TW202403039A - 約氏乳桿菌以及其或其代謝產物用於提升油脂不飽和度的用途 - Google Patents

約氏乳桿菌以及其或其代謝產物用於提升油脂不飽和度的用途 Download PDF

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Abstract

一種約氏乳桿菌，此約氏乳桿菌為 Lactobacillus johnsoniiTCI369，寄存編號BCRC 911071。一種約氏乳桿菌或其代謝產物用於製備提升油脂不飽和度之組合物的用途，此約氏乳桿菌為 Lactobacillus johnsoniiTCI369，寄存編號BCRC 911071。

Description

約氏乳桿菌以及其或其代謝產物用於提升油脂不飽和度的用途
本發明關於一種約氏乳桿菌，特別是涉及一種約氏乳桿菌以及其或其代謝產物用於提升油脂不飽和度的用途。
脂肪酸可以分為「飽和脂肪酸」和「不飽和脂肪酸」，飽和脂肪酸容易導致心血管疾病，而人體所需的必需脂肪酸，都屬於不飽和脂肪酸，例如Omega-3或Omega-6脂肪酸。
為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出具有科學依據且高效的益生菌產品，以造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明提供一種約氏乳桿菌（ Lactobacillus johnsonii）以及其或其代謝產物用於提升油脂不飽和度的用途。
在一些實施例中，一種約氏乳桿菌，此約氏乳桿菌為 Lactobacillus johnsoniiTCI369，寄存編號BCRC 911071。
在一些實施例中，一種約氏乳桿菌或其代謝產物用於製備提升油脂不飽和度之組合物的用途，此約氏乳桿菌為 Lactobacillus johnsoniiTCI369，寄存編號BCRC 911071。
在一些實施例中，約氏乳桿菌用以分解脂肪或代謝膽固醇。
在一些實施例中，約氏乳桿菌用以降低三酸甘油酯。
在一些實施例中，約氏乳桿菌用以降低低密度脂蛋白或增加高密度脂蛋白。
在一些實施例中，約氏乳桿菌用以調節腸道菌相平衡。
在一些實施例中，約氏乳桿菌用以改善腸道屏障。
在一些實施例中，約氏乳桿菌用以抵抗紫外光。
在一些實施例中，約氏乳桿菌用以保護眼睛。
綜上，任一實施例的約氏乳桿菌，其能提升油脂不飽和度。換言之，任一實施例的約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備提升油脂不飽和度的組合物。換言之，前述之組合物具有提升油脂不飽和度的功能。在一些實施例中，約氏乳桿菌、其代謝產物或其所製得的組合物還具有下列一種或多種功能：分解脂肪、代謝膽固醇、降低三酸甘油酯、降低低密度脂蛋白、增加高密度脂蛋白、調節腸道菌相平衡、改善腸道屏障、抵抗紫外光及保護眼睛。
於本文中，在提及含量時所使用的含量單位「%」通常是指重量百分比。
在一些實施例中，一種約氏乳桿菌（ Lactobacillus johnsonii），其為 Lactobacillus johnsoniiTCI369。約氏乳桿菌TCI369以寄存編號BCRC 911071寄存於財團法人食品工業發展研究所，以及寄存編號DSM 34008寄存於德國微生物菌種保藏中心。
在一些實施例中，前述的約氏乳桿菌TCI369分離自中國臥龍潭的潭水。
在一些實施例中，前述的約氏乳桿菌或其代謝產物具有提升油脂不飽和度的能力。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備提升油脂不飽和度之組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有分解脂肪的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能分解此個體的脂肪。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備分解脂肪的組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有代謝膽固醇的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能代謝此個體的膽固醇。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備代謝膽固醇的組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有降低三酸甘油酯的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能降低此個體的三酸甘油酯。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備降低三酸甘油酯的組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有降低低密度脂蛋白的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能降低此個體的低密度脂蛋白。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備降低低密度脂蛋白的組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有增加高密度脂蛋白的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能增加此個體的高密度脂蛋白。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備增加高密度脂蛋白的組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有調節腸道菌相平衡的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能調節此個體腸道的菌相平衡。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備調節腸道菌相平衡的組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有改善腸道屏障的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能改善此個體腸道的屏障。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備改善腸道屏障的組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有抵抗紫外光的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能幫助此個體抵抗紫外光。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備抵抗紫外光的組合物。
在一些實施例中，約氏乳桿菌或其代謝產物具有保護眼睛的能力。換言之，約氏乳桿菌或其代謝產物施予一個體時能保護此個體的眼睛。因此，約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備保護眼睛的組合物。
在一些實施例中，前述的約氏乳桿菌係以菌粉的形式包含於前述的組合物。
在一些實施例中，前述的約氏乳桿菌係以活菌或是死菌的形式包含於前述的組合物。
在一些實施例中，前述的約氏乳桿菌的有效劑量係100 mg/天。
在一些實施例中，前述的個體可為人。
在一些實施例中，前述的組合物可為醫藥組合物、或非醫療目的的食用組合物。
在一些實施例中，當前述的組合物為醫藥組合物時，此醫藥組合物包含有效劑量的約氏乳桿菌。其中，此醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服地（orally）、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。
在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）（例如，無菌的水性溶液（sterile aqueous solution）或分散液（dispersion））、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。
在一些實施例中，注射品的投藥方式可為，但不限於，腹膜內注射（intraperitoneal injection）、皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）、肌肉內注射（intramuscular injection）、靜脈內注射（intravenous injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，含有效劑量的約氏乳桿菌的醫藥組合物可進一步包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑（excipient）、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。其中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）或含有醇的水性溶液（alcohol containing aqueous solution）。
在一些實施例中，含有有效劑量的約氏乳桿菌的醫藥組合物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑（external preparation），這包括，但不限於：乳劑（emulsion）、凝膠（gel）、軟膏（ointment）、乳霜（cream）、貼片（patch）、擦劑（liniment）、粉末（powder）、氣溶膠（aerosol）、噴霧（spray）、乳液（lotion）、乳漿（serum）、糊劑（paste）、泡沫（foam）、滴劑（drop）、懸浮液（suspension）、油膏（salve）以及繃帶（bandage）。
在一些實施例中，當前述的醫藥組合物為外部製劑時，此醫藥組合物可由有效劑量的約氏乳桿菌與為熟習此項技藝者所詳知的一基底（base）相混合而製成。
在一些實施例中，此基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑（additives）：水、醇（alcohols）、甘醇（glycol）、碳氫化合物（hydrocarbons）（諸如石油膠（petroleum, jelly）以及白凡士林（white petrolatum））、蠟（wax）（諸如石蠟（paraffin）以及黃蠟（yellow wax））、保存劑（preserving agents）、抗氧化劑（antioxidants）、界面活性劑（surfactants）、吸收增強劑（absorption enhancers）、安定劑（stabilizing agents）、膠凝劑（gelling agents）（諸如卡波普®974P （carbopol®974P）、微結晶纖維素（microcrystalline cellulose）以及羧基甲基纖維素（carboxymethylcellulose））、活性劑（active agents）、保濕劑（humectants）、氣味吸收劑（odor absorbers）、香料（fragrances）、pH調整劑（pH adjusting agents）、螯合劑（chelating agents）、乳化劑（emulsifiers）、閉塞劑（occlusive agents）、軟化劑（emollients）、增稠劑（thickeners）、助溶劑（solubilizing agents）、滲透增強劑（penetration enhancers）、抗刺激劑（anti-irritants）、著色劑（colorants）以及推進劑（propellants）等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，當前述的組合物為非醫療目的的食用組合物時，此食用組合物包含有效劑量的約氏乳桿菌。其中，此食用組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。
在一些實施例中，含有約氏乳桿菌的食用組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。
在一些實施例中，含有約氏乳桿菌的食用組合物可為飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培食品（bakery products）、健康食品（health foods）或膳食補充品（dietary supplements）等。在一些實施例中，含有約氏乳桿菌的食用組合物可更包括一佐劑。舉例來說，佐劑可為麥芽糖糊精（Maltodextrin）、蘋果酸、蔗糖素、檸檬酸、水果香料、蜂蜜香料、甜菊糖苷或其組合等。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
在一些實施例中，食品添加物可為調味料、甜味料、香料、pH值調整劑、乳化劑、著色料或穩定劑等。
下列範例中若無特別敘明，所進行的實驗步驟是在室溫（約25 ℃）且常壓（1 atm）下進行。
例一：菌種鑑定
將分離自中國臥龍潭潭水的分離菌株進行菌種鑑定。將所分離的菌株的16S核醣體基因（16S rRNA）先行轉錄成互補DNA（cDNA）後，透過16S核醣體基因引子組合（如表一所示）以及聚合酶連鎖反應（PCR）得到此分離菌株的PCR產物後，以Sanger sequencing方式進行定序，以得到16S核醣體基因序列（即SEQ ID NO:3）。接著，將SEQ ID NO:3序列以美國國家生物技術資訊中心（NCBI）網站與其他約氏乳桿菌之16S核醣體基因序列進行比對後可知，此分離菌株的16S核醣體基因序列與其他約氏乳桿菌（ Lactobacillus johnsonii）的16S核醣體基因序列的相似性（Per. Ident）為99.37%至99.46%，如表二所示。因此，將此分離菌株命名為約氏乳桿菌TCI369（ Lactobacillus johnsoniiTCI369）。
表一
引子名稱 序列編號 序列
8F SEQ ID NO:1 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R SEQ ID NO:2 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
表二
約氏乳桿菌 相似性
Lactobacillus johnsoniistrain 15QC3AN 16s ribosomal RNA gene, partial sequence 99.46%
Lactobacillus johnsonii strain KLDS 1.0734 16s ribosomal RNA gene, partial sequence 99.46%
Lactobacillus johnsonii strain KLDS 1.0731 16s ribosomal RNA gene, partial sequence 99.37%
Lactobacillus johnsonii strain 1019 16s ribosomal RNA gene, partial sequence 99.46%
Lactobacillus johnsonii strain LBJ-1297 16s ribosomal RNA gene, partial sequence 99.46%
Lactobacillus johnsonii strain G2A chromosome, complete genome 99.37%
Lactobacillus johnsonii strain DC22.2 chromosome, complete genome 99.37%
Lactobacillus johnsonii ALB-7 gene for 16s ribosomal RNA, partial sequence 99.37%
例二：約氏乳桿菌 TCI369 的保存及培育實驗
1. 使用MRSD培養基（購自BD，產品編號288130）培養例一分離所得的約氏乳桿菌TCI369（SEQ ID NO:3）以得到菌液，然後將菌液與甘油以4：1的比例混合。之後，將菌液與甘油的混合液置於-80 ℃下進行保存。
2. 將約氏乳桿菌TCI369以1%(v/v)的植菌量（約1x104 CFU／mL）接種於MRSD培養基中，並於37 ℃下培養24小時後形成約氏乳桿菌TCI369菌液。
3. 將約氏乳桿菌TCI369菌液以5000rpm轉速進行離心5分鐘取得上清液，將上清液以0.2μm的濾膜進行過濾，所得濾液即為約氏乳桿菌TCI369樣品（即約氏乳桿菌TCI369樣品含有約氏乳桿菌TCI369之代謝產物）。
例三：油脂不飽和度試驗
A. 材料
1. MRSD培養基，購自BD，產品編號288130。
2. 葵花油，廠牌為佳格食品股份有限公司，品名為得意的一天葵花油。
B. 試驗流程：
1. 控制組為含有5%(wt)葵花油的MRSD培養基，實驗組為含有5%(wt)葵花油以及0.25% (v/v) 例二製得的約氏乳桿菌TCI369樣品的MRSD培養基。將各組置於室溫下反應24小時後，委由SGS檢測各組的碘值（IV，Iodine Value）。
C. 試驗結果：
請參閱圖1。控制組的碘值為56%，而實驗組的碘值為65%。也就是說，相對於控制組，實驗組在添加約氏乳桿菌TCI369樣品後，實驗組的碘值提升約16%。
由此可知，約氏乳桿菌TCI369樣品能提升葵花油的碘值。碘值是指每100克油脂（或其他樣品）所吸收碘的質量（克）。碘值越大，油脂的不飽和程度越大；反之，碘值越小，油脂的不飽和程度越小。換言之，由實驗可證，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有提升油脂的不飽和程度，轉換油脂的效果。約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物能夠於體內，將所攝入的油脂轉換為不飽和油脂。
例四：膽固醇代謝試驗
A. 材料與儀器：
1. 細胞株：人類肝細胞，購自ATCC（American Type Culture Collection，美國典型培養物保藏中心），細胞編號HB-8065，以下簡稱HepG2細胞。
2. 細胞培養基：DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）（購自Gibco，產品編號12100-046），添加10% 胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）以及1% 青黴素-鏈黴素（購自Gibco，產品編號15140122）。
3. 無血清細胞培養基：DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium，購自Gibco，產品編號12100-046），添加1% 青黴素-鏈黴素（購自Gibco，產品編號15140122）。
4. 胰蛋白酶：以10X胰蛋白酶（購自Gibco，產品編號15400-054）和其9倍體積的DPBS（Dulbecco's phosphate-buffered saline）稀釋配製而成。
5. 膽固醇攝取細胞檢測試劑套組（Cholesterol Uptake Cell-based Assay Kit），購自Cayman，產品編號600440。此膽固醇攝取細胞檢測試劑套組包含U-18666A以及NBD膽固醇（NBD cholesterol）。
6. 流式細胞儀，購自BD公司。
B. 試驗流程：
1. 將HepG2細胞以每孔1×10 5個的密度，接種於每孔含2 mL的細胞培養基的6孔培養盤中，並在37 ℃下培養24小時。於此，HepG2細胞分為三個試驗組別，其分別為：空白組、控制組及實驗組。各組進行三重複。
2. 培養24小時後，將各組更換為實驗培養基，然後於37 ℃下培養24至72小時。其中，空白組的實驗培養基為含有20 μg/mL NBD膽固醇的無血清細胞培養基。控制組的實驗培養基為含有20 μg/mL NBD膽固醇以及1.25 μM U-18666A的無血清細胞培養基。實驗組的實驗培養基為含有20 μg/mL NBD膽固醇以及0.25% (v/v) 例二製得的約氏乳桿菌TCI369樣品的無血清細胞培養基。
3. 培養24至72小時後，移除培養後的各組的實驗培養基，並以DPBS進行潤洗2次。
4. 於潤洗後，依照膽固醇攝取細胞檢測試劑套組所提供的試驗流程處理各組的細胞以得到各組的待測樣品後，將流式細胞儀的參數設定為FITC的激發光及散射光後，利用流式細胞儀檢測各組的綠色螢光訊號。
C. 試驗結果：
所有組別的相對肝細胞膽固醇量係依下列公式計算：相對肝細胞膽固醇量（%）=（各組綠色螢光訊號/空白組綠色螢光訊號）×100%。
空白組與其他各組的試驗結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。於圖式中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。
請參閱圖2。空白組的細胞僅添加膽固醇進行處理，因此空白組的試驗結果代表細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的相對肝細胞膽固醇量為100%的情況下，控制組的相對肝細胞膽固醇量為143.5%，而實驗組的相對肝細胞膽固醇量為124.9%。也就是說，相對於空白組，控制組的細胞在添加膽固醇及U-18666A後，控制組的相對肝細胞膽固醇量顯著提升約43.5%。相對於空白組，實驗組的細胞在添加膽固醇及約氏乳桿菌TCI369樣品後，實驗組的相對肝細胞膽固醇量顯著提升約24.9%。
由此可知，約氏乳桿菌TCI369樣品能明顯提升肝細胞膽固醇量。換言之，由實驗可證，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有顯著提升肝細胞攝取膽固醇，促進膽固醇代謝的效果。約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物能促進膽固醇代謝，有效降低心血管罹病因子。
例五：脂肪分解試驗
A. 材料與儀器：
1. 細胞株：小鼠骨髓基質細胞，購自ATCC，細胞編號CRL-2749，以下簡稱OP9細胞。
2. 細胞培養基：MEMα（Minimum Essential Medium Alpha Medium）（購自Gibco，產品編號12000-014），添加20% 胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）以及1% 青黴素-鏈黴素（購自Gibco，產品編號15140122）。
3. 檢測套組：甘油細胞檢測試劑套組（Glycerol cell-based assay kit），購自Cayman，產品編號10011725。
4. 檢測儀器：酵素免疫分析儀（ELISA reader），購自BioTek公司（美國）。
B. 試驗流程：
1. 將OP9細胞以每孔8×10 4個的密度，接種於每孔含500 μL的細胞培養基的24孔培養盤中，並在37 ℃下培養7天，每3天更換一次細胞培養基。於此，OP9細胞分為兩個試驗組別，其分別為：空白組及實驗組。各組進行三重複。
2. 培養7天後，使用顯微鏡觀察各組的油滴形成狀況以確認各組的細胞已分化完全。
3. 觀察後，將各組更換為實驗培養基。其中，空白組的實驗培養基為不含樣品的分化培養基，而實驗組的實驗培養基為含有0.125% (v/v) 例二製得的約氏乳桿菌TCI369樣品的分化培養基。接著，將各組於37 ℃下培養7至10天，每3天更換一次各組對應的實驗培養基。
4. 將培養後的各組於每孔中取出25 μL的實驗培養基，並使用甘油細胞檢測試劑套組測定各組分化後的細胞的甘油分泌量。於此，依照甘油細胞檢測試劑套組所提供的試驗流程處理各組取出的實驗培養基後，利用酵素免疫分析儀測量每孔540 nm的吸光值（OD 540值）。
C. 試驗結果：
所有組別的相對甘油分泌量係依下列公式計算：相對甘油分泌量（%）=（各組OD 540值/空白組OD 540值）×100%。
空白組與其他各組的試驗結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。於圖式中，「*」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。
請參閱圖3。空白組的細胞並未添加任何樣品進行處理，因此空白組的試驗結果代表細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的相對甘油分泌量為100%的情況下，實驗組的相對甘油分泌量為153.8%。也就是說，相對於空白組，實驗組的細胞在添加約氏乳桿菌TCI369樣品後，實驗組的相對甘油分泌量顯著提升約53.8%。
由此可知，約氏乳桿菌TCI369樣品能明顯提升甘油分泌量。換言之，由實驗可證，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有顯著促進脂肪分解的效果。約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物能提升脂肪分解效率、加速脂肪代謝，有效降低心血管罹病因子。
例六：抵抗及防禦紫外光試驗
A. 材料與儀器：
1. 細胞株：人類視網膜色素上皮細胞（Human retinal pigmented epithelium），購自ATCC，細胞編號CRL-2302，以下簡稱ARPE-19細胞。
2. 細胞培養基：等量混合DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）（購自Gibco，產品編號12100-046）以及Ham’s F12 medium（購自Gibco，產品編號21700-026），並添加10% 胎牛血清（Fetal Bovine Serum，購自Gibco，產品編號10437-028）、0.5mM 丙酮酸鈉（Sodium pyruvate，購自Gibco，產品編號11360-070）以及15mM HEPES緩衝劑（購自Gibco，產品編號15630-080）。
3. 4mg/mL MTT：以MTT（購自AMERSCO，產品編號0793-5G）和DPBS配製而成。
4. DMSO，購自ECHO，產品編號DA1101-000000-72EC。
5. 紫外光輻射箱，購自Vilber。
6. 酵素免疫分析儀（ELISA reader），購自BioTek公司（美國）。
B. 試驗流程：
1. 將ARPE-19細胞以每孔5×10 3個的密度，接種於每孔含200 μL的細胞培養基的96孔培養盤中，並在37 ℃下培養24小時。試驗組別包含：空白組、控制組及實驗組。各組進行三重複。
2. 培養24小時後，將各組更換為實驗培養基，並於37 ℃下繼續培養24小時。其中，空白組及控制組的實驗培養基為不含樣品的細胞培養基，而實驗組的實驗培養基為含有0.25% (v/v) 例二製得的約氏乳桿菌TCI369樣品的細胞培養基。
3. 培養24小時後，對控制組及實驗組的ARPE-19細胞於紫外光輻射箱中進行UVB（紫外光，照射能量為1.5 J/cm2）照射，並照射10分鐘。
4. 於各組中添加15 μL 4mg/mL MTT，並在37 ℃下培養4小時。
5. 培養4小時後，移除培養後的各組的實驗培養基，並於各組中添加50 μL DMSO以溶解Formazan（甲䐶）結晶。將各組置於振動台上並作用10分鐘。
6. 利用酵素免疫分析儀測量各組的570 nm的吸光值（OD 570值）。
C. 試驗結果：
所有組別的相對細胞存活率係依下列公式計算：相對細胞存活率（%）=（各組OD 570值/空白組OD 570值）×100%。
空白組與其他各組以及控制組與其他各組的試驗結果之間的統計學顯著差異是以學生t檢驗（student t-test）統計分析得到。於圖式中，「#」代表在與空白組比較下其p值小於0.05、「##」代表在與空白組比較下其p值小於0.01，以及「###」代表在與空白組比較下其p值小於0.001。並且，於圖式中，「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05、「**」代表在與控制組比較下其p值小於0.01，以及「***」代表在與控制組比較下其p值小於0.001。
請參閱圖4。空白組未以紫外光刺激也未使用樣品進行處理，因此空白組的試驗結果代表ARPE-19細胞在正常的生理代謝情況下的表現。於此，在設定空白組的相對細胞存活率為100%的情況下，控制組的相對細胞存活率為88.5%，而實驗組的相對細胞存活率為106.0%。也就是說，相對於空白組，控制組的ARPE-19細胞經由紫外光刺激後，控制組的相對細胞存活率顯著下降約11.5%。相對於控制組，實驗組的ARPE-19細胞在添加約氏乳桿菌TCI369樣品後，再經由紫外光刺激，實驗組的相對細胞存活率顯著提升約19.8%。相對於空白組，實驗組的相對細胞存活率提升約6.0%。
由此可知，約氏乳桿菌TCI369樣品能明顯提升紫外光所致的減少的視網膜細胞存活率。換言之，由實驗可證，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有顯著降低紫外光對視網膜細胞之傷害的效果。約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物能抵抗紫外線。約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物能降低紫外光對眼睛細胞之傷害，有效保護眼睛。
例七：人體試驗 - 血液檢測
A. 試驗流程：
令10位20歲以上的3C用品重度使用或血脂偏高的成人受試者每日服用一粒試驗膠囊，並連續服用4週（即28日）。試驗膠囊含有100 mg 約氏乳桿菌TCI369活菌（由例二取得）、4 mg 硬脂酸鎂、4 mg 二氧化矽以及292 mg 難消化麥芽糊精。並且，受試者於開始服用前（以下稱第0週）、服用14日後（以下稱第2週）及服用28日後（以下稱第4週），進行抽血，以偵測在服用試驗膠囊前後的血中三酸甘油酯、高密度脂蛋白（HDL）及極低密度脂蛋白（VLDL）濃度的變化量。
本實施例受試者血中三酸甘油酯、高密度脂蛋白（HDL）及極低密度脂蛋白（VLDL）濃度是委由立人檢驗所（台灣）測定，參照衛福部公告之血液檢驗標準執行。
B. 試驗結果：
請參閱圖5。圖5示出了受試者在服用試驗膠囊前後的血中三酸甘油酯濃度的變化量。第0週時的受試者的血中三酸甘油酯濃度為約121.6 mg/dL；第2週時（即持續服用約氏乳桿菌TCI369活菌2週後）的受試者的血中三酸甘油酯濃度減少至約108.9 mg/dL；以及，第4週時（即持續服用約氏乳桿菌TCI369活菌4週後）的受試者的血中三酸甘油酯濃度減少至約92.6 mg/dL。換言之，相較於服用前，持續服用2週約氏乳桿菌TCI369後可使此些受試者的血中三酸甘油酯濃度減少10.4%。相較於服用前，持續服用4週約氏乳桿菌TCI369後可使此些受試者的血中三酸甘油酯濃度減少23.8%。並且，改善人數比例達70%。由此可知，約氏乳桿菌TCI369活菌確實可減少血中三酸甘油酯濃度。換言之，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有降低三酸甘油酯的效果。
請參閱圖6。圖6示出了受試者在服用試驗膠囊前後的血中高密度脂蛋白濃度的變化量。第0週時的受試者的血中高密度脂蛋白濃度為約54.39 mg/dL；第2週時（即持續服用約氏乳桿菌TCI369活菌2週後）的受試者的血中高密度脂蛋白濃度增加至約54.90 mg/dL；以及，第4週時（即持續服用約氏乳桿菌TCI369活菌4週後）的受試者的血中高密度脂蛋白濃度增加至約58.09 mg/dL。換言之，相較於服用前，持續服用2週約氏乳桿菌TCI369後可使此些受試者的血中高密度脂蛋白濃度增加0.9%。相較於服用前，持續服用4週約氏乳桿菌TCI369後可使此些受試者的血中高密度脂蛋白濃度增加6.8%。並且，改善人數比例達70%。由此可知，約氏乳桿菌TCI369活菌確實可增加血中高密度脂蛋白濃度。換言之，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有增加高密度脂蛋白，增加好膽固醇的效果。
請參閱圖7。圖7示出了受試者在服用試驗膠囊前後的血中極低密度脂蛋白濃度的變化量。第0週時的受試者的血中極低密度脂蛋白濃度為約12.50 mg/dL；第2週時（即持續服用約氏乳桿菌TCI369活菌2週後）的受試者的血中極低密度脂蛋白濃度減少至約11.34 mg/dL；以及，第4週時（即持續服用約氏乳桿菌TCI369活菌4週後）的受試者的血中極低密度脂蛋白濃度減少至約10.38 mg/dL。換言之，相較於服用前，持續服用2週約氏乳桿菌TCI369後可使此些受試者的血中極低密度脂蛋白濃度減少9.3%。相較於服用前，持續服用4週約氏乳桿菌TCI369後可使此些受試者的血中極低密度脂蛋白濃度減少17.0%。並且，改善人數比例達70%。由此可知，約氏乳桿菌TCI369活菌確實可減少血中極低密度脂蛋白濃度。換言之，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有降低低密度脂蛋白，降低壞膽固醇的效果。
例八：人體試驗 - 菌相檢測
A. 試驗流程：
令10位20歲以上的3C用品重度使用或血脂偏高的成人受試者每日服用一粒試驗膠囊，並連續服用4週（即28日）。試驗膠囊含有100 mg 約氏乳桿菌TCI369活菌、4 mg 硬脂酸鎂、 4 mg 二氧化矽以及292 mg 難消化麥芽糊精。並且，受試者於開始服用前（以下稱第0週）及服用28日後（以下稱第4週），進行腸道菌相檢測及腸道相關病原菌蛋白表現量檢測。其中，腸道菌相檢測及腸道相關病原菌蛋白表現量檢測為受試者自行將乾淨之糞便蒐集袋黏貼於馬桶蓋上，以利後續取樣。取樣過程前，受試者會先排空尿液以避免汙染樣品，並取適量樣品放置於含有保存液之取樣管，之後送交圖爾斯生物科技股份有限公司，進行定序分析或比對分析。
其中，前述比對分析係基於 16S 定序分析結果、GreenGenes 資料庫以及 KEGG orthology 拷貝數關係表，預測 KEGG 資料庫 3 個層級的代謝通路功能，並產生腸道相關病原菌蛋白基因表現量的檢測結果。換言之，從糞便樣品中所檢測到的腸道相關病原菌蛋白基因表現量的提升，代表腸道相關病原菌蛋白表現量的提升。
B. 試驗結果：
請參閱圖8。圖8示出了受試者在服用試驗膠囊前後的腸道菌相的平均特徵差異。持續服用4週約氏乳桿菌TCI369後可增加此些受試者腸道菌相的瘤胃菌科（Ruminococcacaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、坦纳菌科（Tannerellaceae）、文肯菌科（Rikenellaceae）、艾克曼菌科（Akkermansiaceae）、乳桿菌科（Lactobacillaceae）等的豐富度。持續服用4週約氏乳桿菌TCI369後可減少此些受試者腸道菌相的梭桿菌科（Fusobacteriaceae）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、梭菌科（Clostridiaceae 1）、消化鏈球菌科（Peptostreptococcaceae）、脫硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）、腸球菌科（Enterococcaceae）等的豐富度。其中，瘤胃菌科、普雷沃氏菌科、坦纳菌科、文肯菌科、艾克曼菌科、乳桿菌科的菌種屬於腸內益菌，而梭桿菌科、腸桿菌科、丹毒絲菌科、梭菌科、消化鏈球菌科、脫硫弧菌科、腸球菌科的菌種屬於腸內壞菌。由此可知，約氏乳桿菌TCI369活菌確實可以有效調節腸道菌相平衡。換言之，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有增加腸内益菌的豐富度，減少腸內壞菌的豐富度，塑造更健康的腸道的效果。
請參閱圖9。圖9示出了受試者在服用試驗膠囊前後的腸道相關病原菌蛋白相對基因表現量的變化量。第0週時的受試者的腸道相關病原菌蛋白相對基因表現量為約0.000015%；而第4週時（即持續服用約氏乳桿菌TCI369活菌4週後）的受試者的腸道相關病原菌蛋白相對基因表現量減少至約0.000008%。換言之，相較於服用前，持續服用4週約氏乳桿菌TCI369後可使此些受試者的腸道相關病原菌蛋白相對基因表現量減少46.7%。由此可知，約氏乳桿菌TCI369活菌確實可減少腸道相關病原菌蛋白相對基因表現量。透過檢測腸道相關病原菌蛋白之表現量，得以評估腸道内病原菌透過KEGG PATHWAY: ko05100入侵腸上皮細胞的狀態。換言之，約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物可顯著減少腸道相關病原菌蛋白基因表現量，減少腸道相關病原菌蛋白表現量。約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物可顯著降低腸道壞菌入侵至腸道上皮細胞，並預防壞菌入侵腸道 。約氏乳桿菌TCI369及/或其代謝產物具有鞏固腸道屏障，改善腸道屏障功能的效果。
綜上，任一實施例的約氏乳桿菌，其能提升油脂不飽和度。換言之，任一實施例的約氏乳桿菌或其代謝產物適用於製備提升油脂不飽和度的組合物。換言之，前述之組合物具有提升油脂不飽和度的功能。在一些實施例中，約氏乳桿菌、其代謝產物或其所製得的組合物還具有下列一種或多種功能：分解脂肪、代謝膽固醇、降低三酸甘油酯、降低低密度脂蛋白、增加高密度脂蛋白、調節腸道菌相平衡、改善腸道屏障、抵抗紫外光及保護眼睛。
無
圖1是碘值的細胞實驗結果的柱狀圖。 圖2是相對肝細胞膽固醇量的細胞實驗結果的柱狀圖。 圖3是相對甘油分泌量的細胞實驗結果的柱狀圖。 圖4是相對細胞存活率的細胞實驗結果的柱狀圖。 圖5是第0週、第2週及第4週的血中三酸甘油酯濃度的人體實驗結果的柱狀圖。 圖6是第0週、第2週及第4週的高密度脂蛋白的人體實驗結果的柱狀圖。 圖7是第0週、第2週及第4週的極低密度脂蛋白的人體實驗結果的柱狀圖。 圖8是第0週及第4週的腸道菌相的平均特徵差異的人體實驗結果的柱狀圖。 圖9是第0週及第4週的腸道相關病原菌蛋白相對基因表現量的人體實驗結果的柱狀圖。
1. TW中華民國；財團法人食品工業發展研究所；2021/08/16；寄存編號：BCRC 911071。 2. DE德國；德國微生物菌種保藏中心；2021/08/23；寄存編號：DSM 34008。
TW202403039A_112125904_SEQL.xml

Claims (10)

  1. 一種約氏乳桿菌，其中該約氏乳桿菌為 Lactobacillus johnsoniiTCI369，寄存編號BCRC 911071。
  2. 一種約氏乳桿菌或其代謝產物用於製備提升油脂不飽和度之組合物的用途，其中該約氏乳桿菌為 Lactobacillus johnsoniiTCI369，寄存編號BCRC 911071。
  3. 如請求項2所述之用途，其中該約氏乳桿菌用以分解脂肪或代謝膽固醇。
  4. 如請求項2所述之用途，其中該約氏乳桿菌用以降低三酸甘油酯。
  5. 如請求項2所述之用途，其中該約氏乳桿菌用以降低低密度脂蛋白。
  6. 如請求項2所述之用途，其中該約氏乳桿菌用以增加高密度脂蛋白。
  7. 如請求項2所述之用途，其中該約氏乳桿菌用以調節腸道菌相平衡。
  8. 如請求項2所述之用途，其中該約氏乳桿菌用以改善腸道屏障。
  9. 如請求項2所述之用途，其中該約氏乳桿菌用以抵抗紫外光。
  10. 如請求項9所述之用途，其中該約氏乳桿菌用以保護眼睛。
TW112125904A 2022-07-11 2023-07-11 約氏乳桿菌以及其或其代謝產物用於提升油脂不飽和度的用途 TW202403039A (zh)

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