CN1192098C - 樟芝菌丝体生物活性物质其制备法及含其组成物 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关以仅生长于台湾特有物种牛樟树树心内的菇类-樟芝的菌丝体进行液体培养后产生以多糖体为主的生物活性物质，其具有增强免疫功能，抗肿瘤和抗寄生虫性；且有关该活性物质的制备方法及含该活性物质的组成物。

Description

樟芝菌丝体生物活性物质其制备法及含其组成物
本发明是有关于樟芝菌丝体生理活性物质，该活性物质的制法及含活性物质的组成物。
樟芝的形态
樟芝(Antrodia camphorata或Antrodia cinnamomea)又名牛樟菇、樟菰、樟窟内菰，台湾有称阴阳对口菇。樟芝子实体属多年生，具有强烈冲鼻的樟树香气，此与一般灵芝类有很大的差异，其外型呈板状或钟状。板状型态者，面为橘红(黄)色，整面全有菌孔，板底层有浅黄白色的木栓质，藉此木栓质附着在牛樟树中空心材内壁上生长。钟状形态者，子实层(钟面)亦呈橘红(黄)色，充满菌孔(4-5个菌孔/毫米)，内有孢子味极苦，新鲜时为橘红色，之后会成为橘褐色或褐色，钟体则呈暗绿褐色的皮壳。以显微镜观察其担孢子，其型态为平滑无色的透明微弯柱形。
樟芝的生物特性
野生的樟芝是生长在牛樟树(Cinnamomum Kanehirae)树干中空内壁上的蘑菇类，因为这个特性，造成很多牛樟树倒伏。文献记载，樟芝是在牛樟树上目前唯一发现的木材腐杉菌，病征为褐色腐朽，故为褐腐菌。但是樟芝的病原性并不强，因此牛樟树很少因此死亡。虽然樟芝对牛樟树而言是病原菌，但因樟芝价格昂贵，超过牛樟树的经济价值，因此是不是牛樟树的病原菌已经不重要了。
樟芝的培养技术
樟芝的培养，人工栽培的技术，仍有待努力。所以，目前仍是以深山采集的方式来获得。但是采集樟芝不是件容易的事，因为首先要寻找牛樟树的产地。常有的困难是牛樟树与冇樟，两者极为相似，不易分辨。目前最直接的方法已由藤田安二提出，冇樟树干油是以黄樟油(safrole)与十五烧醛为主，因而有沙士中黄樟素的味道。牛樟干油则以松油醇(d-terpinenol)为主，而有樟脑油的味道，藉此即可区别牛樟与冇樟。第二个困难是要从大片树林中找到有中空洞的树干才行，此相当不易。空洞中若有樟芝，则可定期采集。
由于找寻中空洞的牛樟树干不易，不肖商人干脆将牛樟树砍倒，以期日后能长出樟芝，进而收集贩售。因此，为环保及经济上的考量，发展人工栽培樟芝是必要进行的方向。可惜的是人工栽培樟芝技术一直无法突破。樟芝在牛樟木屑上生长极为缓慢，甚至停滞。因此，若能改以现代生物技术，来培养樟芝菌丝体，将是最经济、最符合环保的人工培育法。
樟芝的药效及其活性成分
早期的传说是台湾原住民在采伐时，无意间发现了牛樟树上的樟芝，原住民因生活型态之故，体能消耗量较大，肝的病变对原住民来说，是最大的威胁，民族习性原故，原住民较喜欢喝酒、宿醉在所难免，因喝酒过多导致肝病变的比率亦是居高不下。但在喝过樟芝的烹煮液，竟可不药而愈、强身健体、解酒效力更是一流，至此原住民便将樟芝奉为上品，成为原住民的传统珍贵药材。民间传说对肝癌及子宫癌特别有效，也有人认为可治急性腹痛。
科学性的研究则不多，依台大药学系的研究，对鼠类淋巴血癌细胞P-388有明显的毒杀性。师范大学的研究则指出其具有抗胆碱、肠弛缓及血小板凝集作用，另可抑制金黄色葡萄球菌及须疮小芽癣菌的生长。
因此有鉴于：
1.樟芝唯一寄生物种为牛樟树，属于一级保护类树木种类，且有空心的牛樟树的不易取得；
2.樟芝子实体的试管内(in vitro)及离牛樟树心空洞外的培育的困难性；及
3.樟芝菌丝体亦有相似生物功能，且菌丝体的培养和扩大生产较可行；
本案发明人乃经精深研究，发现樟芝菌丝体液体培养所得培养液与菌丝体皆含有生物活性物质，因而完成了本发明。
附图简略说明
图1为显示出根据本发明樟芝菌丝体CCRC 35398培养及从樟芝菌丝体生产生物活性物的方法所得樟芝菌丝体干重与所得生物活性物质，亦即多糖体，的产率相对于培养时间的结果的图形；
图2为显示出根据本发明樟芝菌丝体CCRC 35396培养及从樟芝菌丝体生产生物活性物质的方法所得樟芝菌丝体干重与所得生物活性物质，亦即多糖体，的产率相对于培养时间的结果的图形；
图3为凝胶过滤层析的蛋白质标准品曲线；
图4为樟芝菌丝体所含多糖体的分子量测定图解；
图5为樟芝菌丝体水萃取多糖体的Sepharose 6B分子量测定层析图；
图6为樟芝菌丝体碱萃取多糖体的Sepharose 6B分子量测定层析图；
图7为樟芝菌丝体水萃取多糖体的1H-NMR光谱；
图8为樟芝菌丝体水萃取多糖体的13H-NMR光谱；
图9为樟芝菌丝体多糖体的HF-IR光谱；
图10为樟芝菌丝体多糖体的X光衍射图；
图11为显示出用本发明樟芝菌丝体水萃取物，碱萃取物和发酵液进行巨噬细胞激活试验时，以ELISA分析巨噬细胞所分泌的TNF-α浓度的图形；以及
图12为显示出以C57BL/6及BALB/c小鼠喂食樟芝不同周数及剂量后的免疫反应(细胞激素IL-2、TNF-α、INF-γ)结果的图形。
综上所述，本发明提出一种樟芝生物活性物质，其系经由樟芝菌丝体液体培养后，从其培养液及/或菌丝体分离出者；其为以多糖体为主的樟芝成分混合物；本发明也提出一种从樟芝菌丝体生产生物活性物质的方法，其包括以特殊液体培养基培养樟芝菌丝体及分离出该活性物质；且更提出一种组成物，其含有上述活性物质。
综上所述，本发明提出一种以樟芝菌丝体生产生物活性物质的方法，其包括以特殊液体培养基培养樟芝菌丝体及分离出活性物质的步骤。
本发明所用樟芝菌丝体是得自寄存于中国台弯省新竹市食品工业研究所菌种保存中心的樟芝菌丝体CCRC35398和CCRC35396。
本发明所用樟芝(Antrodia Camphorata)菌丝体CCRC35398和CCRC35396的存活微生物(株)菌种已分别于2001年3月5日和2001年5月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国·北京·中关村)；这两种菌种在保藏中心登记入册的编号分别为CGMCC No.0543和CGMCC No.0575。
樟芝菌丝体的液体培养，基本上是采习用技术来进行。其中包括将菌丝体接种于平板上，于适当温度如15-35℃，(较佳者周温约25℃)下培养约2周后，刮取菌丝接种于烧瓶内，用实施例中所列培养基，在约30℃，pH2-8，较佳者pH4-7，更佳者约pH4.5，及振荡速率50-250rpm之下振荡培养到log期初期，亦即，约5-7天；最后，将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基(同烧瓶培养基)内，在15-30℃，(较佳者周温约25℃)，槽压0.1-1.5公斤/平方厘米，及pH约4.5下，以0.5-1vvm通气速率通入空气，或空气与氧气，二氧化碳或氮气的混合物，较佳者空气，在50-300rpm搅拌速率下培养约8-16天。即得樟芝菌丝体液体培养悬浮液，包括菌丝体与澄清液。
接着为从樟芝液体培养悬浮液分离樟芝活性物质的步骤。
于本发明方法中包括两种分离方式，其一为先将樟芝液体培养悬浮液分离成菌丝体本身与澄清液，再分别分离出活性物质；其二为直接用樟芝液体培养悬浮液，包括菌丝体和液体培养基，分离出活性物质。
于本发明方法的第一种分离活性物质的方式中，包括将樟芝菌丝体与液体分离开的步骤及分别从菌丝体和澄清液分离出活性物质的步骤。
将菌丝体与液体分开的方法可采用习知技术，例如离心，过滤，沉淀(Settling)，倾析(decantation)，等。于本发明一较佳实施例中，系采用离心法，使用习用的离心机，例如欧式离心脱水机，如可得自瑞典ALFALAVAL公司的Decater NX418S；以3200rpm(4000xg)离心即分离出菌丝体和澄清液。
接着为分别从菌丝体和澄清液分离出活性物质的步骤。从菌丝体分离出活性物质的方法包括用溶剂萃取，将菌丝体溶裂再分离，等。依樟芝活性物质特性，及方便性与工业上较佳经济可行性而言，较佳者为采用溶剂萃取法。所用溶剂较佳者为水，溶剂如碱水或酸水溶液，或它们的混合物。于一较佳实施例中，系使用水来萃取。萃取温度可为121℃以下的温度。在用水作为萃取溶剂的情况中，可用30-121℃，萃取30分钟到2小时，然后分离出萃取液。可重复萃取数次，将萃取液合并处理。
从菌丝体萃取液及从培养澄清液分离出活性物质所用的方法相同，如下所述。将培养澄清液浓缩数倍，如5-30倍，较佳者约10倍，如将200升浓缩到20升，接着用醇，如乙醇，或乙醇/水，如95％乙醇/水，在低温如0-30℃，较佳者约4℃下沉淀整夜，最后分离出沉淀物而得所需活性物质。
在本发明方法的另一方式中，系直接从樟芝菌丝体液体培养悬浮液分离出活性物质。其系将包含菌丝体和培养基的培养液直接加热到30-121℃一段适当时间，如30分钟至2小时后分离樟芝菌丝体，再从澄清液用上述程序分离出活性物质。
在本发明第二部份中，提出从樟芝菌丝体液体培养悬浮液依上述本发明方法分离出樟芝活性物质。用本发明方法得到的樟芝生物活性物质系以多糖体为主的物质。
从先前技艺研究中得知菇类所具生理活性成分最主要的是其所含的水溶性多糖类，以往菇类多糖体因多由子实体萃取而受到来源的限制，而由液态培养菌丝体可产生胞外多糖体，且有良好的产量。菌丝多糖可藉由强化宿主免疫机能抑制癌细胞增殖或将其排除。菇类多糖体的功能性成分研究如下：
1.结构分析
由菌丝体或子实体以热水和醇类萃取得的粗多糖，再经纯化成葡聚糖、杂多糖、蛋白多糖等。其中可经凝胶过滤层析(gel filtrationchromatography)精制，再用核磁共振光谱(NMR spectra)、红外线光谱(IR spectra)、气体层析—质谱分析(GC-MS)仪器分析方法，针对葡聚糖、杂多糖等、进行分子量、分子间键结方式，分支程度、旋光度的分析，而可得知其主要结构为β-(1→3)-D-葡聚糖、半乳-β-葡聚糖、α-甘露聚糖-等，可以用X光衍射分析测知，从而与其药力作用相关联，例如其中β-(1→3)-D-葡聚糖呈现的螺旋型结构可能是引发抗肿瘤作用的重要结构。由于菇类多糖体并非皆具有抗肿瘤活性，且其活性受到水中溶解性、分子量大小、分子构型、键结分支程度的影响，因此预期在化学结构分析上的研究，可找到可能的抑癌作用的分子机制。
已知，由担子菌形成的以β-1，3-葡聚糖为主链、β-1，6-葡聚糖侧链的多糖体，在分子量分布上有相当大的差异，且其生理活性也有别，一般依分子量的不同可分为：(A)3-5×103Da左右者具有降低血糖的功能，如灵芝多糖(ganoderan)；(B)10-1000×103Da之间者具有消炎作用；(C)30×103Da以上者则具有抗肿瘤作用，如香菇多糖、灵芝多糖及裂褶菌多糖。因此也测量本发明多糖体的分子量以期了解其生理活性。
从文献而知，茹类多糖体具有多种生物活性，包括：
1.抗肿瘤活性：
于1968年日本Ikegawa等人以“Sarcoma 180/小白鼠腹腔内或口服给药法”实验证实，从多孔菌科(Polyporaceae)和食用菇类子实体萃取的热水萃取物，确实有相当高的肿瘤抑制率和肿瘤完全退缩率。日后许多研究者证实其萃取物即为以多糖体为主者且经证实有相当高的肿瘤抑制率、完全退缩率和低死亡率。
菇类除了水溶性β-(1-3)-D-葡聚糖外，亦含有以盐类或碱萃取的木糖、甘露糖、半乳糖及醛糖等杂糖链的β-多糖及其蛋白质复合体，此类杂多糖以注射或口服给药亦有明显抗癌效果。
2.其它生体机能调节物质：
降血压，降低胆固醇，免疫机能调节，降低血糖活性，抑制血小板凝集能力等皆为重要的发现。
在本发明第三部份中，提出一种组成物，其含有本发明樟芝活性物质及恰当的稀释剂，赋形剂或载体。
在本发明组成物中，通用的稀释剂为，例如，极性溶剂，如水，醇类，酮类，酯类和它们的组合，较佳者为水，醇，水/醇混合物。于较佳实施例中，该稀释剂较佳者为水，生理食盐水，缓冲水溶液，缓冲食盐水，等。
适用于本发明组成物中有或无皆可的赋形剂或载体可为液体或固体形式，如乳糖、糊精、淀粉、硬脂酸纳。液体赋形剂或载体包括水、沙拉油、酒、果汁等。
本发明要以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受这些实施例所限制。
实施例1：以樟芝菌丝体CCRC 35398所作试验：
樟芝菌丝体的培养
菌丝体菌株：为于2001年3月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)的CCRC：35398菌株。
平板培养：将菌丝体接种于平板上，于30℃下培养约2周。
烧瓶培养：刮取平板上的菌丝接种于烧瓶内，用下列培养基，在约30℃，pH 4.5下，于摇动机上以振荡速率50-250rpm振荡培养到log期初期，亦即，约5-7天；
培养基配方
成分                               含量(重量％)
谷类(如麦粉类)                         1
蛋白胨                                 0.1
硫酸镁                                 0.05
磷酸氢二钾                             0.05
硫酸铁                                 0.05
蔗糖                                   2
酵母抽出物、粉、膏                     0.5
豆类(如黄豆粉、绿豆粉、大豆粉等)       0.2
发酵槽培养：
培养基同上，将烧瓶培养物接种于发酵槽培养基内，在30℃，槽压0.5-1.0公斤/平方厘米，及pH约4.5下，以150升/分通气速率通入空气，在200rpm搅拌速率下培养约10天，即得樟芝菌丝体液体培养悬浮液，包括菌丝体与澄清液。
结果：100升发酵液发酵完毕可得2公斤菌丝体(干重)及90升的滤液。
实施例2
樟芝活性成分的分离
从菌丝体和澄清液分别分离出活性物质
采用离心法将菌丝体与液体分开，使用习用的离心机，得自瑞典ALFA LAVAL公司的Decater NX418 S；以3200rpm(4000xg)离心即分离出菌丝体和澄清液。
从菌丝体分离出活性物质
用水在80℃，萃取1小时，然后分离出萃取液，可重复萃取数次，将萃取液合并处理。
从菌丝体萃取液及培养澄清液分离出活性物质
将培养澄清液浓缩约10倍，接着用95％乙醇/水，在约4℃下沉淀整夜，最后分离出沉淀物而得所需活性物质。
直接从樟芝菌丝体液体培养悬浮液分离出活性物质
将包含菌丝体和培养基的培养悬浮液直接加热到100℃约1小时后分离樟芝菌丝体，再从澄清液用上述程序分离出活性物质。
结果：活性物质产量如图1所示。可以看出在培养6天以后，干重与多糖体产率皆显著增加，而于约10天后达到稳定状态。
实施例3：以樟芝菌丝体(CCRC 35396)所作的试验：
用实施例1和2的相同程序对另一樟芝菌丝体(CCRC 35396)进行试验。在干重及多糖体方面得到的结果与另一菌株(CCRC 35398)相似，如图2所示。干重方面：100升发酵液发酵完毕可得2±0.2公斤菌丝体(干重)及90升的滤液；多糖体方面：如图2所示，可以看出在培养6天以后，干重与多糖体产率皆显著增加，而于约10天后达到稳定状态。
实施例4：活性物质分析
一、材料与方法
1.生产菌株
樟芝(Antrodia camphorata)CCRC 35398是购自新竹食品工业发展研究所菌种中心，以potato dextrose agar(PDA)(购自美国Difco公司)斜面培养基培养及保存。
2.菌丝体的培养
利用液态深层培养方法连续培养七天，温度为30，接种的菌数为培养基含量的1.0％，培养基的组成如下：每公斤去离子水中含有蔗糖：20克；(NH4)SO4：3克；MgSO4：3克；KH2PO4：3克；柠檬酸：0.5克；酵母菌萃取物：5克，培养液的pH值调整在5.5。
3.化学药品
甲醇、正己烷及乙酸乙酯(GR级，购自德国Merck公司)，无水硫酸钠亦购自德国Merck公司。
4.菌丝体成分的萃取与区分
(1)萃取
将200克经冷冻干燥的樟芝菌丝体粉末用2升甲醇加热搅拌回流萃取5小时后，过滤。将残渣重复上述的步骤2次。合并收集滤液，减压浓缩(40℃，50mTorr)得到浓缩物(60.67克)。
(2)区分
将浓缩物(60.0克)与硅胶(200克)*置于减压浓缩机中旋转混合。取20克混合物，装载于硅胶管柱(管内充填550克的硅胶)*内。
分别以下述溶剂各1000毫升进行区分：
    冲提次序     1     2     3     4     5     6     7     8
    正己烷(％)     100     75     50     25     0     0     0     0
    乙酸乙酯(％)     0     25     50     75     100     75     50     0
    甲醇(％)     0     0     0     0     0     25     50     100
    总体积(毫升)     1000     1000     1000     1000     1000     1000     1000     1000
二、多糖体的成分分析
樟芝多糖体萃取率
樟芝菌丝体多糖萃取以发酵滤液者萃取率(14.33％)最高，其次是菌丝体水萃取物者(2.98％)，而菌丝体碱萃取物者(1.29％)最低，且菌丝滤液多糖萃取量显著高于水萃取者及碱萃取者，表示樟芝菌丝多糖体产于细胞外多糖含量较细胞内含量高(表1)。
樟芝菌丝体多糖部分，由于发酵滤液抽出的多糖含有9.55％的水份含量，而由菌丝体水萃取及碱萃取的多糖体分别含有10.75％及4.35％水分含量。以酚-硫酸法测定其总糖含量，可得滤液多糖体含量(87.15％)最高，且显著地高于菌丝体水萃取多糖者(72.86％)及碱萃取多糖者(40.65％)，显示碱萃取物含有较多杂质，因为碱性多糖萃取过程中，一些碱溶性无机盐及蛋白质溶于其中而使其含有较高量的灰分(4.86％)及微量蛋白质(14.18％)之故。
表1.樟芝菌丝体多糖的萃取率
    樟  芝     ％萃取率(w/w)1
    滤液萃取物     14.33
    水萃取物     2.98
    NaOH萃取物     1.29
1平均值(p＜0.05).
樟芝中性单糖组成分分析
樟芝菌丝体多糖萃取以2M三氟醋酸水解后再以1N NaOH中和至pH为中性，由多糖分解而得知其单糖组成(表2)。发酵滤液多糖主要由甘露糖(188.54毫克/克)、葡萄糖(150.11毫克/克)及木糖(112.75毫克/克)组成，而水萃取多糖则以葡萄糖(355.77毫克/克)、木糖(205.30毫克/克)及半乳糖(121.39毫克/克)为主要单糖，其碱萃取多糖则由葡萄糖(177.11毫克/克)及木糖(147.23毫克/克)所组成，但其仍含有一些微量的单糖及醛糖酸。而醛糖酸于水萃取多糖中含量(102.40毫克/克)最高，其次是碱萃取多糖(68.56毫克/克)及发酵滤液多糖(54.72毫克/克)。
          表2.樟芝菌丝体发酵液多糖萃取物的单糖组成
糖                 含量1(毫克/克干物质)
  滤液萃取物   菌丝水萃取物   菌丝NaOH萃取物
    核糖     N.D2     N.D.     13.41
    木糖     112.75     205.30     147.23
    甘露糖     188.5     N.D.     N.D.
    葡萄糖     150.11     355.77     177.11
    半乳糖     88.44     121.39     52.00
  葡萄糖醛酸     54.72     102.40     68.56
1相同栏内的值以不同数字表示不同统计意义值(p＜0.05)。
2N.D.：未测得。
多糖分子量测定
凝胶过滤层析蛋白质标准品曲线的制备
凝胶过滤层析条件下制备凝胶过滤层析蛋白质标准品曲线：
管柱：Sepctra/chrom LC管柱(1.6×70公分)
凝胶：Sepharose6B
移动相：0.15M NaCl
流速：0.5毫升/分，3.0毫升/管
多糖体：酚-H2SO4法与UV 480nm
蛋白质：在254nm测量
Sepharose6B为以6％Agarose形成胶体的商品，适合分析分子量为104-106Da多糖分子及104-4×106Da蛋白质分子，以Blue dextran测定其柱床体积为45毫升，再以不同分子量的蛋白质标准品[铁蛋白(ferritin)(MW 4.4×105Da)、醇脱氢酶(MW 1.5×105Da)、白蛋白(MW 4.7×104Da)、碳酸脱水酶(carbonic anhydrase)(MW 2.9×104Da)及细胞色素C(MW 1.24×104Da)]经Sepharose6B管柱溶析后，将标准品的分子量对数值与溶析管数(tube numbers)作图，并求初期回归曲线而得图3所示的凝胶过滤层析的蛋白质标准品曲线。
多糖体分子量测定
将样品以同一条件进行凝胶过滤层析，在蛋白质最大吸收波长254nm侦测析光值而得知样品层析出来的管数，利用酚-硫酸法水解多糖进行显色，将显色的管数代入回归曲线而得知溶析样品的多糖分子量、如图4中所示。
分离及酚-酸法显色后，得知发酵滤液多糖于管数17及35皆有吸收波峰(图4)，经与标准品(图3)比对得知其多糖分子量分别为106Da以上及1.1×104Da，而以水萃取及碱萃取多糖皆于管数11及22处有吸收波峰(图5及图6)，其经比对后得知含有106Da以上及7.6×105Da的多糖分子，菌丝体以凝胶层析后皆有蛋白质的吸收波峰，表示菌丝体多糖中可能含有与多糖键结的微量蛋白，且其多糖体皆含大于106Da的分子，表示其可能含有平均分子量为50-200万的β-(1→6)-葡萄糖基支链的β-(1→3)-喃葡聚糖。
樟芝多糖体的构造分析
自然界多糖为醛糖或酮糖以糖  键键结合的聚合物，是生命有机体不可缺的成分，其存于真菌体中则具有抗肿瘤的活性。而多糖常与蛋白质键结成糖蛋白质，其抗肿瘤活性也成为研究的焦点。已有学者自姬松茸子实体分离出β-(1→6)-D-葡聚糖蛋白质复合体(多糖∶蛋白质＝50∶40)，此外由金针菇菌丝体分离出的活性糖蛋白质金针菇素(proflamin)为10％糖类与90％蛋白质而成的，其分子量为13000±4000Da，对于同系肿瘤B-6或腺癌755有明显抑制效果，由其子实体萃出具抗肿瘤活性的β-多糖EA6(糖∶蛋白质＝70∶30)，被证实与寄主仲介性抗癌作用有一定相关的抗补体活性，因此多糖与蛋白质的比率对于在抗肿瘤活性及其结构判定则为必须探讨的。
1.核磁共振光谱(NMR)的测定
樟芝菌丝体β-D-葡聚糖的1H-核磁共振光谱化学位移在3-4ppm之间的糖类碳上键结的氢，发酵滤液的氢光谱化学位移为4.570(H-1)、4.063(H-6a)、3.866((H-6b)、3.687(H-5)、3.496(H-4)、3.486(H-3)及3.3.3(H-2)(图7)，而水萃取物及碱萃取物的氢光谱的结果相似，化学位移分别为4.570、4.598(H-1)、4.034、4.036(H-6a)、3.837(H-6b)、3.662、3.660(H-5)、3.454、3.473(H-3，4)及3.336、3.337(H-2)，其对应的13C光谱化学位移为103.087(C-1)、78.775(C-3)、77.978(C-5)、76.092(C-2)、73.224(C-4)及75.505(C-6)(图8)，结果与Mizuno等人研究菇类子实体水溶性多糖的一维碳氢光谱化学位移相似。
2.红外线光谱(IR)的测定
樟芝丝体多糖粉末以红外线光谱分析，在发酵滤液于3375cm-1处有OH基、1557cm-1处有W型波峰，表示有C-C-C链存在、2938cm-1处有C-H基及1063cm-1处有-CH-O-CH-基的吸收带出现(图9)；其水萃取及碱萃取多糖则分别于3419、3390cm-1处(OH基)、1557、1539cm-1处有W型波峰(C-C-C)、2922、2919cm-1处(C-H)及1080、1069cm-1处(-CH-O-CH-)皆有吸收带出现，显示菌丝体多糖含有多糖官能基特性。
3.X光衍射(X-ray)的测定
樟芝菌丝体多糖萃取物的X光衍射图，2θ角于发酵滤液为19.43o，而于水萃取及碱萃取则分别为19.48o、19.37o(图10)，由图中可看出经碱萃取的多糖较水萃取或滤液萃取者有更佳的结晶度。
实施例5：活性分析
增强免疫效能
A.巨噬细胞激活试验
实验菌株：樟芝(Antrodia camphorata)CCRC 35398及CCRC 35396
实验方法：
供试样品制备：
按上述实施例1，2和3所述将樟芝发酵后，利用离心分别取得菌丝体及发酵液，菌丝体分别再以热水(100℃以上)及碱液(NaOH)进行萃取，将所得的三种樟芝萃取物(菌丝体水萃取、菌丝体碱萃取、发酵液)再分别以酒精萃取多糖体，最后将萃取的多糖体进行冻干。三种樟芝冻干品皆以二次蒸馏的无菌水回溶并定量浓度至10毫克/毫升，而形成樟芝多糖萃取液。
激活试验：
将制备好的三种樟芝多糖萃取液分别加入1×105细胞/洞的J774A.1巨噬细胞(CCRC 60140)中进行刺激激化，终浓度为100微克/毫升，每个样品皆作三重复，隔液刺激培养后取出细胞培养液，以ELISA方法分析巨噬细胞所分泌的TNF-α浓度。
组别：
(a)阴性对照组一加入2微升磷酸盐缓冲溶液于巨噬细胞中进行刺激；
(b)阳性对照组一加入2微升脂多糖(Lipopolysaccharide)(简称LPS，终浓度10微克/毫升)于巨噬细胞中进行刺激；
(c)实验组一加入不同樟芝菌株的不同萃取物(菌丝体水萃取物、碱萃取物、发酵液)2微升于巨噬细胞中进行刺激，终浓度为100微克/毫升。
结果：
肿瘤坏死因子(TNF-α)具有破坏肿瘤细胞与活化免疫细胞的功能，因此在免疫系统中占有重要的角色。本实验结果如图3所示。三组实验组所测得的TNF-α浓度皆明显比阴性对照组高，其中又以樟芝菌丝体碱萃取物为最高，但略低于阳性控制组。因此由此实验结果可知，樟芝萃取物皆具有刺激活化巨噬细胞的能力，且以碱萃取物为最有效。
B.活体动物实验模式对樟芝活性物质的免疫功能的分析和评估。
本实验是以BALB/cByJ小鼠为实验动物，以喂管方式连续饲喂五周，藉以分析脾脏细胞的各项免疫功能以评估樟芝菌丝体对于免疫调节反应的功效。
经喂食五周后，对小鼠的生长无影响。以MTT法进行淋巴细胞增生反应分析，发现于ConA及PHA处理下，均可促进淋巴细胞增生。于ConA刺激下，可刺激脾脏细胞产生Th1细胞激素IL-2，抑制Th2细胞激素IL-4的生成。
材料与方法
1.实验动物
6周龄BALB/cByJ雌性小鼠，SPF等级，购自台湾国科会国家实验动物繁殖及研究中心。
动物购进后观察一周，以了解其健康情形及生长状况。若有任何小鼠显现不正常情形(如畏光、脱水等)，即淘汰不用。
实验前秤重，去除体重落在(平均体重±2标准差)以外者。符合标准者以随机方式分为三组。每组为单一性别12只。以耳标标记各组小鼠，并于每周秤重一次，观测小鼠生长状况。
2.饲养管理
按一般(conventional)实验动物饲养管理办法进行：动物饲养室的环境设定为23±2℃、50±10％相对湿度、12小时光照/黑暗交替、饲料饮水不限制。
3.实验样品
樟芝菌丝体(CCRC 35396)经如实施例1所述发酵培养后经加工干燥制成样品(样品生产批号：20020315A9B)。
4.剂量设计
实验进行分成对照组及两个受试物组。受试物剂量根据人类每日最适摄取量换算成小鼠的每日摄取量作为低剂量组，另将此剂量放大10倍后作为高剂量组。
I.对照组—等体积二次水
II.低剂量组—每日建议摄食量
III.高剂量组—10倍的每日建议摄食量
剂量计算如下：
一般保健者(人)建议食用量：420毫克/粒×2粒/次×3次/天＝2520毫克/天；
因此，换算小鼠剂量为2520毫克/天×0.0026＝6.552毫克/天-即低剂量组；
高剂量组剂量为65.52毫克/天(6.552毫克/天×10)。
5.受试物给予途径及天数
采用胃管口服给予喂食，每日一次，每周六日，连续五周。
6.实验步骤
6.1动物采血与牺牲
实验老鼠以二氧化碳迷安乐死后，全身喷酒精消毒移至Laminar flow中无菌操作，继续采取脾脏的步骤。
6.2脾脏细胞悬浮液的制备
在无菌状态下取出老鼠的脾脏，置于装有5毫升培养基的30毫米培养皿(petri dish)中。利用5毫升针筒推进器的平尾端轻轻压住脾脏、磨动，磨到整颗脾脏变白色，使结缔组织间的脾脏细胞尽量游离出来。
用无菌吸管将含有细胞的培养基吸至15毫升离心管，静置5-10分钟。吸取细胞悬浮液至另一离心管中，600×g离心5分钟，吸弃上清液。轻拍管壁，使细胞均匀散开。加入5毫升冰冷的ACK RBC溶裂缓冲液(lysis buffer)与细胞混合，作用1分钟。立即加入5毫升已回温的培养基。600×g离心5分钟，吸弃上清液。轻拍管壁，使细胞均匀散开。以10毫升的HBSS缓冲液清洗2次。将细胞悬浮于10毫升培养基中。以锥蓝(Trypan Blue)稀释(大约为10倍稀释)计算细胞总数。将细胞以培养基调成1×107细胞/毫升的浓度。
6.3淋巴细胞增生反应(MTT法)：
先于96孔培养盘培养内分别加入100微升/孔的培养基或含有裂殖素(mitogen)的培养基(分别为10微克/毫升ConA、20微克/毫升PHA及50微克/毫升LPS)。然后加入100微升/孔的4×106细胞/毫升的脾脏细胞悬浮液，置于37℃、5％CO2培养箱内，培养72小时。
于培养后，加入20微升/孔的MTT(5毫克/毫升)，继续培养4小时，离心250×g 10分钟。吸弃200微升/孔的上澄液。加入200微升/孔的DMSO，震荡5分钟后，用ELISA reader测A570nm。
6.4细胞激素分泌试验：
24孔培养盘上分别标示“唯细胞(cell only)”及ConA处理。唯细胞处理孔中加入0.6毫升的培养基；ConA处理孔中加入0.5毫升ConA(10微克/毫升)及0.1毫升的培养基。于每孔内加入0.4毫升107细胞/毫升的老鼠脾脏细胞。24小时后收集细胞培养上清液置于-20℃冰箱。以夹层式(sandwich)-ELISA(酵素-联结免疫吸附检定(enzyme-linked immunosorbent assay))测试细胞培养上清液中IL-2及IL-4含量。
7.数据整理及结果判定
实验结果以平均值±标准误差(Mean±SD)表示。所有结果均以单向变方分析(one-way ANOVA)进行统计，以Duncan’s multiple range test进行各处理组间的比较，并以Dunnett’s t-test进行各处理组与对照组间的比较。
结果
在经五周灌食樟芝菌丝体样品之后，比较对照组与低剂量组、高剂量组小鼠的体重，各组小鼠的生长无明显差异(表3)，显示樟芝菌丝体对小鼠生长无不良影响。
脾脏细胞以ConA、PHA及LPS裂殖素(mitogen)处理，于5％CO2、37℃下培养三天，以MTT法进行淋巴细胞增生反应分析，结果发现于ConA及PHA刺激下，樟芝菌丝体可明显地刺激淋巴细胞增生(P分别为＜0.05及＜0.1)(表4)。
脾脏细胞于自发情况(即cell only)及ConA裂殖素刺激下，于5％CO2、37℃培养24小时，收集其上澄液，分别检测IL-2及IL-4的生成量，以了解樟芝菌丝体对细胞激素生成的影响。结果发现樟芝菌丝体可刺激Th1-type细胞激素IL-2的生成(ConA-stimulated)；对Th2-type细胞激素IL-4的生成则有抑制作用(ConA-stimulated)(表5)。
结论
经过五周的灌食樟芝菌丝体，低剂量组、高剂量组与对照组小鼠的生长皆无明显差异。樟芝菌丝体于ConA及PHA刺激下，可增加淋巴细胞增生；于ConA刺激下，可促进脾脏细胞增加Th1-type细胞激素IL-2的生成，抑制Th2-type细胞激素IL-4的生成。
                   表3实验期间小鼠的平均体重
周  期     对照组     低剂量组     高剂量组
    12只/组     12只/组     12只/组
    第一周     20.34±1.86     20.12±1.52   20.81±1.37
    第二周     22.37±1.68     22.99±1.24   22.57±1.88
    第三周     24.34±1.81     24.38±1.22   24.75±1.85
    第四周     26.08±1.55     25.81±1.39   25.78±1.84
    第五周     27.08±1.96     26.64±1.35   26.59±1.68
1.灌食五周樟芝菌丝体，其是由樟芝(CCRC 35396)发酵培养加工干燥制成。
2.结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。体重单位为克(gm)
                        表4樟芝菌丝体对淋巴细胞增生的影响
    对照组   低剂量组   高剂量组
  刺激指数     ConA   4.40±1.74   9.81±2.44*   4.69±1.94
    PHA   3.71±0.70   4.53±1.11*   3.94±1.34
    LPS   5.82±2.92   5.77±1.71   4.98±1.66
1.灌食五周樟芝菌丝体，其是由樟芝(CCRC 35396)发酵培养加工干燥制成。
2.结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。
3.*P＜0.05，**P＜0.01
表5  “樟芝王”对脾脏细胞细生成胞激素的影响
    组别     对照组     低剂量组     高剂量组
  细胞激素     细胞处理
  IL-2(微微克/毫升) 不经处理(cell only) 5.53±2.19  4.80±2.62   6.89±1.64
ConA-刺激 3233.5±548.1  4400.8±1782.3   5893.9±1577.3*
  IL-2(微微克/毫升) 不经处理(cell only) 3.35±1.75  3.81±2.23   4.66±2.83
ConA-刺激 1142.7±364.3  826.4±220.2**   1095.1±499.7
1.灌食五周樟芝菌丝体，其是由樟芝(CCRC 35396)发酵培养加工干燥制成。
2.结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。
3.*P＜0.05，**P＜0.01
实施例6：活性分析
增强免疫效能
本发明樟芝活性物质均能刺激正常人血液中的淋巴细胞产生细胞介素来杀死U-937人类淋巴癌细胞(表6)，也可以增加巨噬细胞(J744A.1)的吞噬能力(表7)。
表6.樟芝的实体及菌丝体热水可溶多糖对人类淋巴癌细胞的抑制作用
    样    品   用量(微克/毫升)     抑制率(％)
樟芝子实体     0220     14.46126.2343.87
樟芝菌丝体     0220     15.19625.4923.53
表7.樟芝菌丝体活性物质对人类巨噬细胞*吞噬能力的作用
样        品     用量(PPM)   吞噬能力(％)
樟芝菌丝多糖     3.915.6     147159
樟芝培养液多糖(I)     3.615.6     152203
樟芝培养液多糖(II)     3.9     242
灵芝发酵滤液多糖     3.223.5     144233
对照     -     100
*.巨噬细胞株(J774A.1)
本研究显示服用不同剂量及周数的樟芝后，能激发且增强体内细胞激素的表现及活性。由活体动物的实验中进一步证实经由樟芝刺激而得的细胞激素免疫活性能在生物体内发挥其疗效。
请参阅图2，为显示出以C57BL/6及BALB/c小鼠喂食樟芝不同周数及剂量后的免疫反应(细胞激素IL-2、TNF-α、INF-γ)结果的图形，在活体动物评估模式中，我们使用两种近亲交配小鼠(C57/BL6及BALB/c)作实验，将8周龄的C57/BL6及BALB/c小鼠分成多组，每组为10只小鼠，分别给予口服樟芝一周、二周或四周，每组口服剂量分别为喂食樟芝1.0毫克、2.5毫克或5.0毫克。每组小鼠在服完药后的24小时，经由尾部自然感染约150±10只曼氏血吸虫只尾动幼虫，未服用药材各只小鼠亦同时感染相同数目的幼虫作为对照组，6-8星期后利用门脉灌流法(portal perfusion method)牺牲动物，冲出肛门静脉及肠系膜静脉中的成虫，实验结果显示，两种小鼠在服用樟芝2.5毫克或5.0毫克一周后，其产生的成虫数目和对照组比较无明显差别，口服樟芝1.0毫克二周后，所得的结果与前述相似。当两种小鼠口服2.5毫克二周后，其幼虫在小鼠内发育为成虫数目和对照组比较呈现明显降低的趋势，其减虫率介于20％-45％。若口服5.0毫克，二周后则BALB/c小鼠出现比服用同剂量一周的小鼠较明显的效果(减虫率为40％对26％)，但C57BL/6小鼠则与服用一周的效果类似，然而当两种小鼠口服樟芝活性物质1.0毫克或2.5毫克四周后其所得的成虫数目较对照组显著减少，尤其是服用2.5毫克后，其减虫率达到60％和49％。此研究结果显示经服用樟芝活性物质2.5毫克四周后，其所增强的免疫效能在生体内发挥明显的功能(显示减少了约一半的感染率)。(如表8所示)表8.C57BL/6及BALB/c小鼠服用不同剂量的樟芝一周、二周或四周后感染血吸虫所得的减虫效果
*表示未测试
上列详细说明系针对本发明的一可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本案的权利要求范围中。

Claims (11)

1.一种樟芝菌丝体生物活性物质，其特征是经樟芝菌丝体液体培养后产生者，其中所述樟芝菌丝体为CGMCC No.0543或CGMCC No.0575。
2.按照权利要求1所述的樟芝菌丝体生物活性物质，其特征在于所述樟芝菌丝体为CGMCC No.0575。
3.按照权利要求1所述的樟芝菌丝体生物活性物质，其特征在于其中该生物活性物质是源自樟芝菌丝体液体培养所得整个悬浮液。
4.按照权利要求1所述的樟芝菌丝体生物活性物质，其特征在于其该生物活性物质是源自樟芝菌丝体液体培养所得整个悬浮液中的澄清培养液。
5.按照权利要求1所述的樟芝菌丝体生物活性物质，其特征在于其该生物活性物质是源自樟芝菌丝体液体培养所得整个悬浮液中的菌丝体经萃取所得者。
6.一种樟芝菌丝体生物活性物质的制备方法，其特征在于包括以液体培养基培养樟芝菌丝体及分离出活性物质的步骤，其中所述樟芝菌丝体为CGMCC No.0543或CGMCC No.0575。
7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于分离步骤包括将该培养悬浮液分离成固体菌丝体与澄清培养液，接着用溶剂萃取该菌丝体，及将该萃取液与该澄清液合并将该活性物质沉淀分离出。
8.按照权利要求7所述的方法，其特征在于萃取溶剂为水且萃取温度为30至121℃。
9.按照权利要求6所述的方法，其特征在于分离步骤包括将该培养悬浮液直接于30至121℃加热后，将该活性物质沉淀分离出。
10.一种组成物，其特征在于包括如权利要求1至5项中任何一项所述的樟芝菌丝体生物活性物质。
11.根据权利要求1至5项中任何一项所述的樟芝菌丝体生物活性物质在制备用于刺激淋巴细胞增生，刺激Th1-type细胞激素IL-2的生成，抑制Th2-型细胞激素IL-4的生成，和刺激活化巨噬细胞的药物中的应用。
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