CN1600304A - 山葡萄提取物治疗炎症疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了从山葡萄中提取的总聚茋有效部位群、低聚茋化合物山葡萄辛素，毛葡萄甲素，坡垒醇在制备抗炎症疾病药物中的用途。

Description

山葡萄提取物治疗炎症疾病的用途

技术领域

本发明涉及从山葡萄(Vitis amurensis)中提取的总聚芪有效部位群、低聚芪化合物山葡萄辛素(amuresin H)，毛葡萄甲素(heyneanol A)，坡垒醇(hopeaphenol)在制备抗炎症疾病药物中的用途。

背景技术

炎症性疾病如哮喘、类风湿性关节炎等是一类常见病、多发病，前者如哮喘，为呼吸系统疾病的常见症状，多见于支气管哮喘和哮喘性支气管炎，是由支气管平滑肌痉挛和支气管炎症引起的分泌物增加、粘液水肿而导致的广泛的可逆性气道阻塞。目前对其发病机理还不完全清楚。支气管哮喘大多属于I型变态反应，当抗原再次吸入体内，与肺部致敏肥大细胞上的IgE抗体结合，释放一系列炎症介质，如组胺、嗜酸性粒细胞趋化因子和嗜中性粒细胞趋化因子、白三烯、前列腺素等，这些炎症介质可引起气管平滑肌痉挛而诱发哮喘。机体在外界因素，如化学物质、感染、抗原等作用下引起炎症反应，造成局部血管扩张、毛细血管通透性增加，白细胞浸润，产生多种炎症介质，如白三烯、细胞因子等，炎症介质之间、炎症介质与炎性细胞之间以及炎性细胞之间相互作用又加剧了炎症反应。抗炎免疫药将通过抑制炎症介质达到消除炎症的目的。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供了山葡萄提取的总聚芪有效部位群在制备抗炎症疾病药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，其含有治疗有效剂量的从山葡萄提取的总聚芪有效部位群及药用载体。

为了完成本发明的目的，本发明涉及从山葡萄(Vitis amurensis)提取的总聚芪有效部位群，如式(I)所示的化合物山葡萄辛素(amurensin H)

如式(II)所示的化合物毛葡萄甲素(heyneanol A)

如式(III)所示的化合物坡垒醇(hopeaphenol)

                              (III)

及其式I、II、III的化合物衍生物或药用盐分别在制备治疗炎症性疾病的药物中的应用。

LTB₄为花生四烯酸5-脂氧酶代谢途径产物，是一种极强的炎症介质，对多形核白细胞(PMN)和单核细胞具有极强的趋化聚集作用，可诱导PMN脱颗粒，刺激白细胞溶酶体酶释放，刺激PMN超氧阴离子产生。在本发明化合物对大鼠胸腔白细胞的LTB₄生成抑制作用中，本发明化合物I、II、III在10^-5mol/L浓度下大鼠胸腔白细胞LTB₄生成抑制率分别为83％、76％、和56％，表明三者对LTB₄生成有较强的抑制作用，说明本发明化合物有较强的抗炎作用。

LTC₄是过敏性慢反应物质主要成分之一，可使气管平滑肌收缩，其收缩作用强度为组胺的100-1000倍，增加毛细血管渗透性，刺激粘液分泌，在哮喘发病过程中起重要作用。在本发明化合物LTC₄受体拮抗作用中，化合物I、II、III对LTC₄受体的抑制IC₅₀分别为10^-7、5×10^-7和4×10^-5mol/L，说明本发明化合物对LTC₄受体有较强的抑制作用，能用于治疗哮喘。

IL-8为一种多源性细胞因子，对白细胞有极强的趋化聚集活性，可显著诱导白细胞吞噬、脱颗粒、呼吸爆发、释放溶酶体酶和产生超氧阴离子等，与多种疾病，如类风湿性关节炎、过敏性哮喘等密切相关。在本发明化合物对IL-8生成抑制作用实验中，化合物I、II、III对LPS激活的HL-60细胞IL-8生成有明显的抑制作用，IC₅₀分别为2×10^-10、1.9×10^-9、2.2×10^-8mol/L，说明本发明化合物可用于治疗类风湿性关节炎、过敏性哮喘等疾病。

炎症过程中，白细胞向炎症部位移行、趋化、聚集，释放炎症介质，IL-8和fMLP为极强的趋化剂，在它们的诱导下，加剧炎症过程。在本发明化合物对IL-8和fMLP诱导的PMN趋化作用的实验中，化合物I、II、III使趋化的白细胞数目明显减少，其对IL-8诱导PMN趋化的IC₅₀分别为1.1×10^-11、1.1×10^-8、7.1×10^-10mol/L，对fMLP诱导PMN趋化的IC₅₀分别为4.8×10^-13、4×10^-10、1.6×10^-8mol/L；说明本发明化合物能缓解炎症过程，减轻症状。

在小鼠体内实验中，本发明的化合物可抑制IL-8诱导的小鼠体内白细胞趋化作用，抑制率分别为52.4％、12.2％、和77％。

机体在外界因素，如化学物质、感染、机械损伤、抗原等作用下产生炎症反应，造成局部血管扩张、毛细血管通透性增加、白细胞浸润，表现为红、肿、热、痛。巴豆油为一强致炎剂，涂在小鼠耳部，可引起小鼠耳部急性炎症。本实验用巴豆油诱发小鼠耳部肿胀，在本发明化合物和有效部位群(Vit)对小鼠耳部巴豆油炎症的抑制作用中，本发明化合物和有效部位群(Vit)对小鼠耳部巴豆油炎症抑制率分别为22.9％、22.8％、17.5％和29.4％，表明本发明化合物对炎症有抑制作用。

在模拟急性炎症的小鼠角叉菜胶足肿胀中，本发明化合物和有效部位群(Vit)对小鼠角叉菜胶足肿胀有明显的抑制作用实验中，抑制率分别为23.8％、28.2％、17.9％和26.7％，说明本发明化合物和有效部位群(Vit)对急性炎症的有抑制作用。

以2，4-二硝基氟苯(DNFB)为半抗原，涂于小鼠皮肤，与皮肤蛋白结合成抗原使皮肤致敏，当抗原(DNFB)再次攻击后产生抗原抗体反应，引起迟发型变态反应，预先给予本发明化合物和有效部位群(Vit)，则发现对小鼠DNFB致IV型变态反应有较强的抑制作用，抑制率分别为30％、40.7％、36.5％和40.5％。

在炎症时，肥大细胞在致敏剂作用下细胞膜破裂，释放炎症介质。化合物48/80可诱导肥大细胞脱颗粒，本发明化合物可以抑制化合物48/80诱导的肥大细胞脱颗粒，化合物I，II的抑制率分别为43.1％和29.8％。

当卵白蛋白致敏豚鼠再次以卵白蛋白攻击时产生过敏性哮喘，本发明有效部位群(Vit)，可明显延长致敏豚鼠哮喘潜伏期，减轻哮喘症状，减少哮喘动物数。

根据本发明还涉及药物组合物的制备方法。用于此目的时，如果需要，可将活性成分与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当施用形式或剂量形式。

本发明的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明的组合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。

为了将给药单元制成胶囊，将有效成分与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明的组合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明药用组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明药用组合物中最后的制剂中所含有的实际有效药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的逆转肿瘤多药耐药的目的。通常对体重约75公斤患者，所给化合物或有效部位的日剂量为0.001mg/kg体重～500mg/kg体重，优选3mg/kg体重～30mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及包括运用化疗、放疗手段的给药方案。

具体实施方式

以下实施例对本发明作进一步的说明。但本发明并不限于这些实施例。

Vit：山葡萄中提取的有效部位群

制备例1：山葡萄有效部位群(Vit)制备

山葡萄(Vitis amurensis)根，粉碎如黄豆粒状，1Kg，分别以5000ml，2000ml，2000ml，90％乙醇回流提取三次每次二小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏130g，浸膏以1∶3石油醚二次脱脂后，再以丙酮300ml溶解，分成丙酮溶解和丙酮不溶解部分。丙酮溶解部分(60g)与聚酰胺吸附剂(120g)拌匀，室温凉干后，填装于已事先装好的5倍量聚酰胺柱顶(5倍量)，首先以100％蒸馏水洗涤至近无色、再分别以20％乙醇、80％乙醇及丙酮洗脱，收集80％乙醇洗脱液，减压浓缩至干得浅棕色粉状物26.0g(Vit)，测定总低聚芪的含量(约50％以上)备用。聚酰胺柱子可再生反复使用。

制备例2：化合物I的提取制备

山葡萄(Vitis amurensis)的根20 Kg，粉碎后用1∶5、1∶4、1∶4的95％乙醇回流提取三次，每次2小时，合并提取液，减压浓缩得浸膏2.2Kg。将提取浸膏以1∶1硅胶(40-60目)拌匀，室温凉干后，置索氏提取器中，以氯仿(A)、乙酸乙酯(B)、丙酮(C)、甲醇(D)分别回流洗脱。分得A、B、C和D四个部分。取部分B(640g)用硅胶(硅胶H，140-180目)柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱分份收集，薄层检测，将具有相同斑点的部分归并成六个部分，分别为B₁(27.5g)，B₂(30g)，B₃(25g)，B₄(230g)，B₅(70g)，B₆(140g)。B₂部分继续以硅胶柱层析，己烷-丙酮(2∶1)洗脱，然后经过二次反相柱Rp-18，分离，以甲醇-水(7∶3，5.5-4.5)洗脱，分得化合物I(30mg)。

化合物I：浅黄色无定型粉末，254nm荧光灯下显亮兰色荧光。高分辨质谱HR-EIMS，m/z 452.1246[M]⁺，计算值452.1260，

分子式：C₂₈H₂₀O₆；

IR(KBr)：v_max3350，1697，1606，1512，1439，1238，1153，839cm^-1；

UV(MeOH)λ_max(logε)：228(log 4.67，sh)，310(4.49)；

¹H-NMR与¹³C-NMR，见表11。

制备例3：化合物I的合成制备

ε-Viniferin制备：取白藜芦醇(从虎杖中提得，纯度＞95％)23g(0.1M)溶于甲醇200ml常温下逐步加入FeCl3·6H2O水液[25g(0.15M)溶于250ml水中]，搅拌反应48小时，反应物蒸去甲醇，剩余物用水稀释后用乙酸乙酯提取，分出乙酸乙酯层浓缩干燥得萃取物20g，将萃取物以硅胶柱层析，以环己烷-丙酮(3∶1-5∶1)洗脱，分去白藜芦醇及杂质，所得反式ε-Viniferin与顺式ε-Viniferin共4.5g(A)。

五-乙酰基-ε-Viniferin制备：取(A)4.85g，加吡啶和冰醋酸各100ml搅拌室温放置一夜，产物混合物加水300ml，用乙酸乙酯提取，浓缩乙酸乙酯得浓缩物，搅拌下加水200ml，过滤得沉淀4.24g为五-乙酰基-ε-Viniferin(B)备用。

脱氢反应：取(B)4.24g(0.93mmol)，加入5g DDQ(0.02M)，溶于无水二氧六环，加热回流48小时，减压蒸去二氧六环，反应物经硅胶柱层析，以环己烷-丙酮(2∶1)洗脱得2，3-脱氢-五-乙酰基-ε-Viniferin(C)3.5g。

脱乙酰基反应：取(C)3.5g加150ml甲醇和0.75g K₂CO₃(固体)室温搅拌2小时，产物过硅胶柱，以环己烷-丙酮(2∶1)洗脱，得化合物1A，200mg(纯度＞98％)。化合物IA所有的光谱数据与化合物I一致。(见表11)

制备例4：化合物II的提取制备

取制备例2中的B3部分(25g)，分别于硅胶H与反相Rp-18柱层析，洗脱剂为环己烷-丙酮(2∶1)与甲醇-水(5.5∶4.5)分得化合物II(10g)。

化合物II：类白色无定型粉末，

[α]D²⁸-83.5°(c 0.079，MeOH)；

FAB-MS，m/z 907[M+1]⁺；分子式：C₅₆H₄₂O₁₂；

UV(MeOH)λ_max(logε)：282，326nm；

IR(KBr)：v_max3367，1697，1612，1601，1516，1446，1336，1236，1122，1001，835cm^-1；

¹H-NMR与¹³C-NMR，见表1-1。

表1-1化合物I，II的¹H-，¹³C-NMR数据，括号内J值在CD₃COCD₃，用500MHz NMR测定¹H NMR，125MHz NMR测定¹³C NMR

                I                     II                               II             

No.

                                                       No.

       ¹H            ¹³C     ¹H            ¹³C

                                                              ¹H                  ¹³C

1a                    123.3                   133.6    1c                          131.6

2a     7.43 d(8.7)    128.2    7.26 d(8.6)    127.7    2c     6.85 d(2.0)          125.6

3a     6.74 d(8.7)    116.0    6.93 d(8.6)    116.0    3c                          132.5

4a                    158.1                   158.2    4c                          159.6

5a     6.74 d(8.7)    116.0    6.93 d(8.6)             5c     6.79 d(8.6)          110.6

6a     7.43 d(8.7)    128.2    7.26 d(8.6)             6c     7.20 dd(8.6，2.0)    126.2

7a                    149.9    5.44 d(5.1)    94.0     7c     6.79 d(16)           130.0

8a                    117.0    4.54 d(5.1)    57.0     8c     6.67 d(16)           123.7

9a                    138.0                   147.1    9c                          136.1

10a    6.43 d(2.1)    109.7    6.13 d(2.2)    106.8    10c                         119.6

11a                   160.3                   159.9    11c                         162.3

12a    6.53 t(2.1)    102.9    6.24 t(2.2)    101.9    12c    6.35 d(2.0)          96.7

13a                   160.3                   159.9    13c                         159.6

14a    6.43 d(2.1)    109.7    6.13 d(2.2)    106.8    14c    6.69 d(2.0)          104.2

1b                    130.0                   131.9    1d                          133.5

2b    6.89 d(8.7)     128.6    6.61 d(8.6)    127.4    2d     7.21 d(8.6)          127.8

3b    6.69 d(8.7)     116.1    6.65 d(8.6)    115.8    3d     6.69 d(8.6)          116.2

4b                    157.9                   158.0    4d                          157.4

5b    6.69 d(8.7)     116.1    6.65 d(8.6)    115.8    5d     6.69 d(8.6)          116.2

6b    6.89 d(8.7)     128.6    6.61 d(8.6)    127.4    6d     7.21 d(8.6)          127.8

7b    6.89 d(16.8)    129.0    5.58 d(5.1)    91.2     7d     5.42 d(5.5)          93.8

8b    6.98 d(16.8)    122.7    4.34 d(5.1)    51.9     8d     4.46 d(5.5)          56.8

9b                    132.8                   141.7    9d                          147.2

10b                   122.0                   119.8    10d    6.23 d(2.0)          106.7

11b                   155.8                   162.2    11d                         159.7

12b    5.72 d(2.1)    97.2     6.35 d(2.0)    96.3     12d    6.24 d(2.0)          102.2

13b                   156.4                   159.4    13d                         159.7

14b    5.15 d(2.1)    107.3    6.26 d(2.0)    106.9    14d                         106.7

制备例5：化合物III的制备

取例2中的B₅部分(70g)，经二次反相Rp-18柱层析，以MeOH-水(4∶6)洗脱，得化合物III(60mg)。

化合物III：类白色无定型粉末，

[α]D²⁸+366.3°(c 0.104，MeOH)；

FAB-MS m/z 907[M+H]⁺；分子式：C₅₆H₄₂O₁₂；

UV(MeOH)λ_max(logε)：284nm；

IR(KBr)：v_max 3350，1695，1612，1597，1512，1442，1340，1232，1173，1132，1088，1011，995，835cm^-1，

¹H-NMR与¹³C-NMR，见表1-2。

表1-2化合物III的¹H-，¹³C-NMR数据，括号内为J值，在CD₃COCD₃中测定，¹H NMR(500MHz)、¹³C NMR(125MHz)，化合物3的结构组成左右对称，故¹H，¹³C数据只表现左边或右边的数据

                 III                                      III            

No.

                                       No.

       ¹H               ¹³C

                                                ¹H                ¹³C

1a                       131.1        1b                           135.2

2a     7.12 d(8.6)       130.2        2b        6.89 d(8.6)        129.3

3a     6.78 d(8.6)       115.2        3b        6.55 d(8.6)        115.9

4a                       158.4        4b                           155.5

5a     6.78 d(8.6)       115.2        5b        6.55 d(8.6)        115.9

6a     7.12 d(8.6)       130.2        6b        6.89 d(8.6)        129.3

7a     5.74 d(11.4)      88.2         7b        5.78(br，s)        41.3

8a     4.22 d(11.4)      49.8         8b        3.93(br，s)        48.3

9a                       142.5        9b                           140.5

10a                      121.1        10b                          118.6

11a                      158.7        11b                          159.3

12a    6.53 t(1.5)       101.1        12b       5.72 d(2.1)        95.2

13a                      157.2        13b                          157.1

14a    6.28 d(1.5)       106.3        14b       5.15 d(2.1)        111.2

药理实验

实施例1：化合物I、II、III对大鼠胸腔白细胞LTB₄生成抑制作用

LTB₄为花生四烯酸5-脂氧酶代谢途径产物，是一种极强的炎症介质，对多形核白细胞(PMN)和单核细胞具有极强的趋化聚集作用，可诱导PMN脱颗粒，刺激白细胞溶酶体酶释放，刺激PMN超氧阴离子产生。本实验目的在于考察化合物化合物I、II、III对LTB₄生成抑制作用。

方法：大鼠胸腔以角叉菜胶致炎，4小时后取炎性渗出液，白细胞计数，并调其浓度为10⁷细胞/ml，取白细胞1ml分别加入化合物1，化合物2，化合物3、A₂₃₁₈₇、花生四烯酸，反应5分钟，以乙醇中止反应，C₁₈小柱分离LTB₄，行RP-HPLC，流动相：甲醇∶水∶乙酸＝70∶20∶0.1，流速0.8ml/min，检测波长280nm，对LTB₄定量，与对照组比较，计算LTB₄生成抑制率(％)。

结果：化合物I、II、III在10^-5mol/L浓度下大鼠胸腔白细胞LTB₄生成抑制率分别为83％、76％、和56％，表明三者对LTB₄生成有较强的抑制作用，见表1。

             表1化合物I、II、III对LTB₄生成抑制作用

受试物              浓度          LTB₄生成量      对LTB₄生成抑制

                                                   率

                    (mol/L)

                                                   (％)

空白对照            -             -                2479±423

化合物I             10^-5         81±11           83

化合物II            10^-5         84±5            76

化合物III           10^-5         82±5            56

实施例2：化合物I、II、III对致敏豚鼠回肠纵肌LTC₄受体拮抗作用

LTC₄是过敏性慢反应物质主要成分之一，可使气管平滑肌收缩，其收缩作用强度为组胺的100-1000倍，增加毛细血管渗透性，刺激粘液分泌，在哮喘发病过程中起重要作用。本实验旨在试验化合物1，2，3对LTC₄受体拮抗作用。

方法：取卵白蛋白致敏豚鼠回肠纵肌，加入阿托品和氯并吡胺，以LTC₄引发回肠收缩，作为收缩最大值，再分别加入化合物I、II、III，浓度、测量值、测量回肠纵肌收缩幅度，计算收缩抑制率，评价其对LTC₄受体拮抗作用。

结果：化合物I、II、III对LTC₄受体有较强的抑制作用，其IC₅₀分别为10^-7、5×10^-7和4×10^-5mol/L。结果见表2。

           表2化合物I、II、III对LTC₄受体拮抗作用

                                       对LTC₄受体拮抗作用

           化合物

                                       (IC₅₀，mol/L)

           I                           1×10^-7

           II                          5×10^-5

           III                         4×10^-5

实施例3：化合物I、II、III对IL-8生成抑制作用

IL-8为一种多源性细胞因子，对白细胞有极强的趋化聚集活性，可显著诱导白细胞吞噬、脱颗粒、呼吸爆发、释放溶酶体酶和产生超氧阴离子等，与多种疾病，如类风湿性关节炎、过敏性哮喘等密切相关。本实验目的在于考察化合物I、II、III对IL-8生成抑制作用。

方法：以LPS刺激HL-60细胞，分别加入不同浓度化合物I、II、III，37℃培养24小时，收集上清液用ELISA法测定IL-8水平，比较对IL-8生成抑制率(％)。

结果：化合物I、II、III对LPS激活HL-60细胞IL-8生成有明显的抑制作用，IC₅₀分别为2×10^-10、1.9×10^-9、2.2×10^-8mol/L。结果见表3。

           表3化合物1，2，3对IL-8生成抑制作用

                                       对IL-8生成抑制作用

           化合物

                                       (IC₅₀，mol/L)

           I                           2×10^-10

           II                          1.9×10^-9

           III                         2.2×10^-8

实施例4：化合物I、II、III对IL-8和fMLP诱导PMN趋化的抑制作用

炎症过程中，白细胞向炎症部位移行、趋化、聚集，释放炎症介质，IL-8和fMLP为极强的趋化剂，在它们的诱导下，加剧炎症过程。本实验目的在于观察化合物I、II、III对抗fMLP、IL-8诱导白细胞趋化作用。

方法：制备大鼠外周血中性粒细胞，浓度为2.5×10⁶细胞/ml，利用Boyden趋化小室进行试验，分别加入IL-8(1μg/ml)或fMLP(10^-9mol/L)，及被测样品，37℃，3小时，镜下计数趋化的白细胞数。

结果：化合物I、II、III可抑制对IL-8诱导PMN趋化作用，IC₅₀分别为1.1×10^-11、1.1×10^-8、7.1×10^-10mol/L，对fMLP诱导PMN趋化的IC₅₀分别为4.8×10^-13、4×10^-10、1.6×10^-8mol/L。结果见表4。

         表4化合物I、II、II对不同刺激剂诱导中性细胞趋化的抑制作用

                        对不同刺激剂诱导中性细胞趋化的抑制作用(IC₅₀，mol/L)

         化合物

                        IL-8                  fMLP

         I              1.1×10^-11           4.8×10^-13

         II             1.1×10^-8            4×10^-10

         III            7.1×10^-10           1.6×10^-10

实施例5：化合物I、II、III对IL-8抑制小鼠体内白细胞趋化作用

方法：小鼠背部造成气囊后，分别皮下注射化合物I、II、III各50mg/Kg，30分钟后，气囊内注射IL-81μg/0.5ml，4小时后处死小鼠，计数小鼠气囊内白细胞聚集数，并与对照组比较，计算抑制率(％)。

结果：化合物I、II、III在50mg/Kg剂量下皮下注射，可抑制IL-8诱导的小鼠体内白细胞趋化作用，抑制率分别为52.4％、12.2％、和77％。结果见表5。

         表5化合物I、II、III对小鼠体内白细胞趋化抑制作用

                            剂量              对小鼠体内白细胞趋化抑制率

         化合物

                            (mg/Kg)           (％)

         I                  50                52.3

         II                 50                12.2

         III                50                77.0

实施例6：化合物I、II、III和Vit对小鼠耳部巴豆油炎症抑制作用

机体在外界因素，如化学物质、感染、机械损伤、抗原等作用下产生炎症反应，造成局部血管扩张、毛细血管通透性增加、白细胞浸润，表现为红、肿、热、痛。巴豆油为一强致炎剂，涂在小鼠耳部，可引起小鼠耳部急性炎症。本实验用巴豆油诱发小鼠耳部肿胀，观察化合物I、II、III和Vit对小鼠耳部巴豆油炎症的抑制作用。

方法：小鼠皮下分别注射化合物I、II、III各50mg/Kg，Vit 100mg/Kg，30分钟后左耳涂2％巴豆油液50μl，4小时后处死动物，剪下左右耳片，用不锈钢铳子冲下左右耳片，称重，左右耳片重量差表示耳肿胀度，与对照组比较计算肿胀抑制率(％)。

结果：化合物I、II、III和Vit对小鼠耳部巴豆油炎症抑制率分别为22.9％、22.8％、17.5％和29.4％。表明四者有一定的抗炎作用，结果见表6。

            表6化合物1，2，3和Vit对小鼠耳部巴豆油炎症抑制作用

                             剂量               耳部肿胀抑制率

            化合物

                             (mg/Kg)            (％)

            I                50                 22.9

            II               50                 22.8

            III              50                 17.5

            Vit              100                29.4

实施例7：化合物I、II、III和Vit对小鼠角叉菜胶足肿胀抑制作用

小鼠足跖注射角叉菜胶，引起踝关节肿胀，形成急性炎症。本实验目的在于试验化合物I、II、III和Vit对急性炎症的抑制作用。

方法：小鼠分别皮下注射化合物I、II、III各50mg/Kg，Vit 100mg/Kg，30分钟后，右后足跖皮内注射1％角叉菜胶，4小时后沿足关节剪下左右足，称重，以两者重量差为肿胀度，计算肿胀抑制率(％)。

结果：化合物I、II、III和Vit可抑制小鼠角叉菜胶性足肿胀，抑制率分别为23.8％、28.2％、17.9％和26.7％。结果见表7。

  表7化合物1，2，3和Vit对小鼠角叉菜胶足肿胀的抑制作用

                         剂量                     足肿胀抑制率

         化合物

                         (mg/Kg)                  (％)

         I               50                       23.8

         II              50                       28.2

         III            50                 17.9

         Vit            100                26.7

实施例8：化合物I、II、III和Vit对小鼠2，4-二硝基氟苯(DNFB)致IV型变态反应的抑制作用

小鼠以DNFB为半抗原，涂于皮肤，与皮肤蛋白结合成抗原使皮肤致敏，当抗原再次攻击后产生抗原抗体反应，引起迟发型变态反应。实验目的在于观察化合物I、II、III和Vit对小鼠IV型变态反应的抑制作用。

方法：小鼠腹部脱毛，致敏前2天分别皮下注射化合物I、II、III和Vit，连续7天。以1％DNFB致敏，5天后再以1％DNFB攻击小鼠左耳，24小时后处死动物，剪下左右耳廓，用直径8mm不锈钢铳子冲下左右耳片，称重，以左右耳片重量差表示肿胀度，计算肿胀抑制率(％)。

结果：化合物I、II、III和Vit对小鼠DNFB致IV型变态反应有较强的抑制作用，抑制率分别为30％、40.7％、36.5％和40.5％。见表8。

         表8化合物1，2，3和Vit对小鼠IV型变态反应的抑制作用

                            剂量                对IV型变态反应耳肿胀抑制率

         化合物

                            (mg/kg)             (％)

         I                  50                  30.9

         II                 50                  40.7

         III                50                  36.5

         Vit                100                 40.5

实施例9：化合物I、II对化合物48/80诱导的大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒的抑制作用

在炎症时，肥大细胞在致敏剂作用下细胞膜破裂，释放炎症介质。实验目的在于观察化合物I、II对抗肥大细胞脱颗粒作用。

方法：取大鼠腹腔肥大细胞，并调节其浓度为104细胞/10ml，分别加入化合物I、II与化合物48/80(终浓度30μg/ml)，37℃培育3分钟，滴加在预先涂有中性红的玻片上，镜下计数，计算肥大细胞脱颗粒百分数及待测物对肥大细胞脱颗粒抑制作用。

结果：化合物I、II在10^-4mol/L浓度下，对化合物48/80诱导肥大细胞脱颗粒有一定的抑制作用，抑制率分别为43.1％和29.8％。见表9。

          表9化合物I、II对肥大细胞脱颗粒的抑制作用

                        浓度                 肥大细胞脱颗粒的抑制率

          化合物

                        (mol/L)              (％)

          I             10^-4                43.1

          II            10^-4                29.8

实施例10：Vit在体内抗致敏豚鼠哮喘作用

当卵白蛋白致敏豚鼠再次以卵白蛋白攻击时产生过敏性哮喘，实验目的在于观察山葡萄总聚芪有效部位群对抗致敏豚鼠体内哮喘的作用。

方法：豚鼠以卵白蛋白致敏，8天后豚鼠皮下注射Vit 200mg/Kg，连续给药6天，每天一次，致敏14天后以卵白蛋白攻击，观察豚鼠哮喘发作潜伏期及哮喘动物数。

结果：Vit 200mg/Kg，皮下注射给药，可明显延长致敏豚鼠哮喘潜伏期，减轻哮喘症状，减少哮喘动物数。见表10。

表10 Vit在体内抗致敏豚鼠的哮喘作用

           剂量       哮喘潜伏期

组别

                                    发生哮喘动物数

           (mg/Kg)    (秒)

Vit        200        10.4          3/5，哮喘动物哮喘症状轻，仅见腹式呼吸。

                                    5/5，哮喘动物哮喘症状重，可见点头呼吸、

对照       /          0

                                    咳嗽、紫绀，其中1/5动物抽搐死亡。

剂型制备

制备例1：化合物1，2，3(任选一种)50g，加入糊精247.5g，硬脂酸镁2.5g，按胶囊制备法制成1000粒，填装于250mg胶囊，每粒含化合物50mg。

制备例2：山葡萄有效部位群(Vit)100g，加入糊精147.5g，硬脂酸镁2.5g，充分拌均匀后，按胶囊制备法制成1000粒，填装于250mg胶囊，每粒含Vit 100mg，其总聚芪含量不低于50％。

Claims (10)

1、山葡萄提取的总聚茋有效部位群在制备抗炎症疾病药物中的应用，其特征在于，所述的有效部位群中含有如通式(I)所示的山葡萄辛素、如通式(II)所示的毛葡萄甲素、如通式(III)所示的坡垒醇中至少一种。

2.如式(I)所示化合物的山葡萄辛素在制备抗炎症疾病药物中的应用。

3.如式(II)所示化合物的毛葡萄甲素在制备抗炎症疾病药物中的应用。

4.如式(III)所示化合物的坡垒醇在制备抗炎症疾病药物中的应用。

5.根据权利要求1-4的应用，其特征在于，所述的炎症疾病包括过敏性哮喘病、类风湿性关节炎、牛皮癣。

6.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效剂量的从山葡萄提取的总聚茋有效部位群及药用载体。

7.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效剂量的如式(I)所示化合物的山葡萄辛素及药用载体。

8.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效剂量的如式(II)所示化合物的毛葡萄甲素及药用载体。。

9.一种药物组合物，其特征在于，含有治疗有效剂量的式(III)所示化合物的坡垒醇及药用载体。

10、根据权利要求5的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括片剂、胶囊、丸剂、注射剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。