CN1089092C - 一种促分化抑增殖抗癌药二萜类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从热带鞘蕊花属植物提取的式I结构二萜类化合物及制备方法和用途。该方法将鞘蕊花根或茎磨成粉，经有机溶剂萃取，石油醚脱脂，甲醇提取，氧化铝层析得到式I结构的纯品。该化合物有广谱性抑癌作用，用于治疗鼻咽癌，白血病，胃肠癌，食道癌，胆囊癌等，其主要特点是抑制癌细胞增殖，促进癌细胞向正常逆转分化，一反传统细胞毒药物的性质，不杀伤正常细胞。该化合物可与维甲酸联合应用，增强疗效。

Description

一种促分化抑增殖抗癌药二萜类化合物及制备方法和用途

本发明涉及一种从热带鞘蕊花属植物提取的二萜类化合物及制备方法和用途，特别是涉及下式I结构的化合物及制备方法和用途。

目前人们对于这类化合物的研究主要集中在对细胞跨膜信号通路的影响方面，如文献1：谭薇琦、管考梅在“生物化学杂志”，1995，Vol.11，No.3发表的“毛喉萜对人胃癌细胞(BGC-823)中蛋白激酶C及其亚类的影响”。毛喉萜类是从毛喉鞘蕊花中提取出的一种二萜类化合物，国际上曾有报道毛喉鞘蕊花植物中的二萜类化合物有效成分，是腺甘酸环化酶的特异性激活剂。也有人做了毛喉萜类抑制人胃癌细胞(BGC-823)增殖与ras基因表达相关性研究，如文献2：“生物化学杂志”1995年Vol.11，No.4上发表的“毛喉萜抑制人胃癌细胞BGC-823增殖与ras基因表达相关性研究”(谭薇琦、管考梅)，文中描述：将人胃癌细胞BGC-823培养于含10％小牛血清的RPMI 1640培液中，加入毛喉萜类，对照组不加药，于37℃、5％CO₂条件下培养，细胞生长呈浓度依赖曲线。如图1所示。

对于这类植物二萜的研究，如：毛喉萜类作用机理的研究，多年来人们主要集中在其对环腺苷酸(cAMP)通路的影响。如它能增高多种类型细胞中腺苷酸环化酶活性和增加cAMP的积累，通过激活cAMP依赖的蛋白激酶A(PKA)，引起特异的底物蛋白磷酸化，从而调节细胞内有关基因表达等生理效应。另外还有人报道：二萜类化合物在细胞内磷脂酰肌醇通路中的作用及对癌细胞的生理效应。

在上述文献中所介绍的二萜类化合物具有如下结构式：

它们是具有从2-7位乙酰一类的二萜化合物的混合物，且含量在0.01％-0.05％之间，难以得到高纯度的单一成分，更没有单一结构化合物药效的报道，至今未实现临床药用。

本发明的目的在于：1.目前临床上癌症的药物治疗主要是以细胞毒为基础的传统癌症杀伤疗法，尽管这类疗法在许多恶性肿瘤和晚期癌症患者的治疗中取得了显著疗效，但是由于所用药物有较大的毒副作用，同时也杀伤许多正常细胞，给患者带来极大的生理危害，如：脱发、掉牙齿、损伤分泌腺等。为了改变目前临床上单一应用细胞毒药物的现状，开发一种促分化抑增殖的抗癌新药，为癌症的治疗开辟一条新的途径。2、为了达到本发明二萜类化合物的最佳药效，还提供一种该化合物与维甲酸的协同组合。维甲酸是另一类具有一定毒性的白血病细胞的分化诱导剂，联合应用不同作用机制的分化诱导剂，可提高药效、降低毒性和克服癌细胞的耐药性。3、为了提供一种从鞘蕊花属植物中提取式I结构的二萜类化合物的制备方法，并且提取产率超过0.1％，纯度在98％以上。4、为了提供式I结构的二萜类化合物临床用药的合适剂型的用途。本发明的目的是这样实现的：.

本发明提供的从热带鞘蕊花属植物中提取的二萜类化合物具有如下结构：

本发明的二萜类化合物的结构如式I，经元素分析、质谱、红外、紫外、核磁共振等分析方法确定。该化合物为白色结晶，分子量410，熔点为226～228℃，理化性质稳定，即对光、热稳定，加热至226～230℃不升华，冷却后又成晶体，在有机溶剂(乙醇、甲醇、苯、乙酸乙酯、二甲基亚砜)中也很稳定，可长期在室温下保存。

本发明提供的从热带鞘蕊花属植物中提取、纯化式I结构的二萜类化合物的方法，包括以下步骤：

①将洗干净的热带鞘蕊花属植物的根或茎晒干或烘干磨碎成粉末，也可用新鲜植物根或茎粉碎后备用。

②干燥后的植物粉末用有机溶剂萃取，干粉与萃取剂用量比例为1∶3-10重量份，采用通常的浸泡式回流萃取，萃取时间：2-4天，温度：30℃-80℃，可得式I结构的二萜类化合物

③将步骤②得到的二萜类化合物的粗品用石油醚再提取，溶剂用量比例为1∶100～150份，操作同上，提取时间10分钟-60分钟；提取温度28°-60℃，其作用是脱脂，去掉产物中的部分杂质。

④步骤③所得产物再用甲醇溶剂提取，提取物与溶剂用量比例为1∶100～150份，操作同上，提取时间40分钟-60分钟；提取温度30°-60℃，其作用为进一步去掉提取物中所含杂质。

⑤用氧化铝吸附层析法进一步纯化，将步骤④得到的提取物，放入通常的层析装置内，用苯溶液洗脱，洗脱按3～5个洗脱体积进行，将杂质吸附在层析柱上，得到含式I结构的二萜类化合物(纯度＞80％)。

上述步骤中所用有机溶剂如甲醇、乙醇、石油醚、苯等均为挥发性溶剂，保证提取物中不残留，安全有效。可使用的上述溶剂纯度均在分析纯以上。

⑥脱色处理：上述步骤⑤得到的粗品还可经脱色处理，去掉色素进一步纯化。取二萜类化合物粗品与脱色剂按1∶3～50重量份比例混合配成悬浮液，将该悬浮液离心分离5-20分钟，这样处理过的产品，纯度可达95％以上。其脱色剂包括：非离子型去污剂(如吐温80、吐温20或司班80)或活性炭。

此外，需要时可按照本身已知的成盐方法(如通过合适的酸处理)将得到二萜类化合物转化成盐。

⑦该化合物经过高效液相色谱(HPLC)纯化后纯度可达98-99％，可供临床口服、注射；机理、药效和药理研究用或作为分析试剂用。本发明的式I结构的二萜类化合物的用途在于抑制癌细胞增殖，并促其向正常逆转分化，其抗癌作用机制是通过调控癌细胞周期的关键信息分子及转录因子来抑制癌细胞的增殖，并诱导癌细胞向正常逆转分化。它的作用机制有以下几个方面：1、对表皮生长因子受体(EGF-R)的下调作用，对转化生长因子-β(TGF-β)和转化生长因子-α(TGF-α)的正负调节作用，及对细胞膜脂流动的影响(增强细胞膜脂微粘度)；2、调控第二信使的传递，如促进环腺苷酸(cAMP)含量的增高，降低碱性磷酸酶(Apase)，酪氨酸蛋白激酶(TPK)，磷脂酶C(PLC)，肌醇三磷酸(IP3)的活性，调控Ca的释放及蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)的活性，增加蛋白酪氨酸磷酸酶的活性，促进底物蛋白磷酸化；3、抑制生长因子受体基因(如EGF-R基因，TGF-α基因)及癌基因(H-ras，C-myc)的表达，促进抑癌基因p-53的表达。诱导癌细胞(如UMR106，HL60，BGC-823等)恶性表型及肿瘤亚细胞结构向正常逆转分化，从而抑制癌细胞的致瘤力。

本发明的式I结构的二萜类化合物对鼻咽癌、胃肠癌、食道癌、胆囊癌等的有明显的抑制作用，尤其是对人的白血病的诱导分化治疗以及与维甲酸(RA)联合应用抗癌疗效更佳。从下面对癌症的体内外实验可明显看出。

实验实例1：(急性毒性)

本发明的式I结构的二萜类化合物的急性毒性实验

动物：NIH健康小鼠，体重18～22g，雌雄各半，随机分组10只/组

方法：实验前禁食16小时，自由饮水，腹腔注射(或口服)。

药物：本发明的产物给药剂量分别为：175mg/Kg体重、122.5mg/kg体重、85.75mg/kg体重、40.02mg/kg体重，组距0.8。本实验为腹腔注射。

观察时间：连续7天。

实验结果计算法：用Biss法计算小鼠腹腔(IP)注射L_D50值，为94.2mg/kg，95％的可信限，为82.0～108.3mg/kg。见附图10、11。

结论：仅有微毒。实验实例2：一、本发明的产物对人白血病细胞的诱导分化作用

细胞模型  人白血病细胞(HL60)

诱导剂：本发明的产物，纯度98％以上(HPLC纯)

对照物：无血清RPMI1640培养基

阳性对照物：维甲酸(RA)

联合效应物：本发明的产物+RA(一)、不同浓度的本发明的产物对HL60细胞生长的影响：

本发明的产物浓度：5μM，10μM，20μM，30μM，50μM.

本发明的产物+RA浓度：50μM：50μM

HL60细胞：5×10⁴/ml

培养基：RPMI1640培养基，含10％新生小牛血清，(给药时不含血清)对

        照为无血清RPMI1640培养基

培养条件：5％ CO₂，37℃恒温孵育3天。

本发明的产物的细胞生长抑制率为：25％、30％、36％、42％、54％，

呈浓度依赖曲线，本发明的产物与RA联合效应抑制率为62％(见表1)。

           表1、药物对HL60细胞的生长的抑制作用

药物	生长抑制率(％)
		本发明的产物：    5μM10μM20μM50μM100μM	2125304254
阳性对照物RA：    100μM本发明的产物+RA   (50μM：50μM)	4662

                    (三次重复，p＜0.05)(二)、不同浓度的本发明的产物及与RA联合应用对HL60细胞促分化效果观察：

分化剂本发明的产物浓度：10μM，20μM，30μM，50μM

阳性对照物：维甲酸(RA)100μM(文献中有效量)

联合效应物：本发明的产物+RA(50μM：50μM)

对照物：RPMI1640培液

HL60细胞：5×10⁴/ml

培养条件：同(一)

培养三天后作NBT还原反应，计数200个细胞，记录含甲  颗粒的阳性细胞百分数。

结果如表2：30μM，50μM本发明的产物作用细胞三天后，NBT阳性率明显高于对照组，也明显高于阳性对照组。本发明的产物+RA联合作用NBT阳性率明显增高。

        表2药物对HL60细胞的诱导分化作用(p＜0.05)

        本发明的产物浓度             NBT阳性率

            50μM                        67％

            30μM                        24％

            20μM                        14％

            10μM                        4％

        对照                             2％

        阳性对照(RA)                     29％

        联合效应物(本发明的产物+RA)      77％(三)、本发明的产物对HL60细胞促分化作用的动态观察：

分化剂：本发明的产物，20μM

细胞：HL60细胞，5×10⁴/ml

阳性对照物：RA(维甲酸)

对照物：RPMI1640培养液

联合效应物：本发明的产物+RA(50μM：50μM)

培养条件：同上

观察时间：2、4、6、8、10天

结果：培养4天后，随着药物处理时间的延长，4-唑氮兰(NBT)阳性率逐渐增加，第8、第10天明显高于对照和阳性对照，本发明的产物与RA联合，显示出明显的协同效应，如图2所示。实验实例3：

本发明的产物对白血病患者新鲜骨髓标本诱导分化作用效果观察例3-1：急性粒单细胞白血病(M₄)骨髓

经分离种入1×10⁵/ml细胞，加入20μM本发明的产物诱导2天计数NBT阳性率。例3-2：急性粒细胞白血病(M₂b)骨髓

经分离种入1×10⁵/ml细胞，加入20μM本发明的产物诱导3天，计数NBT阳性率。例3-3：急性粒细胞白血病(M₂b)骨髓

经分离种入1×10⁵/ml细胞，加入20μM本发明的产物诱导5天，计数NBT阳性率。结果：本发明的产物对粒细胞(或粒单细胞)白血病患者的新鲜骨髓标本具有明显的诱导分化作用，NBT阳性反应率比对照明显升高。(见表3)

     表3    本发明的产物对白血病人骨髓标本诱导分化作用的观察病例     类型    式I结构   种入细胞数  诱导天数  NBT阳性率例1      M4       20μM    1×10⁶/ml     2       45.0％

       对照     /        1×10⁶/ml     2       21.30％例2      M₂b     26μM    5×10⁶/ml     3       10.0％

       对照     /        5×10⁶/ml     3       1.0％例3      M₂b     20μM    5×10⁶/ml     5       23％

       对照     /        5×10⁶/ml     5       15％实验实例4：

二萜类化合物对人白血病细胞裸鼠异种移植瘤的抑癌效果实验

动物模型：BALB/C裸鼠，4-5周龄  雌雄各半，8只/组

细胞：用人HL60细胞异种移植瘤分离

药物：本发明的产物30μM

对照物：RPMI1640培液

给药途径：腹腔注射

给药时间：30天

实验设计：

对照组：皮下接种细胞1×10⁷个/只

实验I组：皮下接种细胞1×10⁷个/只腹腔给药每日一次，100μg/只/天

实验II组：细胞在体外用30μM本发明的产物处理9天后，细胞作NBT

还原实验，细胞阳性率为40％-50％，按阳性细胞计数接种于裸鼠，2×10⁷

个/只，同时腹腔注射100μg/只本发明的产物/天，注射四周。

所有动物均在接种前经铯源照射400rad

分别于接种后14、18、23天测量瘤块大小，计算体积。在实验结束时统计

鼠存活率。

结果列于表4、表5：

      表4    本发明的产物对肿瘤生长的影响组别       成瘤潜伏期    成瘤率(％)  抑瘤率(％)对照组      6-14天          100        /实验I组     18-30天         80         43实验II组    23-30天         45         55

                (P＜0.05)

    表5    本发明的产物对裸鼠生存时间的影响

         动物数组别      始    终  存活天数(±SD)  存活率     P值对照组    8     0     24.2±4.78      0实验组I   8     5     28.2±5.04      62％    ＜0.05实验组II  8     8     33.8±3.66      100％   ＜0.1

结论：本发明的产物能明显地抑制HL60细胞生长(三次重复)及肿瘤的形成，

      并能使裸鼠模型延长寿命。实验实例5：

本发明的产物治疗人的白血病预临床效果

观察例数：5例，其中3例早幼粒型，效果明显

医院：北大医院  医师：周  时间：91-92年

本发明的产物：纯度：70％以上  剂量：6-12mg/日。

剂型：胶囊，填冲剂：淀粉，用药途径：口服例5-1：46岁 男  早幼粒细胞白血病(后转为粒细胞型)

入院时骨髓中早幼粒白细胞高过50％。1992年2月入院后，用本发明的产物6mg/日，骨髓中早幼粒细胞经32天治疗，降至6.5％。例5-2：35岁 男，早幼粒细胞白血病

91年入院时，骨髓中早幼粒白血病80％，临床出现DIC，在治疗DIC同时，用本发明的产物12mg/日，2周后，病症好转，达部分缓解，出院后继续应用本发明的产物2个月后，骨髓中病症达完全缓解以至后来也未复发。(92年3月复查)例5-3：30岁 男，早幼粒细胞白血病

92年11月住院，骨髓中早幼粒白血病88.5％，合并DIC；住院后，用抗凝剂治疗DIC，用本发明的产物与RA合用，2个月后完全缓解。例5-4：67岁，粒单细胞白血病

91年3月入院时，骨髓中粒单细胞为64％，化疗后无效，应用本发明的产物配合RA后，下降为21％，但外周血中粒单细胞有所升高，可以认为有一定疗效。例5-5：38岁，急性粒单型白血病

91年1月入院，骨髓中幼粒单细胞为87％，化疗7个疗程后，用本发明的产物后，有所下降。

结论：本发明的产物对早幼型粒型白血病有明显疗效，对粒单型疗效次于早幼粒型。实验实例6：

本发明的产物对人鼻咽癌的抑制效果实验

动物模型：BALB/C裸鼠，无菌饲养，体重18-22g，8只/组

细胞株：人鼻咽癌(CNE-2)细胞

药物：本发明的产物浓度为1×10^-4mol/L

对照：生理盐水

给药途径：皮下注射

治疗时间：28天

实验方法：(1)在无菌条件下，将4.5×10⁵个/ml细胞接种于裸鼠的颈部皮下。同时注射本发明的产物8mg/kg体重，连续注射28天后，测量瘤体大小(测量计算法同实施例4)。(2)接种前，细胞在体外用30μM本发明的产物处理，每日一次，7日后接种于裸鼠，同时注射本发明的产物8mg/kg，分别在21天和28天时测量瘤体大小。结果如表6：

        表6    本发明的产物对人鼻咽癌的抑制作用药物         剂量(mg/kg)  成瘤率    瘤重mg       抑瘤率对照组          0         100％    382±240.3      0本发明的产物    8         66％     123.3±117    67.7％

结论：本发明的产物对人鼻咽癌裸鼠模型确有明显的抗癌作用。实验实例7：

本发明的产物对人大肠癌的抑制效果实验

动物模型：BALB/C裸鼠，雌性，5-7周龄，无菌饲养，8只/组

细胞株：人大肠癌(CAII细胞)

药物：本发明的产物400μg/ml(纯度95％以上)

对照：RPMI 1640培液

给药途径：局部皮下注射

给药时间：28天

实验方法：(1)接种细胞(1.5×10⁶个/只)后，连续注射本发明的产物(80μg/只/天)4周，解剖测定瘤体大小。(2)用2×10^-5mol/L本发明的产物连续处理细胞8天，接种裸鼠(1.5×10⁶个/只)，同时连续注射本发明的产物(80μg/只/天)4周，停药一周后，解剖测定瘤体大小(统计方法同实施例4)。结果见表7：

       表7    本发明的产物对大肠癌的抑制作用组别       接种细胞数     成瘤潜伏期    成瘤率    抑瘤率对照组     1.5×10⁶个    7～12天       100％     0实验II组   1.5×10⁶个                            100％实验I组    1.5×10⁶个    28～35天      35％      68.5％

                        (P＜0.1)

结论：本发明的产物对人大肠癌裸鼠模型确有明显抑癌作用。如图3和4实验实例8：

本发明的产物对人胃腺癌(BGC-823)的抑癌效果实验

动物模型：BALB/C裸小鼠，5-7周龄，无菌饲养，8只/组

细胞株：人胃腺癌(BGC-823)细胞

药物：本发明的产物400μg/ml(纯度95％以上)

对照：生理盐水

给药途径：皮下注射

给药时间：28天

实验方法：(1)用本发明的产物2×10^-5mol/L体外处理细胞7天，接种于裸小鼠(1.5×10⁶个/只)，同时连续注射本发明的产物(80μg/只/天)4周，停药一周后，解剖，测定瘤体大小(方法同前)。(2)接种细胞(1.5×10⁶个/只)，连续注射本发明的产物(80μg/只/天)4周，停药一周后，解剖测量瘤体大小。结果见表8：

      表8    本发明的产物对人胃腺癌(BGC-823)的抑制作用组别       成瘤潜伏期    成瘤率(％)    抑瘤率(％)对照组      5-11天         100实验I组     30-35天        28             74.2实验II组    29-35天        36             63

             (P＜0.05)

结论：本发明的产物对胃腺癌(BGC-823)裸鼠模型有抑癌作用，效果明显，如图4所示。实验实例9：

本发明的产物治疗人胃肠癌的预临床效果

观察例数：4例

医院：内蒙古武警部队医院

医师：青    时间：97年3-9月

本发明的产物：纯度90％以上

填充剂：淀粉    剂型：胶囊

服药途径：口服  一疗程15天

剂量：6-8mg/kg体重

例(1)：男46岁，晚期胃癌，手术一年后病理切片证实转移(肝、淋巴、腹水)，不能进食，卧床不起，服本发明的产物，每日60mg-80mg，两个疗程15×2天。第一疗程后，腹水减少，临床症状减轻，能少量进食。第二疗程后，腹水消失，淋巴结缩小，全身症状改善，能下床行走。

例(2)：男45岁，晚期胃癌，剖腹后发现已转移，不能手术，服药前不思饮食，不能入睡，服本发明的产物60mg/日，并配合10mg/日维甲酸，一个疗程后，食欲增强，临床症状减轻，病情稳定，仍在治疗中。

例(3)：男75岁，食道癌晚期，未经手术，不能进食，靠输液维持。每日服用本发明的产物60mg，一个疗程后，改变了吃不下饭的临床症状；两个疗程后，每日能进食4两，临床症状减轻，仍在治疗中。

例(4)：女60岁，胆囊癌，服本发明的产物60mg/日，并配合10mg/日维甲酸，15天后，临床症状减轻，肝功和肺病理检查都正常，食欲增加，仍在治疗中。上述资料还没来得及详细整理，但是有一点可以看出，本发明的产物在改善生活质量方面效果明显。实验实例10：

本发明的产物对人肺癌细胞(PG)裸鼠异种移植瘤的抑癌效果实验

动物模型：BALB/C裸小鼠，6-8只/组

细胞系：人肺癌细胞(PG)移植瘤分离

药物：本发明的产物(98％纯度以上)，用培养液或生理盐水配制成浓度0.04％的本发明的产物与RA(SIGMA产品)按1∶1(0.02％∶0.02％)混合。

对照物：DMEM培养液或生理盐水

给药途径：腹腔注射

给药时间：4周

实验方法：

对照组：皮下接种细胞(2×10⁷)个/只，接种前用台盼蓝染色，90％以上是活的。

实验I组：皮下接种细胞(2×10⁷)个/只，腹腔给药，每日1次，100μg/只/天，注射8周。

实验II组：细胞在体外用30μM本发明的产物处理8天后，细胞(2×10⁷个/只)接种于BALB/裸鼠，同时注射本发明的产物，每日1次，100μg/只/天，注射4周。

实验III组：细胞在体外用30μM本发明的产物处理8天后，细胞(2×10⁷个/只)接种于BALB/裸鼠，同时注射本发明的产物+RA，每日1次，100μg(50μg+50μg)/只/天，注射4周。

所有动物均在接种前经铯源照射400rod。

在接种后14天、21天、28天，测量瘤块，计算体积，其结果如下：

       表9药物对人肺癌移植瘤的抑制作用组别       成瘤潜伏期    成瘤率(％)    抑瘤率(％)对照组       5-11天        100            0实验I组      18-28天       28             30.8实验II组     21-27天       36             41.3实验III组    24天          40             57.6

         (P＜0.05)

结论：本发明的产物对PG的抑制作用以及对PG细胞的致癌力有明显的抑制作用，并能使裸鼠延长寿命。实验实例11：(体外)

本发明的产物对成骨肉瘤细胞增殖的抑制效果实验，及本发明的产物与RA的协同效应实验。

细胞模型：成骨肉瘤细胞(UMR106)

药物：本发明的产物(纯度98％)浓度10^-5mol/L；

      联合用药：维甲酸(RA)10^-5mol/L+本发明的产物10^-5mol/L

      阳性对照药：维甲酸(RA)10^-5mol/L

对照物：无血清MEM培养基

实验方法：1)增殖曲线：细胞接种与50ml培养瓶中，接种数为8×10⁵个，分别用10^-5mol/L处理UMR 106细胞，(37℃，5％CO₂：恒温孵育)连续处理24h，48h，72h，96h，台盼蓝染色后，计数，设相应对照。

实验结果：UMR 106增殖率从63.6％降低到40.5％，如图5和6所示。2)DNA合成(³H-TdR掺入实验)：

将8×10⁵个细胞接种与48孔培养板上，37℃、5％CO₂恒温孵育，用10^-5mol/L本发明的产物处理细胞24小时，加入2μCi³H-TdR温育6小时，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，用0.25％胰酶消化，收集细胞滴在玻璃纤维膜上，用醇醚混合液洗膜，干燥后加入闪烁液，用液闪仪计数。

结果：本发明的产物：TdR的掺入率降低84％，本发明的产物+RA：TdR掺入率降低90％，RA：TdR的掺入率降低84％。(三次重复实验)

结论：本发明的产物能够抑制UMR106细胞增殖抑制其DNA合成如图7所示。实验实例12：(体外)

本发明的产物对白血病(HL60)，红白血病细胞(K562)，鼠肉瘤细胞(S180)的DNA合成的抑制效果及与RA的协同效应实验。

细胞模型：人白血病细胞(HL60)，人红白血病细胞(K562)，鼠肉瘤细胞(S180)

药物：(1)本发明的产物(HPLC纯)

      (2)阳性对照：维甲酸(RA)

      (3)联合应用物：本发明的产物+RA

浓度：(1)10^-5mol/L  (2)10^-5mol/L  (3)10^-5mol/L：10^-5mol/L

培养条件：培基RPIM 1640，37℃，5％CO₂恒温孵育

实验方法：³H-TdR掺入

将细胞分别接种于24孔板上，细胞数为8×10⁵个，用10^-5mol/L本发明的产物、10^-5mol/LRA、本发明的产物+RA(1∶1)分别处理2-4小时，加入2μCi ³H-TdR，温育6小时，用冷PBS洗3次，用0.25％胰酶消化，收集细胞，滴在玻璃纤维膜上，用醇混合液洗膜，干燥后加入闪烁液，用液闪仪计数。

结果见表10：

         表10       ³H-TdR掺入率

细胞系	本发明的产物  RA    本发明的产物+RA
		HL60细胞K562细胞S180细胞	降低80％    68％    87％降低39％    19％    53％降低33％    60％    72％

结论：本发明的产物能够抑制HL60细胞、K562细胞、S180细胞DNA合成的抑制作用，如图8所示。

近年来，根据肿瘤细胞的分化中止于某一发育阶段的理论，提出应用诱导分化方法，使肿瘤细胞继续分化，而使其表型趋于正常。如何使癌细胞的增殖逆转，促进其向正常分化是当前肿瘤发病机理和治疗学研究的热点，它对传统单一杀伤肿瘤细胞的治疗方针是一个极重要的补充。

国内外许多实验室试图寻找对癌细胞有较强的抑制作用，而对正常细胞毒性较小的有效抗癌药物，本发明的二萜类化合物正是为了这一目的。本发明提供的二萜类化合物有效成份是腺苷酸环化酶(Adenylate cyclase)的特异性激活剂，它能够抑制癌细胞的异常增殖，促其向正常细胞分化逆转，而无害于正常细胞，这一特点是当前癌症治疗的新方向。本发明的从鞘蕊花属植物中提取的二萜类化合物除对癌细胞具有明显的促分化抑增殖作用外，还能够下调EGF受体和TGF-α的自分泌；能够调控第二信使的传递；抑制癌细胞的DNA合成，阻断细胞周期G1向S期移行；阻遏癌基因(C-myc、H-ras)的表达，促进抑癌基因(p53)的表达；调控生长因子受体基因(EGF-R、TGF-α、TGF-β)的表达。可以肯定本发明的化合物对癌细胞的恶性增殖具有较强的负调控作用，并诱导癌细胞恶性表型和亚细胞结构的分化逆转，其作用明显优于维甲酸(RA)，且独特之处在于细胞超微结构观察没有毒杀作用，动物抑瘤作用显著；急性毒性试验为微毒；与维甲酸联合应用显示出良好的协同效应。

本发明的优点：

本发明的式I结构二萜类化合物一反传统的细胞毒药物的性质，即：不杀伤正常细胞，诱导癌细胞的逆转分化，具有较强的抑制肿瘤细胞恶性增殖，促进其向正常细胞分化的负调控作用，且具有广谱性的抗癌药效以及毒性甚微的优点。对癌症的全身性治疗调整具有明显的效果，降低手术后肿瘤复发率；还可配合放化疗，抑制肿瘤转移；稳定病情，改善患者的生活质量，延长生命以及治愈肿瘤都将会起到积极的作用。另外式I结构的二萜类化合物与维甲酸协同使用更可提高药效，克服癌细胞的耐药性。此外，还有降压、强心、镇痛和治疗皮炎等作用。

本发明的制备方法工艺简单，设备投资少，生产成本低，最主要的优点是在生产过程中不使用毒性大的溶剂，有机溶剂用量少(产品中不残留)，产品纯度高，医用对人安全。使用该方法获得的产品纯度在98％以上，产品提取率超过0.1％。

本发明的二萜类化合物主要药效：(1)对肿瘤细胞体外生长的抑制作用：

 曾分别以10^-4、10^-5、10^-5、10^-7、10^-8mol/L浓度的本发明的产物分别处理

 大鼠成骨肉瘤细胞(UMR106)，人白血病细胞(IIL-60)，人胃癌细胞(BGC

 -823)，人肺癌细胞(PG)，人鼻咽癌细胞(CNE-2)，人结肠癌CAII细胞系，

 生长抑制率为43％-59％，用最佳浓度10^-5mol/L本发明的产物分别处理

 UMR106、BGC-823、PG细胞，软琼脂集薄形成能力显著降低；荧光偏

 振度技术测定本发明的产物处理后的正常C₃II₁₀细胞及转化的C₃II₁₀细胞，

 正常细胞膜微粘度值变化较小，而转化细胞的微粘度值明显升高，说明癌

 细胞膜脂流动性被降低；用10^-3mol/L本发明的产物处理UMR106、K562、

 S180、HL-60细胞，用TdR双阻断法测定，³H-TdR相对参入率明显降

 低，降低率为39-84％；UMR106细胞经本发明的产物处理后，在倒置显

 微镜下可见细胞由杂乱无章变成梭形有序排列，扫描电镜下观察，细胞表

 面微绒毛几乎完全消失，细胞由多折皱、变得丰满光滑、细胞形态呈梭状，

 似正常成纤维细胞。透射电镜观察：亚细胞结构趋向正常分化，即核质比

 明显降低，核出现分化叶，核糖体大量减少，溶酶体增多等。(2)对动物移植性肿瘤的抑制作用：

 用本发明的产物腹腔注射治疗4周，对昆明小鼠体内S180肉瘤模型和

 Ehrlich ascise细胞造成的腹水癌的抑癌率分别为66％(p＜0.05)和

 73.3％(p＜0.1)。(3)对人体移植性肿瘤的抑制作用：

 将BGC-832细胞，PG细胞，CNE-2细胞分别接种于BALB/C裸鼠，同时

 用本发明的产物局部注射治疗，4周后，肿瘤抑制率分别为72％、42％、

 68％(p＜0.05-0.1)。(4)本发明的产物处理后的癌细胞的致瘤抑制作用：

 用本发明的产物处理CAII细胞，CNE-2细胞，PG细胞，同时注射本发明

 的产物；4周后成瘤抑制率分别为61.8％、67.7％、41％(p＜0.05)，对照组

 的成瘤率为100％。(5)最佳药效的实施：

 用本发明的产物与维甲酸(RA)联合应用，抑癌作用明显增高。体外实验结果：

 对成骨肉瘤(UM106)的生长抑制率比单用本发明的产物提高30.6％；

 对细胞周期的阻断作用提高11％；

 对HL60、K562、S180细胞，DNA合成的降低作用分别提高8.5％，28％，

 30.5％。

 人肺癌细胞(PG)，人鼻咽癌细胞(CNE-2)，人结肠癌CAII细胞系，生长抑制

 率为43％-59％，用最佳浓度10^-5mol/L FSK88分别处理UMR106、BGC

 -823、PG细胞，软琼脂集薄形成能力显著降低；荧光偏振度技术测定

 FSK88处理后的正常C₃II₁₀细胞及转化的C₃II₁₀细胞，正常细胞膜微粘度值

 变化较小，而转化细胞的微粘度值明显升高，说明癌细胞膜脂流动性被降

 低；用10^-3mol/L FSK88处理UMR106、K562、S180、HL-60细胞，用

 TdR双阻断法测定，³H-TdR相对参入率明显降低，降低率为39-84％；

 UMR106细胞经FSK88处理后，在倒置显微镜下可见细胞由杂乱无章变成

 梭形有序排列，扫描电镜下观察，细胞表面微绒毛几乎完全消失，细胞由

 多折皱、变得丰满光滑、细胞形态呈梭状，似正常成纤维细胞。透射电镜

 观察：亚细胞结构趋向正常分化，即核质比明显降低，核出现分化叶，核

 糖体大量减少，溶酶体增多等。(2)对动物移植性肿瘤的抑制作用：

 用FSK88腹腔注射治疗4周，对昆明小鼠体内S180肉瘤模型和Ehrlich

 ascise细胞造成的腹水癌的抑癌率分别为66％(p＜0.05)和73.3％(p＜0.1)。(3)对人体移植性肿瘤的抑制作用：

 将BGC-832细胞，PG细胞，CNE-2细胞分别接种于BALB/C裸鼠，同时

 用FSK88局部注射治疗，4周后，肿瘤抑制率分别为72％、42％、68％

 (p＜0.05-0.1)。(4)FSK88处理后的癌细胞的致瘤抑制作用：

 用FSK88处理CAII细胞，CNE-2细胞，PG细胞，同时注射FSK88；4周

 后成瘤抑制率分别为61.8％、67.7％、41％(p＜0.05)，对照组的成瘤率为

 100％。(5)最佳药效的实施：

 用FSK88与维甲酸(RA)联合应用，抑癌作用明显增高。体外实验结果：

 对成骨肉瘤(UM106)的生长抑制率比单用FSK88提高30.6％；

 对细胞周期的阻断作用提高11％；

 对HL60、K562、S180细胞，DNA合成的降低作用分别提高8.5％，28％，

 30.5％。体内实验结果：

 动物移植瘤抑瘤率(S180)提高16％；

 人异种移植瘤抑瘤率：人胃癌(BGC-823)提高28.8％；人肺癌(PG)提

 高8.8％。

当本发明的化合物用作治疗药物时，可口服或用作注射针剂(如：静脉注射、肌肉注射、皮下注射等)其有效剂量取决于用药患者的临床症状，疾病的程度、

图7本发明的产物、RA、本发明的产物+RA对UMR106细胞³H-TdR掺入率的抑制作用图。

图8本发明的产物、RA、本发明的产物+RA分别对HL60细胞、K562细胞、S₁₈₀细胞³H-TdR掺入率的抑制作用图。

图9本发明的产物、RA、本发明的产物+RA对人肺癌细胞(PG)致瘤力的抑制作用图。

图10 Lg(D)-p正规偏差值曲线图

图11 Lg(D)-p正规偏差值直线图

图面说明如下：

图1中 ---▲---▲---表示对照组

      ---■---■---表示0.2×10^-5mol/L毛喉萜

      ---◆---◆---表示2×10^-5mol/L毛喉萜

图2中 —口—口—表示本发明的产物(20μmol/L)

      —△—△—表示RA(260μmol/L)

      —◇—◇—表示对照(0.25％乙醇)

      —×—×—表示本发明的产物与RA合用

图3-图9中      

  表示 C

               

  表示 本发明的产物

  表示 RA

               

  表示 本发明的产物+RA实施例1：制备式(I)结构的二萜类化合物

①取鞘蕊花根或茎干粉350克，加入1500ml工业酒精回流48小时后，(温度控制在70°～80℃或室温下)真空浓缩干燥后，②加400ml水，搅拌30～40分种后，离心(3000RPM/min，10分钟)弃上清液留沉淀，③再加入130～150ml石油醚搅拌30′后离心(3000RPM/min，10分钟)，留沉淀，再加入130ml石油醚搅拌20′后，离心取沉淀(为粗的本发明的产物7种组分混合物)，④加入130～150ml甲醇搅拌20′～30′，离心，取上清液，沉淀中，再加入甲醇重复上步，取上清同前一次上清液合并。(粗品五种组份)。⑤取20ml的层析氧化铝液体，加入到上步的上清液中，搅拌吸附后，真空抽干。⑥取40ml层析氧化铝装入层析柱，把上述20ml吸附好的样品氧化铝加到柱上，用苯洗脱，收集洗脱液真空抽干。(较纯的本发明的产物)⑦将抽干的样品脱色，用95％酒精130ml溶解5-6g样品，离心取上清液加入20～30ml吐温80或吐温20和司班80混合，真空抽干，加水搅拌，离心。留沉淀，甲醇溶解，真空抽干，烘烤成白色于粉末，分子量410，熔点为226～228℃，理化性质稳定，即对光、热稳定，加热至226～230℃不升华，冷却后又成晶体，在有机溶剂(乙醇、甲醇、苯、乙酸乙酯、二甲基亚砜)中也很稳定，可长期在室温下保存。实施例2：利用实施例1得到的式(I)结构的二萜类化合物与维甲酸(RA)协同使

     用，作为药物制剂。

根据临床治疗学的角度，治疗恶性肿瘤时，联合应用二种或多种药物较使用单一药物更为有效，而且可降低毒性，克服癌细胞的耐药性，本发明提供二萜类化合物与维甲酸(RA)联合应用，发现它们有良好的协同效应，表现出更强的抑癌作用。本发明在药理实验中发现本发明的产物与RA具有协同效应，并在结构上的部分互为重叠，如下结构式：

              (式I)结构与RA结构叠合

由此为依据将本发明的产物与RA联合匹配制成混合药物，用于人体移植瘤实验。如对人肺癌PG细胞的移植瘤实验：①将本发明的产物10^-5mol/L和RA 10^-5mol/L混合，用生理盐水或细胞培养液配制，②选6-8只/组，5-7周龄BALB/C裸小鼠，经铯源照射400rad(接种细胞前)，③取人肺癌癌细胞(PG)皮下接种子裸小鼠，接种前用台盼蓝检测其活细胞数90％以上。④取100μg/0.3ml本发明的产物+RA混合液，腹腔注射，每日1次。对照组注射生理盐水或培养基连续注射4周，⑤在注射14天、21天、28天，停药一周后解剂，测量瘤块大小，计算瘤体积，和抑癌率。(2)本发明的产物+RA对癌细胞致癌力的抑制实验。将人肺癌细胞用30μM本发明的产物处理8天后，PG细胞2×10⁷个接种于BALB/C小鼠，同时注射本发明的产物+RA混合液，注射28天，停药一周后解剖，测量瘤块大小，计算，致瘤率的大小。(3)同时计算动物存活率的延长率，其抑瘤率结果和裸鼠生存时间如下：

       表11  药物对人肺癌移植裸鼠的抑瘤作用组别     成瘤潜伏期      成瘤率    抑瘤率对照组    5～12天        100％(1)       25～30天       16％       54％(2)       25～32天       13％       65％

                (P＜0.05)

        表12  裸鼠生存时间组别       动物数    存活天数    p值对照组       8         13实验(1)组    8         32       ＜0.05实验(2)组    8         35       ＜0.01实施例3：利用实施例1得到的式(I)结构的二萜类化合物与维甲酸(RA)协同使用，对大鼠成骨肉瘤UMR106细胞增殖的抑制实验

细胞模型：成骨肉瘤细胞(UMR106)

药物：本发明的产物(纯度98％)浓度10^-5mol/L和RA10^-5mol/L混合，用生理盐水或细胞培养液配制，注射给小鼠，与对照组实验数据如表13。

    表13  本发明的产物和RA对UMR106细胞增殖的抑制作用

时间(小时)             24              48              72            96对照(细胞数)       1.40+0.23×10⁶ 1.87+0.28×10⁶ 2.58+0.31×10⁶ 3.6+0.31×10⁶

生长率(％)             100             100             100           100本发明产物(细胞数)   0.89+0.20×10⁶ 0.99+0.24×10⁶ 1.22+0.27×10⁶ 1.46+0.30×10⁶

生长率(％)             63.6            52.9            47.2          40.5

RA(细胞数)       1.03+0.21×10⁶ 1.15+0.24×10⁶ 1.48+0.32×10⁶ 1.96+0.27×10⁶

生长率(％)             73.6            61.4            57.4          52.8本发明产物+RA细胞数  0.70+0.25×10⁶ 0.81+0.23×10⁶ 0.96+0.25×10⁶ 1.04+0.28×10⁶

生长率(％)             50              43              37.2          28.2

Claims (10)

1、一种从热带鞘蕊花属植物种提取的式I结构表示的分子量为410，熔点226℃-228℃的白色结晶二萜类化合物：

2、一种制备权利要求1的式I结构的二萜类化合物的方法，其特征在于：包括如下步骤：

①用干净的鞘蕊花的根或茎磨碎成粉末，进行去水干燥；

②干燥后的植物粉末用有机溶剂萃取，干粉与萃取剂用量比例为1∶3-10重量份，采用通常的浸泡式回流萃取，萃取时间：2-4天，温度：30℃-80℃，可得式I结构的二萜类化合物；

③进一步用石油醚提取，步骤②的提取物与萃取剂用量按1∶100-150的比例，操作方法同上，提取时间10分钟-60分钟；提取温度20℃-60℃；

④步骤③的产物用甲醇溶剂提取，操作方法同上，提取时间40分钟-60分钟；提取温度30℃-60℃；

⑤步骤④的产物在氧化铝层析柱内用苯溶液洗脱，洗脱按3-5洗脱体积进行。

3、按权利要求2所述的提取式I结构的二萜类化合物的方法，其特征在于：还包括在上述步骤后进行的脱色工艺，取上一步骤提取的式I结构的二萜类化合物和脱色剂按1∶30-50重量份比例混合配成悬浮液，离心分离。

4、按权利要求3所述的提取式I结构的二萜类化合物的方法，其特征在于：所述的脱色剂包括：非离子去污剂吐温80、吐温20、司班80或活性炭。

5、按权利要求3所述的提取二萜类化合物的方法，其特征在于：还包括在上述步骤后再进行高压液相色谱纯化工艺。

6、按权利要求2所述的提取二萜类化合物的方法，其特征在于：所述的有机溶剂包括：丙酮、乙醇和苯。

7、按权利要求1所述的式(1)结构的二萜类化合物用于制备治疗白血病、鼻咽癌、胃肠癌、食道癌、胆囊癌、皮炎或强心镇痛疾病的药物的用途。

8.一种药物制剂，其特征在于：含有有效剂量的作为有效成分的式(1)结构的二萜类化合物及其可药用的载体或稀释剂。

9.按权利要求8所述的药物制剂，其特征在于：式(1)结构的二萜类化合物的有效剂量为0.6-2.0/公斤体重/日。

10.按权利要求9所述的药物制剂，其特征在于：该制剂还含有与式(1)结构的二萜类化合物混合使用的维甲酸；其中式(1)结构的二萜类化合物有效剂量范围：0.6-2.0mg/公斤/天，维甲酸有效剂量范围：0.2-0.6mg/公斤/天。

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