TWI716249B - 戈氏副擬桿菌的脂多醣用於抑制發炎反應之用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)的脂多醣用於抑制發炎反應之用途，該戈氏副擬桿菌的脂多醣可有效抑制周邊血液單核細胞、巨噬細胞、及/或B細胞因病原性脂多醣所引起的免疫反應，因而可有效利用於抑制發炎反應以及相關醫藥組成物的製備。

Description

戈氏副擬桿菌的脂多醣用於抑制發炎反應之用途
本發明係關於一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)的脂多醣之用途，尤其是一種關於利用戈氏副擬桿菌的脂多醣於抑制發炎反應的應用；其中，該戈氏副擬桿菌的脂多醣可有效抑制周邊血液單核細胞、巨噬細胞、及/或B細胞的免疫反應，以有效抑制發炎反應的發生。
發炎反應為血管系統之組織對致炎因子及局部損傷所發生的防禦性反應，主要由組織受到外傷、出血或病原感染等刺激所激發之生理反應，其中包含紅腫、發熱、疼痛等症狀，發炎反應是先天免疫系統為移除有害之刺激或病原體並促進組織修復等的保護措施，通常情況下，發炎反應是有益的。
脂多醣(Lipopolysaccharide,LPS)為革蘭氏陰性菌細胞膜上主要的成份之一，亦是細菌入侵的標記，係為一種內毒素。脂多醣主要提供並保持細菌結構的完整性，並保護細菌的細胞膜抵抗某些化學物質的攻擊，例如來自宿主的免疫反應等。當微生物入侵個體並釋放大量的脂多醣後，會刺激免疫細胞分泌大量的促進發炎之細胞因子激素，例如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、介白素-1(Interleukin-1,IL-1)等，並使個體產生過度發炎反應，甚至導致敗血症的發生，最嚴重可能致命，且目前因脂多醣所誘發之生物性反應，被認為是引發敗血症的主要原因。
然而，在台灣仍每年約有十一萬人罹患敗血症，平均每天有三百個新發病例，且隨著老年人口的增長、免疫抑制病人增多、侵入性治療檢查的 增加、微生物抗藥性增加，目前敗血症的病例數呈上升趨勢，且儘管至今醫藥發達，嚴重敗血症的死亡率仍然高達百分之三十至四十左右。
因此，綜上所述，因應敗血症的高發生率及高死亡率，且基於現代人生活水平提高且對於保健概念提高，研發一種能方便又有效於前端減緩病原引發的免疫反應或抑制發炎反應之有效成分的組成物，著實有其必要性。
本發明之一目的在提供一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)的脂多醣(Lipopolysaccharides)用於製備抑制一發炎反應之醫藥組成物的用途。
在本發明的一實施例中，該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制一周邊血液單核細胞的免疫反應，且該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制該周邊血液單核細胞分泌細胞因子。
在本發明的一實施例中，該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制一巨噬細胞的免疫反應，且該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制該巨噬細胞分泌細胞因子。
在本發明的一實施例中，該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制一B細胞的免疫反應，且該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制該B細胞進行分化、及/或分泌細胞因子。
在本發明的一實施例中，該發炎反應係由一病原性脂多醣所誘導產生的，且該病原性脂多醣係來自一大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)。
在本發明的一實施例中，該戈氏副擬桿菌之寄存編號為BCRC 910869。
利用本發明實施例之戈氏副擬桿菌的脂多醣於抑制發炎反應時，可以口服方式給藥。其給藥時可與一般食物一同食用，因此製備包含戈氏副擬桿菌的脂多醣之醫藥組成物時，該醫藥組成物可進一步包括蛋白質、單醣、雙醣、寡醣、多醣、碳水化合物、胺基酸、脂質、維他命或其任意組合的成分， 且該醫藥組成物進一步包括一醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、輔劑及/或食品添加劑。
此外，於製備包含本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣之醫藥組成物時，亦可進一步加入所屬技術領域所熟知之載劑或其他輔劑。而其劑型，可為但不限於一噴霧氣體、一溶液、一半固態、一固態、一明膠膠囊、一軟膠囊、一錠劑、一口含片、一口香糖及/或一冷凍乾燥粉末製劑，以便於將本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣傳遞至腸道及/或部分或全部作用於個體內。同時，本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣或包含其他成分的醫藥組成物，亦可添加於食品、保健食品或膳食補充品。
本發明實施例所提供一種戈氏副擬桿菌的脂多醣用於製備抑制發炎反應之醫藥組成物的用途；本發明之戈氏副擬桿菌中，能夠找到與已知在大腸桿菌中合成脂質A相關之LpxA基因、LpxC基因、LpxD基因、LpxH基因、LpxB基因、LpxK基因、KdtA基因、及LpxL基因相對應的直系同源基因之序列位置，但並無法找到與LpxM基因相對應的直系同源基因，但其該些基因的同一性相較於大腸桿菌MG1655菌株以及擬桿菌DSM17855菌株皆偏低；本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣不會刺激周邊血液單核細胞分泌介白素-1β、不會刺激巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α、亦不會誘導初始B表現CD86及CD19的表面抗原蛋白，即B細胞被誘導分化，顯示本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣不會引起周邊血液單核細胞、巨噬細胞、或B細胞產生免疫反應，即其對個體具有低內毒性；再者，本發明戈氏副擬桿菌能夠抑制人類周邊血液單核細胞、巨噬細胞、或B細胞中，由大腸桿菌的脂多醣所誘導的免疫反應，具有於周邊血液單核細胞、巨噬細胞、或B細胞抗發炎的活性，具有免疫抑制能力；因此，本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣可應用於抑制免疫反應以及相關醫藥組成物的製備，特別係可抑制由病原性脂多醣所引發之發炎反應。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1A係大腸桿菌中Kdo2-脂質之生化合成路徑的反應式。
圖1B係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌的BLAST分析比對結果。
圖2A係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌的脂多醣單獨不觸發周邊血液單核細胞免疫反應之折線圖。
圖2B係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌的脂多醣抑制周邊血液單核細胞的發炎反應之長條圖。
圖3A係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌的脂多醣單獨不觸發巨噬細胞免疫反應之折線圖。
圖3B係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌的脂多醣抑制巨噬細胞的發炎反應之長條圖。** p值<0.01。
圖4A係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌的脂多醣單獨不觸發B細胞免疫反應之流式細胞儀分析結果圖。
圖4B係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌的脂多醣抑制B細胞的發炎反應之流式細胞儀分析結果圖。
圖4C係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌的脂多醣於B細胞的抑制發炎反應之長條圖。
使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以單變量變異數分析(One-way ANOVA)進行統計分析。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。
依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。
依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。
定義
本文所述之「有效劑量」係表示能抑制哺乳動物或人類周邊血液單核細胞、巨噬細胞、或B細胞中，由病原性脂多醣所引起的免疫反應及/或發炎反應，尤其係由大腸桿菌的脂多醣所引起的免疫反應及/或發炎反應所需戈氏 副擬桿菌的脂多醣數量，以抑制哺乳動物或人類產生的發炎反應。有效劑量依所抑制或治療的生物種類或個體差異而可能不同，但可藉由例如劑量遞增試驗(dose escalation)以實驗決定其有效劑量。
依據本發明，有關細菌培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關周邊血液單核細胞、巨噬細胞、及B細胞培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關分離純化人類周邊血液單核細胞的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關分離純化B細胞及誘發B細胞分化的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關脂多醣純化的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明，有關流式細胞儀(Flow cytometer)的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
如本文中所使用的，用語「細菌成分」意為培養細菌時，該菌直接或間接相關之衍生物質，包括但不限於該細菌之代謝產物、該細菌之結構、細菌相關活性及非活性成分等。
戈氏副擬桿菌菌株
本發明實施例中所用之戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii,P.goldsteinii)MTS01是一種益生菌株(Probiotic bacteria)，尤其係該戈氏副擬桿菌的脂多醣(Lipopolysaccharides,LPS)能改善由大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)之脂多醣所導致個體的發炎病症。該戈氏副擬桿菌係寄存於德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)；民國107年10月29日；編號DSM 32939；以及寄存於食品工業發展研究 所；民國108年2月15日；編號BCRC 910869。戈氏副擬桿菌為絕對厭氧細菌，需於37℃之無氧培養箱培養約48小時；其中，該系統包含10%的二氧化碳、10%的氫氣、及80%的氮氣。該菌之液態培養液為NIH thioglycollate broth(TGC II)(購自BD，美國，編號為225710)，固態培養基則為Anaerobic blood agar plate(Ana.BAP)(購自啟新生物科技公司，台灣)。該菌長期保存於-80度冰箱，保護液為25%之甘油，無須特殊降溫處理，且可經由冷凍乾燥進行保存，以穩定其活性。
本發明之實施例中經由細胞實驗證實本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣能夠分別有效地抑制由病原性大腸桿菌的脂多醣，所導致的周邊血液單核細胞中介白素-1β(IL-1β)分泌量上升、巨噬細胞中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌量上升、及初始B細胞表現CD86及CD19的表面抗原蛋白等現象，顯示本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣於周邊血液單核細胞、巨噬細胞、或B細胞，具有抑制發炎反應的功效，具有免疫抑制能力，特別係可抑制由病原性脂多醣所引發之發炎反應；此顯示本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣可應用於抑制免疫反應以及相關醫藥組成物的製備。
益生菌株(Probiotic或Probiotic bacteria)係為一微生物，其菌體、混合菌株、萃取物或代謝產物對於宿主本身係具有正面影響，通常源自於人體內、有益於腸道健康的活菌，亦可指外來補充、對身體可能有益的某些微生物；其中，該益生菌株的代謝產物係為培養該益生菌株時，經該細菌代謝後所分泌至細菌培養液中之物質，包含培養該菌的培養液等。
本發明提供一種戈氏副擬桿菌的脂多醣用於製備抑制發炎反應之組成物的用途。同時，本發明之亦提供一種用於抑制發炎反應之組成物，包含一戈氏副擬桿菌的脂多醣、及一醫藥上可接受之載體，且該組成物係一食品、一飲品、一營養補充劑、一保養品、或一醫藥品。
以下將詳細說明本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣之特徵分析與比較、分離純化本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣之方法與步驟、本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣於周邊血液單核細胞的抗發炎活性之測試實驗、本發明戈氏副擬桿 菌的脂多醣於巨噬細胞的抗發炎活性之測試實驗、及本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣於B細胞的抗發炎活性之測試實驗。
實施例1 戈氏副擬桿菌之脂多醣的特徵分析與比較
本發明之一實施例為了進行戈氏副擬桿菌MTS01脂多醣的特徵分析與比較；首先，針對戈氏副擬桿菌MTS01全基因組進行BLAST搜索，以鑑定戈氏副擬桿菌MTS01中，負責生物合成脂質A的候選基因；其中，Blast(Basic Local Alignment Search Tool)是一種用來比對生物序列之一級結構(例如不同蛋白質的氨基酸序列或不同基因的DNA序列)的演算法，主要係透過與一個已知包含若干序列的資料庫中的資訊進行比較，BLAST係用於尋找與待分析的序列相同或類似的已存在序列，藉以預測其功效或角色等的工具，其係於KEGG與NCBI-NR的數據資料庫中進行搜索。
本實施例中，該BLAST搜索係以大腸桿菌MG1655菌株(Genome accession number：U00096)與商用習知慣用的擬桿菌(Bacteroides dorei,B.dorei)DSM17855菌株中，與負責生物合成脂質A相關的基因，作為比較的基準點；其中，圖1係為Kdo2-脂質A(Kdo2-lipid A)在大腸桿菌中的生物合成路徑，即Raetz pathway，如圖1A所示，由尿苷二磷酸-N-乙醯胺基葡萄糖(Uridine diphosphate N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)作為反應的起始物，並透過LpxA、LpxC、LpxD、LpxH、LpxB、LpxK、及KdtA共七個酵素合成一大腸桿菌脂質A的初級產物，再分別透過LpxL及LpxM二個酵素，將第五與第六個醯基鏈添加到該初級產物，並完成大腸桿菌的脂質A，即圖1A中Kdo2-脂質A；其中，已知大腸桿菌的脂質A通常具有六個醯基鏈；細菌的脂多醣主要由脂質A(Lipid A)、核心多糖(Core oligo-saccharide)、及多糖鏈(Wpoly-saccharide或O antigen)三個部分索組成；其中，脂質A為脂多醣的主要毒性來源，其主要功能為協助脂多醣固定在係菌的細胞膜上。
因此，以大腸桿菌中，LpxA、LpxC、LpxD、LpxH、LpxB、LpxK、KdtA、LpxL、及LpxM共九個，與Kdo2-脂質A合成相關的基因進行BLAST分析， 並以與本發明戈氏副擬桿菌同菌屬的擬桿菌DSM17855菌株，同時與Kdo2-脂質A合成相關的基因進行BLAST分析，以作為另一比較組。
BLAST分析比對結果如圖1B所示，其中最左欄係為本發明戈氏副擬桿菌MTS01中可能與其脂質A合成相關的推定基因，中間欄為大腸桿菌MG1655菌株與該些推定基因的同一性(Identity)及E value；最右欄則為擬桿菌DSM17855菌株與該些推定基因的同一性及E value。由圖1B所示，該分析比較結果指出在本發明戈氏副擬桿菌MTS01中，能夠找到與LpxA、LpxC、LpxD、LpxH、LpxB、LpxK、KdtA、及LpxL相對應的直系同源(Ortholog)基因之序列位置，其中並無法找到與LpxM相對應的直系同源基因，且擬桿菌DSM17855菌株具有相同的現象結果。根據先前研究，已知戈氏副擬桿菌與同菌屬之細菌，例如多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、擬桿菌(Bacteroides dorei)、或鬆脆桿菌(Bacteroides fragilis)，其脂質A皆係五醯化(penta-acylated)而非六醯化(Hexa-acylated)，其中如前所述LpxM係為添加第六個醯基鏈於脂質A上的酵素，因此該BLAST分析結果與該先前研究結果相符合。
由先前文獻亦可得知擬菌屬的脂多醣間具有異質性，而圖1B中亦可見本發明之戈氏副擬桿菌MTS01與同菌屬的擬桿菌DSM17855菌株，在該八個相對應的直系同源基因中，同一性並不高，因此該BLAST分析結果與該先前研究結果亦相符合。
實施例2 戈氏副擬桿菌抑制周邊血液單核細胞的發炎反應之功效
本發明之一實施例為進行戈氏副擬桿菌MTS01之脂多醣抑制周邊血液單核細胞的發炎反應之活性測試。然而，因為脂多醣位於細菌的細胞膜上，若要探討脂多醣對抗發炎的直接功效，須先將脂多醣自戈氏副擬桿菌MTS01細胞中進行分離與純化。
本發明實施例中使用RNA分離試劑(即Tri-Reagent)純化方法，將脂多醣從整個戈氏副擬桿菌MTS01細胞中分離出來。首先，將戈氏副擬桿菌MTS01細胞懸浮在足夠量的Tri-Reagent中，接著將該懸浮液於室溫下作用十五分 鐘，以使細胞完全均質化。接著，於該作用溶液中加人1/10體積的氯仿，以產生分離相，並將該混合物劇烈晃動混合後，於室溫下再作用十分鐘。再將所得混合物於12000g下，離心10分鐘以分離水相及有機相，其中將水相溶液轉移至新的1.5mL離心管中，並將蒸餾水添加至有機相中，再重複兩次前述劇烈搖晃混合、作用十分鐘、離心、及收集水相溶液的步驟，以確保完全收集混合物中的脂多醣。將該些水相溶液合併後進行真空乾燥，並將該分離純化而得的粗Tri-Reagent脂多醣，溶解於0.375M氯化鎂(Magnesium chloride，溶解於95%乙醇中，並保存於-20℃)中，接著於12000g下離心15分鐘後，將上清液移除並將沉澱物重新懸浮在蒸餾水中並進行冷凍乾燥，以得到蓬鬆的白色固體，即為本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣。
使用市售的RNA分離試劑，即能夠快速且方便地自少量的細菌細胞中，分離純化出脂多醣、或脂質A(Lipid A)。且此種分離純化方法並不需要專屬的分離純化設備，而且也早已被用於處理相對大量的樣品純化中。市售商業化的RNA分離試劑中主要功效成分為Tri-Reagent(即為Trizol reagent)，其係為溶於水溶液中的酚(Phenol)和硫氰酸胍(Guanidinium thiocyanate)。細菌的細胞膜可直接被Tri-Reagent中的硫氰酸胍破壞，因此不需要以物理性(例如法式壓碎機即French press)或加熱的方式以打破細菌的細胞膜，且使用Tri-Reagent進行純化分離的脂多醣或脂質A的純度較習知手段為高，所產生的脂多醣或脂質A產物中，游離磷酸鹽污染亦較習知手段為低。
本發明實施例中所使用之周邊血液單核細胞，係分離自人類血液的人類周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)；其中，該人類周邊血液單核細胞係透過SepMateTM人類周邊血液單核細胞分離管(SepMateTM PBMC isolation tube，購自STEMCELL Technologies Inc.，加拿大)進行分離，並以每孔2x106個細胞的數量培養於24孔培養盤中；其中，人類周邊血單核細胞由淋巴細胞(Lymphocytes)、單核細胞(Monocytes)、及粒細胞(Granulocytes)組成。
為先初步瞭解本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對周邊血液單核細胞的免疫調節特性，首先進行測試單獨以本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣刺激周邊血液單核細胞的影響實驗。以上述方法培養人類周邊血液單核細胞，再分別於不同孔格中加入0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL、或100000ng/mL前述本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣，並以相同濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作為負控制組，將人類周邊血液單核細胞於37℃下作用24小時後，分別取出相同體積的細胞培養上清液，再以酵素免疫分析儀(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析各組中介白素-1β(Interlukin-1β,IL-1β)的分泌量；其中，大腸桿菌O111：B4菌株(購自Sigma，美國)的脂多醣係以相同方法分離純化所得，已知大腸桿菌O111：B4菌株為一種病原性大腸桿菌菌株，且其脂多醣會誘導個體產生發炎反應。
本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣單獨對周邊血液單核細胞的影響之測試結果如圖2A所示。由圖2A可見，單獨以不同濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用後，人類周邊血液單核細胞分泌介白素-1β的量皆在2000ng/mL以上，即病原性大腸桿菌的脂多醣能使周邊血液單核細胞分泌細胞因子以誘導免疫反應，顯示此實驗方法確實能用以觀察脂多醣對周邊血液單核細胞的免疫調節特性；而單獨以不同濃度之本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣作用後，人類周邊血液單核細胞分泌介白素-1β的量，皆明顯地低於以不同濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用的細胞組別；由此結果可得知本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣幾乎不會刺激周邊血液單核細胞分泌介白素-1β，即不會誘導周邊血液單核細胞產生免疫反應，可知本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對個體具有低內毒性(Endo-toxicity)。
接著為更加瞭解本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對周邊血液單核細胞的免疫調節特性，進一步進行本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣於周邊血液單核細胞的抗發炎活性之測試。首先，以上述方法培養人類周邊血液單核細胞，再分別於不同孔格中，加入大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣與本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣以1：0、1：1、1：10、或1：100體積比例(ng/mL)混 合的樣品，並將人類周邊血液單核細胞於37℃下作用24小時後，分別取出相同體積的細胞培養上清液，再以酵素免疫分析儀分析各組中介白素-1β的分泌量；其中，各組樣品係以0.1ng/mL大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣為基準值。
本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣抑制周邊血液單核細胞的的發炎反應之活性測試結果如圖2B所示。由圖2B可見，經1：10或1：100體積比例(ng/mL)混合的樣品作用後，人類周邊血液單核細胞分泌介白素-1β的量，皆明顯地低於僅經大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用、或經1：1體積比例(ng/mL)混合的樣品作用的結果；由此結果可得知，本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣能夠抑制人類周邊血液單核細胞中，由大腸桿菌的脂多醣所誘導的免疫反應，具有抑制周邊血液單核細胞發炎反應的活性。
實施例3 戈氏副擬桿菌抑制巨噬細胞的發炎反應之功效
本發明之一實施例為進行戈氏副擬桿菌MTS01之脂多醣抑制巨噬細胞的發炎反應之活性測試；其中，本發明實施例中所使用之巨噬細胞，係小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株(Murine macrophage RAW264.7cell line)，該小鼠巨噬細胞係購自美國典型培養物保藏中心(ATCC®)，細胞編號為ATCC® TIB-71TM，該巨噬細胞且係培養於含有10%之胎牛血清、及1%抗生素-抗真菌藥(Antibiotic-antimycotic，購自Thermo Fisher Scientific，美國)的DMEM細胞培養液(Dulbecco's Modified Eagle Medium，購自Gibco，美國，編號為12100-046)中，並以每孔5x105個細胞的數量置於24孔培養盤中，並於37℃含有5%二氧化碳的培養箱中培養24小時，使巨噬細胞貼附在培養盤底部。
為先初步瞭解本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對巨噬細胞的免疫調節特性，首先進行測試單獨以本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣刺激巨噬細胞的影響實驗。以上述方法培養小鼠巨噬細胞，使其貼附於培養盤底後，再分別於不同孔格中加入0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL、或100000ng/mL前述本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣，並以相同濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作為負控制組，將小鼠巨噬細胞胞於37℃下作用24小時後，分別取出相同體積的細胞培養 上清液，再以酵素免疫分析儀分析各組中腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α,TNF-alpha)的分泌量；其中，每組進行五重複，並以單變量變異數分析進行統計分析，各組數值以±標準差表示(* p<0.05；** p<0.01)。
本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣單獨對巨噬細胞的影響之測試結果如圖3A所示。由圖3A可見，單獨以不同濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用後，小鼠巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α的量，會隨著添加濃度上升而增加，即病原性大腸桿菌的脂多醣能使巨噬細胞分泌細胞因子以誘導免疫反應，顯示此實驗方法確實能用以觀察脂多醣對巨噬細胞的免疫調節特性；而單獨以不同濃度之本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣作用後，小鼠巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α的量，皆趨近於零且皆明顯地低於以不同濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用的細胞組別；由此結果可得知本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣不會刺激巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α，即不會誘導巨噬細胞產生免疫反應，可知本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對個體具有低內毒性(Endo-toxicity)。
接著為更加瞭解本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對巨噬細胞的免疫調節特性，進一步進行本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣於巨噬細胞的抗發炎活性之測試。首先，以上述方法培養小鼠巨噬細胞，使其貼附於培養盤底後，再分別於不同孔格中，加入大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣與本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣以1：0、1：1、1：10、1：100、1：1000、或1：10000體積比例(ng/mL)混合的樣品，並將小鼠巨噬細胞於37℃下作用24小時後，分別取出相同體積的細胞培養上清液，再以酵素免疫分析儀分析各組中腫瘤壞死因子-α的分泌量；其中，各組樣品係以1ng/mL大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣為基準值；且每組進行五重複，並以單變量變異數分析進行統計分析，各組數值以±標準差表示(* p<0.05；** p<0.01)。
本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣抑制巨噬細胞的發炎反應之活性測試結果如圖3B所示。由圖3B可見，經1：1或1：10體積比例(ng/mL)混合的樣品作用後，小鼠巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α的量，皆低於僅經大腸桿菌 O111：B4菌株的脂多醣作用的結果；而經1：100、1：1000、或1：10000體積比例(ng/mL)混合的樣品作用後，小鼠巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α的量，皆顯著地低於僅經大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用的結果；由此些結果可得知，本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣能夠抑制巨噬細胞中，由大腸桿菌的脂多醣所誘導的免疫反應，具有於巨噬細胞抗發炎的活性，即本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣具有免疫抑制(Immunoinhibitory)能力，為改善大腸桿菌誘導發炎反應的潛力因子。
實施例4 戈氏副擬桿菌抑制B細胞的發炎反應之功效
本發明之一實施例為進行戈氏副擬桿菌MTS01之脂多醣抑制B細胞的發炎反應之活性測試，以初始B細胞(Naïve B cells)進行實驗；其中，該初始B細胞係以EasySepTM小鼠B細胞分離試劑套組(EasySepTM mouse B cell isolation kit，購自Stemcell Technologies，英國)，分離純化自未經免疫誘導小鼠的脾臟單細胞(Spleen single cells)，並透過流式細胞儀(Flow cytometry，FACSAria，BD，美國)分析及確認該分離之初始B細胞的回收率及純度；其中，將該經分離純化的初始B細胞以4x107個細胞/mL的濃度重新懸浮於流式細胞儀染色緩衝溶液(Flow cytometry staining buffer，含有0.1胎牛血清的磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffered saline buffer,PBS buffer)中，並以5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀醯亞胺酯(5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFDA-SE，購自Molecular Probes，美國)進行初始B細胞的染色，其中係添加終濃度為5μM的CFDA-SE於37℃下作用10分鐘進行染色，分析結束後，立即以冷的流式細胞儀染色緩衝液清洗該初始B細胞三次，並將該初始B細胞重新懸浮於細胞培養液中後，以每孔2x106個細胞/mL的濃度培養於24孔培養盤中。
根據先前研究結果已知初始B細胞經脂多醣進行免疫誘導後，會促使初始B細胞進行抗原呈現的免疫反應，而CD86與CD19係為B細胞專有的抗原呈現蛋白質，且CD86與CD19僅有在初始B細胞分化後才會表現，因此若初始B細胞產生免疫反應表面抗原CD86與CD19蛋白質的表現量會增加，並會促使初 始B細胞分化成漿細胞，而漿細胞為分泌抗體的主要細胞，且其細胞體積顯著的大於初始B細胞，另外B細胞若產生免疫反應亦會增加腫瘤壞死因子-α的分泌量。
為先初步瞭解本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對B細胞的免疫調節特性，首先進行測試單獨以本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣刺激B細胞的影響實驗。以上述方法分離純化初始B細胞並進行體外培養後，再分別於不同孔格中加入100ng/mL、1000ng/mL、或10000ng/mL濃度之前述本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣，並分別以100ng/mL、1000ng/mL、或10000ng/mL濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作為負控制組，接著將B細胞於37℃下作用48小時後，分別以流式細胞儀分析經免疫誘導後，B細胞的大小、及表面抗原CD86與CD19的表現量，並同時取出相同體積的細胞培養上清液，再以酵素免疫分析儀分析各組經免疫誘導後之B細胞的腫瘤壞死因子-α分泌量。
本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣單獨對B細胞的影響之測試結果如圖4A至圖4C所示。由圖4A可見，初始B細胞單獨以100ng/mL、1000ng/mL、及10000ng/mL濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用後，所測得B細胞的大小以及表面抗原CD86的表現量，皆會隨著添加濃度上升而增加；而由圖4B及4C可見，初始B細胞單獨以1000ng/mL之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用後，共有68.8%的B細胞表現CD86的表面抗原蛋白質，且共有35.9%的B細胞表現CD19的表面抗原蛋白質，而腫瘤壞死因子-α的分泌量約為33ng/mL，此些結果顯示病原性大腸桿菌的脂多醣確實會誘導初始B細胞產生免疫反應，顯示此實驗方法確實能用以觀察脂多醣對B細胞的免疫調節特性。
由圖4A可見，初始B細胞單獨以100ng/mL、1000ng/mL、及10000ng/mL濃度之本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣作用後，所測得B細胞的大小以及表面抗原CD86的表現量，皆幾乎未改變且皆明顯地小於及少於以100ng/mL、1000ng/mL、及10000ng/mL濃度之大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣作用的細胞組別；而由圖4B及4C可見，初始B細胞僅經1000ng/mL或10000ng/mL之本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣作用後，分別僅有2.8%及3.5%的B細胞表現CD86的表面抗原蛋白質，且分別僅有0.2%及0.4%的B細胞表現CD19的表面抗原蛋白質，而腫瘤壞死因子-α的分泌量趨近於零，該些數值皆與未經任何脂多醣作 用的細胞相似；由此些結果可得知，本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣不會誘導初始B細胞分化及分泌細胞因子，可知本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對個體具有低內毒性(Endo-toxicity)，且本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣確實不會誘導初始B細胞產生免疫反應。
接著為更加瞭解本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣對B細胞的免疫調節特性，進一步進行本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣抑制B細胞的發炎反應之活性測試。首先，以上述方法分離純化初始B細胞並進行體外培養後，再分別於不同孔格中，加入大腸桿菌O111：B4菌株的脂多醣與本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣以1000：1000或1000：10000體積比例(ng/mL)混合的樣品，並將B細胞於37℃下作用48小時後，分別取出相同體積的細胞培養上清液，再以酵素免疫分析儀分析各組經免疫誘導後，B細胞的腫瘤壞死因子-α分泌量，並同時以流式細胞儀分析經免疫誘導後，B細胞表面抗原CD86及CD19的表現量。
本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣抑制B細胞的發炎反應之活性測試結果如圖4B及4C所示。由圖4B及4C可見，初始B細胞經1000：1000或1000：10000體積比例(ng/mL)混合的樣品作用後，分別共有41.7%或62.4%的B細胞表現CD86的表面抗原蛋白質，且分別共有18.6%或30.4%的B細胞表現CD19的表面抗原蛋白質，而腫瘤壞死因子-α的分泌量則分別約為20ng/mL或36ng/mL；其中，以1000：1000體積比例(ng/mL)混合的樣品抑制功效，較以1000：10000體積比例(ng/mL)混合的樣品為佳；綜合以上結果可得知，本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣能夠抑制由大腸桿菌的脂多醣所誘導產生之B細胞的免疫反應，顯示本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣具有於B細胞抗發炎的活性。
利用本發明實施例之戈氏副擬桿菌的脂多醣於抑制發炎反應時，可以口服方式給藥。其給藥時可與一般食物一同食用，因此製備包含戈氏副擬桿菌的脂多醣之醫藥組成物時，該醫藥組成物可進一步包括蛋白質、單醣、雙醣、寡醣、多醣、碳水化合物、胺基酸、脂質、維他命或其任意組合的成分，且該醫藥組成物進一步包括一醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、輔劑及/或食品添加劑。
此外，於製備包含本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣之醫藥組成物時，亦可進一步加入所屬技術領域所熟知之載劑或其他輔劑。而其劑型，可為但不限於一噴霧氣體、一溶液、一半固態、一固態、一明膠膠囊、一軟膠囊、一錠劑、一口含片、一口香糖及/或一冷凍乾燥粉末製劑，以便於將本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣傳遞至腸道及/或部分或全部作用於個體內。同時，本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣或包含其他成分的醫藥組成物，亦可添加於食品、保健食品或膳食補充品中。
藉由上述試驗可知，本發明實施例所提供一種戈氏副擬桿菌的脂多醣用於製備抑制發炎反應之醫藥組成物的用途；本發明之戈氏副擬桿菌中，能夠找到與已知在大腸桿菌中合成脂質A相關之LpxA基因、LpxC基因、LpxD基因、LpxH基因、LpxB基因、LpxK基因、KdtA基因、及LpxL基因相對應的直系同源基因之序列位置，但並無法找到與LpxM基因相對應的直系同源基因，但其該些基因的同一性相較於大腸桿菌MG1655菌株以及擬桿菌DSM17855菌株皆偏低；本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣不會刺激周邊血液單核細胞分泌介白素-1β、不會刺激巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子-α、亦不會誘導初始B表現CD86及CD19的表面抗原蛋白，即B細胞被誘導分化，顯示本發明戈氏副擬桿菌MTS01的脂多醣不會引起周邊血液單核細胞、巨噬細胞、或B細胞產生免疫反應，即其對個體具有低內毒性；再者，本發明戈氏副擬桿菌的脂多糖能夠抑制人類周邊血液單核細胞、巨噬細胞、或B細胞中，由大腸桿菌的脂多醣所誘導的免疫反應，具有於周邊血液單核細胞、巨噬細胞、或B細胞抗發炎的活性，具有免疫抑制能力；因此，本發明戈氏副擬桿菌的脂多醣可應用於抑制發炎反應以及相關醫藥組成物的製備，特別係可抑制由病原性脂多醣所引發之發炎反應。
【生物材料寄存】
德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)；民國107年10月29日；編號DSM 32939。食品工業發展研究所；民國108年2月15日；編號BCRC 910869。

Claims (9)

  1. 一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)的脂多醣(Lipopolysaccharides)用於製備抑制一發炎反應之醫藥組成物的用途。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制一周邊血液單核細胞、一巨噬細胞、及/或一B細胞的免疫反應。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制該周邊血液單核細胞、及/或該巨噬細胞分泌細胞因子。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該戈氏副擬桿菌的脂多醣係抑制該B細胞進行分化、及/或分泌細胞因子。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該發炎反應係由一病原性脂多醣所誘導產生。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該病原性脂多醣係來自一大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該戈氏副擬桿菌之寄存編號為BCRC 910869。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物進一步包括一醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、輔劑及/或食品添加劑。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物的劑型係一噴霧氣體、一溶液、一半固態、一固態、一明膠膠囊、一軟膠囊、一錠劑、一口含片、一口香糖及/或一冷凍乾燥粉末製劑。
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新型腸道益生菌與減肥,台灣精準醫學學會,2018.07.06 *
新型腸道益生菌與減肥,台灣精準醫學學會,2018.07.06。

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