CN1651041A - 姬松茸水溶性小分子提取物及其制备工艺和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属保健食品和医药技术领域，具体为一种从食用菌姬松茸子实体或人工培养菌丝体中提取的水溶性小分子提取物及其制备工艺和用途。该提取物的分子量小于4000，含有甘露醇(30％以上)、海藻糖(4％以上)、苯丙氨酸、谷氨酸等9种成分。实验研究表明，该提取物对肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，并具有明显的免疫调节功能，而且无毒、无副作用，可用于制备预防和治疗肿瘤病症或免疫相关病症的药物或功能性保健食品。

Description

姬松茸水溶性小分子提取物及其制备工艺和用途

技术领域

本发明属保健食品和医药技术领域，具体涉及一种食用真菌姬松茸水溶性小分子提取物及其制备工艺和在保健食品和医疗药品方面的用途。

技术背景

姬松茸，又称巴西蘑菇，是一种珍贵的食用真菌，在真菌分类上，属于担子菌亚门，层菌纲，散菌目，蘑菇科，蘑菇属，拉丁学名为Agaricus blazei Murill.。该菌原产于巴西、美国、秘鲁等拉美地区。日本于上世纪70年代即已成功引种栽培，随后相继传到越南、泰国、印尼及台湾等东南亚地区，并于上世纪90年代初传入我国。现在福建、浙江等地有大量栽培。同时，有关姬松茸菌丝体的液体培养技术也已研发成功并进行了规模化生产。在成功进行了人工规模化栽培及菌丝体规模化生产的基础上，日本学者又率先对姬松茸的化学成分及其医疗保健功能进行了深入研究，发现其热水提取物及水溶性多糖具有显著的抗肿瘤及调节免疫等生理活性。我国学者也于90年代后期相继开展了其活性成分及其药理活性的研究，证实其热水提取物及水溶性多糖具有抗肿瘤、调节免疫、保肝、降血糖等多种生物活性。迄今为止，相关的研究文献及专利仅发现和证实该真菌热水提取物中的水溶性多糖部分为主要活性成分，其分子量均在10,000以上，属于大分子类活性成分。有关姬松茸中分子量小于4,000的水溶性小分子成分的组成及其生物活性未见专利及文献发表。

发明内容

本发明的目的在于提供一种姬松茸水溶性小分子提取物及其制备工艺，和在保健食品和医疗药品方面的用途。

本发明所提供的姬松茸水溶性小分子提取物，是从食用菌姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取的，分子量低于4,000的小分子化合物的组合物，其中明确不含分子量10,000以上的多糖、蛋白质等大分子组分。

发明人在研究中发现，姬松茸的热水提取物，分别用截留分子量为10,000和4,000的分子筛进行超滤分离后，将热水提取物分成分子量大于10,000，4,000～10,000及分子量小于4,000三个部分。随后的药理学研究证实，这三个部分对S180荷瘤小鼠均具有显著的抑瘤活性，并且以分子量小于4,000的水溶性小分子部分活性最强(见实施例1)。

通过对该分子量小于4,000的活性水溶性小分子部位进行系统的化学成分分离和鉴定，共分离鉴定了9个化合物，其名称是：甘露醇(mannitol)，海藻糖(trehalose)，苯丙氨酸(phenylalanine)，谷氨酸(glutamic acid)，腺嘌啉核苷(adenosine)，尿嘧啶(uracil)，尿嘧啶核苷(uridine)，脱氧尿嘧啶核苷(dexoxyuridine)及deoxyfructosazine[2-(arabo-tetrahydroxybutyl)-5-(erythro-2，3，4-trihydroxylbutyl)pyrazinetrehalose]。这9个化合物均为发明人首次从该真菌中发现(见实施例2)。

采用HPLC-ELSD对该活性部位中的主要成分甘露醇(Mannitol)及海藻糖(Trehalose)进行含量测定分析，结果表明该部位中甘露醇含量大于35％，海藻糖含量大于4％，两者均为姬松茸小分子提取物的主要成分(见实施例3)。

本发明还提供了一种姬松茸水溶性小分子提取物的最佳提取和制备工艺，简称为醇提工艺。

该工艺的具体方法和步骤为：对食用菌姬松茸子实体或人工培养菌丝体，用6-20倍量(体积(升)/重量(公斤))浓度为15-95％的乙醇溶液进行提取，每次提取时间为1-3小时，连续提取1-3次，合并提取液。经正交实验设计，确定了最佳提取工艺为：所用的乙醇浓度为75％，其用量(体积)为姬松茸原料用量(重量)的8倍(升/公斤)，每次提取1.5小时，连续提取2次。

上述提取液合并后，可通过抽滤、超滤或离心过滤后获得澄清的提取液。如果在抽滤、超滤或离心过滤之前使用一定量的澄清剂，如101果汁澄清剂，ZTC1+1天然澄清剂等，则过滤和澄清的效果更为理想。对澄清后的提取液进行乙醇回收和浓缩处理；对浓缩后的提取液再通过真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥，获得粉末状提取物，以便用于各种制剂。也可将浓缩后的提取液用水稀释配成一定浓度直接用于制备口服液等液体制剂(见实施例4)等。

本发明还提供了姬松茸水溶性小分子提取物的另一种有效的提取制备工艺，简称为水提醇沉工艺。

该工艺的方法与通常所用的从植物中提取制备多糖成分的方法类同。不同的只是本工艺的目标提取物为水提醇沉后的澄清液部分(含小分子)，而不是沉淀部分(含多糖、蛋白质等大分子)。该制备工艺的具体步骤为：姬松茸子实体或菌丝体材料，以6-20倍量(重量比)的水加热提取，每次加热1-3小时，连续提取1-3次。合并提取液，以抽滤法、超滤法或离心过滤法进行澄清。澄清液浓缩成稠浸膏后，在搅拌条件下缓缓加入浓度为50-95％的乙醇液，充分搅拌后静置8小时以上，获得澄清液。分取上清液，浓缩、干燥成粉末，或直接稀配成水溶性制剂(见实施例5)。

本发明还提供了姬松茸水溶性小分子提取物的又一种有效制备工艺，简称水提超滤工艺。

该工艺的水提步骤与前述水提醇沉法的水提步骤相同，即姬松茸子实体或菌丝体材料，以6-20倍量(重量比)的水加热提取，每次加热1-3小时，连续提取1-3次，合并滤液，以抽滤法或离心法进行初步的澄清净化。与上述醇沉工艺不同之处在于，本法不是采用醇沉工艺分离小分子和大分子，而是采用截留分子量为4,000的超滤膜进行超滤分离。上述澄清净化后的提取液，通过分子量4,000的超滤膜进行反复超滤后，膜上未通过部分为大分子多糖，通过膜的澄清液即为分子量低于4,000的水溶性小分子提取液(提取流程见图1所示)。将该部分浓缩后直接配制成口服液等液体制剂，或通过喷雾、真空干燥或冻干法制备成粉末，供制备片剂，胶囊剂，合剂等固体制剂之用(见实施例6)。

本发明对上述姬松茸水溶性小分子提取物进行了动物实验，表明本提取物无毒、无副作用，对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，同时具有明显的免疫调节功能。具体试验结果如下：

试验例1：急性毒性实验

小鼠急性毒性试验结果表明，以最大浓度，最大给药容积灌胃给予小鼠，其最大给药量为80.0g/kg，约为临床推荐剂量的160倍。

试验例2：姬松茸水溶性小分子提取物对小鼠S180肉瘤的抑制作用

(1)试验目的

测试姬松茸水溶性小分子提取物对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用。

(2)受试药物

名称：姬松茸水溶性小分子提取物(A)，发明人自行制备。

配制：用蒸馏水配成溶液

(3)对照样品

云芝糖肽胶囊，上海新康制药厂生产，批号：990801，规格：每粒0.34g。

(4)动物

昆明种小鼠，雄性，体重：18-22g，每组10只，由中科院上海实验动物中心提供。

(5)移植性肿瘤：小鼠S180肉瘤，购自中科院上海细胞所。

(6)试验方法

取生长良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水以1∶4稀释，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml，随机分组。姬松茸水溶性小分子提取物(A)设0.5、0.25、0.125g/kg三个剂量组，云芝糖肽对照组0.5g/Kg，接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，连续灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物，称体重，解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：

(7)试验结果

姬松茸水溶性小分子提取物(A)在剂量0.5、0.25、0.125g/kg时，对小鼠S180肉瘤的抑制率分别为76.11、57.52、59.73％，与对照组比较具显著性差异。试验结果见表1及图片1。

(8)试验结论

姬松茸水溶性小分子提取物(A)对小鼠S180肉瘤的生长有明显的抑制作用。

试验例3.姬松茸水溶性小分子提取物对免疫功能的影响

1.对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

表1.姬松茸水溶性小分子提取物(A)对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用

组别       剂量    给药    动物数     动物体重(g)      瘤重(g)       抑瘤率

          (g/kg)   方案    始  终      (去瘤后)         ±SD           ％

空白对照           po×7   10  10     25.14±4.84     2.26±0.34

云芝糖肽   0.5     po×7   10  10     25.69±2.09     1.12±0.49      50.44

           0.125   po×7   10  10     24.31±3.16     0.91±0.54**    59.73

A          0.25    po×7   10  10     24.65±3.54     0.96±0.52**    57.52

           0.5     po×7   10  10     27.74±2.81     0.54±0.31**    76.11

与对照组比较：**P＜0.01。

(1)试验目的

观察姬松茸水溶性小分子提取物对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的作用。

(2)受试药物

名称及配制方法，同试验2。

(3)对照样品

同试验2。

(4)动物

雌性C57BL/6小鼠，体重：18-20g，由中科院上海实验动物中心提供。

(5)其它材料

培养基：RPMI-1610，Difco产品，内含15％NBS，巯基乙醇，Hepes等。

³H-TdR：上海原子核研究所，放射性浓度1mci/ml。

刀豆球蛋白A(ConA)：Sigma产品，50ug/ml。

(6)试验方法

C57BL/6小鼠30只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞约2×10⁶个，随机分为5组，每组6只，即姬松茸水溶性小分子提取物(A)0.125、0.25、0.5g/kg，云芝糖肽胶囊0.5g/kg，生理盐水对照组，均po×7。给药结束后处死动物，无菌条件下取脾，计数脾细胞，并调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，在96孔培养板上每孔加细胞悬液100ul，ConA 50ul和培养液，各组均设三复孔，37℃，5％CO₂条件下培养18小时，加入³H-TdR 0.5uci/孔，继续培养18小时。用多头细胞收集器收集细胞，在液闪仪上测CPM值，并与对照组比较，结果见表2。

(7)试验结果

姬松茸水溶性小分子提取物在0.125g/kg剂量时，有明显的促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖作用，随着剂量的增大，促进脾淋巴细胞增殖作用也随之增强。

表2.姬松茸水溶性小分子提取物对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

组别          剂量(g/kg)    给药途径   动物数    CPM( x±SD)

生理盐水       25ml/kg      po×7      6         9622±248

云芝糖肽       0.5          po×7      6         12965±3540*

               0.125        po×7      6         12883±2820*

姬松茸水溶性

               0.250        po×7      6         14554±3109**

小分子提取物

               0.500        po×7      6         16840±3398**

与对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01

2.姬松茸水溶性小分子提取物对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响

(1)试验目的

观察姬松茸水溶性小分子提取物口服对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响

(2)受试药物

同试验2。

(3)对照样品

云芝糖肽胶囊，来源，批号，规格同上。

(4)试验动物

品系，体重，性别及来源同上。

(5)其它材料

培养基：³H-TdR同上。YAC-1细胞由中科院上海细胞所提供。

(6)实验方法

靶细胞的标记：取传代后24小时生长良好的YAC-1细胞，按1×10⁶个/ml细胞悬液加³H-TdR 10uci，于37℃，5％CO₂培养箱中培养2小时，每30分钟振荡一次，标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为1×10⁵/ml。

NK细胞活性测定：C57BL/6小鼠30只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞约2×10⁶个，随机分为5组，每组6只，即姬松茸水溶性小分子提取物0.125，0.25，0.5g/kg，云芝糖肽胶囊0.5g/kg，生理盐水对照组，均po×7。末次给药结束后处死动物，无菌条件下取脾，制备脾细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml作效应细胞，另取已培养24小时YAC-1细胞，调整细胞浓度为1×10⁴个/ml作为靶细胞，以靶细胞与效应细胞之比为1∶100的细胞加在96孔细胞培养板上，加入³H-TdR 0.5uci/孔，每组均设三复孔，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，收集细胞，测CPM值，计算特异性抑制百分率(Pi)表示NK细胞活性。

(7)实验结果

连续给药7天后能明显激活NK细胞的活性，剂量与促进作用有一定的相关性，0.5g/kg时激活NK细胞的活性优于同等剂量的云芝糖肽。结果见表3。

3.姬松茸水溶性小分子提取物对荷瘤小鼠IL-2产生的影响

(1)试验目的：观察姬松茸水溶性小分子提取物对荷瘤小鼠IL-2产生的影响

(2)受试药物：同上。

表3.姬松茸水溶性小分子提取物对荷瘤小鼠NK活性的影响

组  别     剂量(g/kg)  给药途径   动物数    CPM( x±SD)   Pi(％)

生理盐水    25ml/kg    po×7      6         34568±2338

云芝糖肽       0.5        po×7    6    21534±2344**    37.71

               0.125      po×7    6    22369±2169**    35.29

姬松茸水溶性

               0.250      po×7    6    20169±1208**    41.65

小分子提取物

               0.500      po×7    6    18946±876**     45.19

与生理盐水组比较：**P＜0.01。

(3)对照样品

云芝糖肽胶囊，来源，批号，规格同上。

(4)试验动物

品系，体重，性别，来源同上。

(5)其它材料

培养基，³H-TdR同上。

(6)试验方法

C57BL/6小鼠30只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞约2×10⁶个，随机分组给药，即姬松茸水溶性小分子提取物0.125，0.25，0.5g/kg，云芝糖肽0.5g/kg，生理盐水对照组，均po×7。末次给药结束后处死动物，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，24孔板上每孔加2ml细胞及ConA 5ug/ml，37℃5％CO₂条件下培养24小时收集上清液，用IL-2依赖性细胞株CTLL，以³H-TdR掺入法测定IL-2活性，并与对照组进行比较。结果见表4。

(7)实验结果

姬松茸水溶性小分子提取物连续给药7天后能促进IL-2的产生，其0.5g/kg组作用最明显。

表4.姬松茸水溶性小分子提取物对荷瘤小鼠产生IL-2的影响

组  别        剂量(g/kg)    给药途径     动物数    CPM( x±SD)

生理盐水       25ml/kg      po×7        6         228±87

云芝糖肽       0.5          po×7        6         435±69*

               0.125        po×7        6         428±56*

姬松茸水溶性

               0.250        po×7        6         529±34**

小分子提取物

               0.500        po×7        6         588±96**

与生理盐水组比较：*P＜0.05；**P＜0.01。

4.对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

(1)试验目的

测试姬松茸水溶性小分子提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

(2)受试药物

同上。

(3)对照样品

云芝糖肽胶囊，来源，批号，规格同上。

(4)试验动物

昆明种小鼠，体重：20-22g，雄性，由中科院上海动物中心提供。每组动物数：8只

(5)试验方法

姬松茸水溶性小分子提取物设三个剂量组(0.125、0.25、0.5g/kg)，另设生理盐水组、云芝糖肽组(0.5g/kg)，连续口服给药6天，末次给药结束后每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml，30分钟后颈椎脱臼处死动物，腹腔注入生理盐水2ml，转动小鼠后，吸出腹腔洗液滴于载玻片上，经漂洗、固定、染色后，油镜下进行巨噬细胞计数。

结果判定根据以下公式：

(6)试验结果

生理盐水组小鼠吞噬百分率和吞噬指数分别为22.10％和0.24；姬松茸水溶性小分子提取物连续给药6天后，高、中、低剂量组均能明显激活小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，吞噬百分率分别为58.63％、46.96％和36.88％，吞噬指数分别为0.64、0.56和0.40，高、中剂量组的作用强度与优于云芝糖肽胶囊。试验结果见表5。

(7)试验结论

姬松茸水溶性小分子提取物连续口服给药6天后，高、中、低剂量组均能明显激活小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

表5.姬松茸水溶性小分子提取物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

组  别          剂量       给药       动物数    吞噬百分率％      吞噬指数

                (g/kg)     方案        (只)         ±SD            ±SD

生理盐水        25ml/kg    po×6        8       20.21±1.98      0.22±0.06

云芝糖肽        0.5        po×6        8       38.54±2.68**    0.44±0.04**

姬松茸水溶性小  0.125      po×6        8       36.88±1.86**    0.40±0.02**

分子提取物      0.250      po×6        8       46.96±2.44**    0.56±0.03**

                0.500      po×6        8       58.63±4.36**    0.64±0.06**

与生理盐水组比较：**P＜0.01。

本发明还提出所述姬松茸水溶性小分子提取物的用途，它可以单独用于制备药物和功能性保健食品，也可以与其它任何中西药物或食物，尤其是与某些具有抗肿瘤和(或)免疫调节的药物或食物配伍，用于制备药物和功能性保健食品。

单独由本发明的提取物制备的药物和功能性保健食品，或由该提取物与其它中西药物或食物组成的复方药物和功能性保健食品，均具有抗肿瘤、调节人体免疫力，增强体质和精力等药理活性，可用于：(1)预防和治疗各类肿瘤；(2)增强肿瘤放、化疗的疗效；(3)降低肿瘤放、化疗的毒、副作用；(4)提高肿瘤病人的生活质量，延长寿命；(5)预防和治疗其他免疫相关的疾病，如风湿、类风湿、红斑狼疮、各类肝炎、糖尿病、哮喘、慢性气管炎等；(6)提高人体的免疫力，该善亚健康状态，防病治病，美容养颜、延年益寿。

当该提取物，或包含该提取物的药物和食物组合，用于上述医疗和保健目的时，可以采用本专业人员所熟知的方法和技术，直接和添加必要的辅料，制成胶囊剂、片剂、注射剂、颗粒剂、口服液、糖浆、膏滋、酒剂、饮料、果汁、速溶茶、冲剂等多种制剂成品。当本发明的提取物被制成片剂时，它含有的赋型剂有：稀释剂，如淀粉、糊精、乳糖等；润湿剂或粘合剂，如：水、乙醇、淀粉浆、糊精、明胶浆、低取代羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂，如：干燥淀粉、泡腾崩解剂、表面活性剂等；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、聚乙二醇6000或4000等。当本发明提取物被制成胶囊剂时，它含有的赋型剂有：稀释剂，如：淀粉、糊精、乳糖、氧化镁、碳酸镁等；润湿剂或粘合剂，如：水、乙醇、淀粉浆、糊精浆、明胶浆、低取代羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂，如：干燥淀粉、泡腾崩解剂、表面活性剂等；并选用明胶硬胶囊壳或软胶囊壳。当本发明药物组合物被制成注射剂时，它含有的赋型剂有：增溶剂，如：吐温-80、甘油等；混悬剂，如：羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素等；抗氧化剂，如：亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠等；渗透压调节剂，如氯化钠或葡萄糖等；减轻疼痛的附加剂，如：苯甲醇、盐酸普鲁卡因等。当本发明药物组合物被制成口服液或饮料时，它含有的赋型剂有：蔗糖水溶液、矫味剂；助悬剂，如羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素等；防腐剂，如尼伯金乙酯或尼伯金甲酯、丙二醇、苯甲酸、山梨醇等。

附图说明

图1为姬松茸热水提取液的超滤分离流程图。

图2为姬松茸水溶性小分子提取物对小鼠S180肉瘤的抑制作用试验结果。

图3为姬松茸热水提取物各部位对小鼠S180肉瘤的抑制作用试验结果。

具体实施方式

实施例1  姬松茸热水提取物的超滤分离及其抗肿瘤活性测定

1、实验目的：

按化合物的溶解性能及分子量大小分离姬松茸热水提取物，确定各部位的抗肿瘤活性。

2、超滤分离：

姬松茸材料粉末1.0kg，以1∶10热水提取2次，每次2小时。合并提取液，静置过夜后离心过滤，取澄清液通过事先处理好的D101大孔吸附树脂柱(内含1.0kg树脂)。让提取液全部通过后再用3倍柱床体积的纯净水冲洗柱床。合并通过液及水洗脱液。先取其中1/3洗脱液，浓缩至稠浸膏(比重＞1.10)，用75％乙醇进行醇沉，边加乙醇边搅拌，静置过夜后分取沉淀，真空干燥，得水提醇沉部分(E)。另2/3洗脱液，先用截留分子量为10,000的膜进行超滤，膜上部分浓缩，真空干燥，得分子量大于10,000的部分(A)。通过液再换截留分子量为4,000的膜进行超滤，膜上部分浓缩，真空干燥，得分子量4,000～10,000的部分(B)。通过液浓缩，真空干燥，得分子量小于4,000的部分(C)。树脂柱用95％乙醇洗脱，得95％乙醇洗脱部分(为水不溶性小分子)(D)。其提取分离流程如图1所示。

3、各部位(A、B、C、D、E)对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用

动物：昆明种小鼠，雄性，体重：18-22g，每组10只，由中科院上海实验动物中心提供。

移植性肿瘤：小鼠S180肉瘤，购自中科院上海细胞所。

对照药品：云芝糖肽胶囊，上海新康制药厂生产，批号：990801，规格：每粒0.34g。

云芝精华胶囊，百草堂有限公司，批号：3YZ11057，规格：每粒0.4g。

试验方法：取生长良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水以1∶4稀释，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml，随机分组。A、B、C、D各设一个剂量组，0.5g/Kg；E设0.5g/Kg及1.5g/Kg二个剂量组；云芝糖肽及云芝精华对照组各设0.5g/Kg。接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，连续灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物，称体重，解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：

试验结果：A、B、C、D、E各部位在剂量0.5g/kg时，对小鼠S180肉瘤的抑制率分别为27.45，30.39，50.33，41.50和48.37％，与对照组比较具显著性差异。其中以分子量低于4,000的水溶性小分子部分(C)活性最好。试验结果见表6及图片2。

实施例2.姬松茸水溶性小分子化合物的分离和鉴定

1.提取和分离

姬松茸干燥子实体1Kg，粉碎成初粉，用75％乙醇8升回流提取2次，每次2小时，提取液50℃减压浓缩至约500mL后加水稀释至3000mL，过滤，滤液先用D101大孔吸附树脂柱吸附除去脂溶性杂质，通过也浓缩至500mL，低温

表6.姬松茸水提取各部位对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用

组别        剂量   给药    动物数    动物体重(g)     瘤重(g)         抑瘤率

           (g/kg)  方案    始  终    始      终      ±SD            ％

空白对照           po×7   10  10    20.8    27.6    3.06±0.85

云芝精华    0.5    po×7   10  10    19.9    27.0    0.73±0.28**    76.14

云芝糖肽    0.5    po×7   10  10    20.2    27.1    1.18±0.44**    61.44

A           0.5    po×7   10  10    20.4    27.2    2.22±0.54*     27.45

B           0.5    po×7   10  10    20.2    27.5    2.13±0.50**    30.39

C           0.5    po×7   10  10    21.0    27.7    1.52±0.52**    50.33

D           0.5    po×7   10  10    20.5    27.3    1.79±0.23**    41.50

E           0.5    po×7   10  10    20.0    26.8    1.58±0.24**    48.37

E           1.5    po×7   10  10    20.5    2.2     0.84±0.18**    72.55

与对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01。

放置后析出白色结晶。结晶通过Sephadex LH-20纯化后得化合物I；母液经SephadexLH-20反复进行柱层析，以甲-醇水梯度洗脱，依次得到化合物II～IX。

2.化合物结构鉴定

化合物I：无色针晶，易溶于水，难溶于甲醇。EI/MS m/z：183[M+H]⁺，165[M+H-1H₂O]⁺，147[M+H-2H₂O]⁺，129[M+H-3H₂O]⁺；¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆δ：Hz)：4.39(2H，d，J＝5.5Hz，OH-2，5)，4.30(2H，t，J＝5.5Hz，OH-1，6)，4.11(2H，d，J＝7.0Hz，OH-3，4)，3.60(2H，m，H-1_a，6_a)，3.54(2H，t，J＝7.0Hz，H-3，4)，3.46(2H，m，H-2，5)，3.37(2H，m，H-1_b，6_b)；¹³C NMR(500MHz，DMSO-d₆，δ：Hz)：71.2(C-2，5)，69.6(C-3，4)，63.8(C-1，6)。以上数据和文献报导一致，为甘露醇(mannitol)。

化合物II：无色针晶，易溶于水，甲醇，乙醇。¹H NMR(500MHz，D₂Oδ：Hz)：7.42、7.40、7.38、7.36、7.35、7.31、7.30(5H，单取代苯环)，3.93(1H，t，J＝8.3Hz，H-2)，3.26(1H，dd，J₁＝15.0Hz，J₂＝8.3Hz，H-3_a)，3.08(1H，dd，J₁＝15.0Hz，J₂＝8.3Hz，H-3_b)；¹³C NMR(500MHz，D₂O，δ：Hz)：175.5(C-1)，137.2(C-1’)，131.4(C-3’，5’)，131.1(C-2’，6’)，129.7(C-4’)，58.0(C-2)，38.4(C-3)。以上数据和文献报导一致，为苯丙氨酸(phenylalanine)。

化合物III：无色针晶，易溶于水，甲醇，乙醇。¹H NMR(500MHz DMSO-d₆，δ：Hz)：8.35(s，H-8)，8.14(s，H-2)，7.35(2H，s，加D₂O消失，NH₂)，5.88(1H，d，J＝6.2Hz)，5.43(1H，OH-2’，加D₂O消失)，5.42(1H，OH-3’，加D₂O消失)，5.18(1H，OH-5’，加D₂O消失)，4.60(1H，dd，J₁＝6.2Hz，J₂＝5.7Hz，H-2’)，4.14(1H，dd，J₁＝5.7Hz，J₂＝4.2Hz，H-3’)，3.96(1H，dt，J₁＝4.2Hz，J₂＝3.1Hz，H-4’)，3.67(1H，dd，J₁＝12.0Hz，J₂＝3.1Hz，H-5’_a)，3.55(1H，dd，J₁＝12.0Hz，J₂＝3.1Hz，H-5’_b)；¹³C NMR(500Hz，D₂O，δ：Hz)：156.6(C-6)，153.1(C-2)，149.7(C-4)，140.7(C-8)，119.9(C-5)。以上数据和文献报导一致，为腺嘌呤核苷(adenosine)。

化合物IV：白色无定性粉末，易溶于水。UV λ_max ^H2o(nm)：210；274.8；IR υ_max ^KBR(cm^-1)：3284、2935、1537、1047、1018、876；ESIMS(m/z)：327.6[M+Na]⁺；¹H NMR(500MHz DMSO-d₆，δ：Hz)：8.54(1H，s，H-3)，8.33(1H，s，H-5)，5.33(1H，d，J＝4.2Hz，OH-1’)，4.94(1H，bs，H-1’)，4.72(1H，bs，OH-4″)，4.67(1H，bs，OH-3’)，4.62(1H，d，J＝5.7，OH-2″)，4.43(1H，bs，OH-2’)，4.41(1H，bs，OH-3″)，4.39(1H，bs，OH-6’)，3.74(1H，m，H-3’)，3.64(1H，m，H-4’_a)，3.62(1H，m，H-2’)，3.60(1H，m，H-2″)，3.56(1H，m，H-4″_a)，3.45(1H，m，H-4’_b)，3.41(1H，m，H-4″_b)，3.38(1H，m，H-3″)，3.06(1H，dd，J₁＝14.0Hz，J₂＝2.1Hz，H-1”_b)，2.71(1H，dd，J₁＝14.0HZ，J₂＝9.7Hz，H-1”_a)；¹³C NMR(500MHZ，DMSO-d₆，δ：ppm)：158.22(C-2)、141.02(C-3)、143.35(C-5)、154.36(C-5)、72.0(C-1’)、74.3(C-2’)、71.8(C-3’)、64.0(C-4’)、39.2(C-1”)、71.7(C-2”)、75.5(C-3”)、63.7(C-4”)。HSQC[DMSO-d₆，500MHZδ：ppm，炭谱(相关氢谱)]：143.4(8.54)，141.0(8.33)，75.5(3.38)，74.3(3.62)，72.0(4.94)，71.8(3.74)，71.7(3.60)，64.0(3.64，3.45)，63.7(3.56，3.41)，39.2(2.71；3.06)；HMBC显示为2、5取代吡嗪。以上数据核文献报道一致，为deoxyfructosazine[2-(arabo-tetrahydroxybutyl)-5-(erythro-2，3，4-trihydroxylbutyl)pyrazinetrehalose]。

化合物V：白色针晶，易溶于水。¹H NMR(500MHz DMSO-d₆，δ：Hz)：4.87(2H，d，J＝3.6Hz，H-1，1’)，4.77(2H，t，J＝5.7Hz，OH-4，4’)，4.76(2H，t，J＝5.7Hz，OH-2，2’)，4.60(2H，d，J＝6.2Hz，OH-3，3’)，4.35(2H，t，J＝5.7Hz，OH-6，6’)，3.64(2H，m，H-5，5’)，3.56(2H，m，H-4，4’)，3.54(2H，m，H-6_a，6’_a)，3.47(2H，m，H-3，3’)，3.23(2H，m，H-6_b，6’_b)，3.12(2H，dd，J₁＝5.7HZ，J₂＝3.6Hz，H-2，2’)；¹³C NMR(500MHZ，DMSO-d₆，δ：ppm)：93.6(C-1)，73.4(C-3)，72.9(C-2)，72.1(C-4)，70.6(C-5)，61.3(C-6)。以上数据核文献报道一致，为海藻糖(trehalose)。

化合物VI：白色片装结晶，易溶于水。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆，δ：Hz)：4.09(1H，dd，J₁＝9.0Hz，J₂＝4.4Hz，H-2)，2.32(1H，m，H-4_a)，2.13(2H，m，H-3)，1.96(1H，m，H-4_b)，¹³C NMR(500MHz，DMSO-d₆，δppm)：178.9(C-5)，176.2(C-1)，56.6(C-2)，30.8(C-4)，26.4(C-3)。以上数据核文献报道一致，为谷氨酸(glutamic acid)。

化合物VII：白色针晶，易溶于水，甲醇。¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆，δ：Hz)：7.39(1H，d，J＝7.6Hz，H-5)，5.44(1H，d，J＝7.6Hz，H-6)；¹³C NMR(500MHZ，DMSO-d₆，δ：ppm)：166.1(C-4)，153.3(C-2)，144.0(C-6)，102.0(C-5)。以上数据核文献报道一致，为尿嘧啶(Uracil)。

化合物VIII：白色针晶，易溶于水，甲醇。¹H NMR(500MHz，D₂O，δ：Hz)：7.75(1H，d，J＝8.0Hz，H-5)，5.78(1H，d，J＝5.7Hz，H-1’)，5.76(1H，d，J＝8.0Hz，H-6)，4.33(1H，dd，J₁＝5.7Hz，J₂＝5.2Hz，H-2’)，4.21(1H，dd，J₁＝5.7Hz，J₂＝5.2Hz，H-3’)，4.12(1H，m，H-4’)，3.90(1H，dd，J₁＝12.8Hz，J₂＝2.4Hz，H-5’_a)，3.79(1H，dd，J₁＝12.8Hz，J₂＝4.2Hz，H-5’_b)；¹³C NMR(500MHZ，D₂O，δ：ppm)：168.1(C-4)，153.6(C-2)，143.7(C-6)，104.2(C-5)，91.3(C-1’)，86.2(C-4’)，75.6(C-3’)，71.4(C-2’)，62.7(C-5’)。以上数据核文献报道一致，为尿嘧啶核苷(uridine)。

化合物IX：白色针晶，易溶于水，甲醇。¹H NMR(500MHz，D₂O，δ：Hz)：7.75(1H，d，J＝8.0Hz，H-5)，5.76(1H，d，J＝8.0Hz，H-6)，4.71(1H，t，J＝4.6Hz，H-1’)，4.53(1H，m，H-3’)，4.25(1H，m，H-4’)，3.89(1H，dd，J₁＝12.8Hz，J₂＝3.0Hz，H-5’_a)，3.78(1H，dd，J₁＝12.8Hz，J₂＝3.0Hz，H-5’_b)，2.84(1H，dd，J₁＝18.3Hz，J₂＝5.9Hz，H-2’_a)，1.82(1H，dd，J₁＝18.3Hz，J₂＝5.9Hz，H-2’_b)；¹³C NMR(500MHZ，D₂O，δ：ppm)：168.1(C-4)，153.6(C-2)，143.7(C-6)，104.2(C-5)，82.1(C-4’)，79.0(C-1’)，69.2(C-3’)，66.7(C-5’)，39.6(C-2’)。以上数据核文献报道一致，为脱氧尿嘧啶核苷(deoxyuridine)。

实施例3.HPLC-ELSD法测定姬松茸水溶性小分子提取物中甘露醇及海藻糖的含量

1、仪器与试剂：

Angilent 1100色谱仪，包括G1311A四元泵，G1322A在线脱气机，PL-ELS1000 ELSD检测器，HP ChemStation(Rev.A.07.01)液相色谱工作站。

对照品甘露醇、海藻糖均为本室制备，纯度大于98％；

乙腈、水均为色谱纯。

2、测定方法：

(1)色谱条件：色谱柱Waters Spherisorb NH₂(4.6×250nm，5μm)；流动相75％乙腈：25％water；流速：1.2mL/min。

(2)标准曲线：准确称取干燥至恒重的甘露醇和海藻糖各200.0mg，混合后溶于适量的蒸馏水中，加水定容至50ml作为储备标准液。取1.0，2.0，3.0，4.0，6.0和8.0mL储备标准液，加水定容至10mL；另取2.5mL和5.0mL储备标准液，加水定容至100mL，配成含量100-4000μg/mL的系列标准品溶液。用上述色谱条件进行分析，进样量20μL。以峰面积为纵坐标，以样品浓度(μg/mL)为横座标，绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数r。测得甘露醇的回归方程为Y＝0.00082876X²+2.81355X-195.19，r＝0.9999；海藻糖的回归方程为Y＝0.00036772X²+1。84019X-52。39314，r＝0.9999。

(3)精密度实验：称取姬松茸水溶性小分子提取物样品0.5g溶于100mL蒸馏水中，定溶至刻度。从中精取8.0mL，用蒸馏水定容至10ml，同法配制5份。分别进样20uL，按上述条件进行分析，测定结果如下：

(4)回收率实验：取上述样品溶液8mL，加14.0mg甘露醇和13.0mg海藻糖，蒸馏水定容至10ml，同法制备5份。同法测定，得回收率分别为102.8％和105.8％。

(5)稳定性实验：取上述(3)中配制的样品，分别于0min、30min、60min、2h、4h和8h测定含量，测定结果如下：

          精密度实验结果                             回收率实验结果

        Mannitol Trehalose                        Mannitol   Trehalose

1       1691.54  453.01              1            2271.96    1597.65

2       1713.79  460.53              2            2269.06    1633.05

3       1671.59  462.78              3            2286.47    1595.57

4       1656.24  467.08              4            2273.42    1559.59

5       1676.91  454.6               5            2247.16    1667.67

均值    1682.01  460.85              均值         2269.61    1610.71

STD     21.79    5.89                回收量       1426.33    1369.82

RSD     1.30％   1.28％              加入量       1400       1300

                                     回收率       102.80     105.82％

                           稳定性实验结果

Time       0        30min     60min    2h       4h       8h       Average   STD    RSD

Mannitol   2139.11  2097.21   2103.04  2092.85  2108.88  2098.01  2108.22   18.30  0.87％

Trehalose  586.40   634.41    613.80   567.84   608.61   644.96   602.21    25.71  4.27％

3.测定结果

称取姬松茸水溶性小分子提取物样品500.0mg，用蒸馏水溶解并定溶至100mL，进样20μL，用上法测定。同法测定5次，测得其平均值为甘露醇37.8％；海藻糖4.62％，

实施例4.姬松茸水溶性小分子提取物的醇提工艺

1.提取工艺的正交实验优化：

(1)正交试验设计：

A：乙醇浓度

A₁ 0％；A₂ 15％；A₃ 30％；A₄ 45％；A₅ 60％；A₆ 75％；A₇ 85％；A₈ 95％.

B：样品(公斤)/溶剂量(升)

B₁ 1∶6；B₂ 1∶8

C：提取时间(h)

C₁ 1.5；C₂ 3.0

D：提取次数

D₁ 2；D₂ 3.

依据以上因素和水平设计L₁₆(8×2⁸)正交表见表7。

              表7 L₁₆(8×2⁸)表头设计

	1    2    3    4    5    6    7    8    9A              B    C         D
		12345678910111213141516	1    1    1    1    1    1    1    1    11    2    2    2    2    2    2    2    22    1    1    1    1    2    2    2    22    2    2    2    2    1    1    1    13    1    1    2    2    1    1    2    23    2    2    1    1    2    2    1    14    1    1    2    2    2    2    1    14    2    2    1    1    1    1    2    25    1    2    1    2    1    2    1    25    2    1    2    1    2    1    2    16    1    2    1    2    2    1    2    16    2    1    2    1    1    2    1    27    1    2    2    1    1    2    2    17    2    1    1    2    2    1    1    28    1    2    2    1    2    1    1    28    2    1    1    2    1    2    2    1

(2)判断指标及测定结果：

本正交实验的评价和判断指标为浸膏中海藻糖的含量及海藻糖、葡萄糖、甘露醇的总量。其含量均采用HPLC-ELSD法进行测定，具体测定方法见实施例3。实验结果见表8：

(3)方差分析：

依据以上指标性成分含量测定结果，分别以海藻糖和海藻糖、葡萄糖及甘露醇的总量进行方差分析，结果见表9和表10。

(4)实验结果：表9和表10的方差分析结果表明，无论是单独以海藻糖为评价指标，还是以海藻糖、葡萄糖及甘露醇的总量为评价指标，正交实验结果均显示A6，B2，C1/C2，D2为最佳工艺条件，即用75％的乙醇，用量为1∶8，提取时间为1.5～3小时，连续提取2次。

2.依据正交实验确定的醇提制备工艺

姬松茸子实体粗粉1.0Kg，用8升75％的乙醇溶液进行提取，每次提取时间为1.5小时，连续提取2次，合并提取液。在提取液中加入5％的ZTC1+1天然澄清剂，充分搅拌后静置放冷，用离心过滤法过滤获得澄清的提取液。澄清后的提取液用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩到稠浸膏(比重～1.10)，将该浸膏用真空干燥箱干燥，粉碎，即得姬松茸水溶性小分子提取物153g。

                      表8  各组实验指标性成分测定结果

No.	浸膏        海藻糖含量(0.01g)       海藻糖、葡萄糖、甘露醇总含量(0.01g)
		12345678910111213141516	3.6622  第一次    第二次    平均      255.8718  257.2306  256.55124.1247  152.0225  152.2165  152.1195  291.1428  288.2532  289.6983.7349  160.0411  156.2394  158.1403  277.9825  273.5839  275.78323.7762  157.1902  158.475   157.8326  271.2742  276.9974  274.13583.833   160.4048  160.6231  160.5139  276.2048  276.3011  276.2533.9064  161.7486  158.6477  160.1982  277.3642  281.3509  279.35764.3116  171.9223  172.7599  172.3411  311.8061  317.3923  314.59923.8596  155.4669  151.1828  153.3249  277.1263  272.8327  274.97954.0872  168.5316  171.4922  170.0119  295.5863  296.4133  295.99984.0354  168.3896  163.7394  166.0645  300.0441  295.1978  297.62093.7791  171.5623  173.5924  172.5773  290.6255  295.6512  293.13844.2435  184.3077  193.2801  188.7939  312.2091  326.4581  319.33363.7931  194.7373  194.3611  194.5492  318.8485  318.6545  318.75152.8245  120.467   123.2558  121.8614  226.8674  232.3605  229.61392.4524  95.74547  98.79878  97.27213  192.6088  195.9428  194.27583.2339  146.2279  151.2973  148.7626  259.1611  268.2342  263.6976

                        表9.以海藻糖为指标的方差分析

Ij2IIj2IIIj2IVj2Vj2VIj2VIIj2VIIIj2Qj2SSj	285854.5309 6156485.07  6068192.972 5760805.569 6086586.358 6646046.946 5240932.23 5602865.317 6630964.11399355.4033 6239579.814 6329105.596 6651105.85  6310349.074 5765515.585 7235203.59 6823089.262 5779580.32411424.9808424233.3972451789.4006522356.6764400462.7528242132.3854784402.3818  774754.0552 774831.1606  775744.4637 774808.4645 775722.6582 779758.489 776622.1612 775659.0279657.0299648.703384626   85.80868548  999.1117915 63.11266446 977.3063504 5013.13694 1876.809314 913.675156
			MSjMSEF自由度	1379.575709                           999.1117915 63.11266446             5013.136947.302472385                           5.28857258  0.334072633             26.5359087                                       1          1                     1	SST         自由度19699.69015    31随机误差       16104.9959035

Fu＝0.01Fu＝0.05Fu＝0.1Sig.方差来源最优方案

3.64   8.02               8.024.32**     *                  **D＞A＞B＞＞CA6    B2  C1，C2任选  D2

6.56224397拟合误差      53862.302891772.4605783误差          21188.9189902

表10.以海藻糖、葡萄糖和甘露醇总和为指标的方差分析

	A                                             B             C
			Ij2IIj2IIIj2IVj2Vj2Vij2VIIj2VIIIj2Qj2SSj	1193552.784    19808766.59    19953242.96    18820347.32    19654208.74    20788165.6    17582399     18729280.15      21120499.31209643.759    19863726.75    19719575.41    20878829.04    20019104.61    18906617.75   22225954.1    20974974        18592254.91234812.1831390412.3131409542.261500487.6291202818.61838958.79132495057.083    2479530.833    2479551.148    2481198.522    2479582.084    2480923.96     2488022.07    2481515.884    2482047.1415527.43889    1.18967043     21.5044123     1668.878692    52.44071996    1394.316204    8492.42943    1986.240524    2517.49636
MSjMSEF自由度Fu＝0.01Fu＝0.05Fu＝0.1Sig.方差来源最优方案	2218.205556                                  1668.878692    52.44071996                   8492.429437.546478215                                   5.677632833   0.178406708                   28.89179217                                              1             1                            13.64                                           8.02          8.024.32**                                              *                                          **D＞A＞B＞＞CA6                                            B2      C1，C2任选                      D2	SST            自由度31913.91034        31随机误差           16251.975437215.74846482拟合误差           55920.7471681184.149434误差               21293.9391717

实施例5.姬松茸水溶性小分子提取物的水提醇沉工艺

姬松茸子实体粗粉1.0Kg，用10升的水进行提取，每次提取1.5小时，连续提取2次，合并提取液。在提取液中加入5％的ZTC1+1天然澄清剂，充分搅拌后静置放冷，用离心过滤法过滤获得澄清的提取液。该提取液用旋转蒸发仪浓缩到稠浸膏(比重～1.10)后，边搅拌边加入75％乙醇液5000mL，静置过夜。倾出上清液，用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩到稠浸膏(比重～1.10)后，用真空干燥箱干燥，粉碎，即得姬松茸水溶性小分子提取物112g。

实施例6.姬松茸水溶性小分子提取物的水提超滤工艺

姬松茸子实体粗粉1.0Kg，用10升的水进行提取，每次提取1.5小时，连续提取2次，合并提取液。在提取液中加入5％的ZTC1+1天然澄清剂，充分搅拌后静置放冷，用离心过滤法过滤获得澄清的提取液。将提取液泵入超滤器中，用截留分子量为4,000的超滤膜进行超滤，循环进行数次后，收取通过膜的澄清液，用旋转蒸发仪浓缩到稠浸膏(比重～1.10)，再用真空干燥箱干燥，粉碎，即得姬松茸水溶性小分子提取物128g。

实施例7.含姬松茸水溶性小分子提取物口服液的制备：

姬松茸子实体粗粉1.0Kg，用8升75％的乙醇溶液进行提取，每次提取时间为1.5小时以上，连续提取2次，合并提取液。在提取液中加入5％的ZTC1+1天然澄清剂，充分搅拌后静置放冷，用离心过滤法过滤获得澄清的提取液。澄清后的提取液用旋转蒸发仪回收乙醇并浓缩到稠浸膏(比重～1.10)，将该浸膏用注射用水稀释至1000mL，加入糖精钠0.8g，使溶解，静置24小时，滤过，加水调整总量至1000mL，搅匀，灌装，灭菌，即得。

实施例8.由姬松茸水溶性小分子提取物和灵芝多糖组成的复方胶囊的的制备：

姬松茸水溶性小分子提取物     300g

灵芝多糖提取物(含量56％)     200g

上述组分混合均匀，装入硬明胶胶囊中，共1000粒胶囊。

Claims (9)

1、一种姬松茸的水溶性小分子提取物，从食用菌姬松茸的子实体或其人工培养的菌丝体中获得，其特征在于由水溶性的、分子量低于4,000的小分子化合物组成。

2、根据权利要求1所述的提取物，其特征在于，该提取物中含有下述9种成分：甘露醇，海藻糖，苯丙氨酸，谷氨酸，腺嘌啉核苷，尿嘧啶，尿嘧啶核苷，脱氧尿嘧啶核苷及deoxyfructosazine[2-(arabo-tetrahydroxybutyl)-5-(erythro-2，3，4-trihydroxylbutyl)pyrazinetrehalose]g。

3、根据权利要求2所述的提取物，其特征在于，该提取物中甘露醇的含量在30％以上，海藻糖的含量在4％以上。

4、一种如权利要求1所述的姬松茸水溶性小分子提取物的制备工艺，其特征在于，对食用菌姬松茸的子实体或人工培养的菌丝体采用15％～95％的乙醇进行提取，乙醇的用量(升)为姬松茸材料量(公斤)的6-20倍，提取时间为1-3小时，提取次数为1-3次。

5、根据权利要求4所述的制备工艺，其特征在于，对提取液，经过过滤、乙醇回收及浓缩处理后，直接稀配成液体制剂；或采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥法制成粉末。

6、一种如权利要求1所述的姬松茸水溶性小分子提取物的制备工艺，其特征在于，对食用菌姬松茸子实体或人工培养菌丝采用热水进行提取，水的用量为姬松茸重量的6-20倍，加热时间为1-3小时，提取次数为1-3次；对提取液用抽滤、超滤或离心法过滤进行澄清，将澄清液浓缩成稠浸膏，对稠浸膏用50-95％的乙醇进行醇沉，充分搅拌后静置8小时以上，获取澄清液；或者对提取液用截留分子量为4,000的超滤膜进行超滤分离，以获得澄清液。

7、根据权利要求6所述的制备工艺，其特征在于，对澄清液经回收、浓缩后，可直接稀配成液体制剂，或用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥法制成干燥粉末。

8、一种如权利要求1所述的提取物的应用，其特征在于，该提取物单独或与其他中西药物或食物配伍，用于制备预防和治疗肿瘤病症或预防和治疗免疫相关的病症的药物或功能性保健食品。

9、根据权利要求8所述的提取物的应用，其特征在于，该提取物或包含该提取物的药物和食物组合，制成胶囊剂、片剂、注射剂、颗粒剂、口服剂、糖浆、膏滋、酒剂、冲剂及饮料。

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