CN105294815A - 一种化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种化合物及其制备方法和应用，本发明提供的化合物，通过细胞实验发现，该化合物具有能够抑制人宫颈癌细胞(Hela)的活性，其IC₅₀为18.26μM。

Description

一种化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种化合物及其制备方法和应用。

背景技术

茯苓，俗称云苓、松苓、茯灵，为寄生在松树根上的菌类植物，形状像甘薯，外皮黑褐色，里面白色或粉红色。其原生物为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，多寄生于马尾松或赤松的根部，产于云南、安徽、湖北、河南、四川等地。

茯苓味甘、淡、性平，能渗湿利水，健脾和胃，宁心安神；古人称茯苓为“四时神药”，因为它功效非常广泛，不分四季，将它与各种药物配伍，不管寒、温、风、湿诸疾，都能发挥其独特功效。

目前，关于茯苓组成成分及其用途的分析并未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种化合物及其制备方法和应用。

本发明提供了一种化合物，具有式(I)结构，

本发明提供了一种式(I)结构的化合物的制备方法，包括：

1)对茯苓进行提取，得到浸膏；

2)将得到的浸膏进行萃取，得到含有式(I)结构化合物的粗品；

3)将含有式(I)结构化合物的粗品进行纯化，得到式(I)结构的化合物，

优选的，所述步骤2)中萃取所用的溶剂为乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯和乙酸丙酯中的一种或几种。

优选的，所述步骤3)具体为：

3-1)将含有式(I)结构化合物的粗品通过柱色谱分离，得到柱色谱分离后的产品；

3-2)将柱色谱分离后的产品通过高效液相色谱分离，得到式(I)结构的化合物。

优选的，所述步骤3-1)柱色谱分离的洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯和醋酸。

优选的，所述步骤3-1)中柱色谱分离的具体方法为：依次用石油醚与乙酸乙酯的体积比为(8～15)：1的溶液，石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(40～60)：10:1的溶液和石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(40～60)：(40～60):1的溶液洗脱，收集洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(40～60)：(40～60):1时的产品，即为柱层析分离后的产品。

优选的，所述高效液相色谱分离采用的流动相为乙腈和4wt％～8wt％的甲酸水溶液。

优选的，所述高效液相色谱分离为依次采用制备型高效液相色谱和半制备型高效液相色谱分离。

本发明还提供了一种式(I)所示化合物在制备治疗癌症的药物中的应用，

优选的，所述癌症为宫颈癌。

与现有技术相比，本发明提供了一种式(I)所示结构的化合物，且通过细胞实验发现，本发明所述的化合物能够抑制人宫颈癌细胞(Hela)的活性，其IC₅₀为18.26μM。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹HNMR谱图；

图2为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹³CNMR谱图和DEPT135谱图；

图3为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HSQC谱图；

图4为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹H-¹HCOSY谱图；

图5为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HMBC谱图；

图6为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HRESI(+)MS谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种化合物，具有式(I)结构，

本发明还提供了一种式(I)结构的化合物的制备方法，包括：

1)对茯苓进行提取，得到浸膏；

2)将得到的浸膏进行萃取，得到含有式(I)结构化合物的粗品；

3)将含有式(I)结构化合物的粗品进行纯化，得到式(I)结构的化合物，

按照本发明，本发明通过对茯苓进行提取，得到浸膏；本发明对提取的方法没有特殊限制，本领域公知的用于溶剂提取中草药成分的方法均可，本发明优选采用连续提取法；所述提取的溶剂优选为醇和水的混合溶剂；所述混合溶剂中醇与水的体积比为(60～80)：(40～20)，更优选为70:30；所述醇优选为甲醇和乙醇中的一种或两种；所述茯苓与混合溶剂的用量比优选为1kg：(8～15)L，更优选为1kg：(9～12)L，最优选为1kg：10L；所述提取优选在回流条件下提取，所述提取的时间优选为2～6小时，优选为4～5小时。

提取完毕后，本发明优选还将提取液浓缩，得到浸膏；本发明对浓缩的方法没有特殊限制，本领域技术人员公知的浓缩方法即可，本发明优选采用减压蒸馏浓缩。

按照本发明，本发明对得到的浸膏进行萃取，得到含有式(I)结构化合物的粗品；其中，萃取所用的溶剂优选为乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯和乙酸丙酯中的一种或几种，更优选为乙酸乙酯或乙酸甲酯；萃取的次数优选为3～5次；且为了能够萃取的充分，本发明优选将浸膏与水混合，得到浸膏的水溶液，然后再萃取；所述浸膏与水的体积比优选为1：(10～20)，更优选为1：(12～15)。

按照本发明，本发明将含有式(I)结构化合物的粗品进行纯化，得到式(I)结构的化合物；

具体的，本发明优选将含有式(I)结构化合物的粗品通过柱色谱分离，得到柱色谱分离后的产品；

3-2)将柱色谱分离后的产品通过高效液相色谱分离，得到式(I)结构的化合物。

按照本发明，将含有式(I)结构化合物的粗品通过柱色谱分离，得到柱色谱分离后的产品；其中，柱色谱分离的填料优选为硅胶；且硅胶的用量(以g计)优选为粗品用量(以g计)的4～6倍；更优选为5倍；所述柱色谱分离的洗脱剂优选为石油醚、乙酸乙酯和醋酸；且为了充分的分离各个化合物，本发明优选依次用石油醚与乙酸乙酯的体积比为(8～15)：1的溶液，石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(40～60)：10:1的溶液和石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(40～60)：(40～60):1的溶液洗脱；更优选为依次用石油醚与乙酸乙酯的体积比为(10～12)：1的溶液，石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(45～50)：10:1的溶液和石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(50～55)：(50～55):1的溶液洗脱；收集最后洗脱的产品，即为柱层析分离后的产品。

将柱色谱分离后的产品通过高效液相色谱分离，得到式(I)结构的化合物，其中，所述高效液相色谱分离优选为依次采用制备型高效液相色谱和半制备型高效液相色谱分离；

所述制备型高效液相色谱分离的过程优选为：

具体的，将柱色谱分离后的产品通过制备型高效液相色谱分离，其中，所述色谱分离采用的色谱柱优选为C18反向填料的色谱柱，更优选为50*250mm汉邦柱；所述色谱分离的流速优选为20～50mL/min；更优选为25～30mL/min；所述色谱分离的流动相优选为乙腈和4wt％～8wt％的甲酸水溶液；所述甲酸水溶液更优选为5wt％～6wt％；所述色谱分离检测的波长优选为210nm、238nm、254nm、280nm和324nm；其中，流动相的洗脱优选为梯度洗脱，具体的，所述梯度洗脱优选为0～40min，85～90％乙腈；40～50min，90～95％乙腈；50～55min，95-100％乙腈；所述进样量优选为10mL；更进一步的，收集出峰时间为7～14min，且在210nm,238nm,254nm,280nm,324nm下均有吸收的分离产物；

且为了使上述分离产物纯度更高，本发明优选还将出峰时间为7～14minmin，且在210nm,238nm,254nm,280nm,324nm下均有吸收的分离产物再次进行制备型高效液相色谱分离；其中，所述色谱分离采用的色谱柱优选为C18反向填料的色谱柱，更优选为50*250mm汉邦柱；所述色谱分离的流速优选为20～50mL/min；更优选为25～30mL/min；所述色谱分离的流动相优选为乙腈和4wt％～8wt％的甲酸水溶液；所述色谱分离检测的波长优选为238nm；其中，流动相的洗脱优选为梯度洗脱，具体的，所述梯度洗脱优选为0～50min，55％乙腈；50～70min，55～75％乙腈；70～90min，75-100％乙腈；所述进样量优选为10mL；更进一步的，收集出峰时间为67～75min的分离产物

将得到的出峰时间为67～75min的分离产物进行半制备型高效液相色谱分离，其中，所述色谱分离采用的色谱柱优选为C18反向填料的色谱柱，更优选为Acuity10*250mm色谱柱；所述色谱分离的流速优选为2～5mL/min；更优选为3mL/min；所述色谱分离的流动相优选为乙腈和4wt％～8wt％的甲酸水溶液；且所述乙腈与所述甲酸水溶液的体积比优选为(50～60)：(40～50)，更优选为56:44；所述色谱分离检测的波长优选为238nm；更进一步的，收集主峰产品，出峰时间在69～73min，即为式(I)结构化合物；

本发明对得到的化合物进行了结构鉴定，通过对图1～图6进行分析，其中，图1为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹HNMR谱图；图2为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹³CNMR谱图和DEPT135谱；图3为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HSQC谱图；图4为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹H-¹HCOSY谱图；图5为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HMBC谱图；图6为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HRESI(+)MS谱图；从图6的数据可知，所述化合物在HR-ESI-MS负离子模式下[M-H]^-m/z为571.3315(计算值为571.3276)，提取到的分子式为C₃₃H₄₈O₈，计算不饱和度为10；且通过对图1～图5所述的核磁数据的分析，其中，各个碳的标号见式(I-1)，

具体分析如下：

从¹H-NMR(400MHz,C₅D₅N)可以看出两个明显的双键质子信号δ_H6.99(d,J＝9.0Hz,1H,H-7),6.58(d,J＝9.0Hz,1H,H-6)，7个甲基信号δ_H1.49(s,H-30),1.44(s,H-28),1.38(s,H-29),1.24(s,H-18),1.20(s,H-19),1.03(d,J＝6.6,H-26),1.01(d,J＝6.6,H-27)。通过与已知化合物5α,8α-peroxydehydrotumulosicacid的氢谱进行对比，发现该化合物的氢信号与其非常相似，只是在δ_H5.54位置多出了一个dd峰,积分显示为1个H的信号，耦合常数J＝11.7,5.0Hz,1H；而在δ_H4.42位置缺少了一个H-3信号，推测本化合物为一个过氧四环三萜，其3号位置连接的-OH上的H可能被一个吸电子基团取代。

通过¹³C-NMR(101MHz,C₅D₅N，包括DEPT135)显示有33个碳信号，其中有7个甲基，8个亚甲基，8个次甲基，10个季碳，以及2个羧基碳(δc178.74,δc173.89)，结合¹³C-NMR和¹H-NMR也显示存在一个仲醇羟基、两个羧基、一个烯键末端亚甲基、一个异丙基、2个连氧三级碳。通过与已知化合物5α,8α-peroxydehydrotumulosicacid的碳谱进行对比，发现多了一个低场季碳δ_C173.89信号和一个CH₂信号δ_C61.48，δ_C173.89推测可能为一个羰基碳，另外3号位δ_C73信号消失，多出一个δ_C77.13信号，这与通过氢谱分析推测“3号位置连接的-OH上的H可能被一个吸电子基团取代”相一致，如果这种推测成立，那么多出的低场季碳信号δ_C173.89和一个CH₂信号δ_C61.48可能以某种方式连接在此位置。

在¹H-¹HCOSY谱中，δ6.99(H-7)/6.58(H-6),δ5.54(H-3)/1.81(H-2)/2.27(H-1a)/1.58(H-1b),δ5.37(H-11)/2.31(H-12b)/2.63(H-12a),δ4.57(H-16)/3.01(H-17),δ4.57(H-16)/2.78(H-15b)/1.88(H-15a),δ1.03(H-26)/2.29(H-25)/1.01(H-27)之间有明显的相关信号，结合HSQC谱，推出骨架片段Ⅰ:R-CH＝CH-R(C5-C6-C7-C8)；

Ⅱ:R-CH₂-CH₂-CH(-OH)-R[C10-C1-C2-C3(-OH)-C4]；

Ⅲ:R＝CH-CH₂-R(C9-C11-C12-C13)；

Ⅵ:R-CH₂-CH(-OH)-CH(-R)-R[C14-C15-C16-C17(-C13)-C20；此外还可以看出存在一个异丙基基团Ⅴ:R-CH(-CH₃)-CH₃[C24-C25(-C26)-C27]。

同时，在HSQC谱中可以看出δ_H5.54位置多出的一个dd峰相关的碳为δ_C77.13，进一步说明参考化合物3号位的δ_H4.42化学位移向低场迁移为δ_H5.54，其δ_C73也向低场迁移为δ_C77.13。另外，在δ_H4.6附近由于峰重叠，与其相关的碳有δ_C61.48和δ_C76.20，从碳谱可知δ_C61.48为二级碳(CH₂)，而该位置的氢谱积分显示有3H，说明δ_C76.20为三级碳(CH)，通过细微分析发现δ_C61.48对应的δ_H4.58比δ_C76.20对应的δ_H4.57化学位移值略大。

在HMBC谱中，δ_H6.99(H-7)与δ_C48.26(C-14)、86.88(C-5)、79.25(C-8)和144.60(C-9)相关，δ_H6.58(H-6)与δ_C41.44(C-10)、40.77(C-4)、86.88(C-5)和79.25(C-8)相关，不但验证了结构片段Ⅰ的存在，并且与5α,8α-peroxydehydrotumulosicacidB环相似。δ_H5.54(H-3)与δ_C20.13(C-29)、24.15(C-28)、40.77(C-4)和173.89(C-32)存在相关，说明了片段Ⅱ的存在，并且片段ⅡC-4位置同时连接有两个甲基，与5α,8α-peroxydehydrotumulosicacidA环相似，而且还揭示了C-3通过-O-与一个羰基相连。δ_H5.37(H-11)与δ_C36.30(C-12)、41.44(C-10)、79.25(C-8)相关，验证了片段Ⅲ的存在，与5α,8α-peroxydehydrotumulosicacidC环特征较符合。δ_H4.99(H-31a),4.86(H-31b)同时与δ_C34.47(C-25)、156.29(C-24)相关，并且δ_H4.99(H-31a),4.86(H-31b)与δ_C107.47(C-31)存在一个自身对称相关，验证了了片段Ⅴ的存在，与5α,8α-peroxydehydrotumulosicacidD环支链特征相符。δ_H4.57(H-16)与δ_C48.58(C-20)相关，δ_H1.65(H-30)与δ_C79.25(C-8)、48.26(C-14)、42.31(C-15)相关，支持片段Ⅵ的存在，符合5α,8α-peroxydehydrotumulosicacidD环特征。δ_H4.58(H-33)与δ_C173.89(C-32)相关，从HSQC分析可知δ_H4.58(H-33)是δ_C61.48上的H信号，结合¹H-¹HCOSY谱，表明C33一端连接了一个-OH，另一端连接了一个羰基。

通过综合图1～图6的分析，并与化合物5α,8α-peroxydehydrotumulosicacid的¹³C和¹HNMR的比较，可以确定实施例制备的化合物的结构为式(I)所示结构，且各个碳氢的归属于式(I-1)相符，且通过SciFinderScholar网络版检索，未发现相关报道，表明该化合物为一个新的过氧四环三萜，命名为3-(2-hydroxyacetoxy)-5α,8α-peroxydehydrotumulosicacid；且式(I)结构的化合物的各个碳氢归属如下：

¹HNMR(400MHz,C₅D₅N)δ6.99(d,J＝9.0Hz,1H,H-7),6.58(d,J＝9.0Hz,1H,H-6),5.54(dd,J＝11.7,5.0Hz,1H,H-3),5.37(d,J＝5.2Hz,1H,H-11),4.99(brs,1H,H-31a),4.86(brs,1H,H-31b),4.58(2H,H-33),4.57(1H,H-16),3.01(H-17),2.97(H-20),2.78(H-15b),2.65(H-22B),2.63(H-12a),2.58(H-20),2.56(H-23B),2.42(H-22A),2.37(H-23A),2.31(H-12b),2.29(H-25),2.27(H-1a),1.81(2H,H-2),1.88(d,J＝13.5,H-15a),1.58(H-1b),1.65(s,H-30),1.24(s,H-28),1.38(s,H-29),1.24(s,H-18),1.20(s,H-19),1.03(d,J＝6.6,H-26),1.01(d,J＝6.6,H-27)

¹³CNMR(101MHz,C₅D₅N)δ178.74(C-21),173.89(C-32),156.29(C-24),144.60(C-9),134.65(C-6),131.65(C-7),120.66(C-11),107.47(C-31),86.88(C-5),79.25(C-8),77.13(C-3，与两个甲基C-28，C-29相关),76.20(C-16),61.48(C-33),57.18(C-17),48.58(C-20),48.26(C-14),42.31(C-15),41.44(C-13),40.77(C-10),40.77(C-4),36.30(C-12),34.47(C-25),33.46(C-1),33.29(C-23),31.79(C-22),28.72(C-2),24.93(C-19),24.15(C-28),22.37(C-27),22.22(C-26),20.20(C-30),20.13(C-29),18.51(C-18)

本发明还提供了一种式(I)所示化合物在制备治疗癌症药物中的应用，

通过本发明实施例可知，本发明所述的化合物对具有抗肿瘤作用，且通过细胞实验表明，本发明所述的化合物能够抑制人宫颈癌细胞(Hela)的活性，其IC₅₀为18.26μM。

本发明通过对中草药材茯苓进行研究，通过首先对茯苓中的成分进行提取，然后通过柱层析得到特定的组分，然后通过高效液相对其进行分离，得到特定出峰时间的化合物，即为本发明所述的式(I)结构的化合物，且通过对式(I)结构的化合物进行活性检测，结果表明，本发明所述的化合物能够抑制人宫颈癌细胞(Hela)的活性，其IC₅₀为18.26μM。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将30kg茯苓块投入500L提取罐，加入配制好的70％的乙醇300L，加热回流提取，沸腾时开始计时，提取两次，每次提取2小时；

将两次提取液合并减压浓缩，浓缩至无醇味时停止浓缩，将浓缩浸膏转移至坩埚；

将浸膏按1:15的体积比加水分散，用等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，乙酸乙酯萃取层减压浓缩，得到含有式(I)结构化合物的粗品；

将含有式(I)结构化合物的粗品用甲醇溶解，用样品：硅胶的质量比为1:2的比例拌样，干燥，用5倍于样品重量的硅胶湿法装柱，干法上样，用石油醚：乙酸乙酯体积比10:1的的洗脱剂洗脱，每100mL收集一份馏分，直至收集的馏分浓缩后干物质很少，改用石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比50:10:1的洗脱剂洗脱，同上，每100mL收集一份馏分，直至收集的馏分浓缩后干物质很少，改用石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比50:50:1的洗脱剂洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比50:50:1的洗脱剂洗脱部位的产品；

用制备型HPLC对硅胶柱层析的产品进行粗分：石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸的体积比为50:50:1洗脱部位浓缩干燥后的样品用纯甲醇溶解、离心，取上清液进样，每次进样10mL，色谱条件：50*250mm汉邦柱，流速30mL/min,流动相A：乙腈(ACN)，B:5％甲酸水，0-40min,85-90％ACN；40-50min,90-95％ACN；50-55min,95-100％CAN；检测波长：210nm,238nm,254nm,280nm,324nm.根据出峰情况分为5段：Y1，Y2，Y3，Y4，Y5,其中Y2部位的特征是在210nm,238nm,254nm,280nm,324nm下均有吸收，出峰时间为7～14min。

Y2部分再用制备型HPLC分离，色谱条件：50*250mm汉邦柱，流速30mL/min,流动相A：乙腈，B:5％甲酸水，0-50min,55％ACN；50-70min,55-75％ACN；70-90min,75-100％ACN；检测波长：238nm；根据出峰情况分为7段，Y2-1，Y2-2，Y2-3，Y2-4，Y2-5，Y2-6，Y2-7；Y2-5即为目标化合物，出峰时间为67～75min。

Y2-5再用半制备型HPLC纯化，色谱条件：Acuity10*250mm色谱柱，流速3mL/min；流动相A：乙腈，B:5％甲酸水，56％ACN等度洗脱，检测波长：238nm，收集主峰，浓缩干燥，得到过氧四环三萜5α,8α-epidioxy-3-(2-hydroxyacetoxy)-16a-hydroxy-24-methyllanosta-6,9(11),24(31)-trien-21-oicacid，即式(I)结构所示的化合物。

通过对实施例1得到的化合物进行了结构鉴定，通过对图1～图6进行分析，其中，图1为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹HNMR谱图；图2为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹³CNMR谱图和DEPT135谱；图3为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HSQC谱图；图4为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹H-¹HCOSY谱图；图5为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HMBC谱图；图6为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HRESI(+)MS谱图；

通过对检测结果分析可知，本发明得到的化合物的结构为式(I)所示的化合物。

实施例2

将30kg茯苓块投入500L提取罐，加入配制好的80％的乙醇300L，加热回流提取，沸腾时开始计时，提取两次，每次提取2小时；

将两次提取液合并减压浓缩，浓缩至无醇味时停止浓缩，将浓缩浸膏转移至坩埚；

将浸膏按1:15的体积比加水分散，用等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，乙酸乙酯萃取层减压浓缩，得到含有式(I)结构化合物的粗品；

将含有式(I)结构化合物的粗品用甲醇溶解，用样品：硅胶的质量比为1:2的比例拌样，干燥，用5倍于样品重量的硅胶湿法装柱，干法上样，用石油醚：乙酸乙酯体积比8:1的的洗脱剂洗脱，每100mL收集一份馏分，直至收集的馏分浓缩后干物质很少，改用石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比40:10:1的洗脱剂洗脱，同上，每100mL收集一份馏分，直至收集的馏分浓缩后干物质很少，改用石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比50:50:1的洗脱剂洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比50:50:1的洗脱剂洗脱部位的产品；

用制备型HPLC对硅胶柱层析的产品进行粗分：石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸的体积比为50:50:1洗脱部位浓缩干燥后的样品用纯甲醇溶解、离心，取上清液进样，每次进样10mL，色谱条件：50*250mm汉邦柱，流速30mL/min,流动相A：乙腈(ACN)，B:8％甲酸水，0-40min,85-90％ACN；40-50min,90-95％ACN；50-55min,95-100％CAN；检测波长：210nm,238nm,254nm,280nm,324nm.根据出峰情况分为5段：Y1，Y2，Y3，Y4，Y5,其中Y2部位的特征是在210nm,238nm,254nm,280nm,324nm下均有吸收，出峰时间为7～14min。

Y2部分再用制备型HPLC分离，色谱条件：50*250mm汉邦柱，流速30mL/min,流动相A：乙腈，B:5％甲酸水，0-50min,55％ACN；50-70min,55-75％ACN；70-90min,75-100％ACN；检测波长：238nm；根据出峰情况分为7段，Y2-1，Y2-2，Y2-3，Y2-4，Y2-5，Y2-6，Y2-7；Y2-5即为目标化合物，出峰时间为67～75min。

Y2-5再用半制备型HPLC纯化，色谱条件：Acuity10*250mm色谱柱，流速3mL/min；流动相A：乙腈，B:5％甲酸水，56％ACN等度洗脱，检测波长：238nm，收集主峰，浓缩干燥，得到过氧四环三萜5α,8α-epidioxy-3-(2-hydroxyacetoxy)-16a-hydroxy-24-methyllanosta-6,9(11),24(31)-trien-21-oicacid，即式(I)结构所示的化合物。

通过核磁对实施例2得到的化合物进行检测，其结构为式(I)所示结构。

实施例3

将30kg茯苓块投入500L提取罐，加入配制好的65％的乙醇300L，加热回流提取，沸腾时开始计时，提取两次，每次提取2小时；

将两次提取液合并减压浓缩，浓缩至无醇味时停止浓缩，将浓缩浸膏转移至坩埚；

将浸膏按1:16的体积比加水分散，用等体积的乙醚萃取3-5次，乙酸乙酯萃取层减压浓缩，得到含有式(I)结构化合物的粗品；

将含有式(I)结构化合物的粗品用甲醇溶解，用样品：硅胶的质量比为1:2的比例拌样，干燥，用5倍于样品重量的硅胶湿法装柱，干法上样，用石油醚：乙酸乙酯体积比11:1的的洗脱剂洗脱，每100mL收集一份馏分，直至收集的馏分浓缩后干物质很少，改用石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比45:10:1的洗脱剂洗脱，同上，每100mL收集一份馏分，直至收集的馏分浓缩后干物质很少，改用石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比45:50:1的洗脱剂洗脱，收集石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸体积比45:50:1的洗脱剂洗脱部位的产品；

用制备型HPLC对硅胶柱层析的产品进行粗分：石油醚：乙酸乙酯：冰醋酸的体积比为45:50:1洗脱部位浓缩干燥后的产品用纯甲醇溶解、离心，取上清液进样，每次进样10mL，色谱条件：50*250mm汉邦柱，流速30mL/min,流动相A：乙腈(ACN)，B:6％甲酸水，0-40min,85-90％ACN；40-50min,90-95％ACN；50-55min,95-100％CAN；检测波长：210nm,238nm,254nm,280nm,324nm.根据出峰情况分为5段：Y1，Y2，Y3，Y4，Y5,其中Y2部位的特征是在210nm,238nm,254nm,280nm,324nm下均有吸收，出峰时间为7～14min。

Y2部分再用制备型HPLC分离，色谱条件：50*250mm汉邦柱，流速30mL/min,流动相A：乙腈，B:5％甲酸水，0-50min,55％ACN；50-70min,55-75％ACN；70-90min,75-100％ACN；检测波长：238nm；根据出峰情况分为7段，Y2-1，Y2-2，Y2-3，Y2-4，Y2-5，Y2-6，Y2-7；Y2-5即为目标化合物，出峰时间为67～75min。

Y2-5再用半制备型HPLC纯化，色谱条件：Acuity10*250mm色谱柱，流速3mL/min；流动相A：乙腈，B:5％甲酸水，50％ACN等度洗脱，检测波长：238nm，收集主峰，浓缩干燥，得到过氧四环三萜5α,8α-epidioxy-3-(2-hydroxyacetoxy)-16a-hydroxy-24-methyllanosta-6,9(11),24(31)-trien-21-oicacid，即式(I)结构所示的化合物。

通过核磁对实施例3得到的化合物进行检测，其结构为式(I)所示结构。

实施例4

式(I)结构的化合物的抗肿瘤活性实验

细胞培养:

采用常规培养,培养液为含体积分10％小牛血清的RPMI-1640,青霉素10⁵U/L,,链霉素100mg/L，37℃，5％CO₂:饱和湿度培养箱中培养。

收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度，约为2×l0⁵/ml，接种于96孔板中，每孔100μL，在培养箱中孵育24h待细胞贴壁后，实验组加入不同浓度的式(I)结构的化合物溶液100μL培养(DMSO溶解)，空白对照组加入等量的DMSO，各组设置3个平行孔，置于培养箱中37℃5％CO₂孵育48h后，每孔加入MTT溶液20μL，置于培养箱中继续孵育4h，然后用酸化的10％SDS终止培养,除去上清液，每孔加入150μLDMSO，水平摇床震荡20min，待蓝紫色结晶充分溶解,在酶标仪570nm波长处测定吸光值，每组取平均值，重复三次实验。

测试结果为：

细胞存活率的计算方式为：细胞存活率％＝(实验组OD值/空白对照组OD值)×100％

通过MTT法对分离到的化合物进行体外细胞毒性检测，通过线性回归分析，计算IC50。结果表明：本发明提供的式(I)结构的化合物能够抑制人宫颈癌细胞(Hela)的活性，其IC50为18.26μM。

对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种化合物，具有式(I)结构，

2.一种式(I)结构的化合物的制备方法，包括：

1)对茯苓进行提取，得到浸膏；

2)将得到的浸膏进行萃取，得到含有式(I)结构化合物的粗品；

3)将含有式(I)结构化合物的粗品进行纯化，得到式(I)结构的化合物，

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中萃取所用的溶剂为乙醚、乙酸乙酯、乙酸甲酯、甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯和乙酸丙酯中的一种或几种。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：

3-1)将含有式(I)结构化合物的粗品通过柱色谱分离，得到柱色谱分离后的产品；

3-2)将柱色谱分离后的产品通过高效液相色谱分离，得到式(I)结构的化合物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3-1)柱色谱分离的洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯和醋酸。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3-1)中柱色谱分离的具体方法为：依次用石油醚与乙酸乙酯的体积比为(8～15)：1的溶液，石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(40～60)：10:1的溶液和石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(40～60)：(40～60):1的溶液洗脱，收集洗脱剂为石油醚、乙酸乙酯和乙酸的体积比为(40～60)：(40～60):1时的产品，即为柱层析分离后的产品。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述高效液相色谱分离采用的流动相为乙腈和4wt％～8wt％的甲酸水溶液。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述高效液相色谱分离为依次采用制备型高效液相色谱和半制备型高效液相色谱分离。

9.一种式(I)所示化合物在制备治疗癌症的药物中的应用，

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为宫颈癌。