CN102336835B - 白细胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及白细胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途。更具体而言，本发明涉及一种包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其选自：(1)IL2_mIL3_m2SON3，(2)IL2_mIL3_m3SON3或(3)IL2_mIL3_m1SON3，其中IL2_m是IL2的突变改型的衍生片段，IL3_m2是IL3的突变改型的衍生片段2，IL3_m3是IL3的突变改型的衍生片段3，IL3_m1是IL3的突变改型的衍生片段1，SON3是DNA结合蛋白SON的衍生片段且富含碱性氨基酸。本发明还涉及上述融合蛋白的用途、编码核苷酸序列、包含所述编码核苷酸序列的重组体、包含所述重组体的工程细胞或工程菌、生产所述融合蛋白的方法、所述融合蛋白的复合物及所述复合物的用途。本发明为杀伤和/或清除一般白血病细胞以及白血病干细胞提供了一种全新机理的药物。

Description

白细胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及白细胞介素3衍生片段的融合蛋白及其用途。更具体而言，本发明涉及一种包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其选自：(1)IL2_mIL3_m2SON3，(2)IL2_mIL3_m3SON3或(3)IL2_mIL3_m1SON3，其中IL2_m是IL2的突变改型的衍生片段，IL3_m2是IL3的突变改型的衍生片段2，IL3_m3是IL3的突变改型的衍生片段3，IL3_m1是IL3的突变改型的衍生片段1，SON3是DNA结合蛋白SON的衍生片段且富含碱性氨基酸。特别地，本发明还涉及上述融合蛋白的用途、编码核苷酸序列、包含所述编码核苷酸序列的表达重组体、包含所述重组体的工程细胞或工程菌、生产所述融合蛋白的方法、所述融合蛋白的复合物及所述复合物的用途。

背景技术

攻克癌症一直是医学界面临的重大挑战。传统的化疗与放疗有两个重大缺陷：一个是药物严重的毒副作用，第二个是治疗后容易复发。为了克服这两个缺陷，首先需要靶向杀灭肿瘤细胞。肿瘤靶向治疗是利用特异性的载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位，把药物的杀伤作用或治疗效应尽量限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不伤害正常细胞、组织或器官，从而提高疗效、减少毒副作用，具有高特异性、高效性以及低毒副作用的特点。

靶向治疗的主要特点是特异性结合，本发明根据一般白血病细胞的表面富集的受体设计特异性结合的配体避免对正常细胞的损伤。IL2R在一般白血病细胞表面高表达并富集，在正常的血液细胞表面低表达，甚至不表达。因此，IL2R的配体IL2可以成为特异性结合白血病细胞的“靶向头”。

其次需要靶向杀灭肿瘤干细胞。肿瘤生长是肿瘤组织中极少见的肿瘤干细胞增殖的结果。肿瘤干细胞具有自我增殖和自我分化能力，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用，对一般的化疗与放疗不敏感，是肿瘤复发的“源泉”。如要减少肿瘤复发，相对彻底地治愈恶性肿瘤，则必须清除肿瘤干细胞。目前，肿瘤干细胞已经在多种肿瘤组织中得到了验证。如白血病、乳腺癌、脑癌、前列腺肿瘤、室管膜瘤、皮肤癌等；以肿瘤干细胞为靶标治疗肿瘤是治愈肿瘤的新希望。

急性髓性白血病中的肿瘤干细胞又称之为白血病干细胞。白血病干细胞具有自我更新能力和分化能力，并且基本处于休眠状态。白血病干细胞在细胞生物学方面不同于较成熟的白血病幼稚细胞，它对常规的化疗无反应。这可能是白血病多药耐药、早期复发的主要原因。因此，特异地针对白血病干细胞的治疗策略，将为AML患者提供更有效的治疗。

白血病干细胞表面包含有区别于正常造血干细胞的特异性表面标志CD123(IL-3Rα)。以IL-3Ra为靶点为选择性清除白血病干细胞的有前途的治疗策略。IL3R的配体IL3可以成为特异性结合白血病干细胞的“靶向头”。

通过靶向白血病细胞和白血病干细胞，将药物的毒性作用限制于这两种细胞，可以避免对正常细胞的伤害。

绿脓杆菌毒素PE作为人体异源的毒素蛋白质不应直接应用于导入人体血循环。这是由于其产生的细胞杀伤作用不具备肿瘤细胞特异性，对人体可造成严重的毒副作用；同时其作为人体异源蛋白还具有很强的免疫原性，不仅可导致抗体的迅速生成使之被中和失活，并可引起人体发生严重的过敏反应，甚至休克与死亡。因此需要把毒素导入血循环的方式由毒素蛋白质改为相应的毒素的编码基因，从而最大限度地避免毒素蛋白质导入人体血循环时所造成的严重的毒副作用问题与免疫原性问题。

因此，存在对特异性靶向白血病细胞核白血病干细胞并特异性杀伤白血病细胞和白血病干细胞的药物需求。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于开发一种能特异性靶向杀伤和/或清除白血病细胞与白血病干细胞的药物。

因此，本发明的第一方面涉及一种包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其选自：(1)IL2_mIL3_m2SON3，(2)IL2_mIL3_m3SON3或(3)IL2_mIL3_m1SON3，其中IL2_m是IL2的突变改型的衍生片段，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中IL3_m2是IL3的突变改型的衍生片段2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，IL3_m3是IL3的突变改型的衍生片段3，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，IL3_m1是IL3的突变改型的衍生片段1，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.12，其中SON3是DNA结合蛋白SON的衍生片段且富含碱性氨基酸，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明的第二方面涉及如上所述的融合蛋白作为非病毒载体的用途，其中所述非病毒载体的用途是指所述融合蛋白利用其自身碱性氨基酸所带的正电荷与携带负电荷的核苷酸序列相互结合并利用融合蛋白中与细胞表面特异性受体结合的成分将所述核苷酸序列转运至特定的靶细胞，从而起到靶向性运输工具的作用。

本发明的第三方面涉及如上所述的融合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于编码所述IL2_m、IL3_m2、SON3的核苷酸序列在不改变所述融合蛋白氨基酸序列的情况下，根据使用的宿主细胞的密码子偏爱性相应调整所述核苷酸序列的密码子，优选地，IL3_m2的DNA编码序列如SEQ ID NO.2所示，IL3_m3的DNA编码序列如SEQ ID NO.3所示，IL3_m1的DNA编码序列如SEQ ID NO.4所示，IL2_m的DNA编码序列如SEQ ID NO.1所示，SON3的DNA编码序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，如上所述的融合蛋白的特征在于IL2_mIL3_m2SON3的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，和/或IL2_mIL3_m3SON3的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，和/或IL2_mIL3_m1SON3的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，优选地，IL2_mIL3_m2SON3的DNA编码序列如SEQ ID NO.6所示，和/或IL2_mIL3_m3SON3的DNA编码序列如SEQ ID NO.7所示，和/或IL2_mIL3_m1SON3的DNA编码序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明的第四方面涉及包含如上所述的融合蛋白的编码核苷酸序列或如上所述的编码核苷酸序列的原核或真核表达重组体，优选地，所述表达重组体是由原核质粒载体pCW111构建而成的表达型重组体pCW-IL2_mIL3_m2SON3(图8)、pCW-IL2_mIL3_m3SON3(图15)或pCW-IL2_mIL3_m1SON3(图19)。

本发明的第五方面涉及包含如上所述的融合蛋白的编码基因或如上所述的编码核苷酸序列或如上所述的表达重组体的工程细胞或工程菌，其中所述细胞为适用于表达重组体表达的植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞，所述菌为适用于表达重组体表达的细菌、放线菌、霉菌或酵母菌，优选地，所述菌为细菌，更优选地，所述菌为大肠杆菌，最优选地，所述菌为大肠杆菌DH5α。

优选地，如上所述的工程细胞或工程菌的特征在于所述工程菌为pCW-IL2_mIL3_m2SON3、pCW-IL2_mIL3_m3SON3或pCW-IL2_mIL3_m1SON3分别转化入大肠杆菌DH5α宿主细胞获得的DH5α/pCW-IL2_mIL3_m2SON3、DH5α/pCW-IL2_mIL3_m3SON3或DH5α/pCW-IL2_mIL3_m1SON3。

本发明的第六方面涉及制备如上所述的融合蛋白的方法，其特征在于可以以化学合成、半化学合成和/或重组表达的方式制备所述融合蛋白，优选地，以重组表达的方式制备所述融合蛋白，最优选地，通过在恰当的表达条件下培养权利要求6或7所述的工程细胞或工程菌获得所述的融合蛋白。

本发明的第七方面涉及所述的融合蛋白和毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut组成的复合物，其中所述毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut在中国专利申请200610112334.3中公开，其谱图如图40所示。

本发明的第八方面涉及如上所述的复合物在制备杀伤和/或清除白血病细胞与白血病干细胞的药物中的用途。

换言之，本发明旨在探索一条新的技术路线以克服传统疗法所带来的药物严重的毒副作用及治疗后容易复发两个缺陷，即：一是靶向杀灭肿瘤细胞，二是靶向杀灭肿瘤干细胞。

为此，本发明构建与研制融合蛋白作为非病毒载体，并将之与已有的毒素基因限制性表达重组体组装成复合物，用以准确靶向清除一般白血病细胞和白血病干细胞，而不伤及正常细胞。非病毒载体融合蛋白/毒素基因限制性表达重组体复合物，乃经由一个毒素基因的靶向性运输的设计与另一个毒素基因的限制性表达的设计，从而实现毒素基因只能在恶性肿瘤细胞以及肿瘤干细胞内表达、而不能在正常细胞内表达的意图。

毒素基因的靶向性运输设计是通过受体与配体特异性结合把毒素基因运输至受体富集的肿瘤细胞及肿瘤干细胞表面。本发明提供的这组非病毒载体与已有的毒素基因限制性表达重组体组装成复合物一旦导入血循环，复合物将通过其包含的配体靶向性结合至IL2R和/或IL3R富集的白血病细胞与白血病干细胞表面，进而通过内吞作用进入细胞内。正常细胞表面不表达或少表达这2类受体，复合物与之不结合或者结合较少。通过将复合物限制于白血病细胞与白血病干细胞表面而避免伤及正常细胞，减少复合物的毒副作用。

复合物进入细胞内以后，毒素基因是否表达受肿瘤特异性高表达的核因子-κB(NF-κB)调控，即限制性表达，本发明应用毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut。其中，NFBS是由3个正向、3个反向克隆的NF-kB转录因子的结合位点及其旁侧的DNA序列组成。miniCMV是削帽缩短的真核启动子CMV。它必须在NF-κB的激活下才有启动子的活性。PEIIImut是绿脓杆菌毒素第III功能域编码序列的强毒突变型。白血病细胞与白血病干细胞高表达NF-κB(NF-κB⁺)，复合物通过受体与配体特异性靶向结合并进入白血病细胞与白血病干细胞以后，细胞内高表达的NF-κB与毒素基因表达载体上的NFBS结合，激活了miniCMV偏动子，被激活的miniCMV驱动了其下游的毒素基因PEIIImut的高表达，进而杀伤该细胞。转录因子NF-κB在正常细胞内无活性(NF-κB^-)，因此毒素基因即使进入了正常细胞也不会表达，该正常细胞不会被杀伤。通过毒素基因的限制性表达将复合物的毒副作用最小化。

也即，本发明通过上述革命性的全新靶向性设计，成功地实现了将包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白特异性靶向白血病细胞及白血病干细胞，在所述融合蛋白通过受体、配体靶向结合到白血病细胞和白血病干细胞并通过内吞作用进入白血病细胞和白血病干细胞后，毒素基因在肿瘤特异性高表达的核因子-κB(NF-κB)调控下进行表达，从而杀死所述白血病细胞和白血病干细胞，为以毒副作用最小化的方式实现防治复发的白血病治疗提供了一种有效的药物。

附图说明

图1.表达重组体pCW-IL2_mSON3构建示意图。

图2.PCR反应得到NdeI-IL2_mIL3_m2SON3-BamHI：

1.DNA分子量标准DL2000，

2.PCRC产物NdeI-IL2_mIL3_m2SON3-BamHI，大小为916bps。

图3.Nde I和BamHI双酶切鉴定克隆pCW-IL2_mIL3_m2SON3结果：

4.DNA分子量标准DL15000，

1-3，5-7.pCW-IL2_mII3_m2SON3克隆双酶切产物。

图4.表达重组体pCW-IL2_mIL3_m2SON3构建示意图。

图5.表达重组体pCW-IL3_m2SON3构建示意图。

图6.PCR反应得到Nde I-IL2_mIL3_m3SON3-BamH I：

1.DNA分子量标准DL2000Plus，

2.PCR产物Nde I-IL2_mIL3_m2SON3-BamHI，大小为916bps。

图7.克隆pCW-IL2_mIL3_m3SON3Nde I和BamHI双酶切鉴定结果：

1.DNA分子量标准DL2000，

2-6.pCW-IL2_mIL3_m3SON3克隆双酶切产物。

图8.表达重组体pCW-IL2_mIL3_m3SON3构建示意图。

图9.PCR反应得到NdeI-IL2_mIL3_m1SON3-BamH I：

1.DNA分子量标准DL2000Plus，

2.PCR产物NdeI-IL2_mIL3_m1SON3-BamHI，大小为916bps。

图10.克隆pCW-IL2_mIL3_m1SON3Nde I和BamHI双酶切鉴定结果：

1.DNA分子量标准DL2000，

2-6.pCW-IL2_mIL3_m1SON3阳性克隆双酶切产物。

图11.表达重组体pCW-IL2_mIL3_m1SON3构建示意图。

图12.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果：

1.蛋白分子量标准(97.4，66.2，42.7，29.0，20.1，14.4kDa)，

2.菌体裂解液(未诱导)，

3.菌体裂解液(诱导)，

4.IL2_mIL3_m2SON3包涵体溶解液，

5.纯化后样品。

图13.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果：

1.蛋白分子量标准(97.4，66.2，42.7，29.0，20.1，14.4kDa)，

2.菌体裂解液(未诱导)，

3.菌体裂解液(诱导)，

4.IL2_mIL3_m3SON3包涵体溶解液，

5.纯化后样品。

图14.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果：

1.蛋白分子量标准(97.4，66.2，42.7，29.0，20.1，14.4kDa)，

2.菌体裂解液(未诱导)，

3.菌体裂解液(诱导)，

4.IL2_mIL3_m1SON3包涵体溶解液，

5.纯化后样品。

图15.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果：

1.蛋白分子量标准(97.4，66.2，42.7，29.0，20.1，14.4kDa)，

2.菌体裂解液(未诱导)，

3.菌体裂解液(诱导)，

4.IL3_m2SON3包涵体溶解液，

5.纯化后样品。

图16.经阳离子层析后所收集样品的SDS-PAGE电泳结果：

1.蛋白分子量标准(97.4，66.2，42.7，29.0，20.1，14.4kDa)，

2.菌体(未诱导)，

3.菌体(诱导)，

4.IL2_mSON3包涵体溶解液，

5.纯化后样品。

图17.抗IL2抗体分析融合蛋白表达：

1.IL2_mIL3_m2SON3免疫印迹，

2.IL2_mIL3_m3SON3免疫印迹，

3.IL2_mIL3_m1SON3免疫印迹，

4.IL3_m2SON3免疫印迹，

5.IL2_mSON3免疫印迹。

图18.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白IL2_mIL3_m2SON3结合DNA的能力进行评价：

1.DNA分子量标准DL15000，

2.DNA，

3-8.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。

图19.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白IL2_mIL3_m3SON3结合DNA的能力进行评价：

1.DNA分子量标准DL15,000，

2.DNA，

3-8.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。

图20.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白IL2_mIL3_m1SON3的结合DNA的能力进行评价：

1.DNA分子量标准DL15000，

2.DNA，

3-8.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。

图21.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白IL3_m2SON3结合DNA的能力进行评价：

1.DNA分子量标准DL15000，

2.DNA，

3-9.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。

图22.琼脂糖凝胶迁移延迟试验对融合蛋白IL2_mSON3结合DNA的能力进行评价：

1.DNA分子量标准DL15000，

2.DNA，

3-8.不同质量比的蛋白与DNA的孵育产物。

图23.同一蛋白对于不同细胞株的转染效率。

图中23S代表IL2_mIL3_m2SON3；23S-G代表IL2_mIL3_m3SON3；23S-GAL代表IL2_mIL3_m1SON3；3S代表IL3_m2SON3；2S代表IL2_mSON3；(本发明下文中出现 的简称所代表的非病毒载体均与此一致)；DNA代表绿色荧光蛋白EGFP-N1表达载体。

图24.RT-PCR检测PEIIImut的转录情况：

1.DNA分子量标准DL2,000，

2-4.NFBS-miniCMV-PEIIImut转染HUT78后的RT-PCR产物(507bps，426bps，379bps)，

5-7.NFBS-miniCMV-PEIIImut转染HL60后的RT-PCR产物(507bps，426bps，379bps)，

8.阳性对照，

9.阴性对照。

图25.一般白血病细胞株HUT-78(IL2R⁺IL3R^-NF-κB⁺)在各瞬时转染条件下所得到的MTT结果以杀伤率(％)表示细胞杀伤活性大小：

图中DNA代表毒素基因限制性表达载体NFBS-miniCMV-PEIIImut(本发明下 文图谱中出现的DNA均代表同一毒素基因表达载体)；显示剂量以毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut所用剂量表示(本发明下文图谱中出现的 所用剂量标准均与此一致)。

图26.一般白血病细胞株HL60(IL2R^-IL3R⁺NF-κB⁺)在各瞬时转染条件下所得到的MTT结果以杀伤率(％)表示细胞杀伤活性大小。

图27.肿瘤细胞株HEPG2(IL2R^-IL3R^-NF-κB⁺)在各瞬时转染条件下所得到的MTT结果，以杀伤率(％)表示细胞杀伤活性大小。

图28.非病毒载体融合蛋白/NFBS-miniCMV-PEIIImut复合物转染HUT78细胞后凋亡率。

图29.非病毒载体融合蛋/NFBS-miniCMV-PEIIImut复合物转染HL60细胞后凋亡率。

图30.急性髓性白血病病人来源单个核细胞在各瞬时转染条件下所得到的细胞杀伤率。

图31.健康志愿者来源单个核细胞在各瞬时转染条件下所得到的细胞杀伤率。

图32.流式细胞仪分选CD34⁺CD123⁺双阳性白血病干细胞。

图33.白血病干细胞纯度鉴定。

图34.CD34⁺CD123⁺白血病干细胞瑞氏染色。

图35.甲基纤维素培养基培养18d后集落生成。

图36.与基质细胞共培养5周后可见细胞呈鹅卵石状排列。

图37.白血病干细胞在各瞬时转染条件下所得到的细胞杀伤率。

图38.IL2_mIL3_m3SON3/LIP/DNA对白血病干细胞的细胞杀伤作用。

图39.IL2_mIL3_m3SON3/Ca⁺⁺/DNA对白血病干细胞的细胞杀伤作用。

图40.毒素基因限制性表达载体NFBS-miniCMV-PEIIImut图谱。

图41.总体设计方案示意图。

图42.实验流程图。

具体实施方式

总体设计方案示意图见图41、实验流程图见图42。

本发明涉及的融合蛋白作为非病毒载体与毒素基因限制性表达重组体DNA组装而成的复合物，乃经由一个毒素基因的靶向性运输的设计与另一个毒素基因的限制性表达的设计，从而实现毒素基因只能在恶性肿瘤细胞内表达、而不能在正常细胞内表达的意图。

毒素基因的靶向性运输设计是通过受体与配体特异性结合把毒素基因运输到受体富集的肿瘤细胞表面。在非病毒载体融合蛋白(1)IL2_mIL3_m2SON3、(2)IL2_mIL3_m3SON3或(3)IL2_mIL3_m1SON3的设计中，以受体的配体IL3、IL2或其突变衍生物作为“靶向头”，并与编码富含碱性氨基酸的DNA结合蛋白及核定位多肽的序列SON3连接，且以基因工程的技术方法，克隆与表达并制备其相应的融合蛋白作为非病毒载体。

本发明涉及的融合蛋白非病毒载体靶向结合域IL3_m2、IL3_m3和IL3_m1，其受体富集于一般白血病细胞及白血病干细胞表面；其中IL3_m3取自IL3第9-126氨基酸片段，并且将Asp101突变为Tyr，Lys116突变为Tyr以增强其与IL3Rα的结合能力。IL3_m2在IL3_m3基础上，把Glu22突变为Phe，以去除IL3与IL-3Rβ亚基的结合能力并增加其与L3Rα的竞争性结合，IL3_m1增强其与IL3Rα的结合能力，同时考察IL3_m2、IL3_m3突变位点的效果。

本发明涉及的融合蛋白非病毒载体靶向结合域IL2_m，其受体富集于一般白血病细胞表面，取自IL2N端1-100个氨基酸，并将第58位半胱氨酸突变为丝氨酸，以获得无生物学活性但保留其结合受体能力的IL2衍生片段。

本发明涉及的DNA结合域SON3包含核定位序列和DNA结合序列，由58个氨基酸组成，富含碱性氨基酸。该片段丰富的正电荷可与富含负电荷的毒素基因重组体DNA结合成复合物；其核定位序列可介导该复合物进入细胞核。

本发明运用DNA重组技术，将IL3_m3基因或IL3_m2基因或IL3_m1基因、IL2m基因、SON3基因相联接，构建、表达了融合蛋白IL2_mIL3_m3SON3与IL2_mIL3_m2SON3及IL2_mIL3_m1SON3。

毒素基因的限制性表达设计是对毒素基因特异性表达的调控。本发明应用只在恶性肿瘤细胞内具有转录调控活性的转录因子(如NF-kB)作为调控序列以将毒素基因的表达严格限制在肿瘤细胞内，从而杀灭该细胞；因该转录因子在正常细胞内无活性，毒素基因即使进入了正常细胞也不会表达，该正常细胞不会被杀伤。

本发明涉及的融合蛋白作为非病毒载体与毒素基因限制性表达重组体组装而成的复合物不但靶向杀伤白血病细胞，还靶向杀伤白血病干细胞，同时不伤及正常细胞。

同时，本发明还构建并研制了分别只含有单个配体的IL2_mSON3与IL3_m2SON3融合蛋白作为对照，以全面分析白细胞介素3衍生片段的融合蛋白作为非病毒载体与毒素基因限制性表达重组体组装成复合物的智能化抗癌功能。

实施例

实施例1编码融合蛋白非病毒载体的IL2 _m 基因片段的获得

本发明以qmIL2-pG载体(在专利申请号为200610112334.3的说明书中有详细说明)为模板，设计外引物(引物序列如SEQ ID NO.17所示)以及上下游引物(引物序列如SEQ ID NO.18和19所示)在5’端引入Nde I酶切位点序列CATATG及起始密码子AUG，在3’端引入融合蛋白linker(G₄SG₄T)序列GGTGGCGGAGGTTCTGGTGGC GGTGGAACC，通过重叠PCR扩增已突变的IL2基因编码从N-C端1-100个氨基酸的DNA序列获得片段NdeI-(IL2_m+linker)-，大小为368bps。重叠PCR反应体系总体积60μl，组成为：体系I：DNA模板0.5-1μg，dNTPs(2mM)4μl，Pfu DNA聚合酶(2U/μl)0.25μl，10×PCR Buffer(20mMMg²⁺)5μl，上游引物(10μM)2μl，下游引物(10μM)2μl，加ddH₂O至总体积50μl。体系II：上游引物(各10μM)2.4μl，下游引物(各10μM)2.4μl，dNTPs(2mM)0.8μl，PfuDNA聚合酶(2U/μl)0.05μl，10×PCRBuffer(20mM Mg²⁺)1μl，加ddH₂O至总体积10μl；反应条件为：体系I：95℃×5分钟，(95℃×1分钟→50℃×45秒→72℃×1分钟)×8循环，72℃×8分钟暂停，加入体系II，(95℃×1分钟→50℃×45秒→72℃×1分钟)×30循环，72℃×10分钟。本发明后续重叠PCR 反应体系及条件均照此进行，各参数可能随情况作适当调整，不再一一列出。扩增完以后，取5μl PCR产物于1.0％Agrose电泳检测，结果表明获得了大小符合预期的片段，-20℃保存。

实施例2编码融合蛋白非病毒载体的SON3基因片断的获得

本发明以NCBI登录号为NM_032195的SON蛋白编码核苷酸为模板，设计外引物(引物序列如SEQ ID NO.20所示)以及上下游引物(引物序列如SEQ ID NO.21和22所示)在5’端引入融合蛋白linker(G₄TG₄T)编码序列GGTGGCGGCGGTACCGGTGGTGGCGGAACT以及碱性氨基酸KRKRS编码序列AAACGCAAGCGTAGC，在3’端引入BamH I酶切位点序列GGATCC，通过OVERLAP-PCR获得片段(linker-SON3)-BamH I-，大小为237bps，琼脂糖凝胶电泳证实获得的片段大小与预期相符。

实施例3原核表达重组体pCW-IL2_mSON3表达重组体的构建

本发明以实施例1中获得的IL2_m和实施例2中获得的SON3为模板，设计外引物(引物序列如SEQ ID NO.23所示)以及上下游引物(引物序列如SEQ ID NO.24和25所示)进行重叠PCR以连接、扩增DNA片段。回收并纯化后用BamH I和Nde I双酶切，同样双酶切pCW111原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-IL2_mSON3表达重组体。重组体构建流程见图1，琼脂糖凝胶电泳证实了获得的片段大小与预期相符。

实施例4原核表达重组体pCW-IL2_mIL3_m2SON3表达重组体的构建

本发明以实施例1中获得的IL2_m和实施例2中获得的SON3以及通过全基因合成获得的IL3_m2为模板，用引物(引物序列如SEQ ID NO.24和25所示)进行重叠PCR以连接、扩增得到DNA片段。回收并纯化后用BamHI和Nde I双酶切，同样双酶切pCW111原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-IL2_mIL3_m2SON3表达重组体。重组体构建流程见图4，实验结果见图2、图3。

实施例5原核表达重组体pCW-IL3_m2SON3表达重组体的构建

本发明以实施例4中获得的pCW-IL2_mIL3_m2SON3为模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO.25和26所示)扩增得到DNA片段。回收并纯化后用BamHI和Nde I双酶切，同样双酶切pCW111原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-IL3_m2SON3表达重组体。重组体构建流程见图5，琼脂糖凝胶电泳证实了获得的片段大小符合预期大小。

实施例6原核表达重组体pCW-IL2_mIL3_m3SON3表达重组体的构建

本发明以实施例4中获得的pCW-IL2_mIL3_m2SON3为模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO.27和28所示)设计突变IL3_m2Glu22位点为Phe；通过PCR扩增得到2个DNA片段。利用引物SEQ ID NO.24和25通过重叠PCR将获得的2个DNA片段连接。回收并纯化后用BamHI和Nde I双酶切，同样双酶切pCW111原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-IL2_mIL3_m2SON3表达重组体。重组体构建流程见图8，实验结果见图6、图7。

实施例7原核表达重组体pCW-IL2_mIL3_m1SON3表达重组体的构建

本发明以实施例6中获得的pCW-IL2_mIL3_m3SON3为模板，利用引物(引物序列如SEQ ID NO.29和30所示)设计突变1L3_m2Asp101突变为Tyr，Lys116突变为Tyr；通过PCR扩增得到2个DNA片段。利用引物(引物序列如SEQ ID NO.24和25所示)通过重叠PCR将获得的2个DNA片段连接，回收并纯化后用BamHI和Nde I双酶切，同样双酶切pCW111原核表达载体，按酶连比例连接载体片段，构建pCW-IL2_mIL3_m2SON3表达重组体。重组体构建流程见图11，实验结果见图9、图10。

实施例8融合蛋白非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3和IL2_mSON3的大肠杆菌表达

分别以鉴定后的阳性表达重组体pCW-IL2_mIL3_m3SON3、pCW-IL2_mIL3_m2SON3、pCW-IL2_mIL3_m1SON3、pCW-IL3_m2SON3和pCW-IL2_mSON3转化Ecoli宿主菌DH5α，37℃培养过夜。同时设置pCW111空载体及无DNA的转化体系作为阳性和阴性对照。挑取阳性转化单菌落接种含50μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基，32℃振荡培养过夜。菌液按1～2％(v/v)比例转接于150～200mlLB抗性液体培养基，32℃振荡培养至菌液OD₆₀₀达0.4～0.6。42℃振荡培养4小时。菌液于6000rpm离心10分钟，收集菌体沉淀，进行SDS-PAGE，检测目的蛋白的表达。结果显示，与非诱导阴性对照相比，诱导表达质粒pCW-IL2_mIL3_m2SON3(预期蛋白分子量33.78kD)、pCW-IL2_mIL3_m3SON3(预期蛋白分子量33.76kD)、pCW-IL2_mIL3_m1SON3(预期蛋白分子量33.68kD)、pCW-IL3_m2SON3(预期蛋白分子量21.58kD)和pCW-IL2_mSON3(预期蛋白分子量19.52kD)均于相应条带大小附近出现特异性条带，分子量与预期一致。

实施例9融合蛋白非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3和IL2_mSON3的纯化

本发明使用ACTAR蛋白纯化仪通过阳离子层析柱纯化蛋白。

9.1层析步骤

9.1.1阳离子柱的清洗与平衡

起始缓冲液(A液)：磷酸缓冲液(pH＝7.4)；

洗脱缓冲液(B液)：磷酸缓冲液(pH＝7.4)，2M氯化钠；

利用A液清洗机器管路，并在25min内达到A液的柱平衡。再采用梯度上升的方式，在5min内达到B液的柱平衡。随后，重新瞬时恢复至A液的柱平衡。

[注]：所有用于层析的液体，均必须0.22μm滤膜过滤。

9.1.2上样

上样前的样品处理：将得到的复性后包涵体14,000rpm离心10min后，取上清经过0.22μm孔径滤膜，得到包涵体上样液。将A管置入制备好的得到包涵体上样液，设置流速为1ml/min。

9.1.3蛋白的洗脱及目的蛋白的收集

流速始终保持在1ml/min。在上样结束后实施蛋白的B液梯度洗脱，即设置B液在20min内在阳离子柱中所占比例由0％经梯度上升至100％。随着B液比例的提高，缓冲液的极性将逐渐增加，相应极性的蛋白组分随之从固定相洗脱下来，随洗脱液出柱，同时在监测器上出现相应的明显的吸收峰。收集吸收峰所对应的洗脱液。

9.2SDS-PAGE电泳检测收集的层析样品

收集层析纯化后样品，以及上柱样品、菌体样品，一同进行SDS-PAGE电泳检测，实验结果见图12、图13、图14、图15、图16。并使用Chromscan3快速凝胶扫描仪于626nm波长处对凝胶进行扫描，分析目的蛋白分别在上柱样品和层析收集样品中所占比例。

9.3依照上述层析步骤将待上柱样品全部层析，利用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce公司)进行蛋白定量。将收集的纯化后的样品透析至1×PBS溶液中，定量并冻干，-70℃保存，用于随后细胞实验。

实施例10融合蛋白非病毒载体的理化性质检测

10.1选择4个纯化后融合蛋白送N端氨基酸测序。结果表明其序列与理论序列相符。

10.2利用抗IL2抗体、对5种融合蛋白进行免疫印迹，进一步检测目的蛋白的表达。

10.2.1蛋白转移电泳：

PVDF膜先用甲醇浸湿，再用电转缓冲液浸湿转膜所用的海绵、滤纸和PVDF膜，其中PVDF膜至少要平衡10min。顺序放置电转仪塑料支架、海绵、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵、电转仪塑料支架(凝胶和PVDF膜之间不要有气泡)，然后将塑料支架夹紧。将上述系统放入电转槽中(注意使PVDF膜在正极方向)。于0℃以电流200mA转膜1hr。

10.2.2杂交

电转完毕的PVDF膜先于TBST溶液中洗涤5min，再于封闭液中室温封闭1hr。将膜放入用封闭液稀释的一抗溶液中，室温孵育1-2hr或4℃孵育过夜。用TBST溶液洗膜3次，每次10min。将膜放入用封闭液稀释的二抗中，室温孵育1-2hr。再用TBST溶液洗膜3次，每次10min。吸去膜上多余水分，蛋白面向上放在保鲜膜上。将化学发光液均匀滴加于PVDF膜表面，避光1min后，小心将膜包裹。在暗室中用X光片进行显影。实验结果见图17。

实施例11融合蛋白作为非病毒载体对毒素基因限制性表达重组体DNA结合能力的检测，即琼脂糖迁移延迟检测

首先分别计算各融合蛋白和DNA所带电荷的数量。依据每摩尔质粒DNA所带的负电荷摩尔数，按照每个碱基带一个磷酸根基团即一个负电荷计算，双链DNA乘以2；蛋白质所带的负电荷按照天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)各贡献一个负电荷；赖氨酸(K)精氨酸(R)各贡献一个正电荷计算。理论上计算出蛋白质与DNA带相同电荷时的质量比。依据理论上的结果，选择合适的融合蛋白与毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut比例进行孵育并进行琼脂糖凝胶电泳，比较迁移率变化情况。当两者的比例合适并形成蛋白/DNA复合物，则复合物的电泳迁移较单独质粒电泳明显滞后；选择复合物仅稍有泳出加样孔时所对应的非病毒载体蛋白与DNA的最小质量比(本发明下文中复合物的制备方法以及制备比例均按 照此方法以及通过此方法获得的质量比)。实验结果见图18、图19、图20、图21、图22。

实施例12融合蛋白作为非病毒载体的转染效率检测

分别将复合物加入前1d已经接种好的无抗生素培养基培养的细胞株HUT78(IL2R⁺IL3R^-)、HL60(IL2R^-IL3R⁺)、HEPG2(IL2R^-IL3R^-)(每孔重复3次)。

非病毒载体融合蛋白IL2_mIL3_m1SON3，IL2_mIL3_m2SON3，IL2_mIL3_m3SON3，IL3_m2SON3，IL2_mSON3与绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-N1(工作浓度为1μg/ml)以分别质量比5∶1，5∶1，5∶1，4∶1，3∶1的比例进行孵育，制备非病毒载体融合蛋白/pEGFP-N1复合物。

脂质体与绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-N1(工作浓度为1μg/ml)按照2μl：1μg比例进行孵育，制备脂质体/pEGFP-N1复合物。

将复合物加入无抗生素培养基培养的细胞株。

观察转染细胞的绿色荧光蛋白的表达情况，实验结果见表1，图23。

表1计算各自转染效率并进行分析

结果表明IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3IL2_mSON3与NFBS-miniCMV-PEIIImut复合物能靶向转染绿色荧光蛋白表达载体至相应与融合蛋白配体相结合的受体阳性的细胞。

实施例13RT-PCR检测PEIIImut在肿瘤细胞内是否表达

检测非病毒载体IL2_mIL3_m3SON3介导毒素基因转染入肿瘤细胞株HUT78以及HL60后是否表达。

13.1提取总RNA作为模板，RNA提取方法：由融合蛋白非病毒载体IL2_mIL3_m3SON3介导NFBS-SCP-PEIIImut转染肿瘤细胞株HUT78及HL60。转染35hr后，参照AxyPrep总RNA小量制备试剂盒产品使用说明书的方法，以此细胞分别提取总RNA。操作步骤如下：收集细胞(2×10⁶)至1.5ml离心管，2,000g离心5min，弃上清。加入400μl Buffer I，用装有21-25号针头的注射器反复抽吸8-10次，转入1.5ml离心管中。加入150μl Buffer-II，漩涡震荡15-30s，4℃、12000g，离心5min。取上清至1.5ml离心管中，加入250μl异丙醇，混合均匀。将制备管置于2ml离心管中，转移步骤4中的混合液到制备管中，4℃，6000g离心1min。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入500μl Buffer W1A，12000g离心1min；弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，制备管中加入700μlBuffer W2，12000g离心1min；以同样的方法再用700μlBuffer W2洗一次。弃滤液，将制备管置回到2ml离心管中，12000g离心1min；将制备管放入一干净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加70-100μlBuffer TE或RNase-free水。室温静置1min，12000g离心1min，洗脱得RNA。紫外分光光度计测定RNA浓度，-20℃保存。

13.2应用3对不同的PE扩增引物(引物序列见SEQ ID NO.31-36)进行RT-PCR。

13.2.1使用RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit，合成第一链。参照产品使用说明操作如下：加入Template RNA 0.1-5μg，Oligo(dT)18primer 1μl，5×Reactionbuffer 4μl，Ribolock^TMRNase Inhibitor(20u/μl)1μl，10mM dNTP Mix 2μl，RevertAid^TM M-MuLV Reverse Transcriptase(200U/μl)1μl至无菌、无核酸酶EP管，加DEPC-treated water补充体积至20μl。混匀，离心。42℃孵育60min。70℃，5min终止反应。

13.2.2第二链的合成

加入各试剂cDNA模板2μl，dNTPs(2mM)4μl，PfuDNA聚合酶(2U/μl)0.25μl，10×PCR Buffer(20mM Mg²⁺)5μl，上游引物(10μM)2μl，下游引物(10μM)2μl，ddH₂O 34.75μl至PCR管。执行程序：94℃×3min，(94℃×30sec，58℃×30sec 72℃×45sec)×30cycles，72℃×10min。

13.3取5μl PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳。实验结果证实，转染两种肿瘤细胞株HUT78以及HL60后，PEIIImut可以得到有效转录。实验结果见图24。

实施例14非病毒载体/毒素基因限制性表达重组体DNA复合物对白血病细胞靶向杀伤活性实验

在转染的前一天用含FBS、无抗生素培养基制备细胞悬液，以5×10⁴个细胞/孔(100μl)铺96孔板(采用三复孔)。37℃、5.0％CO2条件下培养。每孔的操作：向同一25μl无血清无抗生素培养基中，分别加入适量的PEIIImut的限制性表达重组体DNA并轻轻混匀；将脂质体或各融合蛋白按照比例分别加至另一25μl无血清无抗生素培养基，轻轻混匀后，室温孵育5min(不可超过25min)。将上述两种液体混匀，37℃孵育30min(不可超过6hr)，即可用于转染。将此大约100μl的脂质体/DNA复合物全部加至孔内，并轻晃培养板使其与孔内原有液体混匀。转染后35h，收获细胞。

14.1分组说明：

1)LIP(脂质体)与PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut组装形成复合物LIP/PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut处理组；

2)融合蛋白非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3/PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut处理组；

3)融合蛋白非病毒载体IL2_mIL3_m3SON3/PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut处理组；

4)融合蛋白非病毒载体IL2_mIL3_m1SON/PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut处理组；

5)融合蛋白非病毒载体IL3_m2SON3/PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut处理组；

6)非病毒载体融合蛋白IL2_mSON3/PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut处理组。

7)空白对照组；

8)非病毒载体融合蛋白IL2_mIL3_m2SON3组；IL2_mIL3_m3SON3组；IL2_mIL3_m1SON3组；IL3_m2SON3组；IL2_mSON3组；

9)单纯毒素基因限制性表达重组体PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut组；

10)LIP组。

14.2每组根据毒素表达载体的质量使用4个剂量2μg，4μg，8μg，16μg，比较其杀伤作用，每组重复3次。

14.3实验用细胞株包括HUT78(IL3R^-IL2R⁺NF-κB⁺)，HL60(IL3R^-IL2R⁺NF-κB⁺)以及HEPG2(IL3R^-IL2R^-NF-κB⁺)。

14.4MTT结果进行统计学分析，使用t检验进行两组均数比较，当P＜0.05认为两者间有显著性差异。实验结果见表2、表3、表4，图25、图26、图27。

表2不同复合物转染肿瘤细胞株HUT-78(IL2R⁺IL3R^-NF-κB⁺)的MTT结果

表3不同复合物转染肿瘤细胞株HL60(IL2R^-IL3R⁺NF-κB⁺)的MTT结果

表4不同复合物转染肿瘤细胞株HEPG2(IL2R^-IL3R^-NF-κB⁺)的MTT结果

融合蛋白作为非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL2_mSON3与毒素基因限制性表达重组NFBS-miniCMV-PEIIImut组装形成复合物对IL2R⁺IL3R^-NF-κB⁺细胞株HUT78发挥杀伤作用，且随着DNA剂量增加，对细胞的杀伤率随之提高。在最高剂量16μg/ml时，所产生的细胞杀伤率达到较高的水平，分别为71.92％、62.70％、64.58％和74.60％。

非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3与毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut组装形成的复合物对IL2R^-IL3R⁺NF-κB⁺细胞株HL60发挥杀伤作用，且其杀伤作用随着DNA剂量的增加，对细胞的杀伤率随之提高。在最高剂量16μg/ml时，所产生的细胞杀伤率都达到较高的水平，分别为38.83％、58.18％、48.51％和37.53％。

各非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3、IL2_mSON3与NFBS-miniCMV-PEIIImut组装形成的复合物对肿瘤细胞株HEPG2(IL3R^-IL2R^-NF-κB⁺)几乎无细胞杀伤活性。

结果表明各非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3 IL2_mSON3分别与NFBS-miniCMV-PEIIImut组装而成的复合物靶向清除相应与融合蛋白配体相结合的受体阳性的细胞。

实施例15融合蛋白作为非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3、IL2_mSON3与毒素基因限制性表达重组体组装形成的复合物分别诱导细胞凋亡

凋亡是一种程序性的细胞死亡，在机体的胚胎发育、组织修复及内环境的稳定等方面起着重要作用，是细胞的基本功能之一。磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)是一种带负电荷的磷脂，在细胞凋亡早期会外翻到细胞膜外侧。Annexin-V是磷脂结合蛋白，可选择性结合和标记PS。将Annexin-V进行绿色荧光蛋白EGFP标记，可作为探针检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(PropidumIodide，PI)是一种活细胞非透过性核酸染料，在凋亡早期不能进入细胞内，但能透过凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜进行染色。将Annexin V与PI匹配使用，是检测细胞凋亡的经典方法。

PEIIImut能够通过不同途径诱导细胞凋亡。本发明对融合蛋白IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3、IL2_mSON3分别与毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut组装而成的复合物诱导HL60、HUT78细胞凋亡的作用进行了流式细胞分析。

分别将肿瘤细胞株分别铺于24孔板，过夜。制备脂质体及非病毒载体与毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut复合物，分别加入24孔板转染细胞。转染33hr后，收获细胞。离心、去上清，用预冷的PBS清洗细胞两次。每个样品加入100μl AnnexinV-EGFP结合缓冲液，避光孵育10min，充分悬浮吹散细胞后，加入500μl PI染液(20μg/ml)，混匀后，避光孵育5min。混匀，并制备成单细胞悬液。4.流式细胞仪上机检测并对检测结果进行分析整理。

结果表明IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3IL2_mSON3与NFBS-miniCMV-PEIIImut复合物分别诱导相应与融合蛋白配体相结合的受体阳性的细胞凋亡的作用，其诱导的细胞凋亡率分别与PBS空白组比较有显著性差异，表明其细胞杀伤作用部分是通过PEIIImut细胞凋亡实现的。实验结果见图28、图29。

实施例16非病毒载体/毒素基因限制性表达重组体DNA复合物对急性髓性白血病患者来源单个核细胞杀伤作用

急性髓性白血病患者白血病细胞表面含有IL2R、IL3R，细胞内NF-κB高表达，而正常血细胞表达水平很低，因此理论上来说，本研究设计的5个非病毒载体融合蛋白与PGLB-NFBS-miniCMV-PEIIImut形成的复合物均能对AML患者血液来源单个核细胞具有杀伤作用。

严格无菌条件下抽取AML初治病人及健康志愿者新鲜血液各约4ml，密度梯度离心法通过Ficoll淋巴分离液分离单个核细胞(mononuclearcells，MNC)，细胞计数后按照约1×10⁶/ml接种96孔板，每孔100μl。制备好LIP及非病毒载体融合蛋白与毒素基因限制性表达重组体复合物后，按照不同剂量梯度分别加至细胞悬液。设置空白对照组，DNA、LIP对照组。每组重复3次。35hr后MTT法检测各复合物对细胞的杀伤作用。实验结果见表5、表6，图30、图31。

表5不同复合物转染急性白血病患者来源单核细胞的MTT结果

表6不同复合物转染健康志愿者来源单核细胞的MTT结果

结果表明各非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3、IL2_mSON3与NFBS-miniCMV-PEIIImut组装形成的复合物对原发性急性髓性白血病患者来源单个核细胞的具有杀伤作用。在DNA较低剂量2μg/ml时细胞杀伤率分别为16.09％，18.74％，16.92％，6.47％，13.74％，随着DNA剂量的增加其细胞杀伤率随之增高，至DNA最高浓度16μg/ml时，杀伤活性处于较高水平，分别为45.77％，70.64％，51.82％，29.77％，56.71％；复合物对健康志愿者来源单核细胞的不具有杀伤作用。说明复合物对急性髓性白血病来源患者白血病细胞具有靶向杀伤作用，不伤及正常细胞。

实施例17非病毒载体/毒素基因限制性表达重组体DNA复合物对白血病干性细胞杀伤杀伤率检测

17.1白血病干细胞的分离

无菌抽取初治急性髓性白血病(AML)病人骨髓4ml，在15ml离心管中加入Ficoll淋巴液4ml，再缓慢加入骨髓，2000g水平离心10min，液体分为3层。用巴斯德吸管吸取第1层和第2层之间的薄膜，置另一干净15ml离心管，用Hank’s液清洗两遍，加入冻存液(90％FBS+10％DMSO)液氮保存待用。

迅速将冻存于液氮的单个核细胞复苏，用计数板计数，用完全培养基(10％FBS+1640)重悬细胞至1×10⁶/ml，台盼兰染色观察细胞存活，细胞存活率90％以上。分装至1.5ml无菌EP管。设置同型对照：在阴性对照管中加入Phycoerythrin(PE)MouseIgG1，Fluoresceinisothiocyanate(FITC)MouseIgG，设置两个单阳管对流式细胞仪进行补偿调节，在两个单阳管中分别加入Phycoerythrin(PE)antihumanCD123、Fluoresceinisothiocyanate(FITC)anti-human CD34，在其余待分选管中加入Phycoerythrin(PE)antihumanCD 123和Fluoresceinisothiocyanate(FITC)anti-human CD34，4℃孵育30min。用流式分选仪进行无菌分选，实验结果见图32。

CD34⁺CD123⁺双阳性白血病干细胞比例占总分选细胞的10.7％(Q2)，获得的CD34⁺CD123⁺双阳性白血病干细胞约2×10⁶个。

17.2分选后白血病干细胞的鉴定

17.2.1取1×10⁴分选后的干细胞，重新用CD34⁺CD123⁺双阳标记检测CD34⁺CD123⁺双阳白血病干细胞占总收获细胞的比例，获得CD34⁺CD123⁺+双阳白血病干细胞纯度。分选后的CD34⁺和CD123⁺白血病干细胞纯度为62.1％，实验结果见图33。

17.2.2瑞氏染色观察细胞形态

取50μl分选后的CD34⁺CD123⁺白血病干细胞悬液滴至载玻片上，待悬液晾干后加入瑞氏染色液，覆盖细胞悬液，染色1min，加入磷酸缓冲液约50μl，5min后用自来水细流冲洗染色液1.5min。待玻片干燥后用倒置显微镜观察细胞形态。

染色后，可见细胞呈圆形，体积较小，胞核增大，核仁可见，约单个或2-3个，呈原始细胞形态特征，实验结果见图34。

17.2.3集落形成实验(Colony-forming test)

白血病干细胞具有干细胞特性，能自我更新、自我分化，以甲基纤维素为支持物的集落形成分析，是用来评价LSC在体外产生子代细胞能力的方法。

将通过流式细胞仪分选后的CD34⁺CD123⁺白血病干细胞按照1×10³、1×10²/孔与甲基纤维素半固体培养基混匀并接种于24孔板共培养，37℃，5％CO₂培养10d后开始显微镜下观察集落生成情况。

10d后可见集落生长，证明分选后的白血病干细胞具有自我增殖、自我更新能力，实验结果见图35。

17.2.4鹅卵石形成能力检测

正常造血干细胞与基质细胞共培养4-6周后，在相差显微镜下就可以观察到干细胞在基质细胞下面形成的鹅卵石区，而分化后的细胞浮在基质细胞的上面。

白血病干细胞具有干细胞自我更新和自我分化能力的特性，与基质细胞的共培养不仅能够观察到LSC产生子代细胞，还能够观察到它的自我更新。

将基质细胞M2-10B4(IL-3，G-CSF)用丝裂霉素C(10μg/mL)处理2hr，去除其增殖能力，按照3×10⁵/孔接种至预先用0.1％明胶溶液处理过的6孔板，至37℃、5.0％CO₂细胞培养箱中培养12hr至基质细胞贴壁。

将分选后的白血病干细胞分别按照10³、10⁴、10⁵/孔加入铺有基质细胞的6孔板(每孔重复2次)，37℃、5.0％CO₂与基质细胞共培养5周。每周半换液：用吸管轻轻从表面吸取1ml干细胞培养液，弃去；再用吸管加入1ml新鲜的培养液。5周后观察鹅卵石形成情况。

5周后将细胞置于相差显微镜下观察，可见细胞有三层，最底层为基质细胞，与基质细胞紧密接触的是一层呈鹅卵石排列的低分化细胞，并且在“鹅卵石”上层悬浮有分化成熟的白血病细胞。证明分选后的干细胞具有自我分化、自我更新能力，实验结果见图36。

17.3各非病毒载体/毒素基因限制性表达重组DNA复合物对白血病干细胞杀伤率检测。

17.3.1各非病毒载体/毒素基因限制性表达重组DNA复合物对白血病干细胞杀伤率检测。实验结果见表7，图37。

表7不同复合物转染白血病干细胞的MTT检测

由结果可知各非病毒载体IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3与NFBS-miniCMV-PEIIImut组装形成的复合物对白血病干细胞具有细胞杀伤作用。在DNA较低剂量3μg/ml时细胞杀伤率分别为5.49％，7.73％，4.49％，6.23％，并且随着DNA剂量的增加其细胞杀伤率随之增高，至最高浓度24μg/ml时，杀伤活性处于较高水平，分别为28.18％，32.92％，21.27％，27.68％。杀伤作用具有DNA浓度依赖性。

分别将IL2_mIL3_m2SON3、IL2_mIL3_m3SON3、IL2_mIL3_m1SON3、IL3_m2SON3与NFBS-miniCMV-PEIIImut组装形成的复合物与IL2_mSON3/NFBS-miniCMV-PEIIImut复合物对白血病干细胞的杀伤作用比较，IL2_mSON3/NFBS-miniCMV-PEIIImu复合物几乎无细胞杀伤作用，说明各融合蛋白非病毒载体/毒素基因复合物是通过IL3-IL3Rα特异性的靶向结合发挥对白血病干细胞的杀伤作用。

17.3.2通过LIP改善融合蛋白非病毒载体/毒素基因特异性表达载体DNA复合物的转染效率，提高复合物对白血病干细胞的杀伤作用，实验结果见表8，图38。

表8IL2_mIL3_m3SON3/LIP//毒素基因限制性表达载体复合物转染白血病干细胞的MTT检测

由结果可知

IL2_mIL3_m3SON3/LIP/DNA复合物白血病干细胞具有细胞杀伤作用，杀伤作用具有DNA浓度依赖性。与未加LIP相比，对白血病干细胞的杀伤率由32.92％提高到45.14％。

17.3.3通过Ca⁺⁺改善融合蛋白非病毒载体/毒素基因限制性表达重组体复合物的转染效率，提高复合物对白血病干细胞的杀伤作用，实验结果见表9，图39。

表9IL2_mIL3_m3SON3/Ca⁺⁺//毒素基因限制性表达重组体复合物转染白血病干细胞的MTT检测

注：DNA表示毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut

由结果可知IL2_mIL3_m3SON3/Ca⁺⁺/DNA复合物白血病干细胞具有细胞杀伤作用，杀伤作用具有DNA浓度依赖性。与未加LIP相比，对白血病干细胞的杀伤率由32.92％提高到41.22％。

Claims (17)

1.一种包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其选自：1）IL2_mIL3_m2SON3，2）IL2_mIL3_m3SON3或3）IL2_mIL3_m1SON3，其中IL2_m是IL2的突变改型的衍生片段，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，其中IL3_m2是IL3的突变改型的衍生片段2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，IL3_m3是IL3的突变改型的衍生片段3，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，IL3_m1是IL3的突变改型的衍生片段1，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.12，其中SON3是DNA结合蛋白SON的衍生片段且富含碱性氨基酸，其相应的氨基酸序列如SEQID NO.13所示。

2.根据权利要求1所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白作为非病毒载体的用途，该用途是指所述融合蛋白利用其自身碱性氨基酸所带的正电荷与携带负电荷的核苷酸序列相互结合并利用融合蛋白中与细胞表面特异性受体结合的成分将所述核苷酸序列转运至特定的靶细胞，从而起到靶向性运输工具的作用。

3.根据权利要求1所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列，其特征在于编码所述IL2_m、IL3_m2、SON3的核苷酸序列在不改变所述融合蛋白氨基酸序列的情况下，根据使用的宿主细胞的密码子偏爱性相应调整所述核苷酸序列的密码子。

4.根据权利要求1所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列，其中IL3_m2的DNA编码序列如SEQ ID NO.2所示，IL3_m3的DNA编码序列如SEQ ID NO.3所示，IL3_m1的DNA编码序列如SEQ ID NO.4所示，IL2_m的DNA编码序列如SEQ ID NO.1所示，SON3的DNA编码序列如SEQ IDNO.5所示。

5.根据权利要求1所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白，其特征在于IL2_mIL3_m2SON3的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示的DNA编码的氨基酸序列，和/或IL2_mIL3_m3SON3的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示DNA编码的氨基酸序列，和/或IL2_mIL3_m1SON3的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示DNA编码的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列，其中IL2_mIL3_m2SON3的DNA编码序列如SEQ ID NO.6所示，和/或IL2_mIL3_m3SON3的DNA编码序列如SEQ ID NO.7所示，和/或IL2_mIL3_m1SON3的DNA编码序列如SEQ ID NO.8所示。

7.将根据权利要求1或5所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列或根据权利要求3、4或6所述的编码核苷酸序列重组连接到原核或真核表达载体后获得的表达重组体。

8.根据权利要求7所述的表达重组体，其是由原核质粒载体pCW111构建而成的表达型重组体pCW-IL2_mIL3_m2SON3、pCW-IL2_mIL3_m3SON3或pCW-IL2_mIL3_m1SON3。

9.包含根据权利要求1或5所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列或根据权利要求3、4或6所述的编码核苷酸序列或根据权利要求7或8所述的表达重组体的工程细胞，其中所述细胞为适用于表达重组体的植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

10.包含根据权利要求1或5所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的编码核苷酸序列或根据权利要求3、4或6所述的编码核苷酸序列或根据权利要求7或8所述的表达重组体的工程菌，其中所述工程菌为适用于表达重组体的细菌、放线菌、霉菌或酵母菌。

11.根据权利要求10所述的工程菌，其中所述菌为大肠杆菌。

12.根据权利要求10所述的工程菌，其中所述菌为大肠杆菌DH5α。

13.根据权利要求10所述的工程菌，其特征在于所述工程菌为pCW-IL2_mIL3_m2SON3、pCW-IL2_mIL3_m3SON3或pCW-IL2_mIL3_m1SON3分别转化入大肠杆菌DH5α宿主细胞获得的DH5α/pCW-IL2_mIL3_m2SON3、DH5α/pCW-IL2_mIL3_m3SON3或DH5α/pCW-IL2_mIL3_m1SON3。

14.制备根据权利要求1或5所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的方法，其特征在于以化学合成、半化学合成或重组表达的方式制备所述融合蛋白。

15.制备根据权利要求1或5所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白的方法，其中通过在本领域已知的表达条件下培养权利要求9或10所述的工程细胞或工程菌获得所述的融合蛋白。

16.根据权利要求1或5所述的包含突变改型的白细胞介素3衍生片段的融合蛋白和已有的毒素基因限制性表达重组体NFBS-miniCMV-PEIIImut组成的复合物。

17.根据权利要求16所述的复合物在制备杀伤和/或清除白血病细胞与白血病干细胞的药物中的用途。