发明内容:
本发明的目的是提供一种以20(S)-原人参二醇为有效成分的能够增强现有抗癌药物疗效,降低其毒性、预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及增强机体免疫功能的抗癌辅助药物。
本发明进一步提供了以20(S)-原人参二醇和药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物。
本发明还提供了由20(S)-原人参二醇和其它抗癌药物以及药学上可接受的载体或辅料组成的药物组合物。
本发明还提供了20(S)-原人参二醇在制备具有增强抗癌药物疗效,降低抗癌药物毒性、预防和治疗放化疗引起的白细胞降低及增强机体免疫功能作用的药物组合物中的用途。
人参皂甙分为二醇组、三醇组和人参皂甙R0。二醇组人参皂甙以20(S)-原人参二醇为皂甙元,主要有Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd等,这些人参皂甙都是在20(S)-原人参二醇的3位及20位连有不同的糖,广泛存在于人参属植物人参、西洋参、三七等的根部及地上各部位,利用这些二醇组人参皂甙的单体或它们的混合物,可以获得20(S)-原人参二醇。
20(S)-原人参二醇的制法很多,目前见报道的方法有利用酶解的方法水解掉3位上的糖,然后再用醋酸水解的方法水解掉20位上的糖,从而获得20(S)-原人参二醇和20(R)-原人参二醇的混合物,然后再用硅胶柱层析的方法分离20(S)-原人参二醇和20(R)-原人参二醇,从而获得20(S)-原人参二醇(昭-58-131999)。另外还有完全用酶解的方法获得20(S)-原人参二醇的专利报道(CN1229086A)。
由于人参皂甙的特殊结构,利用最常见的酸水解的方法难以获得20(S)-原人参二醇,因为利用盐酸、硫酸等强酸水解人参皂甙时,会发生侧链的环合,得不到原人参二醇,得到的是人参二醇。利用醋酸等弱酸水解的话,虽然不发生侧链的环合,但3位上的糖不发生水解,所以必须用其它方法(如酶解)水解掉3位上的糖才能获得20(S)-原人参二醇,即使这样,由于此时发生一部分20(S)向20(R)的构型转变,所以造成分离困难和产率下降。而酶解则存在反应时间长,产品产率低等缺点。
利用碱水解不仅可以水解掉3位及20位的糖,同时也不发生20(S)向20(R)的构型转变,所以碱水解是利用二醇组人参皂甙制备20(S)-原人参二醇的最佳方法,但是在碱性条件下,3位及20位上的糖不易水解,尤其是3位上的糖,所以要求很高的反应温度,中国专利CN1225366A公开了利用高温高压碱水解制备20(S)-人参皂甙Rh2的方法,此方法对于制备20(S)-原人参二醇具有一定的参考意义,但此方法具有设备成本高,操作危险等缺点。
我们发明了在常压下经过高温碱水解利用二醇组人参皂甙制备20(S)-原人参二醇的制备工艺,并申请了中国专利(申请号00123074.3)。通过选择高沸点有机溶剂作反应介质,从而在不加压的情况下使反应温度达到二醇组人参皂甙发生碱水解所需的高温(大于180℃),通过常压高温碱水解的方法获得二醇组人参皂甙的水解产物后,再利用硅胶柱层析、ODS柱层析、重结晶等步骤就可以获得符合药用要求的20(S)-原人参二醇。用上述方法制备的化合物经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1H COSY、1H-1H COSY、比旋光度及熔点测定,并与20-(S)原人参二醇的文献数据对照,确认为20-(S)原人参二醇,结构式如下:
此方法具有设备成本低、操作安全,产品产率高、适于工业化生产的显著优点。
这样获得的20(S)-原人参二醇,经药效学及毒理学研究发现,它具有显著的增强抗癌药物疗效,降低抗癌药物毒性,预防和治疗抗癌药物引起的白细胞降低、增强机体免疫功能的作用,同时几乎没有任何毒副作用,是一种很好的抗癌辅助药物。
本发明的药效学研究结果如下:
20(S)-原人参二醇胶囊与功能主治有关的主要药效学试验
摘要 通过小鼠体内移植性肿瘤模型,对20(S)-原人参二醇胶囊抗肿瘤作用,对化疗药物环磷酰胺(CTX)的增效、减毒作用及其机制进行实验研究。结果表明20(S)-原人参二醇胶囊具有良好的抗癌活性,25、50、100mg/kg剂量组对肝癌H22的平均抑瘤率分别为33.53%、40.10%、49.47%;对Lewis肺癌的平均抑瘤率分别为30.5%、37.2%、48.2%;对黑色素瘤B16的平均抑瘤率分别为40.87%、41.77%、45.27%。而且20(S)-原人参二醇胶囊对CTX具有较明显的增效、减毒作用。通过对NK、SI、IL-2、CD3、CD4、CD8等免疫学指标、细胞增殖周期及C-myc、P53基因表达的测定,从肿瘤免疫、细胞凋亡等角度初步探讨了其抗癌、增效、减毒机制。结果表明20(S)-原人参二醇胶囊主要通过增强免疫功能及诱导细胞凋亡而达到抗肿瘤功效的。试验目的观察荷瘤动物应用20(S)-原人参二醇胶囊后肿瘤生长情况,对该药进行抗肿瘤药效学、增效、减毒作用及其机制研究。
试验材料
1.药物 20(S)-原人参二醇胶囊原料粉 海南亚洲制药有限公司提供,批号000906;羧甲基纤维素钠 上海化学试剂公司提供,批号990606;环磷酰胺 上海华联制药有限公司提供,批号000205;刀豆蛋白A 美国Sigma公司提供;小牛血清 大连生物试剂厂提供;二甲基亚砜 购于北京益利精细化学品有限公司;四氮硝基唑蓝 AMERSCO分装;
IL-2标准品 购于吉林省生物制品所;CTLL2依赖细胞株 由本校免疫教研室保存;RNA酶 美国Sigma公司提供;Propridium Iodide 美国Sigma公司提供;CD3CD4CD8抗体 购于北京大学医学部免疫系;
PCR引物 由北京鼎国生物工程公司合成纯化;RNA裂解液 购于北京鼎国生物工程公司;DEPC博士德生物技术工程公司提供;溴化乙锭宝泰克公司提供;4dNTP 美国Promega公司提供。
2.动物 昆明种小鼠,5~8周龄,体重18~22g,雌雄兼用,每批实验采用同一性别。实验前在实验室常规饲养三天,由长春高新医学实验动中心提供。合格证号:10-5113;C57BL/6纯系小鼠,5~8周龄,体重18~22g,雌雄兼用,每批实验采用同一性别。实验前在实验室常规饲养一周,中国医学科学院实验动物繁育场提供,合格证号:SCXK11-00-0006。
3.细胞株 小鼠肝癌H22、小鼠黑色素瘤B16、小鼠Lewis肺癌,由吉林省肿瘤研究所提供,经本实验室传代保存。
试验方法
1.药物配制 将20(S)-原人参二醇胶囊原料粉在研钵内以1%羧甲基纤维素钠配成不同浓度(0.125、0.25、0.5%)的混悬液。Rg3以1%甲基纤维素钠配成0.25%混悬液。环磷酰胺以无菌生理盐水稀释,配成0.1%溶液,现用现配。
2.动物分组及给药方案将小鼠按体重随机分为下列各组:
(1)抑瘤试验
溶剂对照组:给予1%羧甲基纤维素钠
阳性药对照组:给予环磷酰胺20mg/kg
药物小剂量组:给予20(S)-原人参二醇胶囊25mg/kg
药物中剂量组:给予20(S)-原人参二醇胶囊50mg/kg
药物大剂量组:给予20(S)-原人参二醇胶囊100mg/kg
(2)增效试验
溶剂对照组: 给予1%羧甲基纤维素钠
阳性药小剂量对照组: 给予环磷酰胺5mg/kg
阳性药小+药物小剂量组:给予环磷酰胺5+20(S)-原人参二醇胶
囊25mg/kg
阳性药小+药物大剂量组:给予环磷酰胺5+20(S)-原人参二醇胶囊
100mg/kg
阳性药大剂量对照组: 给予环磷酰胺10mg/kg
阳性药大+药物小剂量组:给予环磷酰胺10+20(S)-原人参二醇胶囊
25mg/kg
阳性药大+药物大剂量组:给予环磷酰胺10+20(S)-原人参二醇胶
囊100mg/kg
(3)减毒试验
溶剂对照组: 给予1%1%羧甲基纤维素钠
阳性药小剂量对照组: 给予环磷酰胺10mg/kg
阳性药小+药物小剂量组:给予环磷酰胺10+20(S)-原人参二醇
胶囊25mg/kg
阳性药小+药物大剂量组:给予环磷酰胺10+20(S)-原人参二醇
胶囊100mg/kg
阳性药大剂量对照组: 给予环磷酰胺20mg/kg
阳性药大+药物小剂量组:给予环磷酰胺20+20(S)-原人参二醇胶
囊25mg/kg
阳性药大+药物大剂量组:给予环磷酰胺20+20(S)-原人参二醇
胶囊100mg/kg
上述各组药物均灌胃(i.g)给药,容量为0.2ml/10g,连续给药10天。
3.20(S)-原人参二醇胶囊的体内抑瘤试验 按抗肿瘤药物实验方法学方法接种肿瘤[1、2],取腹腔内传代7天的肝癌H22小鼠,在无菌条件下抽取瘤细胞,并以生理盐水洗涤3次,调整瘤细胞浓度为1×107/ml,接种于昆明种小鼠左腹股沟皮下,每只小鼠接种0.2ml。取传代Lewis肺癌和黑色素瘤B16肿瘤生长良好的小鼠,在无菌条件下剥离瘤组织块,在玻璃研磨器内研磨成肿瘤匀浆,按瘤重(g)∶生理盐水(ml)=1∶2的比例制备瘤液,接种于C57BL/6小鼠左腹股沟皮下,每只小鼠接种0.2ml。
接种次日起给药,连续给药10天,于停药后24小时颈椎脱臼处死荷瘤小鼠,剥离肿瘤组织,称重。结果以肿瘤生长抑瘤率表示:
抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/对照平均瘤组)×100%
取符合实验标准要求(对照组平均瘤重>1g,且瘤重<400mg的动物数不超过总数的20%)的三批试验结果进行统计学分析。
4.20(S)-原人参二醇胶囊的增效试验 用小鼠肝癌H22及Lewis肺癌建立小鼠体内移植性肿瘤模型,方法及给药同前。末次给药后24小时颈椎脱臼处死荷瘤小鼠,取瘤并称重,比较单纯应用环磷酰胺5mg及10mg治疗同与20(S)-原人参二醇胶囊25mg及100mg分别合用治疗各组之间抑瘤率差异,观察20(S)-原人参二醇胶囊增效作用[3]。
5.20(S)-原人参二醇胶囊的减毒试验 用小鼠肝癌H22及Lewis肺癌建立小鼠体内移植性肿瘤模型,方法及给药同前。比较单纯应用环磷酰胺10mg及20mg治疗同与20(S)-原人参二醇胶囊25mg及100mg分别合用治疗各组之间各组动物体重差异,计算脏器指数,按常规方法[4]计数外周血白细胞数,观察20(S)-原人参二醇胶囊胶囊的减毒作用。
6.20(S)-原人参二醇胶囊对荷瘤小鼠的毒副作用 在进行20(S)-原人参二醇胶囊胶囊体内抑瘤实验过程中,每天称量体重一次,观察其变化情况。于处死荷瘤小鼠前自尾静脉取血,常规计数白细胞数。取瘤同时解剖分离胸腺、脾脏及靶器官,称重并计算脏器指数。
胸腺(脾)指数=胸腺(脾)重(g)/体重(100g)。
7.20(S)-原人参二醇胶囊对荷瘤小鼠免疫功能的影响
7.1药物对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响[5-7]
第三批肝癌H22抑瘤试验中,末次给药后24小时在观察抑瘤率同时,无菌条件下取出荷瘤小鼠脾脏,分组研磨,用IMDM培养液调脾细胞浓度到1×107个/ml。取96孔平底培养板,每只鼠设:
(1)对照孔,3复孔,每孔加100μl IMDM培养液
(2)ConA刺激孔,3复孔,每孔加100μl ConA(10μg/ml)
然后每孔加100μl脾细胞悬液。在37℃、5%CO2培养箱中培养72小时,终止培养前4小时加入MTT溶液(5mg/ml)10μl/孔。终止培养后,小心吸弃孔内上清液,每孔加入100μl DMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解。用酶标仪在570nm波长处测定吸光度(OD值),计算刺激指数。
刺激指数=ConA刺激孔OD值/对照孔OD值
7.2药物对荷瘤小鼠NK细胞毒百分率影响的测定[8、9]
取上述脾细胞悬液,制备常规培养YAC-1细胞悬液,调浓度至1×106个/ml。
取96孔圆底培养板,每只鼠设:
(1)效应细胞∶靶细胞(10∶1)孔,加50μl脾细胞悬液,100μl YAC-1细胞悬液,50μl IMDM培养液;效应细胞对照孔,加50μl脾细胞悬液,150μl IMDM培养液。
(2)效应细胞∶靶细胞(20∶1)孔,加100μl脾细胞悬液,100μl YAC-1细胞悬液;效应细胞对照孔,加入100μl脾细胞悬液,100μl IMDM培养液。
(3)靶细胞对照孔,加入100μl YAC-1细胞悬液,100μl IMDM培养液。
上述各组均设三复孔,将培养板于37℃、5%CO2及100%湿度的培养箱中孵育24小时后,各孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl,同样条件下继续孵育4小时终止培养。然后小心吸弃孔内上清液,每孔加入100μl DMSO,振荡10min。用酶标仪在490nm波长处测定OD值,计算NK细胞毒百分率。
7.3药物对荷瘤小鼠IL-2活性的影响
采用依赖细胞株法检测Ppd对荷瘤小鼠IL-2活性的影响[10、11]。
(1)小鼠脾细胞IL-2诱生 制备脾细胞悬液,方法同上,冲洗一次后调细胞浓度为0.5×107/ml。加入终浓度为5~10μg/ml的ConA,3000rpm离心10min收获细胞培养上清(其中含IL-2)。
(2)IL-2活性测定 将IL-2标准品用培养液倍比稀释,以3复孔加入96孔板,每孔100μl。将待测样品1∶2稀释,亦按3复孔加入到96孔板内。将生长状态良好的CTLL2细胞离心洗涤两遍,用含10%小牛血清的IMDM培养液配成5×105/ml浓度的细胞悬液。向每孔中加入100μl细胞悬液,置5%CO237℃培养箱中孵育22小时后,各孔加入MTT溶液(5mg/ml)10μl,同样条件下继续孵育4小时终止培养,小心吸弃孔内上清液,每孔加入100μlDMSO,振荡10min。用酶标仪在570nm波长处测定OD值。用log2稀释度(X)和各稀释度对应的OD值(Y)作直线回归,分析计算待测样品的IL-2浓度。
4)荷瘤小鼠CD3、CD4及CD8活性测定
每管样品取1×106荷瘤小鼠抗凝血,直接加入免疫荧光抗体各20μl,4℃避光反应30分钟后,加入2ml溶红细胞液,室温作用3~5分钟后可见红细胞溶解,500g离心3分钟。加入2ml PBS洗液,洗涤两次即可上FACS流式细胞仪进行分析。
8.20(S)-原人参二醇胶囊对细胞凋亡及细胞周期的影响
采用流式细胞术(Flow Cytometry Method FCM)对肿瘤组织进行细胞凋亡及细胞周期的检测[12-15]。
(1)样品制备 建立H22荷瘤小鼠模型,给药10天后,颈椎脱臼处死小鼠,剥离肿瘤组织,置于玻璃研磨器内研磨,将细胞悬液过200目筛网,调细胞浓度为1×106个/ml,取200μl细胞悬液以2ml 70%冷乙醇固定,4℃过夜,第2天上机分析。
(2)PI定量DNA荧光染色 将固定细胞用0.01M PBS洗涤2次,调细胞浓度为1×106个/ml,取200μl样品加入0.1mg/ml RNase200μl,室温30min,离心弃上清,以0.01M PBS洗涤2次后加入PI Triton-X100混合物500μl(50μg/ml PI 0.1%Triton-X100),避光室温放置30min,上机前过300目筛网。
(3)FCM检测 采用FACScalibur流式细胞仪进行分析,用Cell Quest软件收获10000个细胞,用ModFitLT软件分析结果。
9.20(S)-原人参二醇胶囊对C-myc及p53基因表达的影响
通过RT-PCR对C-myc及p53基因进行分析。
9.1引物设计与合成
根据引物设计的原则,参考电脑基因库核苷酸序列资料,由北京鼎国生物工程公司合成纯化。
C-myc引物序列:
①5’ACAGG AAAGC AGGTT CTTGG 3’
②5’ACCGT TCTTA GCCGC AAGCA G 3’
p53引物序列:
①5’GACGA TATTC GACCA CGGAT GCT 3’
②5’GAATC GATGG AGTCT CCTG 3’
β-actin为标准内参照
①5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA 3’
②5’ATCATGTTTGAGACCTTCAACA 3’
9.2半定量RT-PCR实验流程[16]
9.2.1组织总RNA提取(采用异硫氰酸胍法)
(1)建立H22荷瘤小鼠模型,给药10天后处死小鼠,剥离肿瘤组织。
(2)取100mg肿瘤组织充分研磨制成组织匀浆;
(3)加入2ml裂解液(4N异硫氰酸胍,20mM NaAC pH5.2,0.1Mβ-巯基乙醇,0.5%十二烷基肌氨酸钠),使组织完全溶解;
(4)12000rpm 4℃离心5分钟,弃沉淀;
(5)加200μl氯仿充分混匀,12000rpm 4℃离心5分钟;
(6)小心吸取上层水相,加入等体积的抽提液(酚∶氯仿∶异戊醇=24∶24∶1)温和混匀,12000rpm 4℃离心5分钟;
(7)重复上述步骤(5)一次;
(8)吸取上清,加1/10体积3N乙酸钠(pH5.2),1倍体积异丙醇,-20℃放置20分钟至1小时;
(9)12000rpm 4℃离心10分钟,弃上清;
(10)加入500μl 75%预冷的乙醇,振荡混匀,12000rpm 4℃离心10分钟,弃上清;
(11)重复上述步骤(9)一次,室温晾干;
(12)加入DEPC水溶解。
9.2.2 RNA甲醛凝胶电泳[17、18]
(1)制备凝胶 将1%琼脂糖熔于DEPC水,加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液[0.1mol/L MOPS(pH7.0)40mmol/L 乙酸钠5mmol/L EDTA(pH8.0)]和甲醛至终浓度分别为1×和2.2mol/L,制备凝胶。
(2)制备样品在一灭菌的Eppendorf管内混合下列液体:
RNA 4.5μl
5×甲醛凝胶电泳缓冲液 2.0μl
甲醛 3.5μl
甲酰胺 10.0μl
于65℃温育15分钟,冷却后离心5秒钟。
(3)加2μl灭菌并用DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液。
(4)将凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液,3-4V/cm电压降进行电泳。
(5)电泳结束后,将凝胶条浸入溴化乙锭(EB)溶液中染色30-45分钟,在紫外灯下照像。
9.2.3组织中总RNA浓度及纯度
检测标本细胞总RNA,应用紫外分光光度计测定RNA纯度及含量,260nm与280nm比值在1.7-2.0之间,基本上无蛋白质污染。根据公式,实际OD值260×核酸稀释倍数×40/1000,计算出RNA的浓度为1.4984μg/μl,提示异硫氰酸胍法提取的RNA有较高纯度和活性。
9.2.4逆转录反应(RT)
反应体系(10μl)
RNA 1μl(约1-2μg RNA)
dNTP 2μl
MgCl2 0.5μl
RP(随机引物) 1μl
反转录酶 1μl
10×Buffer 1μl
dd H2O 3.5μl
温育37℃30分钟,95℃5分钟终止反应。
9.2.5多聚酶链式反应(PCR)
cDNA扩增反应体系(25μl)
RT反应液 10μl
dNTP 2l
引物 1.5μl
Taq DNA聚合酶 1μl
β-actin 1μl
10×Buffer 1.5μl
dd H2O 8μl
(1)向每个eppendorf管内加入50μl石蜡油
(2)简单离心
(3)将Eppendorf管内放入PCR仪,95℃3分钟
(4)温度循环94℃30秒,55℃1分钟,72℃30秒共35个循环
(5)取扩增产4℃贮存,备电泳分析。
9.2.6 PCR产物分析:
取10μl PCR扩增产物,C-myc基因在1.5%的琼脂糖凝胶水平电泳上做扩增产物检测分析,电压80伏,1h,溴化乙啶染色。紫外光下拍照,比较各组电泳条带之间差异。p53基因用SSCP法分析,使PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),比较各组电泳迁移速率的差异,检测p53基因的点突变情况。
统计方法 所有结果均采用Excel进行T检验显著性差异检测,结果以均值±标准差(x±s)表示。
试验结果
1 20(S)-原人参二醇胶囊的抑瘤作用
1.1 20(S)-原人参二醇胶囊对小鼠肝癌H22的生长抑制作用
结果表明,20(S)-原人参二醇胶囊对肝癌H22具有明显的生长抑制作用(P<0.05),且存在剂量效应关系,实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为33.53%、40.10%、49.47%,见表1。
表1 20(S)-原人参二醇胶囊对小鼠肝癌H
22的生长抑制作用(n=10 x+s)
组别 |
剂量 |
瘤重(g) |
抑瘤率% |
P值 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
1.64±0.360.48±0.281.24±0.171.05±0.250.86±0.26 |
-71.024.435.747.7 | <0.001<0.01<0.001<0.001 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mh/kg50mg/kg100mg/kg |
1.37±0.460.47±0.110.72±0.200.63±0.270.59±0.23 |
-65.347.454.056.9 | <0.001<0.01<0.001<0.001 |
溶剂对照 |
20ml/kg |
1.69±0.57 |
- | |
环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
0.27±0.101.20±0.281.17±0.250.95±0.23 |
84.128.830.643.8 |
<0.001<0.05<0.05<0.001 |
1.2 20(S)-原人参二醇胶囊对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用
结果表明,20(S)-原人参二醇胶囊对Lewis肺癌具有明显的生长抑制作用(P<0.05),且存在剂量效应关系,实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为30.5%、37.2%、48.2%,见表2。
表2 20(S)-原人参二醇胶囊对小鼠Lewis肺癌的生长抑制作用(n=10 x±s)
组别 |
剂量 |
瘤重(g) |
抑瘤率% |
P值 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
1.62±0.450.47±0.280.99±0.300.87±0.450.89±0.51 |
-71.039.346.645.0 | <0.001<0.01<0.01<0.01 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
1.06±0.240.27±0.060.80±0.120.66±0.250.44±0.12 |
-74.324.237.758.5 | <0.001<0.05<0.01<0.001 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
1.53±0.290.37±0.201.10±0.271.00±0.530.90±0.24 |
-75.728.134.641.1 | <0.001<0.01<0.05<0.001 |
1.3 20(S)-原人参二醇胶囊对小鼠黑色素瘤B16的生长抑制作用
结果表明,20(S)-原人参二醇胶囊对黑色素瘤B16具有明显的生长抑制作用(P<0.05),且存在剂量效应关系,实验组三个剂量的平均抑瘤率分别为40.87%、41.77%、45.27%,见表3。
表3 20(S)-原人参二醇胶囊对小鼠黑色素瘤B
16的生长抑制作用(n=10 x±s)
组别 |
剂量 |
瘤重(g) |
抑瘤率% |
P值 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
1.56±0.530.24±0.090.88±0.480.85±0.440.82±0.34 |
-84.943.545.547.4 | <0.001<0.01<0.01<0.01 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
1.60±0.490.23±0.100.79±0.410.97±0.350.92±0.40 |
-85.550.339.042.0 | <0.001<0.001<0.01<0.01 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
1.25±0.220.26±0.050.89±0.260.74±0.250.67±0.16 |
-79.528.840.846.4 | <0.001<0.05<0.01<0.001 |
2 20(S)-原人参二醇胶囊的增效作用
2.1 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺治疗小鼠肝癌H22的增效作用
结果表明,环磷酰胺5mg/kg剂量组平均抑瘤率为20.19%,而加用20(S)-原人参二醇胶囊25mg/kg及100mg/kg实验组平均抑瘤率分别为28.95%及44.20%,提高抑瘤率8.76~24.01%。环磷酰胺10mg/kg剂量组平均抑瘤率为32.45%,而加用20(S)-原人参二醇胶囊25mg/kg及100mg/kg实验组平均抑瘤率分别为51.22%及64.25%,提高抑瘤率18.77~31.80%,结果见表4及图1。
2.2 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺治疗小鼠Lewis肺癌的增效作用
结果表明,环磷酰胺5mg/kg剂量组平均抑瘤率为19.40%,而加用20(S)-原人参二醇胶囊25mg/kg及100mg/kg实验组平均抑瘤率分别为32.35%及49.83%,提高抑瘤率12.95~30.43%。环磷酰胺10mg/kg剂量组平均抑瘤率为37.25%,而加用20(S)-原人参二醇胶囊25mg/kg及100mg/kg实验组平均抑瘤率分别为53.93%及62.54%,提高抑瘤率25.29~22.68%,结果见表5及图2。
以上结果提示,环磷酰胺5mg剂量组为治疗肝癌H22及Lewis肺癌的无效剂量,环磷酰胺10mg剂量组为治疗肝癌H22及Lewis肺癌的有效剂量,20(S)-原人参二醇胶囊分别与其联合应用可以提高抑瘤率,增强治疗效果。而且20(S)-原人参二醇胶囊与环磷酰胺X联合用药优于环磷酰胺单纯用药,增效作用明显(与环磷酰胺组比较P<0.05)。
表4 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H
22生长的增效作用
组别 |
剂量 |
瘤重(g) |
抑瘤率% |
溶剂对照组环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇 |
20ml/kg5mg/kg5+25mg/kg5+100mg/kg10mg/kg10+25mg/kg10+100mg/kg |
1.99±0.551.53±0.471.42±0.561.03±0.371.14±0.380.78±0.330.60±0.21 |
-23.3128.55*48.00*30.65*60.85**69.85*** |
溶剂对照组环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇 |
20ml/kg5mg/kg5+25mg/kg5+100mg/kg10mg/kg10+25mg/kg10+100mg/kg |
1.23±0.400.89±0.260.77±0.230.62±0.220.78±0.210.60±0.180.46±0.15 |
-27.6437.40*49.59**36.59*51.22**62.61*** |
溶剂对照组环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇 |
20ml/kg5mg/kg5+25mg/kg5+100mg/kg10mg/kg10+25mg/kg10+100mg/kg |
1.66±0.661.50±0.461.31±0.371.08±0.321.16±0.370.97±0.310.66±0.23 |
-9.6120.935.0*30.1*41.6**60.3*** |
注:与溶剂对照比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
表5 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌生长的增效作用
组别 |
剂量 |
瘤重(g) |
抑瘤率% |
溶剂对照组环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇 |
20ml/kg5mg/kg5+25mg/kg5+100mg/kg10mg/kg10+25mg/kg10+100mg/kg |
1.10±0.370.88±0.290.78±0.200.57±0.130.69±0.200.58±0.310.53±0.14 |
-20.0029.09*48.18**37.27*47.27**51.82** |
溶剂对照组环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇 |
20ml/kg5mg/kg5+25mg/kg5+100mg/kg10mg/kg10+25mg/kg10+100mg/kg |
1.31±0.361.04±0.270.88±0.210.62±0.110.83±0.270.58±0.160.41±0.14 |
-20.6132.82*52.67**36.64*55.73**68.70*** |
溶剂对照组环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺+20(S)-原人参二醇环磷酰胺环磷酰胺+20(S)-原人参二醇 |
20ml/kg5mg/kg5+25mg/kg5+100mg/kg10mg/kg10+25mg/kg |
1.48±0.311.22±0.240.96±0.230.76±0.310.92±0.130.61±0.16 |
-17.5835.15*148.6537.84*58.78** |
环磷酰胺+20(S)-原人参二醇 |
10+100mg/kg |
0.49±0.14 |
67.11*** |
注:与溶剂对照比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
3 20(S)-原人参二醇胶囊的减毒作用
在肝癌H22及Lewis肺癌肿瘤模型中,环磷酰胺10mg及20mg剂量组在抑瘤作用的同时可见体重、免疫器官及白细胞均明显下降(P<0.01或0.001),有些小鼠在停药前就已经死亡。20(S)-原人参二醇胶囊与环磷酰胺合用可对此起保护作用,对抗环磷酰胺所致的体重、白细胞下降及免疫器官萎缩,提高小鼠胸腺及脾脏重量,降低荷瘤小鼠死亡率,减轻环磷酰胺的毒性,见表6-1、6-2、6-3及表7-1、7-2、7-3。
表6-1 20(S)-原人参二醇对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H
22生长的减毒作用
组别 |
体重(g) |
胸腺指数 |
脾指数 |
WBC(×109/L) |
溶剂对照组20ml/kg环磷酰胺10mg/kg环磷酰胺20mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+100mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+100mg/kg | 22.05±1.6419.84±1.57***18.70±1.63***21.83±1.2721.70±1.0621.46±1.5121.08±1.44 | 0.152±0.0430.086±0.021***0.048±0.042***0.129±0.039###0.150±0.038###0.121±0.023###0.130±0.035### | 0.705±0.1560.478±0.094**0.410±0.120**0.629±0.129#0.729±0.140##0.623±0.063##0.698±0.183## | 8.26±2.864.76±2.47***4.24±2.89***7.54±2.80##7.32±2.96##7.50±3.45##8.04±3.38## |
注:与溶剂对照比较*P<0.05与环磷酰胺相应剂量组比较#P<0.05 ##P<0.01 ###P<0.001下表同
表6-2 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H
22生长的减毒作用
组别 |
体重(g) |
胸腺指数 |
脾指数 |
WBC(×109/L) |
溶剂对照组20ml/kg环磷酰胺10mg/kg环磷酰胺20mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+100mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+100mg/kg | 25.43±2.3123.39±1.88*20.76±1.92***24.83±1.7225.17±2.0924.46±2.5225.88±2.41 | 0.283±0.0520.132±0.024***0.096±0.029***0.262±0.030###0.128±0.036###0.261±0.022###0.280±0.033### | 0.849±0.1380.443±0.112***0.389±0.087***0.766±0.088###0.718±0.147###0.738±0.126###0.769±0.114### | 10.67±2.556.76±1.01***5.28±2.37***11.59±2.83##10.32±2.33##9.57±1.43##11.06±3.29## |
表6-3 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺抑制小鼠肝癌H
22生长的减毒作用
组别 |
体重(g) |
胸腺指数 |
脾指数 |
WBC(×109/L) |
溶剂对照组20ml/kg环磷酰胺10mg/kg环磷酰胺20mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+25mg/kg | 24.08±2.0521.83±1.76*19.97±2.64***23.33±2.51 | 0.188±0.0350.091±0.022***0.045±0.014***0.165±0.059### | 0.718±0.1370.426±0.058***0.401±0.125***0.699±0.153### | 10.26±2.345.81±2.51***4.21±1.80***9.45±1.88## |
环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+100mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+100mg/kg | 23.91±2.2724.66±2.5425.14±1.60 | 0.174±0.024###0.170±0.019###0.180±0.025### | 0.679±0.146###0.620±0.130###0.616±0.242### | 9.66±2.58##9.98±2.22##10.94±3.67## |
表7-1 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌生长的减毒作用
组别 |
体重(g) |
胸腺指数 |
脾指数 |
WBC(×109/L) |
溶剂对照组20ml/kg环磷酰胺10mg/kg环磷酰胺20mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+100mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+100mg/kg | 26.75±1.6423.83±1.57***20.71±1.68***25.88±2.2926.14±1.8225.76±1.5126.07±2.94 | 0.173±0.0460.089±0.020***0.075±0.042***0.159±0.083###0.200±0.053###0.166±0.032###0.181±0.066### | 0.552±0.1680.371±0.120*0.286±0.116**0.591±0.069#0.523±0.188#0.526±0.129##0.569±0.241## | 8.68±2.114.52±1.44***4.01±0.85***7.50±2.81##10.34±2.87##7.55±1.04##8.67±2.31## |
表7-2 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌生长的减毒作用
组别 |
体重(g) |
胸腺指数 |
脾指数 |
WBC(×109/L) |
溶剂对照组20ml/kg环磷酰胺10mg/kg环磷酰胺 | 24.47±2.3821.30±1.69** | 0.223±0.0520.118±0.021** | 0.481±0.1380.285±0.087*** | 9.65±2.574.76±1.04*** |
20mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+100mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+100mg/kg |
19.77±2.96***24.64±1.9425.64±2.4524.62±2.4125.47±2.99 |
0.097±0.015***0.282±0.033###0.239±0.030###0.288±0.026###0.227±0.039### |
0.246±0.112***0.435±0.126##0.411±0.147###0.460±0.088###0.463±0.114### |
4.23±1.18***8.55±1.86##9.39±1.92##8.54±1.34##10.03±2.37## |
表7-3 20(S)-原人参二醇胶囊对环磷酰胺抑制小鼠Lewis肺癌生长的减毒作用
组别 |
体重(g) |
胸腺指数 |
脾指数 |
WBC(×109/L) |
溶剂对照组20ml/kg环磷酰胺10mg/kg环磷酰胺20mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇10+100mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+25mg/kg环磷酰胺+20(S)-原人参二醇20+100mg/kg | 23.38±2.1120.52±1.83**18.17±1.60***22.61±2.1823.42±2.6222.67±1.8423.18±2.22 | 0.290±0.0570.091±0.015***0.045±0.011***0.274±0.037###0.286±0.061###0.261±0.028###0.295±0.033### | 0.495±0.1320.322±0.114***0.250±0.129***0.416±0.164##0.421±0.175##0.409±0.169##0.445±0.218### | 10.26±2.345.81±2.51***4.21±1.80***9.45±1.88##9.66±2.58##9.98±2.22##10.94±3.67## |
4 20(S)-原人参二醇胶囊对荷瘤小鼠的毒副作用
20(S)-原人参二醇胶囊对H22、Lewis及B16荷瘤小鼠的体重、胸腺、脾脏及外周血白细胞数均无明显影响,环磷酰胺则明显降低荷瘤小鼠的体重、胸腺指数及外周血白细胞数量(P<0.001),脾指数亦有所下降,见表8~10及图1~3。
表8 20(S)-原人参二醇胶囊对肝癌H
22荷瘤小鼠的毒副作用
组别 |
体重(g) |
肝重(g) |
胸腺腺指数 |
脾指数 |
WBC(109/L) |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
23.31±1.6419.96±2.22***22.94±2.1323.16±2.7123.33±3.07 |
1.641±0.4231.314±0.2341.649±0.2701.632±0.1911.625±0.330 |
0.186±0.0820.091±0.035***0.132±0.0690.148±0.0340.185±0.081 |
0.825±0.1190.532±0.151**0.746±0.1640.732±0.1560.816±0.134 |
10.92±3.265.03±1.37***9.12±3.269.22±3.169.57±1.73 |
注:与溶剂对照比较*P<0.01 **P<0.05 ***P<0.001
表9 20(S)原人参二醇胶囊对Lewis肺癌荷瘤小鼠的毒副作用
组别 |
体重(g) |
肺重(g) |
胸腺指数 |
脾指数 |
WBC(109/L) |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
22.54±1.6419.84±1.57***22.66±1.3122.56±1.0723.10±1.37 |
0.146±0.0110.145±0.0110.143±0.0080.148±0.0120.142±0.013 |
0.152±0.0430.086±0.021***0.146±0.0500.150±0.0370.133±0.036 |
0.405±0.1560.378±0.0940.424±0.1450.428±0.1540.432±0.156 |
8.26±2.864.24±2.47***11.23±2.76*9.22±4.459.61±5.17 |
注:与溶剂对照比*P<0.05 ***P<0.001
表10 20(S)原人参二醇胶囊对黑色素瘤B
16荷瘤小鼠的毒副作用
组别 |
体重(g) |
胸腺指数 |
脾指数 |
WBC(109/L) |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
22.68±1.1519.84±1.63**21.90±0.9922.43±1.6422.34±1.08 |
0.127±0.0290.048±0.042***0.121±0.0490.049±0.3890.024±0.480 |
0.42±0.130.33±0.120.39±0.050.40±0.170.46±0.12 |
10.10±4.044.76±2.89**11.67±3.319.46±3.119.83±2.47 |
注:与溶剂对照比较**P<0.01 ***P<0.001
5 20(S)-原人参二醇胶囊对小鼠免疫功能的影响
5.1 20(S)-原人参二醇胶囊对小鼠脾淋巴细胞转化功能的影响
20(S)-原人参二醇胶囊中剂量及大剂量灌胃给药10天后,ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖反应明显增高(P<0.05及0.01),且存在量效关系。见表11-1。
5.2 20(S)-原人参二醇胶囊对NK细胞活性的影响
20(S)-原人参二醇胶囊中剂量及大剂量灌胃给药10天后,可明显提高小鼠NK细胞活性(P<0.05及0.01),且存在量效关系。见表11-1。
5.3 20(S)-原人参二醇胶囊对荷瘤小鼠IL-2活性的影响
20(S)-原人参二醇胶囊中剂量及大剂量灌胃给药10天后,CTLL2诱导荷瘤小鼠产生的IL-2的量明显增加(P<0.05及0.01),且存在量效关系,见表11-1。
5.4 20(S)-原人参二醇胶囊对荷瘤小鼠CD3、CD4及CD8的影响
FCM检测结果表明20(S)-原人参二醇胶囊大剂量灌胃给药10天后,可明显提高CD3CD8双阳性细胞百分率(P<0.001),并具有提高荷瘤小鼠CD4/CD8比值的趋势,但未见统计学差异。见表11-2及图4。
表11-1 20(S)-原人参二醇胶囊对肝癌H
22荷瘤小鼠免疫功能的影响
组别 |
剂量 |
SI |
NK(%) |
IL-2 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
20ml/kg20mg/kg25mg/kg50mg/kg100mg/kg |
1.022±0.2531.198±0.3311.074±0.1191.299±0.238*1.411±0.193** |
19.23±2.1017.45±3.1420.63±3.2221.52±2.13*23.19±3.27** |
2.169±0.3602.474±0.4412.143±0.2043.077±0.818*5.039±2.394** |
注:与溶剂对照组比较*P<0.05 **P<0.01
表11-2 20(S)-原人参二醇胶囊对肝癌小鼠免疫功能的影响
组别 |
CD3 |
CD4 |
CD8 |
CD3CD4 |
CD3CD8 |
CD4/CD8 |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
52.14±8.1453.38±11.7655.97±8.2958.00±16.6963.19±11.67 |
44.55±3.7646.62±2.4444.46±4.3750.84±26.9250.94±11.81 |
42.22±8.4039.14±5.6444.02±13.5644.18±11.1738.50±7.61 |
9.83±2.3711.56±2.309.50±2.279.21±9.329.04±5.88 |
28.51±4.3224.20±3.1930.33±5.6229.48±5.2736.87±4.78*** |
1.10±0.261.22±0.211.05±0.221.22±0.661.36±0.37 |
注:与溶剂对照组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
6 20(S)-原人参二醇胶囊对细胞凋亡及细胞周期的影响
6.1细胞凋亡的检测结果
经FCM检测发现实验组细胞发生凋亡的百分率明显高于对照组(P<0.001=,在检测图谱中,出现了典型的G1亚峰,即凋亡峰。见表12。
6.2细胞周期分析结果
试验组细胞处于G0/G1期的百分率明显高于对照组(P<0.05或0.01),处于S期的细胞的百分率则明显低于对照组(P<0.05或0.01),而G2+M期相对稳定。说明实验组肿瘤细胞增殖指数下降,细胞生长受阻于G0/G1期,细胞趋于成熟。见表12及图5。
表12 20(S)-原人参二醇胶囊对细胞凋亡及细胞周期的影响
组别 |
细胞凋亡 |
G0/G1 |
S |
G2+M |
溶剂对照环磷酰胺小剂量组中剂量组大剂量组 |
10.51±3.7932.41±3.26***32.47±3.61***32.75±2.66***33.51±4.40*** |
68.36±12.1580.25±9.14*80.77±8.02*82.27±3.98**84.61±7.88** |
26.66±18.2913.91±9.6410.94±12.73*12.15±8.83*7.57±9.49** |
4.98±7.015.83±5.048.29±6.435.54±5.757.82±4.31 |
注:与溶剂对照组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001
7 20(S)-原人参二醇胶囊对肝癌基因表达的影响
(1)如图6所示,RNA甲醛变性凝胶电泳显示RNA完整性良好,无基因组DNA污染。
(2)琼脂糖凝胶电泳紫外光下拍摄照片如图7所见,1为marker;2为原人参二醇胶囊大剂量组;3为溶剂对照组;4为小剂量组;5为原人参二醇胶囊中剂量组;6原人参二醇胶囊为大剂量组;7为CTX对照组;8为溶剂对照组。根据电泳条带的亮度结合marker电泳条带判断基因表达的相对强弱,亮度强者表示基因表达增强,亮度弱者表示基因表达减弱,缺乏条带表示没有基因表达。由图所见,溶剂对照组C-myc电泳条带亮度最强,说明在肿瘤发生过程中,C-myc处于一种过度表达状态。Ppd小剂量、中剂量及CTX对照组均有表达,但相对溶剂对照组条带亮度较弱,Ppd大剂量电泳条带几乎未发现C-myc条带,说明原人参二醇可抑制荷瘤小鼠C-myc过度表达。抑制肿瘤细胞恶性增殖。
(3)用银染-PCR-SSCP方法分析p53基因突变情况,结果Ppd实验组与对照组之间电泳迁移率未见差异,见图8。
本发明的药物组合物,以20(S)-原人参二醇为有效成分,可以口服给药,也可以注射给药,还可以采用其它给药方式,可以制成多种相应的口服制剂或注射剂。
例如,利用20(S)-原人参二醇和各种医药上认可的药用辅料,可以制成片剂、胶囊剂、口服液、颗粒剂等。利用注射用溶媒和(或)助溶剂可以制成20(S)-原人参二醇的注射液,还可以制成注射用粉针剂。
另外,本发明的药物组合物,还可以制成以20(S)-原人参二醇为主要有效成分,同时含有其它一种或多种天然的或合成的抗癌药物组成的复方制剂供临床应用。例如,可以用20(S)-原人参二醇和环磷酰胺、5-氟尿嘧啶,阿霉素、顺铂等组成复方制剂,制成疗效增强、毒性降低的药物组合物。
本发明的药物组合物,其临床用量以20(S)-原人参二醇计可以是10--1000mg,最好是50-100mg,每日分两次服用。