CN1198639C - 新型免疫增强组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含有松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液、或松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分作为有效成分的新型免疫增强组合物或功能性食品、新型杀伤活性诱导组合物或功能性食品、新型肿瘤增殖抑制组合物或功能性食品、新型白介素12诱导组合物或功能性食品、新型TGF-β活性抑制组合物或功能性食品、新型活性氧捕获组合物或功能性食品，以及新型松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分。

Description

新型免疫增强组合物
                       技术领域
本发明涉及新型免疫增强组合物。本发明的免疫增强组合物不仅可以作为药品使用，而且能够以各种形态，例如以功能性食品和健康食品(包括饮料)、或者饲料等饮食物形式使用。不仅如此，还能够以暂时含于口中并且完全从口中吐出的形态，例如以牙粉剂、洗口剂、口香糖、或者漱口剂的形式使用，或者也能够以由鼻腔吸引的吸入剂形式使用。
                       背景技术
已知在蘑菇中含有各种生理活性物质，例如在特公昭57-1230号公报和特许第2767521号说明书中，公开了松蘑中含有的各种抗肿瘤性物质。在上述特公昭57-1230号公报中公开了松蘑菌丝体的液体培养物经热水或者稀碱性溶液提取后，从所得提取液中分离纯化的发射菌素(Emitanin)-5-A、发射菌素-5-B、发射菌素-5-C以及发射菌素-5-D具有抑制肉瘤180细胞增殖的活性。此外，在上述特许第2767521号说明书中公开了从松蘑子实体的水提取物中分离纯化得到的分子量为20～21万的蛋白质(亚基分子量＝10～11万)具有抗肿瘤活性。
本发明人在比较研究市售的各种食用菌类的热水提取物的各种生理活性时，发现包括松蘑在内的多种食用菌具有抑制肉瘤180细胞增殖的活性，但是关于免疫增强活性，则首次发现仅有松蘑显示出非常高的活性。此外，除了松蘑热水提取液之外，还首次发现松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分也显示出免疫增强活性。迄今为止，对这样的松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分的免疫增强活性完全不知晓，而本发明是以这种认识为根据展开的。
                       发明的公开
本发明涉及松蘑(Tricholoma matsutake)热水提取液或者松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分。
本发明还涉及含有松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分、以及可药用载体的免疫增强组合物、杀伤活性诱导(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)组合物、肿瘤增殖抑制组合物、白介素12诱导组合物、TGF-β活性抑制组合物以及活性氧捕获组合物。
本发明还涉及单独含有松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分的或根据需要同时含有1种或1种以上食品成分的免疫增强功能性食品、杀伤活性诱导(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)功能性食品、肿瘤增殖抑制功能性食品、白介素12诱导功能性食品、TGF-β活性抑制功能性食品以及活性氧捕获功能性食品。
此外，本发明涉及包括将松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分以有效量施用给需免疫增强的对象在内的增强免疫的方法。
本发明还涉及包括将松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分以有效量施用给需诱导杀伤活性(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)的对象在内的诱导杀伤活性(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)的方法。
本发明还涉及包括将松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分以有效量施用给需抑制肿瘤增殖的对象在内的抑制肿瘤增殖的方法。
本发明还涉及包括将松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分以有效量施用给需诱导白介素12的对象在内的诱导白介素12的方法。
本发明还涉及包括将松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分以有效量施用给需抑制TGF-β活性的对象在内的抑制TGF-β活性的方法。
本发明还涉及包括将松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分以有效量施用给需捕捉活性氧的对象在内的捕获活性氧的方法。
本发明还涉及松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分在制备免疫增强组合物或免疫增强功能性食品中的应用。
本发明还涉及松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分在制备杀伤活性诱导(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)组合物或杀伤活性诱导(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)功能性食品中的应用。
本发明还涉及松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分在制备肿瘤增殖抑制组合物或肿瘤增殖抑制功能性食品中的应用。
本发明还涉及松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分在制备白介素12诱导组合物或白介素12诱导功能性食品中的应用。
本发明还涉及松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分在制备TGF-β活性抑制组合物或TGF-β活性抑制功能性食品中的应用。
本发明还涉及松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分在制备活性氧捕获组合物或活性氧捕获功能性食品中的应用。
                    附图的简单说明
图1是吸附组分D2用1H一级NMR测定所得到的谱图。
图2是吸附组分D2用13C一级NMR测定所得到的谱图。
图3是吸附组分D2的根据偏振光圆二色性分析所得到的CD谱图。
                    实施发明的优选方式
以下，详细说明本发明。
可用热水从松蘑(Tricholoma matsutake)中提取，并用阴离子交换树脂吸附所得到的本发明的新型组分，尽管经过热水提取步骤，仍显示出优良的免疫增强活性。而且，松蘑热水提取液也显示出优良的免疫增强活性。另外，松蘑碱性溶液提取液也显示出优良的免疫增强活性。并且，将上述碱性溶液提取液经阴离子交换树脂吸附后所得到的本发明的新型组分也显示出优良的免疫增强活性。
因此，本发明的免疫增强组合物中含有(1)松蘑热水提取液、(2)松蘑碱性溶液提取液、(3)松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分以及(4)松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分作为有效成分，并且还含有药剂学上或兽医学上所允许的常规载体。
本发明的免疫增强组合物中有效成分松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分，例如用热水进行松蘑的提取(以下，称为“热水提取步骤”)，所得到的提取液经阴离子交换树脂吸附后(以下，称为“阴离子交换树脂吸附步骤”)，用适当的洗脱液将吸附组分洗脱(以下，称为“洗脱步骤”)来得到，但并不限定与此。
用于热水提取步骤的上述松蘑，例如天然松蘑的子实体或菌丝体、或是经培养得到的松蘑菌丝体或培养物(Broth)。用于培养的上述松蘑，例如吴羽化学工业株式会社生物医学研究所建立并保存的松蘑CM627-1株。
当以子实体或者菌丝体作为上述松蘑使用时，为了提高提取效率，优选以破碎物或者粉体形式进行加工。
热水提取步骤中所使用的热水的温度优选60～100℃，更优选80～98℃。在提取时为了提高提取效率，优选边搅拌或震荡边进行提取。提取时间例如可以根据松蘑的状态(即子实体、菌丝体、或者培养物的状态，或加工为破碎物或粉体形式时的加工状态)、热水温度、或有无搅拌或震荡等条件采取适宜确定，通常为1～6小时，优选2～3小时。
热水提取步骤中所得到的提取液能够以含不溶物的混和状态直接用于下一步的阴离子交换树脂吸附步骤，不过优选除去不溶物后或者除去不溶物且除去提取液中的低分子组分后，再进行下一步的阴离子交换树脂吸附步骤。例如，可以通过离心分离将混有不溶物的热水提取液中的不溶物除去，然后仅将得到的上清用于下一步的阴离子交换树脂吸附步骤。或者将混有不溶物的热水提取液经离心得到的上述上清进行透析，除去小分子组分(优选分子量为3500以下的组分)，然后将其用于下一步的阴离子交换树脂吸附步骤。
阴离子交换树脂吸附步骤所用的阴离子交换树脂可以使用公知的阴离子交换树脂。例如，二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素或者三乙基氨基乙基(TEAE)纤维素。
洗脱步骤所使用的洗脱液可以根据所使用的阴离子交换树脂的种类而适当选择，例如氯化钠水溶液等。
洗脱步骤所洗脱出的组分可以直接作为本发明免疫增强组合物的有效成分使用，不过通常因为含有来自洗脱液的盐类，所以优选再经透析将其除去。
本发明的免疫增强组合物中有效成分松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分具有以下理化性质，不过并非仅限于此。并且，以下所示的各个数值是松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分的一种形式，即、后述的实施例2所制备的吸附组分D2的理化性质，它是根据后述实施例的“吸附组分D2的理化性质的研究”中所记载的各种测定方法得到的数据。
(1)糖类含量：换算成葡萄糖为13％。
(2)蛋白质含量：换算成白蛋白为86％。
(3)糖组成：甘露糖47.7μg/mg、半乳糖32.43μg/mg、葡萄糖25.09μg/mg、阿拉伯糖12.09μg/mg、核糖8.30μg/mg、木糖3.75μg/mg、以及鼠李糖0.44μg/mg。
(4)氨基酸组成：天冬氨酸以及天冬酰胺14.12mol％、苏氨酸6.39mol％、丝氨酸7.64mol％、谷氨酸以及谷胺酰胺13.83mol％、甘氨酸14.03mol％、丙氨酸7.77mol％、缬氨酸5.36mol％、半胱氨酸0.87mol％、蛋氨酸1.11mol％、异亮氨酸3.70mol％、亮氨酸5.20mol％、酪氨酸1.51mol％、苯丙氨酸2.28mol％、赖氨酸4.05mol％、组氨酸1.67mol％、精氨酸2.52mol％、以及脯氨酸7.93mol％。
(5)分子量分布：广泛分布于约4.5万～100万之间。其中，存在5个峰，推测其各自的分子量为约4.5万、约12万、约16万、约38万、以及100万以上。
(6)等电点：根据等电点电泳法检测出3个峰。主带位于4.8附近(4.5～5.2)，其它带位于7.6附近(7.35～8.0)以及9.2附近(8.65～9.3)。
(7)紫外分光分析：于240～260nm检测出峰(测定条件参照后述的“吸附组分D2的理化性质研究”(7))。
(8)1H一级NMR分析：如图1所示的谱图(测定条件参照后述的“吸附组分D2的理化性质研究”(8)(i))。
(9)13C一级NMR分析：如图2所示的谱图(测定条件参照后述的“吸附组分D2的理化性质研究”(8)(ii))。
(10)偏振光圆二色性分析：如图3所示的谱图(测定条件参照后述的“吸附组分D2的理化性质研究”(9))。根据Chen等人的方法[Biochemistry，11，4120-4131(1972)]解析二级结构，结果为含17％α螺旋、18％β折叠、65％无规卷曲。
本发明的免疫增强组合物中有效成分松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分可以按照先前所说的松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分的制备方法进行制备而得到，不过制备方法不限定于此。即，除了使用碱性溶液代替热水以外，可以按照与松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分的上述制备方法同样的方法进行制备。例如，用碱性溶液进行松蘑的提取(以下，称为碱性溶液提取步骤)，所得到的提取液经阴离子交换树脂吸附后(即，阴离子交换树脂吸附步骤)，以适当的洗脱液洗脱吸附组分(即，洗脱步骤)，即可以得到产物。
作为碱性溶液提取步骤中所使用的碱性溶液，例如可以使用碱金属(例如，钠或者钾)的氢氧化物，特别是使用氢氧化钠的水溶液，不过并非仅限于此。上述碱性溶液的pH优选8～13，更优选9～12。碱性溶液提取步骤优选在0～20℃进行，更优选在0～15℃进行。将碱性提取步骤得到的提取液进行中和处理后，即可用于下一步的阴离子交换树脂吸附步骤。
本发明的免疫增强组合物，可以将有效成分松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分与药剂学上或者兽医学上所允许的常规载体一起施用于动物，优选施用于哺乳动物(特别是人)。
本发明的有效成分松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂的吸附组分具有免疫增强活性，例如杀伤活性(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)的诱导活性、肿瘤增殖抑制活性、细胞因子(尤其是白介素12)诱导活性、TGF-β活性抑制活性或活性氧捕获活性。
因此，本发明的有效成分松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分，可以单独或者优选与药剂学上或者兽医学上允许的常规载体一起，针对需要免疫增强的对象，例如需要诱导杀伤活性(优选肠道淋巴细胞的杀伤活性)的对象、需要抑制肿瘤增殖的对象、需要诱导细胞因子(特别是白介素12)的对象、需要抑制TGF-β活性的对象或需要捕获活性氧的对象，以有效剂量进行施用。
此外，本发明的有效成分松蘑热水提取液松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分可以用于制备免疫增强组合物或者免疫增强功能性食品，例如诱导杀伤活性(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)的组合物或诱导杀伤活性(优选诱导肠道淋巴细胞的杀伤活性)的功能性食品、抑制肿瘤增殖的组合物或抑制肿瘤增殖的功能性食品、诱导白介素12的组合物或诱导白介素12的功能性食品、抑制TGF-β活性的组合物或抑制TGF-β活性的功能性食品、或者捕获活性氧的组合物或捕获活性氧的功能性食品。
本发明的免疫增强组合物的施用剂型没有特殊限定，例如可以是散剂、细粒剂、颗粒剂、片剂、胶囊、悬浊液、乳剂、糖浆剂、酊剂、或丸剂等的口服药剂，或者是注射剂、外用液、软膏、栓剂、局部施用的乳霜、或点眼药等的非口服药剂。
这些口服药剂可以按照常规方法，例如使用明胶、藻酸钠、淀粉、支链淀粉、白糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、羧甲基纤维素、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、结晶纤维素、大豆卵磷脂、蔗糖、脂肪酸酯、滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇、硅酸镁、硅酸酐、或者合成硅酸铝等赋形剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、稀释剂、保存剂、着色剂、香料、矫味剂、稳定剂、保湿剂、防腐剂、或者抗氧化剂等进行制备。
非口服施用的方法，例如有注射(皮下、静脉内等)以及直肠给药等。其中，采用注射剂最为适合。
例如，在调制注射剂时，除了作为有效成分的上述组分之外，可以任意使用如生理盐水或者林格氏液等水溶性溶剂、植物油或者脂肪酸酯等非水溶性溶剂、葡萄糖或者氯化钠等的等渗剂、助溶剂、稳定剂、防腐剂、悬浮剂或乳化剂等。
此外，本发明的免疫增强组合物也可以由使用缓释性聚合物等的缓释制剂的方法进行施用。例如，可以将本发明的免疫增强组合物装入到乙烯醋酸乙烯酯聚合物的颗粒中，并通过外科方法将此颗粒移植到想要治疗或者预防的组织中。
本发明的免疫增强组合物可以含有0.01～99重量％，优选含有0.1～80重量％的松蘑热水提取液或者松蘑碱性溶液提取液、或者松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分，但不仅限于此。
使用本发明的免疫增强组合物释时的给药剂量可以根据疾病的种类、患者的年龄、性别、体重、症状程度以及给药方法等适宜确定，并可以口服使用或非口服使用。
此外，其形式不限于药品，可以是各种形式，例如功能性食品和健康食品(包括饮料)、或作为饲料的饮食物的形式。而且，也可以是暂时性含在口中并且完全吐出的形式，例如以牙粉剂、洗口剂、口香糖、或者漱口剂的形式使用。此外，还能够以从鼻腔吸入的吸入剂的形式使用。例如，能够以添加剂的形式(例如食品添加剂)将松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液、或松蘑热水提取液或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂的吸附组分添加到所希望的食品(包括饮料)、饲料、牙粉剂、洗口剂、口香糖或漱口剂等中。
                         实施例
以下，通过实施例具体说明本发明，不过这些不限定本发明的范围。
实施例1：蘑菇热水提取液的生物活性试验
(1)蘑菇热水提取液的制备
将市售的岩手县产松蘑子实体250g进行冻干以除去水分，之后经磨碎得到35g粉末。
将上述粉末的一部分(20g)和800mL纯水加到1升体积的烧杯中，在搅拌器的搅拌下，在93～98℃的水浴中提取3小时。提取结束后，冷却至室温，进行离心分离(12000rpm，20分钟)，得到上清。
在取得上清后的沉淀部分中加入500mL纯水，进行和上述相同的处理。进行此操作共计3回，将各个操作得到的上清和最先得到的上清合并后，注入到分子量为3500的分级透析膜(Spectra/Por3Membrane；Spectrum，美国)，在自来水的水流中透析2天。将透析膜内液体通过旋转蒸发仪进行浓缩后冻干，得到粉末1.12g。
并且，针对市售的13种食用菌进行和上述相同的处理，分别得到粉末。食用菌的种类和收率(相对于干燥菌体质量％)如表1所示。
表1
No.                 食用菌种类         产率
1                   松蘑               5.6
2                   香菇               6.0
3                   火菇               5.5
4                   平菇               5.3
5                   舞菇               4.9
6                   滑菇               7.0
7                   Eryngii            5.8
8                   岩菇               4.6
9                   木耳               4.8
10                  四孢蘑菇           7.3
11                掬玉菌              6.9
12                白舞菇              5.1
13                蘑菇                6.3
14                Porcini             5.5
(2)蘑菇热水提取液的生物活性测定
将前项(1)得到的食用菌提取液的粉末形式经口施用给小鼠，研究其对肠道淋巴细胞杀伤活性诱导的影响。即从盲肠壁移植有肿瘤细胞的小鼠中取出肠间膜淋巴节细胞，在试管内测定经上述肿瘤细胞再次刺激时的杀伤活性，并检测其生物活性。所使用的肿瘤细胞为小鼠白血病细胞P815和B7/P815细胞，它是将九州大学生体防御医学研究所的原田守博士提供的细胞株用添加有10％的胎牛血清(已于56℃热处理30分钟)的RPMI1640培养基，在吴羽化学工业株式会社生物医学研究所进行传代培养得到的细胞株。动物是由日本SLC购入的雌性DBA/2小鼠，经预饲养后，用8周龄的进行试验。
预先将经戊巴比妥(大日本制药)腹腔用药50mg/kg的处于麻醉状态的小鼠固定，用剪刀和小钳子打开腹部，取出盲肠部分，使用装配有1/8G牙科用注射针头(旗印本木注射针)的1mL体积的注射器，将B7/P815细胞(1×106个/50μL)移植到盲肠壁下，使用解剖用缝合器缝合腹部。将麻醉后苏醒的小鼠放入饲养笼中，在常规饲养环境下饲养。自从移植肿瘤细胞的第二天开始，使用口服给药用探针，将各个样品按照500mg/kg/天连续口服10天(每一组有5～10只)。
在最后给药的第二天，杀死小鼠，无菌条件下取出肠间膜淋巴节，移入已经放入Hanks平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solution)的无菌平皿中。用剪刀和小钳子将淋巴节拆解后，通过过滤网制备成淋巴细胞的单细胞液。用添加10％的胎牛血清(已经于56℃热处理30分钟)的RPMI1640培养基将细胞洗涤3次后，用分别添加10％胎牛血清(已经于56℃热处理30分钟)、5×10-5mol/L的2-巯基乙醇、20mmol/L的4-(2-羟乙基)-1-派嗪乙磺酸、以及30μg/mL庆大霉素的RPMI1640培养基调整细胞浓度为5×106个/mL，作为效应细胞使用。
另一方面，刺激细胞按照以下的流程制备。即，将P815细胞或者B7/P815细胞悬浮于RPMI1640培养基中，制备成为5×106个/mL的悬浮液。并且加入丝裂霉素(Sigma)至50μg/mL，在5％二氧化碳气体培养箱中反应30分钟后，用添加10％胎儿牛血清(已经于56℃热处理30分钟)的RPMI1640培养基洗涤细胞3次，调整细胞浓度至1×105个/mL。
混和淋巴细胞-肿瘤细胞反应(Mixed Lymphocyte Tumor cellReaction)按照以下的条件进行研究。
即，向细胞培养用的平底96孔微型板(Falcon 3072；BectonDickinson Labware，美国)中加入上述的效应细胞和/或者刺激细胞各0.1mL，在5％二氧化碳气体培养箱中培养3天后，用过滤器回收细胞。此外，在效应细胞和刺激细胞两者都加入的情况下，使二者的细胞数之比为12.5(效应细胞/刺激细胞)。在本测定体系中，上述效应细胞是在混和淋巴细胞-肿瘤细胞反应中作为“淋巴细胞”行使功能，上述刺激细胞是作为“肿瘤细胞”行使功能。在培养结束的24小时以前，在平板各孔中加入3H-胸苷(Amersham Japan)37kBq。用5％三氯乙酸将回收的细胞充分洗涤后干燥，并且放入液体用玻璃小瓶中，加入液体闪烁剂，用液体闪烁计数器进行放射性活性测定。
刺激指数(Stimulation Index；S.I.)按照下式计算：
[S.I.]＝(Bmix-Bs)/(Be-Bs)
[式中，Bmix是效应细胞及刺激细胞混和培养组的放射活性(单位＝Bq)，Bs是刺激细胞单独培养组的放射活性(单位＝Bq)，Be是效应细胞单独培养组的放射活性(单位＝Bq)]
另一方面，淋巴细胞-肿瘤细胞混和培养所造成的细胞毒性诱导反应(Lymphocyte Tumor cell Mixed culture-induced Cytotoxicity)按照以下的条件进行研究。
即，向24孔细胞培养用微型板(Culture Clastar)(Costar 3524；Corning Inc.，美国)中加入上述效应细胞和/或刺激细胞(效应细胞数/刺激细胞数＝12.5)各0.1mL，在37℃的5％二氧化碳气体培养箱中培养3天，培养结束后，回收细胞，用添加10％胎儿牛血清(已经于56℃热处理30分钟)的RPMI1640培养基洗涤细胞3次。用显微镜仅进行细胞悬浮液中的效应细胞数的计数，调整效应细胞数为2.5×106个/mL。
另一方面，将另外准备的P815细胞和铬酸钠(Amersham Japan)在37℃反应20分钟。用添加10％胎儿牛血清(已经于56□热处理30分钟)的RPMI1640培养基洗涤细胞3次，除去未结合的放射性物质。并且将放射性铬标记的肿瘤细胞调整至5×104/mL。
在试管中分别加入0.1mL上述效应细胞或者是其2倍稀释系列和放射性铬标记的肿瘤细胞，在37℃的5％二氧化碳气体培养箱中反应4小时，反应结束后，用添加10％胎儿牛血清(已经于56℃热处理30分钟)的RPMI1640培养基于每个试管中加1.5mL，并用混和器充分混和后，离心(1200rpm，5分钟，4℃)，分离上清，用γ计数器测定放射活性。
特异性伤害率[Specific Lysis；S.L.(单位＝％)]可以按照下式计算：
[S.L.％]＝{(B-Bf)/(Bmax-Bf)}×100
[式中，B是试验组上清的放射活性(单位＝Bq)，Bf是自然游离组上清的放射活性(单位＝Bq)，Bmax是最大游离组的放射活性(单位＝Bq)]
自然游离组指的是放射性铬标记的肿瘤细胞单独培养组，最大游离组指的是Triton处置的放射性铬标记肿瘤细胞组。
上述项(1)调制的样品对混和淋巴细胞-肿瘤细胞反应或者对淋巴细胞-肿瘤细胞的混和培养造成的细胞毒性诱导反应的影响的测定结果(效应细胞数/肿瘤细胞数为12.5时的数值)如表2所示。可以看到来自松蘑子实体的样品显示出明显的增强。其中，对照组是口服纯水0.2mL。在表2中，*表示相对于对照组具有p＜0.05的明显差。
表2
                             对于混和淋巴细胞-肿       淋巴细胞-肿瘤细胞混
                             瘤细胞反应的影响          和培养造成的细胞毒性
                                                       诱导反应
No.          样品来源        (相对于对照组的％)        (相对于对照组的％)
1            松蘑            132*                     175*
2            香菇            118                       92
3            火菇            112                       103
4            平菇            111                       103
5            舞菇            108                       118
6            滑菇            107                       103
7            Eryngii         120                       112
8            岩菇            101                       120
9            木耳            109                       103
10           孢蘑菇          106                       113
11           掬玉菌          108                       106
12           白舞菇          110                       114
13           蘑菇            102                       97
14           porcini         116                       103
实施例2：松蘑热水提取液及其阴离子交换树脂吸附组分的制备
将吴羽化学工业株式会社生物医学研究所建立和传代保存的松蘑CM627-1株菌丝体接种到10个已经放入100mL灭菌培养基(3％葡萄糖、0.3％酵母提取物，pH6.0)的500mL体积三角瓶中，并且在22℃、250rpm的振荡培养仪中培养4周。用匀浆器处理所得的培养物后，在搅拌器的搅拌下，在93～98℃的水浴中提取3小时。提取结束后，冷却至室温，通过离心分离(12000rpm，20分钟，4℃)得到上清。
向沉淀中加入纯水500mL，进行和上述相同的处理.此操作共进行3次，之后将上清全部合并，注入到透析膜(Spectra/Por3Membrane，分子量3500分级)中，在自来水的水流中透析3天。将透析膜内液体用旋转蒸发仪进行浓缩后冻干，得到粉末(组分D)3.9g。
接着，将上述粉末(组分D)溶于50mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)中，然后加到预先经上述缓冲液平衡的二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素柱(直径＝3cm，高度＝20cm)上，然后，流入上述缓冲液100mL，得到非吸附组分D1(以下，称为“D1组分”)。然后，调制200mL向上述缓冲液中加1mol/L氯化钠的溶液，将其流经上述柱子，洗脱吸附物，得到吸附组分D2(以下，称之为“D2组分”)。将得到的非吸附组分和吸附组分分别注入到透析膜(Spectra/Por3Membrane，分子量3500分级)中，在自来水的水流中透析3天。将透析膜内液体用旋转蒸发仪进行浓缩后冻干，得到非吸附组分D1粉末1.9g和吸附组分D2粉末1.5g。
根据“上述蘑菇热水提取液的生物活性试验”(2)同样的方法，研究各个组分的免疫活性，如表3所示，吸附组分D2经确认具有活性。在表3中，*表示相对于对照组具有p＜0.01的明显差，**表示相对于对照组具有p＜0.05的明显差。组分D指的是过EAE纤维素柱之前的组分
表3
                                混和淋巴细胞-肿瘤细      淋巴细胞-肿瘤细胞混
                                胞反应                   和培养所造成的细胞毒
                                                         诱导反应
实验No.     样品/给药量         (相对于对照组的％)       (相对于对照组的％)
1           D/250mg/kg          158*                    153*
            D1/250mg/kg         103                      109
            D2/250mg/kg         162*                    171*
2           D2/2.5mg/kg         106                      110
            D2/25mg/kg          134**                   143*
            D2/250mg/kg         151*                    167*
吸附组分D2的理化性质的研究
进行D2组分的理化性质的研究，其测定方法和结果如下所示。
(1)糖的定量
使用苯酚硫酸法进行比色定量。D2组分的糖含量以葡萄糖换算值计为13％。
(2)蛋白质的定量
使用Folin铜法进行比色定量。D2组分的蛋白质含量以白蛋白换算值计为86％。
(3)糖的组成分析
将1.0mg D2组分和0.2mL的2mol/L三氟醋酸加到封口管中，在100℃下水解6小时后，用蒸发仪进行减压干燥，获得残渣。将残渣溶于500μL纯水中，再用纯水进行2倍或者10倍稀释。向50μL该溶液中加入500ng内标物庚糖，并且加到装配有柱TSK-gel SugarAXGLC-9A 15cm×4.6mm ID(东梭)以及检测器分光光度计RF-535(岛津制作所)的高速液相色谱仪LC-9A(岛津制备所)上。柱温70℃，流动相及其流速分别为0.5M硼酸钾缓冲液(pH8.7)、0.4mL/分钟。柱后标记的条件是使用1％精氨酸/30％硼酸作为反应试剂，流速为0.5mL/分钟，反应温度是150℃，检测波长为EX 320nm和EM 430nm。
糖组成按照由多到少的次序分别为甘露糖47.7μg/mL、半乳糖32.43μg/mL、葡萄糖25.09μg/mL、阿拉伯糖12.09μg/mL、核糖8.30μg/mL、木糖3.75μg/mL以及鼠李糖0.44μg/mL。
(4)氨基酸组成分析
将1.0mg D2组分和6mol/L盐酸0.1mL加到封口管中，在110℃水解22小时后，用蒸发仪进行减压干燥，得到残渣。将残渣溶解到1.0mL纯水中，取其中50μL用于氨基酸分析。所用装置为日立L-8500型氨基酸分析仪(日立制作所)，并且用茚三酮显色进行定量。
氨基酸组成为天冬氨酸以及天冬酰胺14.12mol％、苏氨酸6.39mol％、丝氨酸7.64mol％、谷氨酸以及谷胺酰胺13.83mol％、甘氨酸14.03mol％、丙氨酸7.77mol％、缬氨酸5.36mol％、半胱氨酸0.87mol％、蛋氨酸1.11mol％、异亮氨酸3.70mol％、亮氨酸5.20mol％、酪氨酸1.51mol％、苯丙氨酸2.28mol％、赖氨酸4.05mol％、组氨酸1.67mol％、精氨酸2.52mol％以及脯氨酸7.93mol％。
(5)分子量分布的测定
将1.0mg D2组分溶于1.0mL纯水中之后，用0.22μm过滤器过滤得到滤液。将此滤液加至装配有柱Asahipak GS-620 50cm×7.6mm ID(旭化成)、差示折射计检测器RID-6A(岛津制作所)、以及紫外线检测器SPD-6A(岛津制作所)的高速液相色谱仪装置LC-9A(岛津制作所)。柱温为室温，流动相及其流速分别为纯水和0.5mL/分钟。
分子量分布为广泛分布于约4.5万～100万之间。其中存在5个峰，推测其各自的分子量为约4.5万、约12万、约16万、约38万、以及100万以上。
(6)等电点分析
将190μg D2组分溶解到20μL纯水中，其一半量中加入40％(体积/体积)左右的蔗糖，进行电泳。电泳条件如下。
胶：IEF-PAGE mini(4％，pH3～10；TEFCO公司)
电泳缓冲液：(阴极)0.04mol/L氢氧化钠溶液、(阳极)0.01mol/L磷酸溶液
电泳条件：在100V进行30分钟电泳后，于300V进行20分钟电泳，再于500V进行40分钟电泳。
PI标准物：各带为1.35g(Pharmacia)
检测出3个宽峰。主带位于4.8附近(4.5～5.2)，其它带位于7.6附近(7.35～8.0)以及9.2附近(8.65～9.3)。
(7)紫外线分光分析(UV)
溶于纯水，在0.5mg/10mL的浓度下进行测定。使用2500PC(岛津制作所)装置。于240～260nm检测出峰。
(8)核磁共振分析(NMR)
测定条件如下。
(i)1H一级NMR测定
使用UNITY INOVA-500型(Varian公司)为测定装置。用氘化盐酸胍D2O溶液作为溶剂。浓度为4mol/L，内标使用DDS，在温度23□下进行测定。
所得到的谱图示于图1。在糖1位质子特征性的4.5ppm～5.0ppm附近，检测到被认为是半乳糖或者葡萄糖的α1位的峰。另外，在5.0～5.2ppm附近，检测到被认为是半乳糖或者葡萄糖的β1位的峰。
(ii)13C一级NMR测定
在观测频率为150.8MHz进行测定。浓度是20.3mg/0.75mL，内标是重甲醇(3％重水溶液，δ＝49ppm)，温度为45℃，脱偶合在1H完全脱偶合的条件下进行测定。
结果示于图2。103～104ppm附近的宽峰是半乳糖或者葡萄糖的1位碳，可以认为是通过β型糖苷键结合。102.96ppm和102.51ppm的各个峰可以认为分别是通过甘露糖的α1位及β1的糖苷键结合。99.17ppm的峰是半乳糖或者葡萄糖的α1位，仍可以认为是通过糖苷键结合。
对于1位以外，进行60～80ppm峰的化学位移的解析。比较各个单糖的化学位移，认为半乳糖或葡萄糖的β2位碳、或甘露糖2位(α，β)的碳有变化。对于半乳糖或葡萄糖的α型碳，其化学位移与单糖比较未发生变化，因此推测6位发生变化并与甘露糖4位的信号(67.8ppm)重叠(该此峰的强度大，故有此推测)。由以上可知，在1位以外参与结合的糖的位置是半乳糖或葡萄糖的2位(β型)和6位(α型)、或者是甘露糖的2位(α，β型)。但由于峰整体较宽、S/N也差，所以解析的精度不高。
(10)偏振光圆二色性分析(CD)
测定的条件如下。
用JASCOJ-500A作为测定装置，以水为溶剂。在蛋白质浓度为0.125mg/mL，波长范围是200～250nm，单元长度为1mm，温度为室温(24□)，累计次数是8次的条件下进行测定。
所得到的CD光谱示于图3。CD值(纵轴)以平均残基椭圆率[θ]表示。[θ]的单位是deg·cm·decimol-1。换算成[θ]时的平均残基分子量为103.45(根据氨基酸分析得到)。二次结构解析根据Chen等人的方法计算，结果为含17％α螺旋、18％β折叠、65％无规卷曲。
吸附组分D2的生物活性评价例
(1)吸附组分D2的肉瘤180肿瘤增殖抑制活性
使用由日本CLEA(株)购入的ICR雌性小鼠作为试验动物，用在吴羽化学工业株式会社生物医学研究所的ICR雌性小鼠腹腔内传代培养的肉瘤180细胞作为肿瘤细胞。即，在5周龄的ICR雌性小鼠的腋窝部皮下，移植106个肉瘤180细胞(1组＝10只)。从移植后的第二天起，将上述实施例2中得到的吸附组分D2按照定量(1.0mg/kg、10mg/kg或50mg/kg)隔日10次，腹腔内施用，在移植后第25天杀死小鼠取出肿瘤结节，测定重量。对照组设计成生理盐水施用组。
根据下式计算增殖抑制率(单位＝％)：
[增殖抑制率(％)]＝{(Wc-W)/Wc}×100
[式中，W是样品处置组的平均结节重量(单位＝g)，Wc是生理盐水处置组的平均结节重量(单位＝g)]
结果如表4所示。表中，*表示相对于对照组具有p＜0.05的明显差。由表4可以明确，通过施用D2组分可观测到明显的增殖抑制。
表4
No.             样品/施用量              增殖抑制率％
1               D2组分/1.0mg/kg          65％*
2               D2组分/10mg/kg           76％*
3               D2组分/50mg/kg           46％
(2)吸附组分D2的细胞因子诱导活性
将8周龄的DBA/2雌性小鼠杀死后放血，无菌条件下取出肠间膜淋巴节，转移到装有Hanks平衡盐溶液的无菌玻璃平皿中。用剪刀和小钳子将淋巴节拆解后，通过滤网并制备淋巴细胞单细胞液。用添加10％胎牛血清(已经于56℃热处理30分钟)的RPMI1640培养基洗涤细胞3次后，调整细胞数为2×106个/mL。将上述实施例2得到的吸附组分D2溶于培养基中，过滤除菌，调整样品溶液至250μg/mL。在96孔的细胞培养用平底微型板(Falcon 3072；Becton DickinsonLabware，美国)中加入上述细胞和样品各0.1mL，于37℃的5％二氧化碳气体培养箱中培养18小时后，离心分离出上清。使用市售的测定试剂盒(Intertest 12X；Genzyme公司，美国)测定培养上清中的白介素12总含量。结果如表5所示。由表5可以确认，D2组分具有白介素12诱导活性。
表5
                                    总白介素12含量
No.         样品                    (pg/mL)
1           培养基对照              0(检测限以下)
2           D2组分(125μg/mL)       69
(3)吸附组分D2的免疫抑制物TGF-β结合活性
在蛋白质吸附少的聚丙烯管(Multi siliconized tube，Safe SealMicrocentrifuge Tube；Funakoshi)中，将人基因重组转型增殖因子β1(Transforming Growth Factor-β1(以下，称TGF-β1)；Funakoshi)样品溶于含2％白蛋白的磷酸缓冲液中(pH7.2)，制备成100ng/mL的溶液。另一方面，将上述实施例2得到的吸附组分D2溶于含2％白蛋白的磷酸缓冲液中，调至2mg/mL的浓度。将上述TGF-β1溶液和D2组分溶液各0.5mL加到蛋白质吸附少的管中，于22℃反应3小时。反应结束后，用市售的测定试剂盒(Quantikine Human TGF-β1ELISA Kit；Funakoshi)测定反应液中的TGF-β1含量。
结合率(单位＝％)按照下式计算：
[结合率(％)]＝{Tc-T/Tc}×100
[式中，T为D2组分添加组的TGF-β1实测值(单位＝ng/mL)，Tc是含有2％白蛋白的磷酸缓冲液添加组的TGF-β1实测值(单位＝ng/mL)]。
结果如表6所示。D2组分添加组中可以观测到D2组分和TGF-β1的结合。
表6
No.       样品                                     结合率％
1         添加含有2％白蛋白的磷酸缓冲液(对照)      0
2         D2组分(1mg/mL)                           21
(4)吸附组分D2的活性氧捕获活性
将3.0mol/L的次黄嘌呤溶液1000μL、2U/mL黄嘌呤氧化酶(Boehringer Mannheim)溶液5μL、8mg/mL-D2组分500μL以及RPMI1640培养基495μL加入到试管中后，添加270μmol/L的2-甲基-6-苯基-3，7-二氢咪唑并[1，2-a]吡嗪-3-酮(CLA-phenyl；东京化成)溶液120μL。之后，放入将反应槽温度保持在37℃的化学发光计(Aloka)中，反应30分钟，并测定产生的化学发光量随时间的变化。
捕获活性(单位＝％)按照下式计算：
[捕获活性(％)]＝{Cc-C/Cc}×100
[式中，C是D2组分添加组的化学发光量，Cc是磷酸缓冲液添加组(对照组)的化学发光量]
结果如表7所示。由表7可以明确D2组分具有活性氧捕获活性。
表7
No.          样品                       捕获活性％
1            磷酸缓冲液(pH7.2)          0
2            D2组分(1mg/mL)             96
(5)吸附组分D2的抗肿瘤活性
将吴羽化学工业株式会社生物医学研究所在50mL体积的细胞培养用烧瓶(3014；Becton-Dickinson公司)中传代培养的Swiss Alubino3T3株和SV40转导3T3细胞株[大日本制药株式会社实验产品部(大阪)]，用0.125％胰蛋白酶溶液(Sigma公司)处理数分钟后，使之自烧瓶壁上游离。洗涤后，悬浮于含有10％胎牛血清(已经于56℃热处理30分钟)的DMEM(Dulbecco’s Modification of Eagle’s  Medium)培养基中，调整细胞数为2×103个/mL。将其按每孔0.1mL注入到96孔细胞培养用平底微型板(3072；Bectom-Dickinson公司)的各个孔中。
于37℃的5％二氧化碳气体培养箱中培养24小时后，加入指定量的上述实施例2得到的吸附组分D2或者是培养基0.1mL，再培养24小时。在培养结束的6小时前，添加3H-胸苷(Amersham Internationalplc)1μCi/孔。培养结束后，将细胞用滤纸回收，用5％三氯乙酸将细胞充分洗涤后干燥，用液体闪烁计数器测定细胞中摄入的放射能量。吸附组分D2的50％抑制浓度(LD50)对于SV40转导3T3细胞株是约50μg/mL，对于Swiss Alubino 3T3株是约40μg/mL。另外，根据MTT法测定LD50时，得到与3H-胸苷法测定的结果几乎相同的结果。
实施例3：松蘑碱性溶液提取液及其阴离子交换树脂吸附组分的制备
将由上述实施例2同样方法制备的松蘑CM627-1株菌丝体培养物用匀浆器处理后，添加氢氧化钠溶液至整体浓度为0.1mol/L。在搅拌器的搅拌下，于22℃提取1小时。提取结束后，进行离心分离(12000rpm，20分钟，4℃)，得到上清。
向沉淀中加入0.3mol/L的氢氧化钠溶液，进行与上述相同的处理，得到上清液。进一步向沉淀中加入0.5mol/L的氢氧化钠溶液，进行与上述相同的处理，得到上清液。将全部上清合并，在上述上清中加入1mol/L盐酸，调整pH到7.0后，放入透析膜(Spectra/por3 Membrane，分子量3500分级)，在自来水的水流中透析3天。将透析膜内的液体用旋转蒸发仪进行浓缩后冻干，得到4.3g粉末(以下，称为“组分A”)。
然后，将上述粉末(组分A)溶于50mmol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.0)中，并且将其加至预先经上述缓冲液平衡的二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素柱(直径＝2cm，高度＝20cm)上，接着，流入上述缓冲液100mL，得到非吸附组分A1(以下，称之为“A1组分”)。然后，调制200mL向上述缓冲液中加1mol/L氯化钠的溶液，将其流经上述柱子，洗脱吸附物，得到吸附组分A2(以下，称之为“A2组分”)。将得到的非吸附组分和吸附组分分别注入到透析膜(Spectra/Por3Membrane，分子量3500分级)中，在纯水中透析3天。将透析膜内液体用旋转蒸发仪进行浓缩后冻干，得到非吸附组分A1粉末和吸附组分A2粉末。
组分A的生物活性评价例
根据上述“蘑菇热水提取液的生物活性试验”(2)同样的方法评价T细胞增强活性时，组分A施用组(施用量＝250mg/kg)的活性在混和淋巴细胞-肿瘤细胞反应中为130％(相对于对照组的％)，在淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养造成的细胞毒性诱导反应中为131％(相对于对照组的％)。
根据上述“吸附组分D2的生物活性评价例”(2)相同的方法评价细胞因子诱导活性时，培养基对照组的白介素12总含量在检测限以下，与之相对，组分A添加组的白介素12总含量为69pg/mL。
根据上述“吸附组分D2的生物活性评价例”(3)相同的方法评价TGF-β结合活性时，组分A的结合活性是26％。
                    产业上的实用性
根据本发明的免疫增强组合物，能够增强免疫能力。
以上，通过特定的方案说明了本发明，但业内人士已知的变化和改良也包括在本发明范围内。

Claims (20)

1.一种松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分或松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分。
2.一种免疫增强组合物，它含有选自松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分和松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分的有效成分0.01～99重量％，以及可药用载体。
3.权利要求2所述的免疫增强组合物，免疫增强是杀伤活性诱导。
4.权利要求2所述的免疫增强组合物，免疫增强是肿瘤增殖抑制。
5.权利要求2所述的免疫增强组合物，免疫增强是白介素12诱导。
6.权利要求2所述的免疫增强组合物，免疫增强是TGF-β活性抑制。
7.权利要求2所述的免疫增强组合物，免疫增强是活性氧捕获。
8.一种免疫增强功能性食品，它单独含有选自松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分和松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分的有效成分。
9.一种免疫增强功能性食品，它同时含有选自松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分和松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分的有效成分0.01～99重量％以及1种或1种以上食品成分。
10.权利要求8或9所述的免疫增强功能性食品，免疫增强是杀伤活性诱导。
11.权利要求8或9所述的免疫增强功能性食品，免疫增强是肿瘤增殖抑制。
12.权利要求8或9所述的免疫增强功能性食品，免疫增强是白介素12诱导。
13.权利要求8或9所述的免疫增强功能性食品，免疫增强是TGF-β活性抑制。
14.权利要求8或9所述的免疫增强功能性食品，免疫增强是活性氧捕获。
15.选自松蘑热水提取液、松蘑碱性溶液提取液、松蘑热水提取液的阴离子交换树脂吸附组分和松蘑碱性溶液提取液的阴离子交换树脂吸附组分的有效成分在制备以0.01～99重量％的量含有上述有效成分的免疫增强组合物或免疫增强功能性食品中的应用。
16.权利要求15所述的应用，免疫增强是杀伤活性诱导。
17.权利要求15所述的应用，免疫增强是肿瘤增殖抑制。
18.权利要求15所述的应用，免疫增强是白介素12诱导。
19.权利要求15所述的应用，免疫增强是TGF-β活性抑制。
20.权利要求15所述的应用，免疫增强是活性氧捕获。
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