CN100340186C - 姬松茸水溶性多糖及其制备工艺和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属保健食品和医药技术领域，具体为一种从食用菌姬松茸子实体或人工培养菌丝体中提取的水溶性多糖及其制备工艺。该提取物的分子量为10000以上，共提取方法有2种。其一为先用乙醇提取除去水溶性小分子杂质，再用水提取水溶性多糖，水提液直接浓缩即得；其二为水提超滤工艺，材料直接用热水提取后用截留分子量为4,000的超滤膜超滤，膜上未通过部分直接浓缩即得。实验研究表明，该提取物对肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，并具有明显的免疫调节功能，而且无毒、副作用，可用于制备预防和治疗肿瘤病症或免疫相关疾病的药物或功能性保健食品。

Description

姬松茸水溶性多糖及其制备工艺和用途

技术领域

本发明属保健食品和医药技术领域，具体涉及一种食用真菌姬松茸水溶性多糖及其制备工艺以及在保健食品和医疗药品方面的用途。

技术背景

姬松茸，又称巴西蘑菇，是一种珍贵的食用真菌，在真菌分类上，属于担子菌亚门，层菌纲，散菌目，蘑菇科，蘑菇属，拉丁学名为Agaricus blazei Murill.。该菌原产于巴西、美国、秘鲁等拉美地区。日本于上世纪70年代即已成功引种栽培，随后相继传到越南、泰国、印尼及台湾等东南亚地区，并于上世纪90年代初传入我国。现在福建、浙江等地有大量栽培。同时，有关姬松茸菌丝体的液体培养技术也已研发成功并进行了规模化生产。在成功进行了人工规模化栽培及菌丝体规模化生产的基础上，日本学者又率先对姬松茸的化学成分及其医疗保健功能进行了深入研究，发现其热水提取物及水溶性多糖具有显著的抗肿瘤及调节免疫等生理活性。我国学者也于90年代后期相继开展了其活性成分及其药理活性的研究，证实其热水提取物及水溶性多糖具有抗肿瘤、调节免疫、保肝、降血糖等多种生物活性。关于其制备工艺已有许多文献报道，其中大多数均是采用经典的水提醇沉的方法，也有采用碱水提、酸水提、盐水提或酶解后水提，浓缩后在用醇沉淀的方法获得多糖，因此都属于水提醇沉的技术范畴。事实上，这一工艺用于制备姬松茸多糖时醇沉效率低、杂质含量尤其是小分子杂质含量很高，因此只能制备出粗多糖，其中有效多糖的含量相对较低。此外本工艺还存在着费工费时，重现性差，质量不稳定等多种缺陷，直接导致其药理活性及临床疗效不理想或不稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种效率高、质量稳定的姬松茸水溶性多糖及其制备工艺和在制备保健食品和医疗药品方面的应用。

本发明所提供的姬松茸水溶性多糖，是从姬松茸子实体或人工培养的菌丝体中提取的，分子量10,000以上的多种多糖的复合物。

发明人在研究中发现，由于姬松茸中的水溶性小分子成分，如甘露醇、海藻糖等含量特别高，采用经典的水提醇沉工艺并不能将这些小分子成分有效去除，因此采用该工艺制备出的多糖仍含有含量很高的甘露醇、海藻糖等小分子成分，导致提取物中有效多糖含量低，药理活性及临床疗效均不理想。此外，采用该工艺制备出多糖呈糖浆状，不易干燥制备成粉末；工艺条件很难准确把握，重现性差，批次间的误差很大：以及费工费时等许多不足。

发明人在研究中还发现，姬松茸的水溶性小分子部位同样具有很好的药理活性及开发利用价值，因此研究一种有效的制备工艺，将姬松茸的水溶性小分子部位和水溶性多糖进行有效的分离，对这两方面的有效利用均是非常有益的。

为此本发明提出了既能对姬松茸的水溶性多糖进行有效提取和分离，又能对水溶性小分子部位进行有效提取和分离的统一的制备工艺。

该工艺的步骤是，先用15-95％的乙醇对姬松茸子实体或人工培养菌丝进行提取，以去除小分子组分；醇提后的残渣再用水进行提取，其水提液过滤澄清后直接浓缩、干燥即得所述的姬松茸水溶性多糖。称此工艺为醇提工艺。

在醇提步骤中，所用乙醇的浓度为15-95％％，用量为姬松茸材料量的6-20倍(重量(公斤)/体积(升)比)，每次提取时间为1-3小时，连续提取1-3次(见实施例1)。

经上述方法醇提后的残渣，烘干后用按姬松茸残渣材料量6-20倍的水(重量比)进行提取，每次提取1-3小时以上，连续提取1-3次。经正交实验设计，确定了最佳工艺条件为：所用水的量为姬松茸原料用量(重量)的10倍，每次提取2小时，连续提取2次(见实施例2)。

两次水提取液合并后，可通过抽滤、超滤或离心过滤后获得澄清的提取液。必要时可在抽滤、超滤或离心过滤之前使用一定量的澄清剂，如101果汁澄清剂，ZTC1+1天然澄清剂等。澄清后的水提取液进行浓缩处理，然后直接用水稀配成口服液等液体制剂；或通过真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥的方法制成粉末状姬松茸多糖，用于其它各种制剂(见实施例2)。

本发明还提供了姬松茸水溶性多糖的另一种有效制备工艺，简称水提超滤工艺。

该工艺的步骤为：对姬松茸子实体或菌丝体材料，以6-20倍量(重量比)的水加热提取，每次加热1-3小时，连续提取1-3次，合并滤液，以抽滤法或离心法进行初步的澄清净化，再用截留分子量为4,000的超滤膜反复进行超滤分离，膜上未通过部分即为姬松茸水溶性多糖。将该部分浓缩后直接配制成口服液等液体制剂，或通过喷雾、真空干燥或冻干法制备成粉末，以供制备片剂，胶囊剂，合剂等固体制剂之用(见实施例3)。

本发明对上述姬松茸水溶性多糖进行了动物实验，表明本提取物无毒、无副作用，对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，同时具有明显的免疫调节功能。具体试验结果如下：

试验例1：急性毒性实验

小鼠急性毒性试验结果表明，以最大浓度，最大给药容积灌胃给予小鼠，其最大给药量为75.0g/kg，约为临床推荐剂量的150倍。

试验例2：姬松茸水溶性多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用

(1)试验目的

测试姬松茸水溶性多糖对小鼠S180肉瘤生长的抑制作用。

(2)受试药物

名称：姬松茸水溶性多糖(B)，发明人自行制备。

配制：用蒸馏水配成溶液

(3)对照样品

云芝糖肽胶囊，上海新康制药厂生产，批号：990801，规格：每粒0.34g。

(4)动物

昆明种小鼠，雄性，体重：18-22g，每组10只，由中科院上海实验动物中心提供。

(5)移植性肿瘤：小鼠S180肉瘤，购自中科院上海细胞所。

(6)试验方法

取生长良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水以1∶4稀释，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml，随机分组。姬松茸水溶性多糖(B)设0.5、0.25、0.125g/kg三个剂量组，云芝糖肽对照组0.5g/Kg，接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，连续灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物，称体重，解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：

(7)试验结果

姬松茸水溶性多糖(B)在剂量0.5、0.25、0.125g/kg时，对小鼠S180肉瘤的抑制率分别为72.57、63.27、62.39％，与对照组比较具显著性差异。试验结果见表1及图片1。

(8)试验结论

姬松茸水溶性多糖(B)对小鼠S180肉瘤的生长有明显的抑制作用。

          表1.姬松茸水溶性多糖(B)对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用

组别

剂量

给药

动物数

动物体重(g)

瘤重(g)

抑瘤率

	(g/kg)	方案	始  终	(去瘤后)	±SD	％
							空白对照		po×7	10  10	25.14±4.84	2.26±0.34
云芝糖肽	0.5	po×7	10  10	25.69±2.09	1.12±0.49	50.44
							姬松茸水溶性多糖	0.125	po×7	10  10	23.64±1.48	0.85±0.22**	62.39
0.25	po×7	10  10	26.31±1.97	0.83±0.41**	63.27
						0.5		po×7	10  10	25.71±2.64	0.62±0.32**	72.57

与对照组比较：**P＜0.01。

试验例3.姬松茸水溶性多糖对免疫功能的影响

1.对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

(1)试验目的

观察姬松茸水溶性多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的作用。

(2)受试药物

名称及配制方法，同试验2。

(3)对照样品

同试验2。

(4)动物

雌性C57BL/6小鼠，体重：18-20g，由中科院上海实验动物中心提供。

(5)其它材料

培养基：RPMI-1610，Difco产品，内含15％NBS，巯基乙醇，Hepes等。

³H-TdR：上海原子核研究所，放射性浓度1mci/ml。

刀豆球蛋白A(ConA)：Sigma产品，50ug/ml。

(6)试验方法

C57BL/6小鼠30只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞约2×10⁶个，随机分为5组，每组6只，即姬松茸水溶性多糖(B)0.125、0.25、0.5g/kg，云芝糖肽胶囊0.5g/kg，生理盐水对照组，均po×7。给药结束后处死动物，无菌条件下取脾，计数脾细胞，并调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，在96孔培养板上每孔加细胞悬液100ul，ConA 50ul和培养液，各组均设三复孔，37℃，5％CO₂条件下培养18小时，加入³H-TdR 0.5uci/孔，继续培养18小时。用多头细胞收集器收集细胞，在液闪仪上测CPM值，并与对照组比较，结果见表2。

(7)试验结果

姬松茸水溶性多糖在0.125g/kg剂量时，有明显的促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖作用，随着剂量的增大，促进脾淋巴细胞增殖作用也随之增强。

            表2.姬松茸水溶性多糖对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

组别	剂量(g/kg)	给药途径	动物数	CPM( x±SD)
					生理盐水	25ml/kg	po×7	6	9622±248
云芝糖肽	0.5	po×7	6	12965±3540*
					姬松茸水溶性多糖	0.125	po×7	6	13894±1948**
0.250	po×7	6	14195±2486**
				0.500		po×7	6	16980±3572**

与对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01

2.姬松茸水溶性多糖对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响

(1)试验目的

观察姬松茸水溶性多糖口服对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响

(2)受试药物

同试验2。

(3)对照样品

云芝糖肽胶囊，来源，批号，规格同上。

(4)试验动物

品系，体重，性别及来源同上。

(5)其它材料

培养基：³H-TdR同上。YAC-1细胞由中科院上海细胞所提供。

(6)实验方法

靶细胞的标记：取传代后24小时生长良好的YAC-1细胞，按1×10⁶个/ml细胞悬液加³H-TdR 10uci，于37℃，5％CO₂培养箱中培养2小时，每30分钟振荡一次，标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为1×10⁵/ml。

NK细胞活性测定：C57BL/6小鼠30只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞约2×10⁶个，随机分为5组，每组6只，即姬松茸水溶性多糖0.125，0.25，0.5g/kg，云芝糖肽胶囊0.5g/kg，生理盐水对照组，均po×7。末次给药结束后处死动物，无菌条件下取脾，制备脾细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml作效应细胞，另取已培养24小时YAC-1细胞，调整细胞浓度为1×10⁴个/ml作为靶细胞，以靶细胞与效应细胞之比为1∶100的细胞加在96孔细胞培养板上，加入³H-TdR 0.5uci/孔，每组均设三复孔，37℃，5％CO₂条件下培养24小时后，收集细胞，测CPM值，计算特异性抑制百分率(Pi)表示NK细胞活性。

(7)实验结果

连续给药7天后能明显激活NK细胞的活性，剂量与促进作用有一定的相关性，0.5g/kg时激活NK细胞的活性优于同等剂量的云芝糖肽。结果见表3。

                表3.姬松茸水溶性多糖对荷瘤小鼠NK活性的影响

组别	剂量(g/kg)	给药途径	动物数	CPM( x±SD)	Pi(％)
						生理盐水	25ml/kg	po×7	6	34568±2338
云芝糖肽	0.5	po×7	6	21534±2344**	37.71
						姬松茸水溶性多糖	0.125	po×7	6	20963±1146**	39.36
0.250	po×7	6	19433±1088**	43.78
					0.500		po×7	6	17852±876**	51.64

与生理盐水组比较：**P＜0.01。

3.姬松茸水溶性多糖对荷瘤小鼠IL-2产生的影响

(1)试验目的：观察姬松茸水溶性多糖对荷瘤小鼠IL-2产生的影响

(2)受试药物：同上。

(3)对照样品

云芝糖肽胶囊，来源，批号，规格同上。

(4)试验动物

品系，体重，性别，来源同上。

(5)其它材料

培养基，³H-TdR同上。

(6)试验方法

C57BL/6小鼠30只，每鼠腋皮下接种Lewis肺癌细胞约2×10⁶个，随机分组给药，即姬松茸水溶性多糖0.125，0.25，0.5g/kg，云芝糖肽0.5g/kg，生理盐水对照组，均po×7。末次给药结束后处死动物，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/ml，24孔板上每孔加2ml细胞及ConA 5ug/ml，37℃5％CO₂条件下培养24小时收集上清液，用IL-2依赖性细胞株CTLL，以³H-TdR掺入法测定IL-2活性，并与对照组进行比较。结果见表4。

(7)实验结果

姬松茸水溶性多糖连续给药7天后能促进IL-2的产生，其0.5g/kg组作用最明显。

           表4.姬松茸水溶性多糖对荷瘤小鼠产生IL-2的影响

组别	剂量(g/kg)	给药途径	动物数	CPM( x±SD)
					生理盐水	25ml/kg	po×7	6	228±87
云芝糖肽	0.5	po×7	6	435±69*
					姬松茸水溶性多糖	0.125	po×7	6	518±45**
0.250	po×7	6	569±63**
				0.500		po×7	6	620±82**

与生理盐水组比较：*P＜0.05；**P＜0.01。

4.对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

(1)试验目的

测试姬松茸水溶性多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

(2)受试药物

同上。

(3)对照样品

云芝糖肽胶囊，来源，批号，规格同上。

(4)试验动物

昆明种小鼠，体重：20-22g，雄性，由中科院上海动物中心提供。每组动物数：8只

(5)试验方法

姬松茸水溶性多糖设三个剂量组(0.125、0.25、0.5g/kg)，另设生理盐水组、云芝糖肽组(0.5g/kg)，连续口服给药6天，末次给药结束后每鼠腹腔注射20％鸡红细胞悬液1ml，30分钟后颈椎脱臼处死动物，腹腔注入生理盐水2ml，转动小鼠后，吸出腹腔洗液滴于载玻片上，经漂洗、固定、染色后，油镜下进行巨噬细胞计数。

结果判定根据以下公式：

(6)试验结果

生理盐水组小鼠吞噬百分率和吞噬指数分别为20。21％和0.22；姬松茸水溶性多糖连续给药6天后，高、中、低剂量组均能明显激活小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，吞噬百分率分别为56.63％、44.69％和42.66％，吞噬指数分别为0.62、0.54和0.48，高、中剂量组的作用强度与优于云芝糖肽胶囊。试验结果见表5。

(7)试验结论

姬松茸水溶性多糖连续口服给药6天后，高、中、低剂量组均能明显激活小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

            表5.姬松茸水溶性多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

组别	剂量(g/kg)	给药方案	动物数(只)	吞噬百分率％±SD	吞噬指数±SD
						生理盐水	25ml/kg	po×6	8	20.21±1.98	0.22±0.06
云芝糖肽	0.5	po×6	8	38.54±2.68**	0.44±0.04**
						姬松茸水溶性多糖	0.125	po×6	8	42.66±1.34**	0.48±0.03**
0.250	po×6	8	44.69±1.89**	0.54±0.02**
					0.500		po×6	8	56.63±3.23**	0.62±0.04**

与生理盐水组比较：**P＜0.01。

本发明还提出所述姬松茸水溶性多糖的用途，它可以单独用于制备药物和功能性保健食品，也可以与其它任何中西药物或食物，尤其是与某些具有抗肿瘤和(或)免疫调节的药物或食物配伍，用于制备药物和功能性保健食品。

单独由本发明的提取物制备的药物和功能性保健食品，或由该提取物与其它中西药物或食物组成的复方药物和功能性保健食品，均具有抗肿瘤、调节人体免疫力，增强体质和精力等药理活性，可用于：(1)预防和治疗各类肿瘤；(2)增强肿瘤放、化疗的疗效；(3)降低肿瘤放、化疗的毒、副作用；(4)提高肿瘤病人的生活质量，延长寿命；(5)预防和治疗其他免疫相关的疾病，如风湿、类风湿、红斑狼疮、艾滋病、各类肝炎、糖尿病、哮喘、慢性气管炎等；(6)提高人体的免疫力，该善亚健康状态，防病治病，美容养颜、延年益寿。

当该提取物，或包含该提取物的药物和食物组合，用于上述医疗和保健目的时，可以采用本专业人员所熟知的方法和技术，直接和添加必要的辅料，制成胶囊剂、片剂、注射剂、颗粒剂、口服液、糖浆、膏滋、酒剂、饮料、果汁、速溶茶、糖果等多种制剂成品。当本发明的提取物被制成片剂时，它含有的赋型剂有：稀释剂，如淀粉、糊精、乳糖等；润湿剂或粘合剂，如：水、乙醇、淀粉浆、糊精、明胶浆、低取代羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂，如：干燥淀粉、泡腾崩解剂、表面活性剂等：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁、液体石蜡、聚乙二醇6000或4000等。当本发明提取物被制成胶囊剂时，它含有的赋型剂有：稀释剂，如：淀粉、糊精、乳糖、氧化镁、碳酸镁等；润湿剂或粘合剂，如：水、乙醇、淀粉浆、糊精浆、明胶浆、低取代羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂，如：干燥淀粉、泡腾崩解剂、表面活性剂等；并选用明胶硬胶囊壳或软胶囊壳。当本发明药物组合物被制成注射剂时，它含有的赋型剂有：增溶剂，如：吐温-80、甘油等；混悬剂，如：羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素等；抗氧化剂，如：亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠等；渗透压调节剂，如氯化钠或葡萄糖等；减轻疼痛的附加剂，如：苯甲醇、盐酸普鲁卡因等。当本发明药物组合物被制成口服液或饮料时，它含有的赋型剂有：蔗糖水溶液、矫味剂；助悬剂，如羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素等；防腐剂，如尼伯金乙酯或尼伯金甲酯、丙二醇、苯甲酸、山梨醇等。

附图说明

图1为姬松茸水溶性多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用试验结果

具体实施方式

实施例1醇提去除小分子成分的工艺优化

1.提取工艺的正交实验优化：

(1)正交试验设计：

A：乙醇浓度

A₁ 0％；A₂ 15％；A₃ 30％；A₄ 45％；A₅ 60％；A6 75％；A₇ 85％；A₈ 95％。

B：样品(公斤)/溶剂量(升)

B₁ 1∶6；B₂ 1∶8

C：提取时间(h)

C₁ 1.5；C₂ 3.0

D：提取次数

D₁ 2；D₂ 3。

依据以上因素和水平设计L₁₆(8×2⁸)正交表见表6。

                                  表6 L₁₆(8×2⁸)表头设计

	1       2         3       4       5       6       7       8       9
										A                         B       C               D
	12345678910111213141516	1122334455667788	1212121212121212	1212121221212121	1212212112122121	1212212121211212	1221122112211221	1221122121122112	1221211212212112										1221211221121221

(2)判断指标及测定结果：

本正交实验的评价和判断指标为浸膏中海藻糖的含量及海藻糖、葡萄糖、甘露醇的总量。其含量均采用HPLC-ELSD法进行测定。实验结果见表7：

(3)方差分析：

依据以上指标性成分含量测定结果，分别以海藻糖和海藻糖、葡萄糖及甘露醇的总量进行方差分析，结果见表8和表9。

(4)实验结果：表8和表9的方差分析结果表明，无论是单独以海藻糖为评价指标，还是以海藻糖、葡萄糖及甘露醇的总量为评价指标，正交实验结果均显示A6，B2，C1/C2，D2为最佳工艺条件，即用75％的乙醇，用量为1∶8，提取时间为1.5～3小时，连续提取2次。

                        表7各组实验指标性成分测定结果

No.

浸膏

海藻糖含量(0.01g)

海藻糖、葡萄糖、甘露醇总含量(0.01g)

12345678910111213141516

3.66224.12473.73493.77623.8333.90644.31163.85964.08724.03543.77914.24353.79312.82452.45243.2339

第一次152.0225160.0411157.1902160.4048161.7486171.9223155.4669168.5316168.3896171.5623184.3077194.7373120.46795.74547146.2279

第二次152.2165156.2394158.475160.6231158.6477172.7599151.1828171.4922163.7394173.5924193.2801194.3611123.255898.79878151.2973

平均152.1195158.1403157.8326160.5139160.1982172.3411153.3249170.0119166.0645172.5773188.7939194.5492121.861497.27213148.7626

255.8718291.1428277.9825271.2742276.2048277.3642311.8061277.1263295.5863300.0441290.6255312.2091318.8485226.8674192.6088259.1611

257.2306288.2532273.5839276.9974276.3011281.3509317.3923272.8327296.4133295.1978295.6512326.4581318.6545232.3605195.9428268.2342

256.5512289.698275.7832274.1358276.253279.3576314.5992274.9795295.9998297.6209293.1384319.3336318.7515229.6139194.2758263.6976

表8.以海藻糖为指标的方差分析

表9.以海藻糖、葡萄糖和甘露醇总和为指标的方差分析

实施例2.姬松茸醇提除杂后水溶性多糖的制备工艺及其优化

1.指标性成分含量方法的建立

经典的多糖含量测定方法是先测定总糖含量，再减去还原糖，由于姬松茸经过75％乙醇提取，小分子的还原糖已经提取完全，所以直接用酚硫酸法测定多糖含量。

(1)标准曲线与线性范围

准确称取海藻糖20.0mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，混匀。

分别吸取标准品溶液0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，1.4ml，1.6ml及1.8ml，各以水补至2.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静置10分钟，摇匀，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，以多糖微克数为横坐标，以光密度为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程，结果见表10。

                                表10标准曲线试验数据

Amountμg

16

24

32

40

48

56

64

72

Absorbance	0.212	0.339	0.480	0.604	0.723	0.847	0.970	1.103
									回归方程	Y＝0.0158x-000351    R2＝0.9996

上述结果表明，酚硫酸法测定多糖含量的方法在16～72μg范围内线性关系良好：Y＝0.0158x-0.00351  R²＝0.9996

(2)加样回收试验

精密称取一批已知含量的多糖样品250mg，置50ml容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，分别精密量取3份0.8ml；3份1.0ml；3份1.2ml；各加0.5ml标准品溶液，加水稀释至100ml，备用。

精密量取上述溶液1.0ml，加水1.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静置10分钟，摇匀，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，根据标准曲线计算多糖含量，结果见表11。

注：三种浓度的样品的稀释系数分别为0.8、1.0和1.2。

                           表11加样回收试验测定数据

Conc.	No.	加样前μg	加入量μg	测定结果μg	回收量μg	回收率％
							80％水平	1	33.704	20μg	53.91	20.206	101.03
2	20μg	54.12	20.416	102.08
					3	20μg		53.82		20.116	100.58
100％水平	4	42.13	20μg	62.09								19.96	99.80
					5	20μg	62.15	20.02	100.10
	6		20μg	62.02						19.89	99.45
					120％水平	7	50.556	20μg	70.05			19.494	97.47
8	20μg	70.22	19.664	98.32
						9		20μg	70.38	19.824	99.12
x±SD：99.77±1.33％；RSD＝1.32％

(3)精密度试验

精密称取一批多糖样品6份，每份250mg，置50ml容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，分别精密量取1.0ml，加水稀释至100ml，备用。

精密量取上述溶液1.0ml，加水1.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静置10分钟，摇匀，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，根据标准曲线计算多糖含量，结果见表12。

                  表12重复性试验数据(n＝6)

No.	称样量mg	吸光度	样品浓度μg/ml	浸膏中多糖含量(％)
					1	202.3	0.634	42.34	84.68
2	200.1	0.626	41.84	83.68
					3	200.7	0.638	42.63	85.26
4	200.3	0.629	42.05	84.10
					5	201.5	0.631	42.13	84.26
6	200.1	0.626	41.87	83.74
					x±SD：84.29±0.55％；RSD＝0.65％

结果表明：酚硫酸法测定本品多糖的含量，方法精密度较好，RSD％＜1％。

(4)反应后样品溶液稳定性

取上述反应的样品溶液一份，分别在0、30min、60min、90min。120min内测定吸光度，结果见表13。

                              表13稳定性试验数据

Time	0	30min.	60min.	90min.	120min.	RSD
							A	0.638	0.637	0.638	0.639	0.637	0.12％

结果表明：反应后样品溶液在2小时内稳定。

2.正交试验

(1)正交试验设计

a.因素及水平

A因素(提取次数)1水平：1次

               2水平：2次

               3水平：3次

B因素(提取时间)1水平：1小时

               2水平：2小时

               3水平：3小时

C因素(水的用量)1水平：1∶10

               2水平：1∶8

               3水平：1∶6

b.表头设计

        表14 L₉(3⁴)正交表

No.	A	B	C	Err
					1	1	1	1	1
2	1	2	2	2
					3	1	3	3	3
4	2	1	2	3
					5	2	2	3	1
6	2	3	1	2
					7	3	1	3	2
8	3	2	1	3
					9	3	3	2	1

(2)试验方法

a.供试品溶液制备

准确称取姬松茸残渣15g，按表头设计C列加入8～12倍体积的水，浸泡30分钟；分别置电热套中，加热至沸腾后，分别按B列保持微沸1～3小时；分别按A列提取1～3次，合并提取液，60℃减压浓缩至适当体积后，加水定容至100ml，精密量取1.0ml，置250ml容量瓶中，加水至刻度，混匀。

b.样品含量测定

吸取供试品溶液1.0ml，按上述步骤操作，测得光密度值，以标准曲线计算多糖含量，结果见表15。

                                 表15含量测定结果

No.	称样量(g)	Absorbance	浓度(μg/ml)	多糖总量(g)	提取率(％)
						1	15.05	0.434	29.68	0.742	4.93

2	14.92	0.413	28.35	0.709	4.75
						3	15.08	0.384	26.54	0.664	4.40
4	15.10	0.539	36.36	0.909	6.02
						5	15.01	0.548	36.92	0.923	6.15
6	14.95	0.615	41.14	1.029	6.88
						7	14.93	0.533	35.95	0.899	6.02
8	15.04	0.628	41.99	1.050	6.98
						9	15.07	0.595	39.91	0.998	6.62

(3)结果分析

a.方差分析

以提取率为考察指标，对试验结果进行方差分析。

                   表16正交试验结果方差分析

方差来源	df	SSj	MSj	F	Sig.
						A	2	6.1908	3.0954	359.47	**
B	2	0.1882	0.0941	10.92
						C	2	0.8401	0.4200	48.78	*
Err.	2	0.0172	0.0086

F_α＝0.01(2，2)＝99；F_α＝0.05(2，2)＝19；F_α＝0.10(2，2)＝9

方差分析表明A因素最显著，其次是C因素，B因素在α＝0.05水平不显著，在α＝0.10水平显著，

b.多重比较

由于各因素有三个水平，需要进行多重比较。

$S_{\stackrel{\‾}{x}}=\sqrt{\frac{S_e}{f_e*n}}=\sqrt{\frac{0.0172}{2*3}}=0.05354$

$Q_2^2\left(0.05\right)=6.08$

$Q_2^3\left(0.05\right)=8.33$

    表17 A因素的多重比较

	邻	间
			K3(6.54)
K2(6.35)	0.19

K1(4.69)	1.66	7.85
			Q0.05Sx	0.3255	0.4995

A因素(提取次数)多重比较表明，A₃水平和A₂水平无显著差异，从经济角度考虑，提取次数选取A₂水平，即提取2次。

       表18 B因素多重比较

	邻	间
			(K3)5.97
(K2)5.96	0.01
			(K1)5.65	0.31	0.32
Q0.05Sx	0.3255	0.4995

B因素多重比较的结果和方差分析一致，在α＝0.05水平不显著，B₃平和B₂无差异，但它们和B₁差异较大，不过在0.05水平不显著，故B因素选取B₂水平，即提取2小时。

     表19 C因素的多重比较

	邻	间
			(K1)6.26
(K2)5.80	0.46
			(K3)5.52	0.28	0.74
Q0.05Sx	0.3255	0.4995

C因素多重比较表明，C₁水平显著高于其它两个水平，由于C因素处于最高水平，需要追加试验，以确定最佳溶剂比例。

3.追加试验

准确称取姬松茸残渣6份15g，3份加水150ml；3份加水180ml，浸泡30分钟；分别置电热套中，加热至沸腾后，保持微沸2小时；提取2次，合并提取液，60℃减压浓缩至适当体积后，加水定容至100ml，精密量取1.0ml，置250ml容量瓶中，加水至刻度，混匀。

                                     表20追加试验数据

溶剂比例	No.	称样量(g)	Absorbance	浓度(μg/ml)	多糖总量(g)	提取率(％)
							1∶10	1	15.03	0.615	41.12	1.028	6.84
2	14.98	0.609	40.75	1.019	6.80
						3		14.92	0.605	40.52	1.013	6.79
Average				1.020	6.81
						1∶12		4	15.09	0.616	41.23	1.031	6.83
5	14.95	0.614	41.08	1.027	6.87
							6	14.96	0.617	41.29	1.032	6.90
Average				1.030	6.87

结果表明，溶剂量增加并不能显著增加多糖的提取率和提取总量，故C因素定为C1水平，即按1∶10的(V/W)的比例加水。

4.结论

根据以上正交试验及追加试验，表明姬松茸醇提后的残渣提取多糖的最佳工艺为：

姬松茸残渣，按1∶10的比例(重量比)加水浸泡30分钟，加热至沸腾后保持微沸2小时，提取2次，合并提取液，过滤，60℃减压浓缩至干。

5.工艺稳定性验证

准确称取5份姬松茸残渣，每份60g，分别加水600ml，浸泡30分钟，电热套加热至沸腾后，保持微沸2小时，提取2次，合并提取液，60℃减压浓缩至干。

精密称取上述多糖样品，每份250mg，置50ml容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，分别精密量取1.0ml，加水稀释至100ml，备用。

精密量取上述溶液1.0ml，加水1.0ml，然后加入6％苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml，静置10分钟，摇匀，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，根据标准曲线计算多糖含量。

                               表21工艺稳定性试验数据

No.	称样量(g)	浸膏量(g)	浸膏提取率％	多糖总量g	总提取率％	浸膏中多糖百分含量(％)
							1	59.98	4.828	8.05	4.097	6.83	84.84
2	60.04	4.863	8.1	4.107	6.84	84.44
							3	60.09	4.825	8.03	4.086	6.8	84.68

4	59.93	4.842	8.08	4.081	6.81	84.28
							5	59.94	4.837	8.07	4.094	6.83	84.63
Average		4.839	8.07	4.093	6.82	84.58
							RSD(％)		0.30	0.34	0.2	0.24	0.3

结果表明该提取工艺稳定，RSD＜1％。

实施例3.姬松茸水溶性多糖的水提超滤工艺

姬松茸子实体粗粉1.0Kg，用10倍量(重量比)的水进行提取，每次提取2小时，连续提取2次，合并提取液。在提取液中加入5％的ZTC1+1天然澄清剂，充分搅拌后静置放冷，用离心过滤法过滤获得澄清的提取液。将提取液泵入超滤器中，用截留分子量为4,000的超滤膜进行超滤，循环进行数次后，收取膜上未通过部分，用旋转蒸发仪浓缩到稠浸膏(比重～1.10)，再用真空干燥箱干燥，粉碎，即得姬松茸水溶性多糖68g。

实施例4.含姬松茸水溶性多糖口服液的制备：

姬松茸子实体粗粉6.0Kg，先用48升75％的乙醇溶液进行提取，每次提取时间为2小时，连续提取2次，合并提取液。残渣再用60升的水提取2次，每次2小时，合并水提取液，放冷后抽滤澄清。将此澄清液浓缩成稠浸膏(比重～1.10)，将该浸膏用注射用水稀释至1000mL，加入糖精钠0.8g，使溶解，静置24小时，滤过，加水调整总量至1000mL，搅匀，灌装，灭菌，即得。

实施例5.由姬松茸水溶性多糖和灵芝多糖组成的复方胶囊的的制备：

姬松茸水溶性多糖(86％)      250g

灵芝多糖提取物(含量92％)    250g

上述组分混合均匀，装入硬明胶胶囊中，共1000粒胶囊。

Claims (7)

1、一种姬松茸水溶性多糖的制备工艺，其特征在于先用15-95％的乙醇对姬松茸子实体或人工培养菌丝进行提取，以去除小分子组分；醇提后的残渣再用水进行提取，其水提液过滤澄清后直接浓缩、干燥即得所述的姬松茸水溶性多糖。

2、根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述醇以升为单位的用量是以公斤为单位的姬松茸材料量的6-20倍，提取时间为1-3小时，提取次数为1-3次。

3、根据权利要求2所述的制备工艺，其特征在于，醇提后的残渣用6-20倍重量的水连续提取1-3次，每次提取1-3小时，以获得多糖的水提取液。

4、根据权利要求1-3之一所述的制备工艺，其特征在于，所获得多糖的水提取液经过滤澄清，再浓缩提取液，然后直接稀配成液体制剂，或采用真空干燥、喷雾干燥或冷冻干燥法制成粉末。

5、一种由权利要求1-4之一所述制备工艺制备获得的姬松茸水溶性多糖。

6、一种如权利要求5所述的姬松茸等水溶性多糖的应用，其特征在于，该提取物单独或与其他中西药物或食物配伍，用于制备预防和治疗肿瘤病症和治疗免疫相关的病症的药物和功能性保健食品。

7、根据权利要求6所述的提取物的应用，其特征在于，该提取物或包含该提取物的药物和食物组合，制成胶囊剂、片剂、注射剂、颗粒剂、口服剂、糖浆、膏滋、酒剂、冲剂及饮料。

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