CN1620305A - 诱导凋亡的方法和诱导凋亡的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供具有良好药理活性并且容易被消化道吸收的新型组合物或保健食品,该组合物包含巴西蘑菇提取物,具有诱导细胞凋亡活性。该组合物可以进一步包含药用载体。典型地,细胞为癌细胞。该组合物进一步包含分化诱导剂。优选的是,该分化诱导剂是维生素A衍生物。维生素A衍生物可以是维甲酸。上述巴西蘑菇提取物可包含分子量为100至2000的主要层析洗脱级分,该级分通过用热水提取巴西蘑菇子实体、透析获得的提取物并用层析法处理外部透析液而获得。
Description
技术领域
本发明涉及诱导凋亡的方法和用来诱导凋亡的组合物,其中的方法包括通过对伞菌(agaricus)进行提取而获得的物质。
背景技术
凋亡(程序性细胞死亡)在形态发生学、个体发生学以及维持成年人组织内环境稳定等中具有重要作用,例如消化道表皮细胞的更新、识别自身抗原的T细胞溶解以及细胞过度生长后在一些特殊位点出现细胞死亡,形成具有特殊层状结构的中枢神经系统。通常,细胞凋亡需要新蛋白合成。诱导细胞凋亡的基因被称作自杀基因。
通常,癌细胞通过一系列基因突变获得无限复制能力。近期,关于凋亡的研究有了新进展,凋亡的分子机制也变得清楚。一种原髓细胞性白血病细胞系-HL-60细胞系被广泛用作筛选诱导凋亡剂的模型。HL-60细胞也是筛选分化诱导剂的合适模型。当HL-60细胞被诱导分化时,丢失肿瘤细胞不断复制的能力(去癌阶段),使细胞生长受到抑制。凋亡和分化诱导被认为是肿瘤治疗的有效措施。一些特异的抗癌物质和维甲酸衍生物已经应用于临床。同时也发现了一些来源于植物的具有抗癌作用的物质。近些年,研制了一种长春花碱抗肿瘤药物喜树碱(生物碱)和其类似物,并且已经获得临床数据。
已知的一种蘑菇科担子菌-巴西蘑菇(Agaricus blazei Murill),一般地称作伞菌(agaricus mushroom),具有抗肿瘤活性。伞菌粉末或者各种提取物常作为保健食品食用。已经有许多关于伞菌中大分子物质,如多糖,包括β-D-葡聚糖,和蛋白质等活性的报道。然而,通常大分子蛋白质和多糖并不能被消化道完全吸收。至今,伞菌含有的细胞体成分很难被消化。因此,希望可以从伞菌中提取得到一种具有良好生物活性、可以像药物和保健食品那样口服吸收的物质。
发明内容
已经证实伞菌提取物具有抑制细胞生长活性、分化诱导活性和凋亡诱导活性,并且已经得到具有良好生物活性并能像药物和保健食品那样口服的物质。
本发明涉及诱导细胞凋亡的组合物,组合物包括伞菌提取物。
优选的是,该组合物进一步包括药用载体。
优选的是,该细胞是癌细胞。
优选的是,该组合物进一步包括分化诱导剂。
优选的是,该分化诱导剂是维生素A衍生物。
优选的是,该维生素A衍生物是维甲酸。
该维生素A衍生物还可以是类胡萝卜素。
本发明还涉及一种诱导细胞凋亡的方法,该方法包括给受试者施用含伞菌提取物的组合物的步骤。
优选的是,该组合物进一步包含药用载体。
优选的是,这种细胞是癌细胞。
优选的是,该组合物进一步包括分化诱导剂。
优选的是,该分化诱导剂是维生素A衍生物。
优选的是,该维生素A衍生物是维甲酸。
通常,提取物可以通过热水浸泡伞菌子实体制备。
伞菌提取物包含分子量为100至2000的主要层析洗脱级分,该级分通过用热水提取伞菌子实体、透析获得的提取物并对透析物(dialyzate)进行层析而获得。
可替换的方案是,伞菌提取物包含作为有效成分的透析物,该透析物通过下列步骤获得:用热水提取伞菌子实体,将上述提取物和乙醇混合,离心分离沉淀和上清液,将上清液和乙醇混合,离心分离沉淀和上清液,最后将沉淀溶解在稀释水(diluted water)中,进行透析。
伞菌提取物可以和药用载体适当混合。本研究领域的技术人员熟知这种药用载体,这些载体包括但不局限于以下载体:缓冲液,如Ring’s溶液、Hank’s平衡盐溶液或者缓冲生理盐水;脂肪酸,如芝麻油;合成的脂肪酸酯,如油酸乙酯或者甘油三酯;糖,如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇;植物淀粉,如从谷类、小麦、水稻或者土豆中获得的淀粉;纤维素,如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲纤维素钠;橡胶,如阿拉伯树胶或黄蓍胶;蛋白质,如明胶或者胶原;交联的聚乙烯吡咯烷酮;琼脂;藻酸和其盐等等。
本发明还涉及使用伞菌提取物来制备具有诱导癌细胞凋亡活性的组合物。
附图简述
图1是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的生长抑制作用;
图2是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的生长抑制作用;
图3是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的生长抑制作用;
图4是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的生长抑制作用;
图5是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)对白血病细胞系HL-60细胞的生长抑制作用;
图6是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的生长抑制作用;
图7是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的分化诱导作用;
图8所示为一种分化诱导剂(ATRA)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的分化诱导作用;
图9是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的诱导凋亡作用;
图10是本发明效应的示意图,所示为伞菌提取物(ABMK-22)和分化诱导剂(维甲酸)共同作用于白血病细胞系(HL-60细胞系)时的诱导凋亡作用;
图11所示为分化诱导剂(VD3)对白血病细胞系(HL-60细胞系)的分化诱导作用;
图12所示为伞菌提取物(ABMK-22)中某一成分对白血病细胞系(HL-60细胞系)的生长抑制作用;
图13所示为伞菌提取物(ABMK-22)中某一成分对白血病细胞系(HL-60细胞系)的诱导凋亡作用;
图14所示为伞菌提取物(ABMK-22)中某一成分的免疫活化活性。
图15所示为伞菌提取物(ABMK-22)中某一成分的免疫活化活性。
图16所示为溶链菌(Picibanil)的免疫活化活性。
实施本发明的最佳模式
以下将描述具有诱导细胞凋亡作用的来源于伞菌的物质和根据本发明制备该组合物的方法。
本发明所使用的伞菌是天然和人工培养的伞菌的子实体或者伞菌菌丝体。方便起见,还可以使用商业来源的干燥伞菌作为提取原料。以上伞菌可不经处理、剪碎或者磨成粉末,用于制备伞菌提取物。
伞菌提取物是包括使用水、低级醇等作为溶剂获得的伞菌源性成分的伞菌的提取物。典型地,使用水、乙醇、含水乙醇等作为溶剂。可以使用任意溶剂,只要该溶剂提取到的级分具有诱导细胞凋亡的作用。通常,干燥的伞菌或其粉末用2至10倍其体重的溶剂进行提取。用作提取的溶剂包括水、乙醇、丙醇、丁醇、丙酮、1,3-丁二醇、乙酸乙酯、己烷、二氯甲烷、甲醇或其混合物。
典型地,使用热水作为溶剂制备伞菌提取物。使用热水从伞菌中提取来制备伞菌提取物。
通常用干的子实体与其5-10倍重量的水混合制备伞菌提取物,热回流(heat-refluxing)上述混合物1至3小时。对热回流剩余的残渣反复进行回流操作。用冷冻干燥、喷雾干燥或者其他相关领域技术人员所熟知的一种方法,对热水提取得到的溶液加以干燥,获得干燥产品(以下称作干燥物A)。干燥物A和5-20倍其重量的水相混合。然后,上述溶液置于透析管中透析10-15小时,重复几次。将上述制备的透析液冻干获得干燥产品(以下称作干燥物C),干燥物C具有诱导细胞凋亡的活性。
然后,透析管中的剩余溶液进一步和自来水透析20~40小时,用蒸馏水透析两次,每次数小时,最后通过前述方法获得透析管中剩余溶液的干燥产品。这样即可制备得到具有诱导细胞凋亡活性的干燥产品(以下称作干燥物B)。
上述得到的干燥物C溶于10倍于其重量的蒸馏水,用蒸馏水作为洗脱液进行层析,获得20mL级分。得到的级分通过凝胶过滤方法分离,中间级分主要是分子量约100至2000的分子。根据本发明,该分子具有诱导细胞凋亡的作用。
这些级分进一步通过利用ODS(十八烷基硅烷化硅胶)的反相层析、利用DEAE-TOYOPEARL 650的离子交换层析等,证实了包括多种成分,例如精氨酸、赖氨酸、甘露醇等。
用上述方法通过热水提取得到的溶液和等量的乙醇混合。将混合物离心,分离沉淀和上清液。得到的上清液进一步和1至3倍体积的乙醇混合。对混合物进一步加以离心得到沉淀。沉淀溶解于蒸馏水并进行透析。透析液是低分子量级分,具有诱导细胞凋亡的活性。
上述制备的伞菌提取物或其级分具有诱导细胞凋亡的活性,可以单独或者协同其它各种载体作为口服药物。制备的伞菌提取物或其级分具有诱导细胞凋亡的作用,可以单独或者协同其它食品作为保健食品。
通常,本发明中的组合物可以和药用载体一起口服(例如生理盐水、缓冲生理盐水、葡萄糖、水等)。本发明的组合物可以单独或者协同其它药物和食品一起服用。
本发明的组合物可以口服或者非肠胃道给药。肠道外给药包括局部给药、皮肤给药、动脉内给药、肌肉给药、皮下给药、髓内给药、池内给药、室内给药、静脉给药、腹腔给药或者鼻内给药。优选的给药方式是,本发明的组合物通过静脉注射或动脉内注射给药。根据本发明,该组合物的给药和制剂的细节可以参照本领域教科书“REMINGTON药学”(Maack Publishing Co.,Easton,PA)中所述。
口服的组合物包括本领域技术人员熟知的、适用于给药的药用载体。这种载体可以使组合物制备为片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、混悬液、悬浮液或其它适合患者消化吸收的制剂。
本发明的组合物中包括对于诱导细胞凋亡有效量的伞菌提取物。本领域的技术人员能全面得理解“药理学有效量“的概念。本领域的技术人员能够充分理解术语“药理学有效量”,它指的是足以减轻癌症患者症状的伞菌提取物的量。因此药理学有效量指的是足够诱导细胞凋亡的量。
证明药理学有效量的有用方法是衡量癌症患者症状减轻的程度。伞菌提取物的给药量取决于个体的健康状况,可以优化使用剂量,从而达到所需效果。这是本领域技术人员确定药理学有效量的常规方法。
药理学有效量可以最先通过体外细胞培养物或者合适的动物模型实验进行评估。然后,根据这些信息可以确定应用于人类的量和给药途径。
作为指导性建议,而非加以限制,根据本发明给成年人施用级分的干燥固体来诱导凋亡时,足以诱导细胞凋亡的量为每人每天0.1至30.0克的剂量。优选每人每天3至15克。
具有诱导细胞凋亡活性的伞菌提取物或者其级分可以和一种或多种食品按照足以发挥其活性的比例混合。以本领域的技术人员已知的形式,通常以粉末的形式一种或多种食品和具有免疫活化活性的提取物混合。混合物可以用作液体食品,依赖于其用途或个人喜好。混合物还可以制备成胶囊(如硬胶囊、软胶囊)、片剂、丸剂,也可以制备成粉剂、颗粒剂、茶叶、茶包或者糖果。
以下,将进一步通过实施例来描述本发明。下面的实施例只是示例性的说明本发明,并不对本发明做任何限定。
实施例
(实施例1)
2L蒸馏水和300g的Kyowa巴西蘑菇混合,加热至沸腾,回流2小时。上述溶液过滤得到过滤液(热水提取液)和残渣。再将2L的蒸馏水和残渣混合,加热至沸腾,回流2小时制备热水提取物和残渣。上述步骤可以重复一次。得到的过滤液合并冻干,制备得到干燥物A[153克:提取率(回收)51%]。
500mL的蒸馏水和50克干燥物A混合并置于透析管(Spectra/PoreMembrane 50×31,内径8mm,长30厘米,FE-0526-65)透析。混合物和3升蒸馏水透析12小时。透析液冻干制备得到干燥物C(27克:提取率53%)。透析管中剩余溶液进一步和热水透析30小时,然后和蒸馏水透析两次(4小时1次,共8小时)。然后透析管中剩余溶液冻干,制备得到干燥物B(11克:提取率22%)。接下来,3克的干燥物C溶于30mL蒸馏水并用TOYOPEARLHW40C(内径40mm,直径420mm)进行层析。洗脱液主要是蒸馏水。每一级分用20mL的整数倍体积的洗脱液洗脱得到级分1至30。这些级分根据薄层层析结果分为以下5组。级分1至11(75mg,2.5%);级分12至15(920mg,30.7%);级分16至17(1570mg,52.3%);级分18至19(270mg,9%);和级分20至28(97mg,3.2%)。
级分16(以下称为1SY-16)的红外线(IR)吸收光谱分析数据如下。
级分16:红外光谱(KBr)3390,3325,3285,2940,2920,1641,1634,1622,1615,1600,1595,1405,1394,1084,1020:分子量(凝胶过滤估算)100至2000Da。
(实施例2)
进行和实施例1中所述类似的热水提取,得到6L的合并过滤液(用热水提取的溶液)。减压条件下将滤液浓缩至1L,加入1L乙醇并混合,分离多糖。将混合物离心,分离沉淀和上清液。将3L的乙醇进一步和上清液混合,离心得到沉淀,沉淀溶解于蒸馏水并透析。透析液加以冻干,获得称作ABMK-22的粉末。
(实施例3)
观察了伞菌热水提取物(ABMK-22)冻干粉的细胞生长抑制活性(试验1)、细胞分化诱导活性(试验2)和细胞凋亡诱导活性(试验3)。
通过以下方法进行生物活性试验。
1、细胞生长抑制活性(试验1):分析中,采用胶原凝胶滴包埋的培养物-药物敏感性实验(CD-DST方法),并进行细胞计数。
参考H.Kobayashi等人(国际癌症学杂志11:449-455,1997)的方法进行CD-DST试验。
简要地说,该方法如下所述进行:首先,将细胞(HL-60细胞系)悬浮液和胶原(如I型胶原(Cellmatrix Type CD,Nitta Gelatin Inc.))、重构缓冲液、培养基(如浓缩F-12培养基)在冰上混合,将受试细胞包被在胶原中。上述混合液置于多孔培养板中,每孔1000至10000个细胞(需要大约3滴胶原凝胶滴),于CO2孵箱37℃培养过夜。然后,受试药物以预先确定的浓度加入各培养孔,培养24小时。用缓冲液洗板,除去受试药物。加入培养基,继续培养7天。用中性红对胶原中的细胞集落进行染色。每个胶原滴用10%的中性甲醛缓冲液固定,水洗、干燥,最后图像分析。通过癌细胞集落增加的体积和中性红染色差异计算药物对细胞的生长抑制作用和ABMK-22给药组和对照组的相对生长率。CD-DST方法已发展成为一种检测实体瘤药物敏感性试验方法。然而,由于该方法是生长试验方法,因此可以用来作为一种衡量细胞生长状态的方法。
细胞计数板计数的方法参照Rinsho Kensaho Teiyo所描述的方法(Kanai临床试验医学手册),第30版.(1993年8月20日;Kanehara& Co.,Ltd.;Tokyo)。
2、细胞分化诱导活性(试验2):通过测定硝基四唑蓝(NBT)还原力进行评价。
按照S.J.Collins等人(Int.J.Cancer:25,213-218(1980))的方法进行NBT还原力试验。方法简述如下:收集大约20000个细胞,用RPMI-1640培养基洗细胞。然后,将细胞悬于RPMI-1640培养基(含有0.1%NBT和100ng/mL的佛波酯)中,于37℃培养40分钟。显微镜下观察,若细胞中含有兰黑色沉积物为分化细胞。
3、凋亡诱导活性(试验3)。通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)介导的缺口末端标记法(TUNEL方法)进行评价。Gavrieli等人在1992年报道了组织片TUNEL凋亡鉴定方法。(Yael Garvrieli et al.,细胞生物学杂志,119卷,3期,1992年11月,493-501)。TUNEL方法可以在单独细胞水平观察各种发病状态下的细胞凋亡,比较细胞的形态学改变。按照Gavrieli等的方法(同上),用原位凋亡检测试剂盒wako(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)检测了HL-60细胞系的凋亡情况。
4、细胞生长抑制活性的测定结果(试验1)
由HL-60细胞系的试验结果发现,CD-DST方法不适用于观察悬浮细胞的生长状态,因此,用细胞计数方法观察对细胞的生长抑制。
首先,绘制各浓度ABMK-22作用下的HL-60细胞系的生长曲线,细胞的最初数量统一为200,000个/mL,ABMK-22的终浓度分别为0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、2.5、3、4和5mg/mL,四天后进行细胞计数。
图1所示为各浓度ABMK-22作用的HL-60细胞的生长曲线。图1中每个符号表示各浓度ABMK-22作用(图1下符号表示各浓度的ABMK-22)的HL-60细胞的细胞个数(个数/ml)。图2至5表示培养第一、第二、第三、第三和第四天的细胞数量,每条曲线表示各浓度ABMK-22作用的HL-60细胞在上述四天培养中的生长情况。
如图2所示,培养第一天,ABMK-22在1mg/mL浓度以下不影响HL-60细胞生长。ABMK-22在2mg/mL以上剂量依赖性地抑制HL-60细胞生长。
如图3所示,培养第二天,ABML-22在0.25mg/mL浓度以上和对照组相比剂量依赖性地抑制HL-60细胞生长。
如图4所示,培养第三天,ABML-22在0.1mg/mL浓度和对照组相比抑制HL-60细胞生长,抑制率达到50%左右。生长受到抑制的细胞从形态学上观察也出现细胞死亡。0.25mg/mL或更高浓度的ABMK-22作用下,活细胞数量显著降低。显示了特异的细胞杀伤效应。
如图5所示,培养第四天,ABML-22在0.1mg/mL浓度时抑制HL-60细胞生长,和对照组相比抑制率达到84%左右。从形态学上观察,生长受到抑制的细胞也出现细胞死亡。在培养的第三天,0.25mg/mL或更高浓度的ABMK-22显示了特异的对HL-60细胞的杀伤效应。
图6表示的是在各培养时间点各组细胞数量和对照组相比(T/C%)的结果。纵轴表示相对于对照组的抑制细胞生长效应,横轴表示各浓度的AMBK-22。如图6所示,ABMK-22时间依赖性地抑制HL-60细胞生长。2mg/mL或者更高浓度的ABMK-22在培养第一天剂量依赖性地抑制细胞生长(实心圆),1mg/mL或者更高浓度ABMK-22在培养第二天同样出现上述效应(空心方块)。低浓度ABMK-22在培养第三天(空心三角形)和第四天(空心圆)对HL-60产生抑制细胞生长作用,这种抑制作用被证实是由于细胞死亡。
5、细胞分化诱导活性的测定结果(试验2)
在各浓度ABMK-22作用下,HL-60细胞培养四天后观察ABMK-22的分化诱导活性。图7表示NBT还原能力结果,NBT还原能力是各浓度ABMK-22对HL-60细胞诱导分化能力的反应。图7中,ABMK-22浓度依赖性地增加NBT阳性细胞。在4mg/mL浓度大约33%的活细胞发生分化,这一浓度相当于10-8到10-7mol/L的全反式维甲酸(ATRA)的诱导分化活性(图8)。图8表示用同样方法测定的ATRA对细胞的分化诱导活性。
6、诱导细胞凋亡活性的测定结果(试验3)
如以上结果所示,ABMK-22即使在低浓度也能呈时间依赖性地杀伤细胞。因此认为ABMK-22诱导细胞凋亡。通过TUNEL方法证实了ABMK-22的诱导凋亡活性。
根据以上ABMK-22作用1天后的结果(见图2),选择了1mg/mL(细胞生长和对照组相似)和5mg/mL(细胞生长受到显著抑制)的剂量。ABMK-22作用一天后观察诱导细胞凋亡的活性。图9表示各试验组的结果。如图9所示,当1mg/mL浓度的ABMK-22作用HL-60细胞时,诱导细胞凋亡的活性和对照组相比的p值小于0.053。5mg/mL浓度的ABMK-22显著诱导细胞凋亡,和对照组相比p值小于0.001(Student t检验)。基于上述结果,ABMK-22杀伤HL-60细胞是因为其诱导细胞凋亡的作用。
(实施例4)ABMK-22和分化诱导剂协同作用的效应
已知上述激活型维生素D3制剂(VD3)和全反式维甲酸(ATRA)具有诱导HL-60细胞系分化的作用。
VD3诱导HL-60细胞分化为单核细胞和巨噬细胞系,ATRA诱导HL-60分化为粒细胞。图10表示通过NBT还原力和各浓度ABMK-22、10-9和10-11mol/L浓度的ATRA协同作用HL-60细胞的分化诱导活性。如图10所示,ABMK-22协同低浓度ATRA(10-9到10-11mol/L)时可以浓度依赖性地诱导分化,并且ATRA在10-9mol/L时可以显著增强ABMK-22的分化诱导活性。
图11表示通过NBT还原试验观察10-9到10-11mol/L浓度的1α,25(OH)2D3(维生素D3的活性形式,以下称作VD3)单独作用于HL-60细胞时的分化诱导活性。如图所示,当VD3在10-10mol/L或更低时,VD3单独作用HL-60细胞并不诱导细胞分化。进一步发现,如图8所示,当ATRA在10-9mol/L或更低时,ATRA不诱导细胞分化。
癌细胞的生长、分化、和凋亡互有关联。一种物质对细胞的生长抑制作用可以中止细胞周期。细胞生长抑制后,可诱导分化。凋亡直接诱导死亡信号。细胞生长、分化和凋亡只是在转化的方向上有差异。因此,某一物质数量、特性上的差异,可能会同时出现细胞生长抑制、分化或者凋亡的情况。
VD3和ATRA已经在临床上用于癌细胞的分化诱导治疗。然而,由于其不良反应,VD3主要作为外用药物使用,而ATRA仅作为治疗APL(一种基因突变明显的癌症)使用。
此处的结果,尤其是图8和图10显示在低浓度分化诱导剂作用下不能产生分化诱导作用,但是这些物质协同其他物质(尤其是伞菌)时可显著诱导分化。进一步发现,ABMK-22协同维生素A样物质(类胡萝卜素)可显著诱导分化。本发明的结果证实了这一点。
(实施例5)ABMK-22中的成分的诱导凋亡活性
为确定实施例2中制备的ABMK-22中具有诱导细胞凋亡活性的成分,ABMK-22进一步被纯化分离。制备得到的成分用第三部分描述的方法试验。通过上述实施例3中检测凋亡活性的试验来观察制备得到的成分的诱导凋亡活性(试验3)。
1、ABMK-22中成分的纯化分离和结构分析。
实施例2中制备的ABMK-22(大约13.5毫克)溶于30ml蒸馏水,用ODS(50毫米id×300nm)作为载体进行反相层析。洗脱液是蒸馏水、5%乙醇/水、70%甲醇/水和100%甲醇。使用上述洗脱液ABMK-22中的成分一次被洗脱。用200ml整数倍的洗脱液对每一级分洗脱。根据薄层层析的结果,每种级分分为以下5组:ABMK2201(18.7g,93.5%);ABMK2202(445mg,2.2%);ABMK2203(36.9mg,0.18%);ABMK2204(3.5%);和ABMK2205(91.3mg,0.46%)。然后每50毫克ABMK2202用5%甲醇通过高效液相(HPLC,ODS体积20mmid×250mm)分离,分别得到ABMK6873(34.7mg,0.17%)和ABMK0415(2.2mg,0.011%)。
ABMK6873和ABMK0415用以下条件进行质谱和核磁共振分析。根据结果,两种成分被确定为是β-N-(γ-谷酰基)-4-甲酰苯肼(以下式I)和N-(3-羧丙基)-2-甲酰基-5-羟基甲吡咯(以下式II)
质谱
峰成分的冻干粉级分和millo-Q水混合,得到10mg/mL的水溶样品。使用的仪器是JEOL HX110/110A串联型质谱仪。质谱方法是FAB、EI、CI和HRFAB,条件是阳性测定模式(FAB、EI、CI),阴性测度模式(FAB、CI)和阴性测定模式(HRFAB),FAB、EI、CI的分辨能力为1000,HRFAB的分辨能力为5000。
(1)FAB-MS
甘油用作基质,进样时和样品以1∶1的比例混合,立即测定。碱离子混合物用于阳性模式,碘化铯混合物用于阴性模式,上述条件用作质谱校正。
(2)EI-MS和CI-MS
样品本身作为离子源。对于CI,异丁烷作为离子气体。
(3)HRFAB-MS
PEG-500用作质谱校正样品。甘油和样品进样时1∶1混合,加入适当数量的PEG-500,然后在阴性模式迅速测定。在PEG-500双峰和中间的一个目的峰([M-H]-=210)间实行质谱校正。
核磁共振分析
用Bruker DMX500(1H 500MHZ)和JEOL JNM-A400核磁共振仪进行NMR分析。质谱分析后,样品冻干后溶于0.3ml重水中进行测试。进一步使样品溶于氯仿进行分析。
分析结果
ABMK0415:
上述质谱图谱中,含有分子量211的峰。因此,确定化合物的分子量是211。阴极模式的HRFAB-MS测定具有更好的灵敏度,图谱中具有精确的峰(m/z=210.0757),这表面化合物分子式符合C10H12O4N(-1.0mmu)。因此,峰I表示的分子式是C10H18O4N。
为了获得化合物的结构式进行了核磁共振分析。作为HMBC图谱上的交叉峰信息的分析结果,确定了式II表示的结构。
ABMK6873:
FAB-MS图谱中,m/z266处出现MH+离子。EI-MS图谱中,M+离子位于m/z 649(C20H11F12N3O3),[M-H2O]+离子位于m/z331。通过1H-NMR,确定了醛质子、p-取代芳香环和谷氨酸残基-CO-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH结构。两种芳香质子去屏蔽后,在中性溶液中的紫外吸收在313nm,在碱性溶液中的吸收峰在385nm。在m/z136(C7H8N2O)处产生的重要吸收峰和p-甲酰苯肼结构一致。
UVλ120 MAXnm(logε);231(3.79),313(4.19);+NaOH 248(3.76),385(4.30);+HCl 231(3.79),313(4.19):FAB+MS m/z(相对强度);266(MH+,100),201(62),166(16),137(20),136(15),132(39),121(16);1HNMR(400MHz,D2O)9.73(1H,s,-CHO),7.91(2H,d,J=8.5Hz),7.03(2H,d,J=8.5Hz),3.91(1H,t,J=6Hz,Hα),2.67(2H,m,Hγ),231(2H,m,Hβ)
2、ABMK-22中的成分的凋亡诱导活性
按照第三部分描述的方法观察ABMK0415和ABMK6873冻干粉末的诱导凋亡活性。ABMK0415的浓度范围在2.07×10-6M到2.07×10-4M之间。ABMK6873的浓度范围在2.7×10-6M到2.7×10-4M之间。结果如图12和13所示。
图12表示在各浓度ABMK0415和ABMK6873作用下的HL-60细胞的生长曲线。图12中的符号表示在各浓度级分作用下的细胞数目(个/ml),图12左上部表示了各符号具体代表的浓度。空心圆表示放线菌素D(ACD)阳性对照组,实心圆表示未给药的阴性对照组。
如图12所示,ABMK0415和ABMK6873剂量依赖性地抑制HL-60细胞生长。尤其是ABMK0415在2.07×10-4M、ABMK6873在2.7×10-4M浓度时显著抑制HL-60细胞的生长。
图13表示ABMK0415在2.07×10-4M、ABMK6873在2.7×10-4M浓度作用HL-60细胞两天后,凋亡呈阳性结果的比例。在图13中,横轴表示各样品组,纵轴表示发生凋亡的细胞比例。如图13所示,ABMK0415在2.07×10-4M时凋亡细胞比例大约是35%,而ABMK6873在2.7×10-4M浓度时,凋亡比例大约是70%。因此认为ABMK0415和ABMK6873具有凋亡活性。
(实施例6)ABMK-22中的成分的免疫活化活性评价
评价了ABMK0415和ABMK6873的免疫活化活性。
免疫系统包括树状细胞。树状细胞也可以被称作树树枝状细胞(arborescent cell)、树状白细胞或者D细胞。这是具有树状形态细胞的常用名,树状形态细胞源于髓细胞,分布于除脑以外的各种器官和组织。这一细胞群包括淋巴树状细胞、朗罕氏细胞、帘(veil)细胞、连接细胞和interstitional细胞。外源性物质侵入体内伴随有炎症反应,细胞吞饮外源物质,并且从局部沿afferens管道进入相关淋巴结或者经由血流进入脾脏。细胞进入T细胞依赖区域后,以和II型抗原结合的方式递呈抗原,活化特异性T细胞,从而引起免疫应答。
1、材料和方法
1.1.材料
志愿者同意的前提下,以两个健康志愿者的血液为样品。
1.2.分离外周血单核细胞(PBMC)
通过Ficoll-Paque密度梯度离心方法从肝素化的全血中分离PBMC。
1.3.待测样品
ABMK0415和ABMK6873作为待测样品。ABMK0415和ABMK6873分别溶于细胞培养基中(含10%FCS和5%人AB型血清的RPMI-1640),两者的终浓度为200mg/mL。上述混合物用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌得到待测样品。
1.4.免疫活化活性的观察
通过从体外观察化合物诱导人外周血单核细胞为树状细胞(DC)的能力大小来确定新化合物的免疫活化活性。
单核细胞在二氧化碳孵箱中于培养皿中培养1小时,使培养皿中粘附大量单核细胞。在500U/mL的GM-CSF和IL-4存在情况下,上述细胞用含5%人AB型血清的RPMI-1640培养基培养。
培养过程中使用的培养皿直径为3.5cm。在培养第六天加入溶链菌制剂和新化合物,溶链菌制剂和新化合物的终浓度分别为0.1KE/mL和200μg/mL。溶链菌制剂(Chugai Pharmaceutical Co.,Ltd.)具有树状细胞诱导活性,作为阳性对照。含5%AB血清的RPMI-1640培养基培养组作为阴性对照。
培养第七天收集所有培养皿中树状细胞。使用抗CD80单克隆抗体(BD Bioscience公司)通过流式技术分析树状细胞表面抗原。Studentt检验分析组间显著性差异。
2、结果
待检样品中,培养开始后第六天加入ABMK0415和ABMK6873后可以显著增加CD80分子的表达。图14和图15表示了这一诱导作用。
图14表示ABMK6873的检测结果。图14中上面部分表示未加待测样品的细胞的流式细胞技术分析结果。图14中下面部分表示ABMK6873作用的细胞的流式细胞分析结果。图中横轴表示荧光强度(10g),纵轴表示细胞数量,M1表示设定为对照抗体(IgG1FITC)数值的区域。
如图14所示,ABMK6873作用单核细胞后,大约92%树状细胞CD80表达增加(测定的数值未显示)。因此,ABMK6873可以活化树状细胞。CD80表达可见于M1区域的树状细胞。
类似地,图15表示ABMK0415的检测结果。图15中上面部分表示未加待测样品的细胞的流式细胞技术分析结果。图15中下面部分表示ABMK0415作用的细胞的流式细胞技术分析结果。图中横轴和纵轴的含义和图14中所表示的一致。
如图15所示,加入ABMK0415后,20%的树状细胞的CD80表达增加。ABMK0415可以诱导树状细胞活化。
另一方面,图16表示树状细胞培养第六天加入溶链菌制剂后收集的单核细胞结果。溶链菌制剂被认为具有诱导树状细胞活性。图16中上面部分表示未加溶链菌制剂的细胞的流式细胞分析结果。图16中下面部分表示26%树状细胞的CD80表达增加,这表明溶链菌制剂诱导了树状细胞活化。
图14、15和16表示ABMK0415和ABMK6873都具有树状细胞诱导活性,尤其是ABMK6873的树状细胞诱导能力强于溶链菌制剂。
工业适用性
本发明提供了诱导癌细胞凋亡的组合物和包含所述组合物的保健食品。伞菌提取物中包含抑制白血病细胞系生长和诱导凋亡的成分。因为凋亡和分化的诱导是肿瘤的重要治疗措施,所以可以提供肿瘤患者的有效治疗药物和食品。
Claims (14)
1.一种诱导细胞凋亡的组合物,其包括伞菌提取物。
2.根据权利要求1的组合物,进一步包括药用载体。
3.根据权利要求1的组合物,其中细胞是癌细胞。
4.根据权利要求1的组合物,进一步包括分化诱导剂。
5.根据权利要求4的组合物,其中分化诱导剂是维生素A衍生物。
6.根据权利要求5的组合物,其中维生素A衍生物是维甲酸。
7.根据权利要求1的组合物,其中伞菌提取物是通过以下步骤获得的透析物:
用热水提取伞菌子实体;
将提取物和乙醇混合,离心分离沉淀和上清液;
将上清液和乙醇混合,离心分离沉淀和上清液;
将沉淀溶解于蒸馏水,进行透析。
8.诱导细胞凋亡的方法,该方法包括给受试者施用含伞菌提取物的组合物。
9.根据权利要求8的方法,其中组合物进一步包括药用载体。
10.根据权利要求8的方法,其中细胞是癌细胞。
11.根据权利要求8的方法,其中组合物进一步包括分化诱导剂。
12.根据权利要求11的方法,其中分化诱导剂是维生素A衍生物。
13.根据权利要求12的方法,其中维生素A衍生物是维甲酸。
14.伞菌提取物在制备用于诱导癌细胞凋亡的组合物中的用途。
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