；

*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

表四～2脾脏细胞分泌IgG(ng/ml)的能力-K3，K4的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 7.17±0.89 12.04±0.46 9.55±0.77

K3 5 3.85±0.73** 3.43±0.40** 4.46±0.95**

K3 10 3.18±0.55** 3.16±0.62** 3.48±0.43**

K3 20 6.12±0.70 7.10±1.39* 8.56±1.34

K4 5 12.55±3.08 12.99±0.86 18.29±0.92**

K4 10 6.54±1.43 15.15±5.16 22.59±5.35*

K4 20 21.23±3.19** 19.11±4.23 22.56±3.84*

a：表中数据为6次实验的Mean±S.E.M；

*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；

3-2：离体培养下，脾脏细胞分泌IgM的能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用如表五所示，口服40mg/kg/day以上的PCM，10mg/kg/day以上的K1及K3，2.5mg/kg/day以上的K2，5mg/kg/day以上的K4小鼠脾脏细胞，从培养第三天起，其IgM的分泌量皆显著高于控制组。

表五～1脾脏细胞分泌IgM(ng/ml)的能力-PCM，K1，K2的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 138.27±42.55^a 171.10±39.90 184.29±30.97

PCM 10 184.37±36.35 251.78±37.64 273.91±33.30

PCM 40 375.07±13.6*** 352.16±17.60*** 323.52±13.70***

PCM 80 328.96±24.46*** 322.79±23.76* 296.89±12.42**

K1 2.5 181.30±34.26 201.03±33.98 190.20±38.67

K1 5 223.32±51.46 233.67±31.32 249.35±38.32

K1 10 356.52±28.8*** 362.17±31.1** 527.33±41.00***

K1 20 267.18±58.97 280.79±32.08* 320.44±41.39*

K2 2.5 378.0±55.5*** 479.8±60.9*** 254.4±30.8

K2 5 457.81±87.3** 507.62±91.9** 334.75±48.7*

K2 10 540.23±68.8*** 512.47±84.20*** 550.54±50.10***

K2 20 837.1±114.5*** 695.2±144.7** 591.5±108.4***

a：表中数据为10次实验的Mean±S.E.M；

*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

表五～2脾脏细胞分泌IgM(ng/ml)的能力-K3，K4的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 121.91±34.35 200.75±32.77 219.30±18.60

K3 5 222.42±42.83 214.45±28.51 277.52±101.63

K3 10 287.66±44.44* 294.30±30.68* 309.51±30.88*

K3 20 372.14±69.48* 519.53±52.63*** 606.44±88.10**

K4 5 463.65±76.41*** 688.17±85.78*** 649.89±70.09***

K4 10 514.45±70.30*** 733.58±95.70*** 807.32±104.21***

K4 20 747.6±128.42*** 746.50±157.76*** 857.49±92.19***

a：表中数据为6次实验的Mean±S.E.M；*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

3-3：离体培养下，脾脏细胞分泌IgA的能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用，如表六所示，口服不同剂量的PCM小鼠，脾脏细胞培养三天后，IgA分泌量显著低于控制组；相反的，口服K1 10mg/kg/day，培养第3天至第5天后IgA分泌显著高于控制组，口服K210mg/kg/day以上，IgA分泌显著高于控制组。口服5mg/kg/day K3培养第4天之后，IgA分泌显著低于控制组，口服5mg/kg/day K4培养第5天之后，IgA分泌显著高于控制组

表六～1脾脏细胞分泌IgA(ng/ml)的能力-PCM，K1，K2的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 130.48±30.76^a 144.72±31.06 128.56±35.52

PCM 10 50.67±13.28** 66.09±8.68* 74.73±15.17

PCM 40 84.31±8.09 94.72±10.64 125.41±8.51

PCM 80 36.03±4.10** 46.16±5.09** 56.05±7.71*

K1 2.5 118.64±19.79 94.65±53.54 108.37±16.01

K1 5 148.60±24.55 127.93±66.0 148.81±22.97

K1 10 432.11±48.1*** 378.5±196.2*** 422.74±76.67**

K1 20 145.93±26.52 144.08±84.36 179.0±18.86

K2 2.5 133.90±33.39 181.00±47.98 277.13±101.1

K2 5 155.67±18.66 142.89±26.86 94.91±12.07

K2 10 239.64±43.1* 258.20±46.4* 260.00±40.93*

K2 20 273.20±54.87* 211.48±57.82 324.7±153.4**

a：表中数据为10次实验的Mean±S.E.M；*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；***表示P＜0.001

表六～2脾脏细胞分泌IgA(ng/ml)的能力-K3，K4的作用

成分剂量培养天数(天)

(mg/kg/day) 3 4 5

控制组 58.21±12.63 66.92±17.16 73.41±14.64

K3 5 32.83±7.00 27.37±5.83* 21.96±4.17**

K3 10 26.57±3.68* 28.97±5.95* 18.87±2.66**

K3 20 43.08±4.05 43.45±5.92 30.50±3.60*

K4 5 55.56±4.71 79.51±3.74 106.69±7.29*

K4 10 66.43±5.26 95.39±10.08 121.97±12.69*

K4 20 119.59±15.08** 101.53±25.08 133.16±20.09*

a：表中数据为6次实验的Mean±S.E.M；*表示P＜0.05；**表示P＜0.01；

(4)脾脏细胞分泌T_H1型及T_H2型细胞激素分泌能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用TH1型免疫反应主要激发细胞性免疫反应，而T_H2型免疫反应主要激发体液(抗体)性免疫反应。如表七所示，本研究检视小鼠口服PCM、K1、K2、K3及K4之后，脾脏细胞分泌TH1型细胞激素(Interferon-γ；IFN-γ)及T_H2型细胞激素(Interleukin-10；IL-10)的变化；发现小鼠服用10mg/kg/day及80mg/kg/day的PCM后IFN-γ的分泌显著高于控制组。服用K1及K2 2.5mg/kg/day以上，IFN-γ的分泌显著高于控制组；服用5mg/kg/day及10mg/kg/day的K3 IFN-γ的分泌显著高于控制组；服用20mg/kg/day的K4 IFN-γ的分泌显著高于控制组。IL-10的分泌在服用PCM、K3及K4之后，没有明显的变化，然而，服用K12.5mg/kg/day以上，K2 5mg及20mg/kg/day，则显示明显增加IL-10的分泌。

表七～1脾脏细胞分泌IFN-γ及IL-10的变化-PCM，K1，K2的作用

成分剂量细胞激素(pg/ml)

(mg/kg/day) IFN-γ IL-10

控制组 254.14±55.68^a 103.91±20.36

PCM 10 465.11±26.6** 115.90±17.29

PCM 40 264.79±48.36 77.31±9.31

PCM 80 433.44±31.10** 181.97±33.26

K1 2.5 428.7±38.9* 170.28±13.0*

K1 5 673.33±96.73** 178.76±24.56*

K1 10 682.28±73.78** 176.17±45.24

K1 20 783.97±76.1*** 334.7±45.8***

K2 2.5 414.80±31.3* 135.71±19.89

K2 5 432.70±50.22* 226.48±55.67*

K2 10 348.45±72.56* 135.62±48.15

K2 20 457.48±57.60** 195.27±40.0*

表七～2脾脏细胞分泌IFN-γ及IL-10的变化-K3，K4的作用

成分剂量细胞激素(pg/ml)

(mg/kg/day) IFN-γ IL-10

控制组 124.25±28.15^a 107.80±20.79

K3 5 917.07±130.41* 262.09±108.41

K3 10 449.74±100.67* 86.48±33.26

K3 20 176.20±45.96 98.74±27.05

K4 5 240.45±107.83 128.91±45.46

K4 10 252.26±103.76 197.39±68.73

K4 20 292.00±77.77* 155.91±26.16

a：表中数据为6次实验的Mean±S.E.M；*表示P＜0.05

(5)T淋巴球CD4⁺8^-及CD4^-8⁺次族群的变化CD4⁺CD8^-T细胞主要是辅助型T细胞(Helper T-cells)，而CD4^-CD8⁺主要是胞杀型T细胞(Cytotoxic T-cells)。如表八所示，本研究以不同浓度PCM喂食小鼠后，取出脾脏细胞，分离出非附着性细胞，进行免疫萤光测试。结果显示CD4⁺8^-细胞所占的比例有上升趋势，但与控制组相较无显著差异；不过，CD4^-8⁺细胞所占的比例，与控制组比较，有显著增加的现象。由于CD4⁺8^-细胞也有增加的趋势，故CD4/CD8比例没有显著变化。CD4^-8⁺T细胞的增加，与脾脏细胞IFN-γ分泌量增加的现象相吻合，因为CD4^-8⁺T淋巴球是「专一性细胞免疫反应」的主要反应细胞(effector cells)。

表八T淋巴球次族群的变化-PCM的作用

成分剂量萤光阳性细胞百分比(％)

(mg/kg/day) CD4 CD8 CD4/CD8

控制组 23.40±2.31^a 12.50±0.82 1.87

PCM 10 28.67±2.54 15.31±0.72* 1.87

PCM 40 27.72±0.66 16.67±1.08** 1.66

PCM 80 29.95±2.75 16.76±1.29** 1.79

a：表中数据为5次实验的Mean±S.E.M；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

(6)自然杀手细胞活性自然杀手细胞(Nature killer cells；NK cells)为对抗肿瘤细胞及病毒感染细胞的非专一性胞杀细胞，小鼠口服PCM后，分离非附着性脾脏细胞，测试其所含的NK细胞活性。如表九所示，口服10mg/kg/day的PCM有显著增加NK细胞活性的现象，高于此剂量则没有增强NK活性的现象。IFN-γ为促进NK细胞活化的细胞激素，此数据也与IFN-γ分泌量增加的现象相吻合。

表九自然杀手细胞活性-PCM的作用

成分剂量 Target∶Effector

(mg/kg/day) 1∶12.5 1∶25 1∶50

控制组 16.57±0.61^a 17.04±1.06 16.57±0.61

PCM 10 14.24±2.18 20.78±1.25 23.12±2.86*

PCM 40 18.62±2.62 18.20±2.02 20.99±3.59

PCM 80 15.54±3.49 18.27±2.05 16.35±0.90

a：数据为目标细胞(YAC-1)死亡百分比，即propedium iodide阳性反应细胞比例。数据为5次实验的mean±S.E.M，*为P＜0.05

(7)腹腔巨噬细胞吞噬能力巨噬细胞(macrophages)为免疫系统中主要的吞噬细胞之一，负责清除入侵的病原菌及体内坏死的细胞。如表十所示，本研究以PCM喂食小鼠后，分离出腹腔巨噬细胞(peritonealmacrophages)，再以带有萤光之K-12大肠杆菌为目标细胞，观察其吞噬能力。结果显示，口服40及80mg/kg/day的PCM后，腹腔巨噬细胞随着PCM浓度增加，显著增强对大肠杆菌的吞噬能力。

表十腹腔巨噬细胞吞噬作用

成分剂量吞噬作用

(mg/kg/day)

控制组 20.88±3.90^a

PCM 10 17.08±1.82

PCM 40 27.49±3.99*

PCM 80 38.22±2.20**

a：数据为巨噬细胞有吞噬目标细胞占所有巨噬细胞百分比，表中数据为10次实验的Mean±S.E.M；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01

Claims

1.一种提升哺乳类动物免疫力的医药组合物，包含一提升哺乳类动物免疫力有效量作为有效成分的具下列化学式(I)的羊毛甾烷；及与该有效成分共同使用的医药允许载体或稀释剂：

于式中R₁为H或CH₃；R₂为OCOCH₃，C＝O或OH；R₃为H或OH；R₄为-C(＝CH₂)-C(CH₃)₂R_a，其中R_a为H或OH，或-CH＝C(CH₃)-R_b，其中R_b为CH₃或CH₂OH；R₅为H或OH；及R₆为CH₃或CH₂OH。

2.如权利要求1所述的医药组合物，其中该羊毛甾烷(I)具有具下列化学式：

或

3.如权利要求1所述的医药组合物，其中该医药组合物含有1～60重量％的羊毛甾烷。

4.如权利要求1所述的医药组合物，其中该医药组合物为口服的。

5.如权利要求1所述的医药组合物，其中该哺乳类动物为人类。

6.一种提升哺乳类动物免疫力的茯苓萃取物，包含5～60重量％的权利要求1所述的羊毛甾烷(I)且实质上不含开环羊毛甾烷。

7.如权利要求6所述的茯苓萃取物，其是由包含下列步骤的方法所制备：

b)浓缩步骤a)萃取所获得的液体；

c)将步骤a)所获得的浓缩物导入一硅胶管柱；

d)以一低极性洗脱液冲洗该硅胶管柱，及收集所产生的洗脱液；及

e)浓缩步骤d)的洗脱液。

8.如权利要求7所述的茯苓萃取物，其中从步骤e)所获得的洗脱液的浓缩物以硅胶薄层层析法分析具有一层析值(Rf)≥0.1，其中以紫外光灯及碘作检侧，展开液为二氯甲烷∶甲醇＝96∶4。

9.如权利要求7所述的茯苓萃取物，其中步骤a)的萃取所使用的溶剂为95％酒精。

10.如权利要求9所述的茯苓萃取物，其中步骤b)的浓缩物被进一步以一体积比为1∶1的甲醇及正己烷的两相溶剂萃取；分离出甲醇层；及浓缩该甲醇层，所获得的浓缩物被用作为步骤c)的硅胶管柱的进料。

11.如权利要求7所述的茯苓萃取物，其中步骤d)的低极性洗脱液为体积比为96.5∶3.5的二氯甲烷及甲醇的混合溶剂。

12.如权利要求6所述的茯苓萃取物，其包含10-20重量％的羊毛甾烷(I)。

13.如权利要求6所述的茯苓萃取物，其中该羊毛甾烷(I)具有具下列化学式：

或

14.一种如权利要求1中所述的化学式(I)的羊毛甾烷作为活性成分在制备提升哺乳类动物免疫力药物中的应用。

15.一种如权利要求6至13项中任一项所述的茯苓萃取物作为活性成分在制备提升哺乳类动物免疫力药物中的应用。