CN111481565B - 戈氏副拟杆菌的脂多醣用于抑制发炎反应的医药组合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物产物领域,尤其是关于一种戈氏副拟杆菌的脂多醣用于制备抑制发炎反应的医药组合物的用途。本发明提供一种戈氏副拟杆菌的脂多醣用于制备抑制发炎反应的医药组合物的用途,该戈氏副拟杆菌的脂多醣可有效抑制周边血液单核细胞、巨噬细胞、及/或B细胞因病原性脂多醣所引起的免疫反应,因而可有效利用于抑制发炎反应以及相关医药组合物的制备。
Description
技术领域
本发明涉及微生物产物领域,尤其是关于一种戈氏副拟杆菌的脂多醣用于制备抑制发炎反应的医药组合物的用途。
背景技术
发炎反应为血管系统的组织对致炎因子及局部损伤所发生的防御性反应,主要由组织受到外伤、出血或病原感染等刺激所激发的生理反应,其中包含红肿、发热、疼痛等症状,发炎反应是先天免疫系统为移除有害的刺激或病原体并促进组织修复等的保护措施,通常情况下,发炎反应是有益的。
脂多醣(Lipopolysaccharide,LPS)为革兰氏阴性菌细胞膜上主要的成份之一,亦是细菌入侵的标记,是一种内毒素。脂多醣主要提供并保持细菌结构的完整性,并保护细菌的细胞膜抵抗某些化学物质的攻击,例如来自宿主的免疫反应等。当微生物入侵个体并释放大量的脂多醣后,会刺激免疫细胞分泌大量的促进发炎的细胞因子激素,例如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、介白素-1(Interleukin-1,IL-1)等,并使个体产生过度发炎反应,甚至导致败血症的发生,最严重可能致命,且目前因脂多醣所诱发的生物性反应,被认为是引发败血症的主要原因。
然而,在中国台湾地区每年仍有约十一万人罹患败血症,平均每天有三百个新发病例,且随着老年人口的增长、免疫抑制病人增多、侵入性治疗检查的增加、微生物抗药性增加,目前败血症的病例数呈上升趋势,且尽管至今医药发达,严重败血症的死亡率仍然高达百分之三十至四十左右。
因此,综上所述,因应败血症的高发生率及高死亡率,且基于现代人生活水平提高且对于保健概念提高,研发一种能方便又有效于前端减缓病原引发的免疫反应或抑制发炎反应的有效成分的组合物,着实有其必要性。
发明内容
本发明的一目的在提供一种戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii)的脂多醣(Lipopolysaccharides)用于制备抑制发炎反应的医药组合物的用途。
在本发明的一实施例中,该戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制周边血液单核细胞的免疫反应,且该戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制该周边血液单核细胞分泌细胞因子。
在本发明的一实施例中,该戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制巨噬细胞的免疫反应,且该戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制该巨噬细胞分泌细胞因子。
在本发明的一实施例中,该戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制B细胞的免疫反应,且该戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制该B细胞进行分化、及/或分泌细胞因子。
在本发明的一实施例中,该发炎反应是由病原性脂多醣所诱导产生的,且该病原性脂多醣是来自大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)。
在本发明的一实施例中,该戈氏副拟杆菌的寄存编号为DSM 32939。
利用本发明实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣于抑制发炎反应时,可以口服方式给药。其给药时可与一般食物一同食用,因此制备包含戈氏副拟杆菌的脂多醣的医药组合物时,该医药组合物可进一步包括蛋白质、单醣、双醣、寡醣、多醣、碳水化合物、胺基酸、脂质、维他命或其任意组合的成分,且该医药组合物进一步包括医药学上可接受的赋形剂、载剂、辅剂及/或食品添加剂。
此外,于制备包含本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣的医药组合物时,亦可进一步加入所属技术领域所熟知的载剂或其他辅剂。而其剂型,可为但不限于喷雾气体、溶液、半固态、固态、明胶胶囊、软胶囊、锭剂、口含片、咀嚼胶(chewing gum)及/或冷冻干燥粉末制剂,以便于将本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣传递至肠道及/或部分或全部作用于个体内。同时,本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣或包含其他成分的医药组合物,亦可添加于食品、保健食品或膳食补充品。
本发明实施例所提供一种戈氏副拟杆菌的脂多醣用于制备抑制发炎反应的医药组合物的用途;本发明的戈氏副拟杆菌中,能够找到与已知在大肠杆菌中合成脂质A相关的LpxA基因、LpxC基因、LpxD基因、LpxH基因、LpxB基因、LpxK基因、KdtA基因、及LpxL基因相对应的直系同源基因的序列位置,但并无法找到与LpxM基因相对应的直系同源基因,但其该些基因的同一性相较于大肠杆菌MG1655菌株以及拟杆菌DSM17855菌株皆偏低;本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣不会刺激周边血液单核细胞分泌介白素-1β、不会刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α、亦不会诱导初始B表现CD86及CD19的表面抗原蛋白,即B细胞被诱导分化,显示本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣不会引起周边血液单核细胞、巨噬细胞、或B细胞产生免疫反应,即其对个体具有低内毒性;再者,本发明戈氏副拟杆菌能够抑制人类周边血液单核细胞、巨噬细胞、或B细胞中,由大肠杆菌的脂多醣所诱导的免疫反应,具有于周边血液单核细胞、巨噬细胞、或B细胞抗发炎的活性,具有免疫抑制能力;因此,本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣可应用于抑制免疫反应以及相关医药组合物的制备,特别是可抑制由病原性脂多醣所引发的发炎反应。
以下将进一步说明本发明的实施方式,下述所列举的实施例是用以阐明本发明,并非用以限定本发明的范围,任何熟习此技艺者,在不脱离本发明的精神和范围内,当可做些许更动与润饰,因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。
附图说明
图1A是大肠杆菌中Kdo2-脂质的生化合成路径的反应式;
图1B是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌的BLAST分析比对结果;
图2A是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣单独不触发周边血液单核细胞免疫反应的折线图;
图2B是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣抑制周边血液单核细胞的发炎反应的柱形图。;
图3A是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣单独不触发巨噬细胞免疫反应的折线图;
图3B是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣抑制巨噬细胞的发炎反应的柱形图;**p值<0.01;
图4A是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣单独不触发B细胞免疫反应的流式细胞仪分析结果图;
图4B是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣抑制B细胞的发炎反应的流式细胞仪分析结果图;
图4C是本发明的一实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣于B细胞的抑制发炎反应的柱形图。
具体实施方式
使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示,各组之间的差异以单变量变异数分析(One-way ANOVA)进行统计分析。
本文中所使用数值为近似值,所有实验数据皆表示在20%的范围内,较佳为在10%的范围内,最佳为在5%的范围内。
本申请中涉及的戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii)是一种已经保藏的菌种,本申请仅是对于该菌种产生的脂多糖进行研究。
依据本发明,医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型,这包括,但不限于:注射品(injection)[例如,无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。
依据本发明,医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如,该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂:溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明,该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂:水、生理盐水(normal saline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。
依据本发明,该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药:皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。
定义
本文所述的「有效剂量」是表示能抑制哺乳动物或人类周边血液单核细胞、巨噬细胞、或B细胞中,由病原性脂多醣所引起的免疫反应及/或发炎反应,尤其是由大肠杆菌的脂多醣所引起的免疫反应及/或发炎反应所需戈氏副拟杆菌的脂多醣数量,以抑制哺乳动物或人类产生的发炎反应。有效剂量依所抑制或治疗的生物种类或个体差异而可能不同,但可藉由例如剂量递增试验(dose escalation)以实验决定其有效剂量。
依据本发明,有关细菌培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明,有关周边血液单核细胞、巨噬细胞、及B细胞培养的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明,有关分离纯化人类周边血液单核细胞的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明,有关分离纯化B细胞及诱发B细胞分化的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明,有关脂多醣纯化的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明,有关流式细胞仪(Flow cytometer)的操作程序与参数条件等是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
如本文中所使用的,用语「细菌成分」意为培养细菌时,该菌直接或间接相关的衍生物质,包括但不限于该细菌的代谢产物、该细菌的结构、细菌相关活性及非活性成分等。
戈氏副拟杆菌菌株
本发明实施例中所用的戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii,P.goldsteinii)MTS01是一种益生菌株(Probiotic bacteria),尤其是该戈氏副拟杆菌的脂多醣(Lipopolysaccharides,LPS)能改善由大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)的脂多醣所导致个体的发炎病症。该戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii)是寄存于DSMZ-德国微生物菌种保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen,DSMZ);2018年10月29日;编号DSM32939;以及寄存于食品工业发展研究所;2019年2月15日;编号BCRC 910869。戈氏副拟杆菌为绝对厌氧细菌,需于37℃的无氧培养箱培养约48小时;其中,该系统包含10%的二氧化碳、10%的氢气、及80%的氮气。该菌的液态培养液为NIH thioglycollate broth(TGC II)(购自BD,美国,编号为225710),固态培养基则为Anaerobic blood agar plate(Ana.BAP)(购自启新生物科技公司,中国台湾)。该菌长期保存于-80℃冰箱,保护液为25%的甘油,无须特殊降温处理,且可经由冷冻干燥进行保存,以稳定其活性。
本发明的实施例中经由细胞实验证实本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣能够分别有效地抑制由病原性大肠杆菌的脂多醣,所导致的周边血液单核细胞中介白素-1β(IL-1β)分泌量上升、巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌量上升、及初始B细胞表现CD86及CD19的表面抗原蛋白等现象,显示本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣于周边血液单核细胞、巨噬细胞、或B细胞,具有抑制发炎反应的功效,具有免疫抑制能力,特别是可抑制由病原性脂多醣所引发的发炎反应;此显示本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣可应用于抑制免疫反应以及相关医药组合物的制备。
益生菌株(Probiotic或Probiotic bacteria)是一微生物,其菌体、混合菌株、萃取物或代谢产物对于宿主本身是具有正面影响,通常源自于人体内、有益于肠道健康的活菌,亦可指外来补充、对身体可能有益的某些微生物;其中,该益生菌株的代谢产物为培养该益生菌株时,经该细菌代谢后所分泌至细菌培养液中的物质,包含培养该菌的培养液等。
本发明提供一种戈氏副拟杆菌的脂多醣用于制备抑制发炎反应的组合物的用途。同时,本发明的亦提供一种用于抑制发炎反应的组合物,包含戈氏副拟杆菌的脂多醣、及医药上可接受的载体,且该组合物是食品、饮品、营养补充剂、保养品、或医药品。
以下将详细说明本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣的特征分析与比较、分离纯化本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣的方法与步骤、本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣于周边血液单核细胞的抗发炎活性的测试实验、本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣于巨噬细胞的抗发炎活性的测试实验、及本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣于B细胞的抗发炎活性的测试实验。
实施例1戈氏副拟杆菌的脂多醣的特征分析与比较
本发明的一实施例为了进行戈氏副拟杆菌MTS01脂多醣的特征分析与比较;首先,针对戈氏副拟杆菌MTS01全基因组进行BLAST搜索,以鉴定戈氏副拟杆菌MTS01中,负责生物合成脂质A的候选基因;其中,Blast(Basic Local Alignment Search Tool)是一种用来比对生物序列的一级结构(例如不同蛋白质的氨基酸序列或不同基因的DNA序列)的算法,主要是通过与一个已知包含若干序列的数据库中的信息进行比较,BLAST是用于寻找与待分析的序列相同或类似的已存在序列,藉以预测其功效或角色等的工具,其是于KEGG与NCBI-NR的数据数据库中进行搜索。
本实施例中,该BLAST搜索是以大肠杆菌MG1655菌株(Genome accession number:U00096)与商用习知惯用的拟杆菌(Bacteroides dorei,B.dorei)DSM17855菌株中,与负责生物合成脂质A相关的基因,作为比较的基准点;其中,图1A是Kdo2-脂质A(Kdo2-lipid A)在大肠杆菌中的生物合成路径,即Raetz pathway,如图1A所示,由尿苷二磷酸-N-乙酰胺基葡萄糖(Uridine diphosphate N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)作为反应的起始物,并透过LpxA、LpxC、LpxD、LpxH、LpxB、LpxK、及KdtA共七个酵素合成一大肠杆菌脂质A的初级产物,再分别透过LpxL及LpxM二个酵素,将第五与第六个酰基链添加到该初级产物,并完成大肠杆菌的脂质A,即图1A中Kdo2-脂质A;其中,已知大肠杆菌的脂质A通常具有六个酰基链;细菌的脂多醣主要由脂质A(Lipid A)、核心多糖(Core oligo-saccharide)、及多糖链(Opoly-saccharide或O antigen)三个部分索组成;其中,脂质A为脂多醣的主要毒性来源,其主要功能为协助脂多醣固定在细菌的细胞膜上。
因此,以大肠杆菌中,LpxA、LpxC、LpxD、LpxH、LpxB、LpxK、KdtA、LpxL、及LpxM共九个,与Kdo2-脂质A合成相关的基因进行BLAST分析,并以与本发明戈氏副拟杆菌同菌属的拟杆菌DSM17855菌株,同时与Kdo2-脂质A合成相关的基因进行BLAST分析,以作为另一比较组。
BLAST分析比对结果如图1B所示,其中最左栏是本发明戈氏副拟杆菌MTS01中可能与其脂质A合成相关的推定基因,中间栏为大肠杆菌MG1655菌株与该些推定基因的同一性(Identity)及E value;最右栏则为拟杆菌DSM17855菌株与该些推定基因的同一性及Evalue。由图1B所示,该分析比较结果指出在本发明戈氏副拟杆菌MTS01中,能够找到与LpxA、LpxC、LpxD、LpxH、LpxB、LpxK、KdtA、及LpxL相对应的直系同源(Ortholog)基因的序列位置,其中并无法找到与LpxM相对应的直系同源基因,且拟杆菌DSM17855菌株具有相同的现象结果。根据先前研究,已知戈氏副拟杆菌与同菌属的细菌,例如多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、拟杆菌(Bacteroides dorei)、或松脆杆菌(Bacteroides fragilis),其脂质A皆是五酰化(penta-acylated)而非六酰化(Hexa-acylated),其中如前所述LpxM是添加第六个酰基链于脂质A上的酵素,因此该BLAST分析结果与该先前研究结果相符合。
由先前文献亦可得知拟菌属的脂多醣间具有异质性,而图1B中亦可见本发明的戈氏副拟杆菌MTS01与同菌属的拟杆菌DSM17855菌株,在该八个相对应的直系同源基因中,同一性并不高,因此该BLAST分析结果与该先前研究结果亦相符合。
实施例2戈氏副拟杆菌抑制周边血液单核细胞的发炎反应的功效
本发明的一实施例为进行戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣抑制周边血液单核细胞的发炎反应的活性测试。然而,因为脂多醣位于细菌的细胞膜上,若要探讨脂多醣对抗发炎的直接功效,须先将脂多醣自戈氏副拟杆菌MTS01细胞中进行分离与纯化。
本发明实施例中使用RNA分离试剂(即Tri-Reagent)纯化方法,将脂多醣从整个戈氏副拟杆菌MTS01细胞中分离出来。首先,将戈氏副拟杆菌MTS01细胞悬浮在足够量的Tri-Reagent中,接着将该悬浮液于室温下作用十五分钟,以使细胞完全均质化。接着,于该作用溶液中加入1/10体积的氯仿,以产生分离相,并将该混合物剧烈晃动混合后,于室温下再作用十分钟。再将所得混合物于12000g下,离心10分钟以分离水相及有机相,其中将水相溶液转移至新的1.5mL离心管中,并将蒸馏水添加至有机相中,再重复两次前述剧烈摇晃混合、作用十分钟、离心、及收集水相溶液的步骤,以确保完全收集混合物中的脂多醣。将该些水相溶液合并后进行真空干燥,并将该分离纯化而得的粗Tri-Reagent脂多醣,溶解于0.375M氯化镁(Magnesium chloride,溶解于95%乙醇中,并保存于-20℃)中,接着于12000g下离心15分钟后,将上清液移除并将沉淀物重新悬浮在蒸馏水中并进行冷冻干燥,以得到蓬松的白色固体,即为本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣。
使用市售的RNA分离试剂,即能够快速且方便地自少量的细菌细胞中,分离纯化出脂多醣、或脂质A(Lipid A)。且此种分离纯化方法并不需要专属的分离纯化设备,而且也早已被用于处理相对大量的样品纯化中。市售商业化的RNA分离试剂中主要功效成分为Tri-Reagent(即为Trizol reagent),其是溶于水溶液中的酚(Phenol)和硫氰酸胍(Guanidinium thiocyanate)。细菌的细胞膜可直接被Tri-Reagent中的硫氰酸胍破坏,因此不需要以物理性(例如法式压碎机即French press)或加热的方式以打破细菌的细胞膜,且使用Tri-Reagent进行纯化分离的脂多醣或脂质A的纯度较习知手段为高,所产生的脂多醣或脂质A产物中,游离磷酸盐污染亦较习知手段为低。
本发明实施例中所使用的周边血液单核细胞,是分离自人类血液的人类周边血液单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC);其中,该人类周边血液单核细胞是透过SepMateTM人类周边血液单核细胞分离管(SepMateTMPBMC isolation tube,购自STEMCELL Technologies Inc.,加拿大)进行分离,并以每孔2x106个细胞的数量培养于24孔培养盘中;其中,人类周边血单核细胞由淋巴细胞(Lymphocytes)、单核细胞(Monocytes)、及粒细胞(Granulocytes)组成。
为先初步了解本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对周边血液单核细胞的免疫调节特性,首先进行测试单独以本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣刺激周边血液单核细胞的影响实验。以上述方法培养人类周边血液单核细胞,再分别于不同孔格中加入0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL、或100000ng/mL前述本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣,并以相同浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作为负控制组,将人类周边血液单核细胞于37℃下作用24小时后,分别取出相同体积的细胞培养上清液,再以酵素免疫分析仪(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析各组中介白素-1β(Interlukin-1β,IL-1β)的分泌量;其中,大肠杆菌O111:B4菌株(购自Sigma,美国)的脂多醣是以相同方法分离纯化所得,已知大肠杆菌O111:B4菌株为一种病原性大肠杆菌菌株,且其脂多醣会诱导个体产生发炎反应。
本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣单独对周边血液单核细胞的影响的测试结果如图2A所示。由图2A可见,单独以不同浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用后,人类周边血液单核细胞分泌介白素-1β的量皆在2000ng/mL以上,即病原性大肠杆菌的脂多醣能使周边血液单核细胞分泌细胞因子以诱导免疫反应,显示此实验方法确实能用以观察脂多醣对周边血液单核细胞的免疫调节特性;而单独以不同浓度的本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣作用后,人类周边血液单核细胞分泌介白素-1β的量,皆明显地低于以不同浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用的细胞组别;由此结果可得知本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣几乎不会刺激周边血液单核细胞分泌介白素-1β,即不会诱导周边血液单核细胞产生免疫反应,可知本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对个体具有低内毒性(Endo-toxicity)。
接着为更加了解本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对周边血液单核细胞的免疫调节特性,进一步进行本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣于周边血液单核细胞的抗发炎活性的测试。首先,以上述方法培养人类周边血液单核细胞,再分别于不同孔格中,加入大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣与本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣以1:0、1:1、1:10、或1:100体积比例(ng/mL)混合的样品,并将人类周边血液单核细胞于37℃下作用24小时后,分别取出相同体积的细胞培养上清液,再以酵素免疫分析仪分析各组中介白素-1β的分泌量;其中,各组样品是以0.1ng/mL大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣为基准值。
本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣抑制周边血液单核细胞的的发炎反应的活性测试结果如图2B所示。由图2B可见,经1:10或1:100体积比例(ng/mL)混合的样品作用后,人类周边血液单核细胞分泌介白素-1β的量,皆明显地低于仅经大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用、或经1:1体积比例(ng/mL)混合的样品作用的结果;由此结果可得知,本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣能够抑制人类周边血液单核细胞中,由大肠杆菌的脂多醣所诱导的免疫反应,具有抑制周边血液单核细胞发炎反应的活性。
实施例3戈氏副拟杆菌抑制巨噬细胞的发炎反应的功效
本发明的一实施例为进行戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣抑制巨噬细胞的发炎反应的活性测试;其中,本发明实施例中所使用的巨噬细胞,是小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株(Murine macrophage RAW264.7 cell line),该小鼠巨噬细胞是购自美国典型培养物保藏中心细胞编号为TIB-71TM,该巨噬细胞且是培养于含有10%的胎牛血清、及1%抗生素-抗真菌药(Antibiotic-antimycotic,购自Thermo Fisher Scientific,美国)的DMEM细胞培养液(Dulbecco's Modified Eagle Medium,购自Gibco,美国,编号为12100-046)中,并以每孔5x105个细胞的数量置于24孔培养盘中,并于37℃含有5%二氧化碳的培养箱中培养24小时,使巨噬细胞贴附在培养盘底部。
为先初步了解本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对巨噬细胞的免疫调节特性,首先进行测试单独以本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣刺激巨噬细胞的影响实验。以上述方法培养小鼠巨噬细胞,使其贴附于培养盘底后,再分别于不同孔格中加入0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL、10000ng/mL、或100000ng/mL前述本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣,并以相同浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作为负控制组,将小鼠巨噬细胞胞于37℃下作用24小时后,分别取出相同体积的细胞培养上清液,再以酵素免疫分析仪分析各组中肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α,TNF-alpha)的分泌量;其中,每组进行五重复,并以单变量变异数分析进行统计分析,各组数值以±标准偏差表示(*p<0.05;**p<0.01)。
本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣单独对巨噬细胞的影响的测试结果如图3A所示。由图3A可见,单独以不同浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用后,小鼠巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α的量,会随着添加浓度上升而增加,即病原性大肠杆菌的脂多醣能使巨噬细胞分泌细胞因子以诱导免疫反应,显示此实验方法确实能用以观察脂多醣对巨噬细胞的免疫调节特性;而单独以不同浓度的本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣作用后,小鼠巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α的量,皆趋近于零且皆明显地低于以不同浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用的细胞组别;由此结果可得知本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣不会刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α,即不会诱导巨噬细胞产生免疫反应,可知本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对个体具有低内毒性(Endo-toxicity)。
接着为更加了解本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对巨噬细胞的免疫调节特性,进一步进行本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣于巨噬细胞的抗发炎活性的测试。首先,以上述方法培养小鼠巨噬细胞,使其贴附于培养盘底后,再分别于不同孔格中,加入大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣与本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣以1:0、1:1、1:10、1:100、1:1000、或1:10000体积比例(ng/mL)混合的样品,并将小鼠巨噬细胞于37℃下作用24小时后,分别取出相同体积的细胞培养上清液,再以酵素免疫分析仪分析各组中肿瘤坏死因子-α的分泌量;其中,各组样品是以1ng/mL大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣为基准值;且每组进行五重复,并以单变量变异数分析进行统计分析,各组数值以±标准偏差表示(*p<0.05;**p<0.01)。
本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣抑制巨噬细胞的发炎反应的活性测试结果如图3B所示。由图3B可见,经1:1或1:10体积比例(ng/mL)混合的样品作用后,小鼠巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α的量,皆低于仅经大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用的结果;而经1:100、1:1000、或1:10000体积比例(ng/mL)混合的样品作用后,小鼠巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α的量,皆显著地低于仅经大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用的结果;由此些结果可得知,本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣能够抑制巨噬细胞中,由大肠杆菌的脂多醣所诱导的免疫反应,具有于巨噬细胞抗发炎的活性,即本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣具有免疫抑制(Immunoinhibitory)能力,为改善大肠杆菌诱导发炎反应的潜力因子。
实施例4戈氏副拟杆菌抑制B细胞的发炎反应的功效
本发明的一实施例为进行戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣抑制B细胞的发炎反应的活性测试,以初始B细胞(B cells)进行实验;其中,该初始B细胞是以EasySepTM小鼠B细胞分离试剂套组(EasySepTM mouse B cell isolation kit,购自StemcellTechnologies,英国),分离纯化自未经免疫诱导小鼠的脾脏单细胞(Spleen singlecells),并透过流式细胞仪(Flow cytometry,FACSAria,BD,美国)分析及确认该分离的初始B细胞的回收率及纯度;其中,将该经分离纯化的初始B细胞以4x107个细胞/mL的浓度重新悬浮于流式细胞仪染色缓冲溶液(Flow cytometry staining buffer,含有0.1胎牛血清的磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered saline buffer,PBS buffer)中,并以5(6)-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidylester,CFDA-SE,购自Molecular Probes,美国)进行初始B细胞的染色,其中是添加终浓度为5μM的CFDA-SE于37℃下作用10分钟进行染色,分析结束后,立即以冷的流式细胞仪染色缓冲液清洗该初始B细胞三次,并将该初始B细胞重新悬浮于细胞培养液中后,以每孔2x106个细胞/mL的浓度培养于24孔培养盘中。
根据先前研究结果已知初始B细胞经脂多醣进行免疫诱导后,会促使初始B细胞进行抗原呈现的免疫反应,而CD86与CD19是B细胞专有的抗原呈现蛋白质,且CD86与CD19仅有在初始B细胞分化后才会表现,因此若初始B细胞产生免疫反应表面抗原CD86与CD19蛋白质的表现量会增加,并会促使初始B细胞分化成浆细胞,而浆细胞为分泌抗体的主要细胞,且其细胞体积显著的大于初始B细胞,另外B细胞若产生免疫反应亦会增加肿瘤坏死因子-α的分泌量。
为先初步了解本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对B细胞的免疫调节特性,首先进行测试单独以本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣刺激B细胞的影响实验。以上述方法分离纯化初始B细胞并进行体外培养后,再分别于不同孔格中加入100ng/mL、1000ng/mL、或10000ng/mL浓度的前述本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣,并分别以100ng/mL、1000ng/mL、或10000ng/mL浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作为负控制组,接着将B细胞于37℃下作用48小时后,分别以流式细胞仪分析经免疫诱导后,B细胞的大小、及表面抗原CD86与CD19的表现量,并同时取出相同体积的细胞培养上清液,再以酵素免疫分析仪分析各组经免疫诱导后的B细胞的肿瘤坏死因子-α分泌量。
本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣单独对B细胞的影响的测试结果如图4A至图4C所示。由图4A可见,初始B细胞单独以100ng/mL、1000ng/mL、及10000ng/mL浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用后,所测得B细胞的大小以及表面抗原CD86的表现量,皆会随着添加浓度上升而增加;而由图4B及4C可见,初始B细胞单独以1000ng/mL的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用后,共有68.8%的B细胞表现CD86的表面抗原蛋白质,且共有35.9%的B细胞表现CD19的表面抗原蛋白质,而肿瘤坏死因子-α的分泌量约为33ng/mL,此些结果显示病原性大肠杆菌的脂多醣确实会诱导初始B细胞产生免疫反应,显示此实验方法确实能用以观察脂多醣对B细胞的免疫调节特性。
由图4A可见,初始B细胞单独以100ng/mL、1000ng/mL、及10000ng/mL浓度的本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣作用后,所测得B细胞的大小以及表面抗原CD86的表现量,皆几乎未改变且皆明显地小于及少于以100ng/mL、1000ng/mL、及10000ng/mL浓度的大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣作用的细胞组别;而由图4B及4C可见,初始B细胞仅经1000ng/mL或10000ng/mL的本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣作用后,分别仅有2.8%及3.5%的B细胞表现CD86的表面抗原蛋白质,且分别仅有0.2%及0.4%的B细胞表现CD19的表面抗原蛋白质,而肿瘤坏死因子-α的分泌量趋近于零,该些数值皆与未经任何脂多醣作用的细胞相似;由此些结果可得知,本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣不会诱导初始B细胞分化及分泌细胞因子,可知本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对个体具有低内毒性(Endo-toxicity),且本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣确实不会诱导初始B细胞产生免疫反应。
接着为更加了解本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣对B细胞的免疫调节特性,进一步进行本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣抑制B细胞的发炎反应的活性测试。首先,以上述方法分离纯化初始B细胞并进行体外培养后,再分别于不同孔格中,加入大肠杆菌O111:B4菌株的脂多醣与本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣以1000:1000或1000:10000体积比例(ng/mL)混合的样品,并将B细胞于37℃下作用48小时后,分别取出相同体积的细胞培养上清液,再以酵素免疫分析仪分析各组经免疫诱导后,B细胞的肿瘤坏死因子-α分泌量,并同时以流式细胞仪分析经免疫诱导后,B细胞表面抗原CD86及CD19的表现量。
本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣抑制B细胞的发炎反应的活性测试结果如图4B及4C所示。由图4B及4C可见,初始B细胞经1000:1000或1000:10000体积比例(ng/mL)混合的样品作用后,分别共有41.7%或62.4%的B细胞表现CD86的表面抗原蛋白质,且分别共有18.6%或30.4%的B细胞表现CD19的表面抗原蛋白质,而肿瘤坏死因子-α的分泌量则分别约为20ng/mL或36ng/mL;其中,以1000:1000体积比例(ng/mL)混合的样品抑制功效,较以1000:10000体积比例(ng/mL)混合的样品为佳;综合以上结果可得知,本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣能够抑制由大肠杆菌的脂多醣所诱导产生的B细胞的免疫反应,显示本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣具有于B细胞抗发炎的活性。
利用本发明实施例的戈氏副拟杆菌的脂多醣于抑制发炎反应时,可以口服方式给药。其给药时可与一般食物一同食用,因此制备包含戈氏副拟杆菌的脂多醣的医药组合物时,该医药组合物可进一步包括蛋白质、单醣、双醣、寡醣、多醣、碳水化合物、胺基酸、脂质、维他命或其任意组合的成分,且该医药组合物进一步包括一医药学上可接受的赋形剂、载剂、辅剂及/或食品添加剂。
此外,于制备包含本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣的医药组合物时,亦可进一步加入所属技术领域所熟知的载剂或其他辅剂。而其剂型,可为但不限于喷雾气体、溶液、半固态、固态、明胶胶囊、软胶囊、锭剂、口含片、咀嚼胶及/或冷冻干燥粉末制剂,以便于将本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣传递至肠道及/或部分或全部作用于个体内。同时,本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣或包含其他成分的医药组合物,亦可添加于食品、保健食品或膳食补充品中。
藉由上述试验可知,本发明实施例所提供一种戈氏副拟杆菌的脂多醣用于制备抑制发炎反应的医药组合物的用途;本发明的戈氏副拟杆菌中,能够找到与已知在大肠杆菌中合成脂质A相关的LpxA基因、LpxC基因、LpxD基因、LpxH基因、LpxB基因、LpxK基因、KdtA基因、及LpxL基因相对应的直系同源基因的序列位置,但并无法找到与LpxM基因相对应的直系同源基因,但其该些基因的同一性相较于大肠杆菌MG1655菌株以及拟杆菌DSM17855菌株皆偏低;本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣不会刺激周边血液单核细胞分泌介白素-1β、不会刺激巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α、亦不会诱导初始B表现CD86及CD19的表面抗原蛋白,即B细胞被诱导分化,显示本发明戈氏副拟杆菌MTS01的脂多醣不会引起周边血液单核细胞、巨噬细胞、或B细胞产生免疫反应,即其对个体具有低内毒性;再者,本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣能够抑制人类周边血液单核细胞、巨噬细胞、或B细胞中,由大肠杆菌的脂多醣所诱导的免疫反应,具有于周边血液单核细胞、巨噬细胞、或B细胞抗发炎的活性,具有免疫抑制能力;因此,本发明戈氏副拟杆菌的脂多醣可应用于抑制发炎反应以及相关医药组合物的制备,特别是可抑制由病原性脂多醣所引发的发炎反应。
【生物材料寄存】
戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii),寄存于DSMZ-德国微生物菌种保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ);地址:德国布伦瑞克市38124因霍芬大街7B;2018年10月29日;编号DSM 32939。
Claims (10)
1.一种戈氏副拟杆菌(Parabacteroides goldsteinii)的脂多醣作为单一的活性成分用于制备抑制发炎反应的医药组合物的用途,所述发炎反应是由病原性脂多醣所诱导产生。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制周边血液单核细胞、巨噬细胞、及/或B细胞的免疫反应。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制该周边血液单核细胞、及/或该巨噬细胞分泌细胞因子。
4.根据权利要求2所述的用途,其特征在于戈氏副拟杆菌的脂多醣是抑制该B细胞进行分化、及/或分泌细胞因子。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于病原性脂多醣是来自大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于戈氏副拟杆菌的寄存编号为DSM 32939。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于医药组合物进一步包括医药学上可接受的赋形剂、医药学上可接受的载剂及/或医药学上可接受的食品添加剂。
8.根据权利要求1所述的用途,其特征在于医药组合物的剂型是喷雾气体、溶液、半固态及/或固态。
9.根据权利要求8所述的用途,其特征在于医药组合物的剂型是软胶囊、锭剂、口含片、咀嚼胶及/或冷冻干燥粉末制剂。
10.根据权利要求8所述的用途,其特征在于医药组合物的剂型是明胶胶囊。
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