TW202202158A

TW202202158A - 牛樟芝組合物於免疫調節的用途

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Publication number: TW202202158A
Application number: TW109122047A
Authority: TW
Inventors: 林進忠; 賴宗賢; 陳婉菁; 李政墩
Original assignee: 台灣利得生物科技股份有限公司
Priority date: 2020-06-30
Filing date: 2020-06-30
Publication date: 2022-01-16
Also published as: US20210401912A1

Abstract

本揭露提供一種牛樟芝組合物於免疫調節的新應用，其中，牛樟芝組合物包括：50 wt%至100 wt%的牛樟芝菌絲體；以及0 wt%至50 wt%之牛樟芝子實體萃取物。

Description

牛樟芝組合物於免疫調節的用途

本揭露關於一種牛樟芝組合物的新應用，其係用於免疫調節上。

多醣體及三萜衍生物於免疫學領域上的治療潛力被廣泛的探討。其中，牛樟芝為台灣特有的真菌之一，已知可用於治療發炎反應、感染及癌症。例如，目前已知牛樟芝萃取物可抑制介白素-1β(IL-1β)及介白素18 (IL-18) 的分泌，且可減少發炎體NLRP3的表現，並抑制ATP誘導的ROS產生及凋亡蛋白酶-1(caspase-1)活化；故牛樟芝萃取物可用於發炎反應的治療上(Journal of Ethnopharmacology, Volume 155, Issue 1, 8 August 2014, Pages 154-164)。此外，更有報導指出，當小鼠服用牛樟芝多醣體後，其干擾素γ(IFN-γ)及腫瘤壞死因子α (TNF-α) 表現增加，且脾臟樹突細胞、巨噬細胞、CD8α⁺ 表面表現、樹突細胞上的主要組織相容性複合體(major histocompatibility )第II類I-A/I-E也增加，而脾臟細胞中的CD4⁺ /CD8⁺ 比例及B細胞數目也提升；同時，當服用牛樟芝多醣體後，小鼠的感染情形也受到抑制(International Immunopharmacology, Volume 8, Issue 3, March 2008, Pages 458-467)。再者，也有研究指出，服用牛樟芝萃取物可顯著抑制肺癌腫瘤生長及轉移，且不會影響血清生物參數或體重，故牛樟芝萃取物可視為一種肺癌治療的候選藥物(Scientific Reports, Volume 9, Article number: 5145 (2019))。

此外，抗原提呈(antigen-presentation)機制與樹突細胞、B細胞及MHC II分子交互作用有關。目前已有研究顯示，單核球細胞與後天免疫，例如抗原提呈及促進調節性T細胞(Treg cell)增生有關。調節性T細胞及T細胞可幫助維持自體抗原耐受性及負調控調節T細胞。因此，MHC II⁺ 樹突細胞可為免疫學研究另一契機。

在免疫療法上，程式性死亡分子1 (programmed death 1, PD-1)/程式性死亡分子1配體(PD-1 ligand, PD-L1)軸被視為重要的指標。PD1受體在活化的T細胞表面上表現。PD-L1受體則在腫瘤細胞過度表現。在T細胞上的PD1受體可與腫瘤細胞的PD-L1受體連接，而抑制細胞毒性T細胞。PD-1/PD-L1軸為免疫學上常見的新穎標的之一。

有鑑於此，若能提供一種牛樟芝組合物於調控免疫反應的新應用，將有利於後續的免疫學研究或免疫治療(例如，免疫療法)上。

本揭露的主要目的在於提供一種牛樟芝組合物的新應用，其係用於免疫調節上。

本揭露的牛樟芝組合物包括：50 wt%至100 wt%的牛樟芝菌絲體；以及0 wt%至50 wt%之牛樟芝子實體萃取物。於本揭露的一實施例中，牛樟芝組合物包括：50 wt%至99 wt%的牛樟芝菌絲體；以及1 wt%至50 wt%之牛樟芝子實體萃取物。於本揭露的另一實施例中，牛樟芝組合物是由50 wt%至100 wt%的牛樟芝菌絲體；以及0 wt%至50 wt%之牛樟芝子實體萃取物所組成。於本揭露的再一實施例中，牛樟芝組合物是由50 wt%至99 wt%的牛樟芝菌絲體；以及1 wt%至50 wt%之牛樟芝子實體萃取物所組成。

當使用本揭露的牛樟芝組合物時，可達到免疫調節的功效。因此，本揭露提供一種前述牛樟芝組合物的用途，用以製備具有免疫調節特性的醫藥組成物。此外，本揭露更提供一種免疫調節方法，包括下列步驟：提供一所需主體一有效劑量的前述牛樟芝組合物，以調節該主體的免疫反應。其中，該主體可為人類或其他哺乳動物。

於本揭露中，牛樟芝菌絲體可為一牛樟芝菌絲體固態培養物。其中，牛樟芝菌絲體可以可食用五穀雜糧進行固態培養，待採收後再經乾燥、研磨製粉等加工程序製得。

於本揭露中，牛樟芝子實體萃取物可為一水與乙醇的萃取物。其中，牛樟芝子實體萃取物可為以50 wt%至95 wt%乙醇萃取的萃取物。

於本揭露中，牛樟芝組合物每公克包含的活性成分包括：4,7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯并二噁茂 (2.9 mg~17 mg)、4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5-[3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯]-2-環己烯酮 (0.35 mg~21 mg)、輔酶Q3 (0.23 mg~10 mg)、樟黃素C (0.24 mg~9 mg)、樟菇酸B (0.09 mg~5 mg)、樟菇酸H (0.25 mg~13 mg)、樟菇酸K (0.15 mg~8 mg)、樟菇酸A (0.005 mg~2 mg)、樟菇酸C (0.03 mg~2 mg)、去氫硫色多孔菌酸 (0.14 mg~11 mg)及去氫齒孔菌酸 (0.15 mg~15 mg)。

於本揭露中，免疫調節特性可為減少PD-L1⁺ B細胞 (PD-L1⁺ B cells)、減少PD-L1⁺ 單核球細胞 (PD-L1⁺ monocytes)、減少MHC II⁺ 樹突細胞 (MHC II⁺ dendritic cells)、增加作用型CD4 αβ T細胞(Effector CD4 αβ T cell)、及/或增加作用型CD8 αβ T細胞(Effector CD8 αβ T cell)。特別是，當一主體服用含有本揭露的牛樟芝組合物或含有牛樟芝組合物的醫藥組成物後，相較於未服用牛樟芝組合物或含有牛樟芝組合物的醫藥組成物前，周邊血中的PD-L1⁺ B細胞減少、PD-L1⁺ 單核球細胞減少、MHC II⁺ 樹突細胞減少、作用型CD4 αβ T細胞增加及/或作用型CD8 αβ T細胞增加。其中，周邊血中的PD-L1⁺ B細胞、PD-L1⁺ 單核球細胞、MHC II⁺ 樹突細胞、作用型CD4 αβ T細胞及/或作用型CD8 αβ T細胞可透過流式細胞儀、酶聯免疫斑點法(Enzyme-linked Immunospot Assay, ELISPOT)或免疫組織化學染色法(immunohistochemistry, IHC)分析而得。

於本揭露中，醫藥組成物或牛樟芝組合物可經由非口服、口服、經鼻、局部、或經由植入型藥盒(implanted reservoir)等方式投藥。

此外，於本揭露的醫藥組成物中，可包括300 mg至1500 mg的牛樟芝組合物，例如可包括300 mg至1400 mg、300 mg至1300 mg、400 mg至1200 mg、400 mg至1100 mg、500 mg至1100 mg、500 mg至1000 mg、或800 mg至1000 mg。再者，於本揭露的醫藥組成物中，醫藥組成物可為以溶液、膠囊、錠劑、顆粒、噴霧、糖漿或其他適合的型式。當醫藥組成物為膠囊或錠劑，前述的牛樟芝組合物的劑量可包括在一或多個膠囊或錠劑中。

於本揭露中，醫藥組成物或牛樟芝組合物的服用劑量可為每日300 mg至4000 mg的牛樟芝組合物。例如，可為每日800 mg至4000 mg、1200 mg至4000 mg、1300 mg至4000 mg、1400 mg至3800 mg、1400 mg至3500 mg、1500 mg至3500 mg、1500 mg至3300 mg、1600 mg至3300 mg、1600 mg至3000 mg、1600 mg至2800 mg、1600 mg至2500 mg、1600 mg至2300 mg或1600 mg至2000 mg的牛樟芝組合物。

於本揭露中，醫藥組成物或牛樟芝組合物的服用頻率可為每日服用1至3次。此外，服用時機並無特殊限制，可為飯前、飯後、睡前或其他時間。

於本揭露中，醫藥組成物或牛樟芝組合物係至少服用7天，如此可達到調節免疫的功效。

於本揭露中，所使用的「有效劑量」一詞，係指能夠對於所需主體產生預期效果所需的劑量，且其會根據投藥路徑、使用賦形劑、以及與其它藥劑共同使用的可能性而改變。

於本揭露中，醫藥組成物另包括藥學上可接受之載劑、安定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增厚劑、或賦形劑、或上述之組合。

於本揭露中，所使用的「可接受」一詞，即其必須與牛樟芝組合物相容(較佳係能穩定牛樟芝組合物)，並且不能對所需主體造成傷害。

下文將配合圖式並詳細說明，使本揭露的其他目的、優點、及新穎特徵更明顯。

以下提供本揭露的不同實施例。這些實施例是用於說明本揭露的技術內容，而非用於限制本揭露的權利範圍。一實施例的一特徵可透過合適的修飾、置換、組合、分離以應用於其他實施例。

牛樟芝組合物的製備

本揭露之牛樟芝組合物係由50 wt%至99 wt%之牛樟芝固態培養菌絲體以及1 wt%至50 wt%牛樟芝子實體水及乙醇萃取物所組成。其中，牛樟芝菌絲體係以可食用五穀雜糧進行固態培養(接種比率5-15%(v/w))，經18~30℃培養3~5個月後，採收後再加工製得牛樟芝菌絲體粉末。此外，牛樟芝子實體萃取物則係以下列方式獲得：自經植菌之牛樟段木採收子實體，將所採收之子實體烘乾，再將烘乾之子實體以水(50~100℃)以及乙醇(35~50℃)依1:8至1:12(W/V)比例分別進行萃取1~10小時，重覆萃取一至二次，萃液濃縮後備用。

將分別製得之牛樟芝菌絲體固態培養物粉末與牛樟芝子實體水及乙醇萃取物，以99:1至1:1之比例組合，而得到牛樟芝組合物。組合例一為：80克牛樟芝菌絲體固態培養物粉末混合20克牛樟芝子實體水及乙醇萃取物。組合例二為：90克牛樟芝菌絲體固態培養物粉末混合10克牛樟芝子實體水及乙醇萃取物。

以下實施例所使用之牛樟芝活性組成物「LEAC102試驗樣品」係由，由台灣利得生技股份有限公司研發生產提供，其為前述組合例一所述的牛樟芝組合物。經由組成分分析，本發明之牛樟芝活性組成物包含活性成份：4,7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯并二噁茂 (2.9 mg~17 mg)、4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5-[3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯]-2-環己烯酮 (0.35 mg~21 mg)、輔酶Q3 (0.23 mg~10 mg)、樟黃素C (0.24 mg~9 mg)、樟菇酸B (0.09 mg~5 mg)、樟菇酸H (0.25 mg~13 mg)、樟菇酸K (0.15 mg~8 mg)、樟菇酸A (0.005 mg~2 mg)、樟菇酸C (0.03 mg~2 mg)、去氫硫色多孔菌酸 (0.14 mg~11 mg)及去氫齒孔菌酸 (0.15 mg~15 mg)。

實驗方法

於本實施例中，係對健康受試者進行試驗。以流式細胞儀作為評估免疫調控反應的手段之一進行4次分析檢測。於本實施例中，所有受試者每天口服LEAC102試驗樣品兩次，每次相當於800~1000mg牛樟芝攝取量，並服用3個月。免疫細胞與免疫調控功能指數的關係是以成對學生T試驗分析。

於本實施例中，所使用的試劑包括：細胞分離液Ficoll-Paque PREMIUM (GE Healthcare cat#17-5442)、染色緩衝溶液、細胞內染Foxp3穿孔試劑套組(eBioscience™ Foxp3) (eBioscience cat#00-5523-0)、巴斯特滴管 (Volac cat#D812)、1.5 ml微型離心管 (SSI cat#1260-00)、15 ml及50 ml塑膠離心管 (Corning CentriStar cat#4307941 / #430829)、無菌塑膠吸管 (Thermo Scientific Nunc Serological Pipette) (cat#170355 /#170356 / #170357)、96孔盤 (V底) (用於細胞計數) (Basic Life cat#BL6001)及FACS™試管 (流量管)(Corning cat#FLCON 352008)。

使用Ficoll密度梯度離心技術 (Ficoll density gradient centrifugation technique) (Ficoll-Paque™ PREMIUM; GE Healthcare, USA)，由白膜層(buffy coat)分離人類周邊血單核球細胞。離心後，以1倍的PBS緩衝溶液清洗周邊血單核球細胞，而後以染色緩衝溶液 (2 % FBS + 0.02 % NaN₃ 於1× PBS中)回溶細胞，以進行細胞表面標記物 (cell surface marker)染色或細胞內染色。

由周邊血取得周邊血單核球細胞，並以細胞表面標記物進行免疫分型染色。其中，細胞表面標記物所用抗體包括以異硫氰酸螢光素(Fluorescein isothiocyanate (FITC))標記之人類T細胞受體α/β(T-cell receptor alpha/beta (TCRα/β))及CD33；以藻红蛋白(Phycoerythrin (PE))標記之人類CD4、CD14、CD25、CD39、PD-L-1及PD-1；以偶合染料(Coupled Dye (ECD))標記之人類CD45；以APC標記之人類T細胞受體γ/δ(TCR gamma/delta (TCRγ/δ))及CD11c；以及以AlexaFluor^® 488APC標記之人類CD25及PD-1。以流式細胞儀(Navios flow cytometer) (Beckman Coulter)取得數據，並以Kaluza軟體版本2.1 (Beckman Coulter)進行分析。

將免疫子群體(immune subset)作表現型全面性篩選(comprehensively screening phenotype)並進行深度(in-depth)數據分析，同時以動力學比較不同時間點的差異。而不同時間點數據以成對學生T試驗作定性類比及檢驗統計差異。

實驗結果

牛樟芝活性組成物對於周邊血單核球細胞中PD-L1⁺ 細胞亞群(subset)的功效

PD-1/PD-L1軸(PD-1/PD-L1 axis)與免疫平衡(immune balance)調節高度相關。PD-L1為在正常細胞及腫瘤細胞上表面的蛋白質，其向PD-1表面T細胞(PD-1 expressing T cell)傳送負向信號，抑制T細胞活化。為了評估本實施例的牛樟芝活性組成物於PD-1/PD-L1軸的調節作用，收集受試者的周邊血單核球細胞，並以流式細胞儀及對特定抗原的抗體進行分析，並以前述分析軟體進行分析(*,P > 0.05, **,P > 0.01, ***,P > 0.001)。結果如圖1及圖2所示。其中，圖1為受試者的PD-L1⁺ B細胞分佈圖，而圖2為受試者的PD-L1⁺ 單核球細胞分佈圖。

如圖1所示，相較於第0週，第12週及第16週時PD-L1⁺ B細胞表現顯著降低。如圖2所示，相較於第0週，第4週及第12週時PD-L1⁺ 單核球表現也顯著降低。此結果顯示，PD-L1在B細胞及單核球細胞表現降低；代表口服本實施例的牛樟芝活性組成物可有效抑制PD-L1及PD-1的作用。

牛樟芝活性組成物對於周邊血單核球細胞中MHC II⁺ 樹突細胞的功效

樹突細胞為有效的抗原提呈及加工細胞(antigen presenting and processing cells)，其可幫助提供適合T細胞及B細胞的抗原。在人類樹突細胞中，所有的樹突細胞展現大量的MHC II相關標記。為了評估本實施例的牛樟芝活性組成物於MHC-II正細胞亞群(MHC-II positive cell subsets)的調節效果，收集受試者的周邊血單核球細胞，並以流式細胞儀及對特定抗原的抗體進行分析，並以前述分析軟體進行分析(*,P > 0.05, **,P > 0.01, ***,P > 0.001)。結果如圖3所示，其為受試者的MHC II⁺ 樹突細胞分佈圖。

如圖3所示，相較於第0週，第16週時MHC II⁺ 樹突細胞表現顯著降低。此結果顯示，口服本實施例的牛樟芝活性組成物可有效幫助抑制受試者中的交互呈現作用(cross-presentation activity)。

牛樟芝活性組成物對於周邊血單核球細胞中作用型CD4 αβ T細胞及作用型CD8 αβ T細胞的功效

T細胞為一對抗細胞外及細胞內病原體的必要免疫亞群之一。T細胞可分為兩個主要子族群，CD4及CD8 T細胞，其分別為輔助T細胞及細胞毒性T細胞。此外，T細胞會因受到刺激而活化，而正調控表面抗原表現。為了評估本實施例的牛樟芝活性組成物於作用型CD4 αβ T細胞及作用型CD8 αβ T細胞的調節效果，收集受試者的周邊血單核球細胞，並以流式細胞儀及對特定抗原的抗體進行分析，並以前述分析軟體進行分析(*,P > 0.05, **,P > 0.01, ***,P > 0.001)。結果如圖4及圖5所示，其分別為受試者的作用型CD4 αβ T細胞及作用型CD8 αβ T細胞分佈圖。

如圖4所示，相較於第0週，第12週及第16週時作用型CD4 αβ T細胞表現顯著提升。如圖5所示，相較於第0週，第12週及第16週時作用型CD8 αβ T細胞表現也顯著提升。此結果顯示，作用型CD4 αβ T細胞及作用型CD8 αβ T細胞表現增加，代表口服本實施例的牛樟芝活性組成物可有效提升T細胞活性。

前述實驗結果顯示，本揭露的牛樟芝活性組成物具有調節免疫的功效，其可減少健康主體的PD-L1⁺ B細胞、PD-L1⁺ 單核球及MHC II⁺ 樹突細胞，且增加健康主體的作用型CD4 αβ T細胞及增加作用型CD8 αβ T細胞。特別是，本揭露的牛樟芝活性組成物可負調控PD-L1/PD-1軸，並可正調控作用型CD4 αβ T細胞及作用型CD8 αβ T細胞。此外，本揭露的牛樟芝活性組成物可用於後天免疫調節。於細胞增生的實驗結果中，在16週服用本揭露的牛樟芝活性組成物後，顯著負調控受試者的MHC-II⁺ 樹突細胞表現，並同時減少PD-L1⁺ 單核球細胞的表現。此結果顯示，本揭露的牛樟芝活性組成物對於後天免疫反應的調控上可展現有效的治療功效。

無

圖1為受試者的PD-L1⁺ B細胞分佈圖。

圖2為受試者的PD-L1⁺ 單核球細胞分佈圖。

圖3為受試者的MHC II⁺ 樹突細胞分佈圖。

圖4為受試者的作用型CD4 αβ T細胞分佈圖。

圖5為受試者的作用型CD8 αβ T細胞分佈圖。

無。

Claims

一種牛樟芝組合物的用途，用以製備具有免疫調節特性的醫藥組成物，其中該牛樟芝組合物包括： 50 wt%至100 wt%的牛樟芝菌絲體；以及 0 wt%至50 wt%之牛樟芝子實體萃取物。
如請求項1所述的用途，其中該牛樟芝菌絲體為一牛樟芝菌絲體固態培養物。
如請求項1所述的用途，其中該牛樟芝子實體萃取物為以50 wt%至95 wt%乙醇萃取的萃取物。
如請求項1所述的用途，其中該免疫調節特性為減少PD-L1⁺ B細胞 (PD-L1⁺ B cells)。
如請求項4所述的用途，其中該免疫調節特性為，一主體服用該醫藥組成物後，相較於未服用該醫藥組成物前，周邊血中的PD-L1⁺ B細胞減少。
如請求項5所述的用途，其中係以流式細胞儀、酶聯免疫斑點法或免疫組織化學染色法分析周邊血中的PD-L1⁺ B細胞。
如請求項1所述的用途，其中該免疫調節特性為減少PD-L1⁺ 單核球細胞 (PD-L1⁺ monocytes)。
如請求項7所述的用途，其中該免疫調節特性為，一主體服用該醫藥組成物後，相較於未服用該醫藥組成物前，周邊血中的PD-L1⁺ 單核球細胞減少。
如請求項8所述的用途，其中係以流式細胞儀、酶聯免疫斑點法或免疫組織化學染色法分析周邊血中的PD-L1⁺ 單核球細胞。
如請求項1所述的用途，其中該免疫調節特性為減少MHC II⁺ 樹突細胞 (MHC II⁺ dendritic cells)。
如請求項10所述的用途，其中該免疫調節特性為，一主體服用該醫藥組成物後，相較於未服用該醫藥組成物前，周邊血中的MHC II⁺ 樹突細胞減少。
如請求項11所述的用途，其中係以流式細胞儀、酶聯免疫斑點法或免疫組織化學染色法分析周邊血中的MHC II⁺ 樹突細胞。
如請求項1所述的用途，其中該免疫調節特性為增加作用型CD4 αβ T細胞(Effector CD4 αβ T cell)。
如請求項13所述的用途，其中該免疫調節特性為，一主體服用該醫藥組成物後，相較於未服用該醫藥組成物前，周邊血中的作用型CD4 αβ T細胞增加。
如請求項14所述的用途，其中係以流式細胞儀、酶聯免疫斑點法或免疫組織化學染色法分析周邊血中的作用型CD4 αβ T細胞。
如請求項1所述的用途，其中該免疫調節特性為增加作用型CD8 αβ T細胞(Effector CD8 αβ T cell)。
如請求項16所述的用途，其中該免疫調節特性為，一主體服用該醫藥組成物後，相較於未服用該醫藥組成物前，周邊血中的作用型CD8 αβ T細胞增加。
如請求項17所述的用途，其中係以流式細胞儀、酶聯免疫斑點法或免疫組織化學染色法分析周邊血中的作用型CD8 αβ T細胞。
如請求項1所述的用途，其中該醫藥組成物包括300 mg至1500 mg的牛樟芝組合物。
如請求項1所述的用途，其中該醫藥組成物的服用劑量為每日300mg至4000 mg的牛樟芝組合物。