TWI394837B - 牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－１及其抗體 - Google Patents

牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－１及其抗體 Download PDF

Info

Publication number
TWI394837B
TWI394837B TW99130552A TW99130552A TWI394837B TW I394837 B TWI394837 B TW I394837B TW 99130552 A TW99130552 A TW 99130552A TW 99130552 A TW99130552 A TW 99130552A TW I394837 B TWI394837 B TW I394837B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
acp
mycelium
polysaccharide
antrodia camphorata
fermentation product
Prior art date
Application number
TW99130552A
Other languages
English (en)
Other versions
TW201211261A (en
Inventor
Jia Hsin Guo
Wei Ting Tseng
Yi Rung Chen
Original Assignee
Univ Nat Pingtung Sci & Tech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Nat Pingtung Sci & Tech filed Critical Univ Nat Pingtung Sci & Tech
Priority to TW99130552A priority Critical patent/TWI394837B/zh
Publication of TW201211261A publication Critical patent/TW201211261A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI394837B publication Critical patent/TWI394837B/zh

Links

Landscapes

  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1及其抗體
本發明係關於一種多醣體，特別係關於一種自牛樟芝(Antrodia camphorata )菌絲體固態醱酵物分離純化而得之之單一多醣體。
牛樟芝(Antrodia camphorata )，又稱樟芝或牛樟菇等，於分類學上屬於真菌界(Fungi)、擔子菌門(Basidiomycota)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)、同擔子菌綱(Homobasidiomycetes)、無褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia)。牛樟芝子實體生長於台灣保育類牛樟樹(Cinnamoum kanehirai Hay)之心材內壁，週邊向內彎曲，能分解木材之纖維素而造成木頭腐朽，為木頭腐朽菌。野生牛樟芝生長環境均屬於幽暗、潮濕且溫度較低之中海拔地區，特別是野生牛樟芝生長緩慢，因此產生子實體需要相當長的時間。由於牛樟樹為保育類樹種且分布數量極為稀少，再加上人為的盜採，使得野生牛樟芝數量相當稀少，使得牛樟芝價格昂貴，所以具有「森林中的紅寶石」之美稱。
牛樟芝子實體為多年生，無柄且為木栓質至木質，具有濃厚的樟樹香氣，形態多變，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀，緊貼於木材表面，菇體表面孔狀，初生時鮮紅色，隨著生長逐變為乳白色、淡紅褐色、淡褐色或淡黃褐色，週邊常呈放射狀，並往四周擴展生長，呈半圓狀或不規則 形。
有些牛樟芝的種類被發現具有藥理活性，在台灣民俗醫學療法上，牛樟芝子實體被認為具有某些醫藥功效，將該子實體細磨成乾燥粉末或以熬煮方式口服，為民間流傳具療效的食藥菇類，具有解毒、抗發炎、抗腫瘤、抑制血管增生及治療肝臟疾病等活性。
由上述得知牛樟芝具藥理活性，市面上已不乏牛樟芝系列之保健產品。目前市面上販售的牛樟芝相關保健產品，製程係由牛樟芝子實體得一菌絲體進行醱酵，主要以食用該菌絲體達保健功效。但是，牛樟芝係為一成份複雜之腐朽菌，有研究指出在人工培養篩選牛樟芝菌絲體時，會篩選到致癌的菌株，表示牛樟芝並非所有成份食用後皆有益於人體健康，也有可能含有某些毒素，若冒然食用反而會影響健康，產生無法預期的副作用，而喪失保健的功效。再者，若要破壞牛樟芝內非藥理活性物質對健康的危害，會選擇經一高溫加熱步驟以確保食用上的安全，然而該高溫加熱步驟亦可能使牛樟芝內有效成份之活性喪失，而失去牛樟芝藥理活性的價值，故找出且分離一具功效且安全的牛樟芝有效藥理活性成份是為一重要課題。
目前從許多關於牛樟芝的研究中，已知牛樟芝成份非常複雜，發現牛樟芝子實體中含有獨特且不同骨架形成之三萜類化合物，也有研究發現牛樟芝成份含有多醣體。關於多醣體與調節免疫反應的機制研究指出，多醣體之結構會快速活化T淋巴抗原呈現細胞(antigen-presenting cells)，而具有提升免疫力、抗腫瘤、抗發炎及抑菌等活性。 若能從牛樟芝萃取物中找到具藥理活性的多醣體來促成提升免疫力，且能將該多醣體以人工培養方式大量培養獲得，能應用於提升人類免疫系統，將為人類健康帶來莫大的幫助。再者，若能從牛樟芝萃取物中取得大量具活性之多醣體，再將該牛樟芝多醣體應用於提升人類免疫系統，甚至將其製備為疫苗佐劑，可為人類健康帶來莫大的幫助。
甚至有研究指出多醣體的功能性調節可能取決於單醣組成及醣苷鍵結(Leunget al. 2006)，在牛樟芝菌絲體多醣體中含有β-1,6-半乳糖鍵結具有修復肝功能之活性(Hanet al. 2006)等，若能發現一牛樟芝多醣體且能確認該多醣體的結構特徵及免疫活性，將能有效了解牛樟芝多醣體的藥理活性研究。
本發明之主要目的係提供一種牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1係為牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之有效藥理活性成份。
本發明的次一目的，係提供一種牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，係可經由人工培養一牛樟芝菌絲體固態醱酵物，經萃取及分離純化而大量獲得該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1。
本發明的再一目的，係提供一種牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1可以有效刺激免疫細胞增殖。
本發明的又一目的，係提供一種牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之結構特徵具藥理活性。
本發明的又一目的，係提供一種牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1抗體，係具有抗原辨識特異性。
根據本發明的一種牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，係包含：由果糖(fructose)、阿拉伯糖(arabinose)、甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)及半乳糖(galactose)等所構成，該果糖：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖之構成比為5：5：22：43：104；分子量：2.9×104 Da；構成單位：由半乳糖1,6鍵結為主與其他單醣鍵結構成；由果糖以T-鍵結、甘露糖以T-鍵結、半乳糖以T-、1,6及1,3,4鍵結、葡萄糖以1,2,4鍵結、阿拉伯糖以1,2,4鍵結；含多醣體的特殊官能基Poly-OH及-COOH，且含有α-D-半乳糖與β-D-半乳糖；及含有α-D-果糖-(1→、α-D-甘露糖-(1→及α,β-D-半乳糖-(1→的結構。本發明係另使用該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1製備一多醣體ACP-1抗體，該抗體專一性辨識該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：以下介紹為本發明較佳實施例，係包含牛樟芝菌絲體 固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1製備，取得牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1後，進而分析該多醣體ACP-1之組成單糖及結構特徵，並進行該多醣體ACP-1之免疫試驗，本發明較佳實施例還製備出抗多醣體ACP-1之多株抗體及測試該多株抗體之免疫試驗。
一、本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1的製備
本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1係較佳萃取自寄存於中華民國食品工業研究所之牛樟芝(Antrodia camphorata )NPU-50菌株，該菌株寄存編號為BCRC 930127。該牛樟芝NPU-50菌株，係由培養野生牛樟芝子實體中，分離出一具較鮮紅之外觀顏色、特殊香氣及生長速率較快之菌株。將該牛樟芝NPU-50菌株於一固態培養基醱酵成一牛樟芝菌絲體固態醱酵物，萃取該牛樟芝菌絲體固態醱酵物得一粗多醣體，進一步利用快速蛋白質液相層析儀(FPLC)由該粗多醣體中，分離純化出本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1。詳細步驟係包含一醱酵步驟、一萃取步驟及一分離純化步驟，如下所示：該醱酵步驟 ：首先將該牛樟芝NPU-50菌株培養於MEB液態培養基進行醱酵，該醱酵條件係選擇震盪醱酵於27℃，100 rpm，培養七天得一含有牛樟芝菌絲體之醱酵液，利用均質機均質該醱酵液，再將該醱酵液接種至一固態培養基上，該固態培養基係包含一基材、一碳源及一氮源，該基材為米，係選自於糙米、胚芽米、糯米、蓬萊米、 在來米或茭白之一，該碳源係選自由葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、乳糖(lactose)、澱粉(starch)、纖維素(cellulose)及蔗糖(sucrose)所組成之族群，該氮源係選自由蛋白腖(peptone)、麥芽抽出物(malt extract)、酵母抽出物(yeast extract)及三蛋白腖(tripeptone)所組成之族群。本發明之固態培養基較佳係選擇胚芽米作為基材，葡萄糖作為碳源，蛋白腖及麥芽抽出物作為氮源，該固態培養基培養條件係選擇於27℃醱酵約2至6個月形成一固態醱酵物，該固態醱酵物具有強烈的香氣，且該固態醱酵物內部形成類似海綿狀的結構。
該萃取步驟 ：將該固態醱酵物，經冷凍乾燥後研磨成粉末，並利用適用之萃取方法，以水或有機溶劑進行萃取，藉以取得牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，其中有機溶劑係選自醇類、酯類、烷類或鹵烷所組成之族群，但並不受此限制。
本發明較佳實施例係選擇使用「水萃取法」，首先將該固態醱酵物係選擇加入蒸餾水，利用均質機均質後，再以超音波震盪75℃至90℃，1小時到3小時，本發明係選擇於80℃震盪2小時，待冷卻後，選擇以超高速冷凍離心10,000 rpm，20分鐘得一上清液，選擇以布氏漏斗過濾該上清液，將該過濾後之上清液以95%酒精於4℃沉澱一個晚上得一沉澱物，利用抽氣過濾收集該沉澱物，並選擇利用70%酒精清洗該沉澱物兩次，該沉澱物係為該牛樟芝NPU-50菌絲體固態醱酵物之粗多醣體，稱為牛樟芝菌絲體固態醱酵產物粗多醣體(Antrodia camphorata polysaccharide，ACP)，以下簡稱為ACP。
該分離純化步驟 ：該ACP中係含有本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1及其他種類之多醣體或小分子糖，因此本發明進一步先經由去鹽管柱將ACP中的小分子糖類去除掉，再經由快速蛋白質液相層析儀(FPLC)，分離純化得該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1。
本發明較佳實施例係將該ACP經冷凍乾燥後研磨成粉末，進行該ACP去除小分子糖類。首先係選擇將該ACP粉末溶於去離子水中，再選擇於低溫環境下3500 rpm離心4分鐘得一上清液，取該上清液選擇利用0.45 μm過濾膜過濾，將該過濾後之上清液進行去除小分子量糖類的動作。本發明較佳實施例係選擇PD-10去鹽管柱，首先以去離子水清洗該去鹽管柱，再加入該過濾後之上清液，收集通過去鹽管柱之液體。
再取該通過去鹽管柱之液體，進一步利用快速蛋白質液相層析儀(FPLC)搭配分子篩管柱(Sephacryl S-300 High Resolution，GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)，係選擇利用0.05 M NaCl沖提液分離該ACP，流速則選擇為0.5 mL/min，每管收集8 mL，共收集40管，於第20-23管分液間便可收集獲得本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，本發明收集獲得牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1較佳係選擇第22管分液。
以上所述為本發明較佳實施例如何從牛樟芝菌絲體NPU-50菌株培養醱酵，經萃取粗多醣體ACP，經分離純 化，得本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，如第1圖所示，後續係進一步分析該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之組成單糖及結構特徵。
二、本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1的組成單糖及結構分析
經上述製備方法獲得該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1後，係針對該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物多醣體ACP-1進行分析試驗，該分析試驗係包含：單糖組成分析、分子量分析、多醣體鍵結分析、官能基分析及多醣體結構分析。
該單糖組成分析：
本發明較佳實施例係選擇採用氣相色層儀(GC)分析該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物多醣體ACP-1之單糖組成。首先將待測醣類轉變為可揮發且對熱穩定的衍生物，再搭配氣相層析儀測定醣類，該氣相層析具有選擇性強、分辨力好、靈敏度高以及分析速度快等優點，當該衍生物在進行氣相層析時，相同分子量的單糖，如葡萄糖、甘露糖及半乳糖，仍然會因其原子排列順序的不同而造成滯留時間有所不同，因此該衍生物的圖譜可經由標準品圖譜的比對而得知其單糖組成。
首先取單糖標準品果糖(fructose)、鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、半乳糖(galactose)、葡萄糖(glucose)及肌醇(myo-Inositol)進行衍生化，衍生化後的單糖分別注入恆溫 的氣相層析儀中進行分析，得一各單糖標準品的滯留時間。之後將本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1進行水解及衍生化，再進行與單糖標準品分析同樣的條件來進行氣相層析儀，取得該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1的單糖組成之滯留時間。與單糖標準品之滯留時間比對後，可得知該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1係由果糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖所組成。
進一步利用圖譜的波峰面積換算為各單糖所組成之比例，可得知該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1係由果糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖以5：5：22：43：104的比例組成，由上述結果得知牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1是由不同種的單糖所組成的多醣體。且多醣體相關研究指出，多醣體若大部份為葡萄糖與半乳糖所組成的多醣體，則可以抑制B型肝炎病毒活性(Leeet al. 2002)，而本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1中，主要也是由半乳糖與葡萄糖所組成之多醣體。
該分子量分析：
本發明較佳實施例係選擇係採用高效能液相層析儀(HPLC-RI)分析該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之分子量大小，該HPLC-RI系統包含RI偵測器，幫浦，管柱為TSK-GEL(7.8 mm(ID)×30.0 cm(L)，G3000PWXL，Tosoh，Japan)，烘箱溫度係選擇為40℃，移動相選擇為0.05 M NaCl，流速為0.6 ml/min，展開40 分鐘。首先需要先完成分子量標準品分析，取數個不同大小分子量標準品dextran(Mw=5900、11800、22800、47300、112000 daltons,Shodex standard)建立標準品之分子量與滯留時間的標準曲線(calibration curve)。再取該含有牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1分液(第22管分液)進行與標準品相同條件之HPLC-RI分析，以取得一牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1分液之滯流時間，再將該該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1分液之滯留時間代入標準曲線中，便可求得分子量為2.9×104 Da，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1分液為牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP進行上述FPLC-RI分子量分析時最早出現的主要波鋒，因此將本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵物中所萃取、分離及純化而得之該多醣體命名為ACP-1。
該多醣體鍵結分析：
本發明較佳實施例係選擇利用氣相層析質譜儀(GC/MS)分析該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之多醣體鍵結，得知該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之單糖組成後，進一步測定多醣體中各種單糖殘基的鍵結方式，測定多醣體中各種單糖殘基的鍵結方式最常使用的方法為甲基化(methylation)分析法，再搭配GC/MS進行分析比對。
取該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，先經甲基化後再利用酸分解多醣體，之後再經乙醯化，形成部份甲基化糖醇乙酸酯衍生物(Partially Methylated Alditol Acetates，PMAAs)，再將該PMAAs注入GC/MS進行分析，得該牛樟芝菌線體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之MS圖譜。將該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1的MS圖譜經與資料庫比對後，可比對出該多醣體ACP-1主要鍵結為：該多醣體ACP-1中之果糖係以T-進行鍵結、甘露糖係以T-進行鍵結、半乳糖係以T-、1,6及1,3,4進行鍵結、葡萄糖係以1,2,4進行鍵結、阿拉伯糖係以1,2,4進行鍵結。
該官能基分析：
本發明較佳實施例係利用傅立葉紅外線光譜儀鑑別該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1結構中各種官能基團，及確定多醣體中各種六碳糖(吡喃糖)糖苷鍵結構型。取該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1加入溴化鉀(potassium bromide，KBr)均勻研磨後製成錠劑後，再利用傅立葉紅外線光譜儀分析，而該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1的紅外線光圖譜結果，顯示該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1有3409 cm-1 波峰，該波峰為多醣體特有的Poly-OH吸收波峰，有1723 cm-1 波峰，該波峰為-COOH的C=O吸收波峰，且有912及810 cm-1 的波峰，顯示具有β-D-galactose及α-D-galactose吸收波峰。
由以上結果得知該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1具有多醣體特有的紅外線吸收波峰：Poly-OH吸收波峰，及-COOH的C=O吸收波峰，且ACP-1多醣體具有β-D-galactose及α-D-galactose吸收波峰。
該結構分析：
本發明較佳實施例係選擇利用核磁共振(1 H NMR)分析多醣體結構中糖苷鍵構，藉由H-1至H-7的化學訊號(chemical shifts)進行比對及推斷出多醣體結構中含有的糖苷鍵構。本發明較佳實施例選擇取5 mg該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，加入500 μL重水(D2 O)置換多醣體中的氫，放入NMR的樣品管中，選擇核磁共振光譜儀400 MHZ進行1 H-NMR分析，偵測該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物多醣體ACP-1中氫的位置與數量。取該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1的1 H-NMR光譜圖中之H-1至H-7的化學訊號與文獻比對後，結果顯示該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1具有α-D-果糖-(1→、α-D-甘露糖-(1→及α,β-D-半乳糖-(1→的結構。
綜合以上該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1分析，已了解該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之單糖組成、多醣體鍵結及多醣體結構中糖苷鍵構後，進一步試驗該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之免疫功效。
三、牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之免疫細胞增殖試驗
本發明較佳實施例係取該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1進行免疫細胞增殖的試驗。首先係選擇分離SD大鼠的周邊血液單核球細胞及脾臟中的免疫細胞，係選擇加入50 μL 2×106 cells/mL之周邊血液單核 球細胞及脾臟中的免疫細胞分別加入96孔盤中，再分別加入劑量為1 μg/mL lipopolysaccharides(LPS)、10 μg/mL concanalin A(ConA)或150 μg/mL牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，本發明較佳實施例係選擇將96孔盤置於5%CO2 ，37℃的培養箱，培養細胞72小時，再於每孔加入細胞增殖檢測試劑Alamar BlueTM 10 μL，於5%CO2 ，37℃之培養箱中反應四小時後，利用ELISA reader於570 nm及600 nm分別測吸光值，再經計算公式得到免疫細胞之增殖百分比。老鼠周邊血液單核球細胞增殖結果如第2圖所示，LPS與ConA皆能刺激免疫細胞增殖，而該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1可刺激免疫細胞增殖達控制組的2.2倍；在老鼠脾臟中的免疫細胞增殖結果如第3圖所示，LPS與ConA皆能刺激脾臟免疫細胞增殖，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1之刺激增殖效果約為控制組的1.5倍。
另外本發明較佳實施例，除了單純加入該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1進行免疫細胞增殖試驗外，另係選擇該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1含1 μg/mL LPS或含10 μg/mL ConA共同刺激SD大鼠分離的周邊血液單核球細胞及脾臟中的免疫細胞。在老鼠周邊血液單核球細胞增殖結果如第4圖所示，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1含LPS共同刺激，可增殖免疫細胞達到控制組的2倍；該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1含ConA共同刺激，可增殖免疫細胞達到控制組的6.1倍。在老鼠脾臟中的免疫 細胞增殖結果如第5圖所示，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1含LPS共同刺激，可增殖免疫細胞達到控制組的2.2倍；該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1含ConA共同刺激，可增殖免疫細胞達到控制組的3.6倍。
由上述免疫試驗結果得知，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1誘導週邊血液單核球細胞及脾臟免疫細胞增殖的效果佳，單獨給予該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1可達控制組2.2倍及1.5倍，能有效提升免疫細胞增殖；當該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1和ConA共同刺激後，免疫細胞增殖效果大幅提升，可達控制組6.1倍及3.6倍。單獨給予該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1已能有效提升免疫細胞增殖，再加上ConA會刺激T細胞增殖，二者加成效果共同提升免疫細胞增殖，能更有效引發產生免疫反應，且可達到刺激免疫系統細胞增殖及活化的功效，顯示牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1具有做為疫苗佐劑的功效。
四、牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1多株抗體製備及免疫測試
經上述製備方法獲得該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1後，本發明較佳實施例進一步取該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1製備多株抗體及進行抗體特性免疫試驗。
牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1多 株抗體製備
本發明較佳實施例係選擇將該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1混合Freund’s完全佐劑完全乳化均勻成一混合液，將該混合液選擇以皮下注射的方式打入一實驗動物紐西蘭大白兔體內，此後，取牛樟芝菌絲體固態醱酵
產物多醣體ACP-1混合Freund’s不完全佐劑完全乳化均勻混合液每二週補強注射一次，共補強注射五次入該實驗兔體內，最後麻醉該實驗兔以取全血的方式犧牲，將取得的全血經1500 rpm離心10分鐘後，取得大量抗體血清(serum)，進一步將該大量抗體血清進行純化取得一ACP-1多株抗體，以下簡稱為ACP-1多株抗體。接下來係針對該ACP-1多株抗體進行免疫測試，以測試該ACP-1多株抗體之免疫特性。
牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1多株抗體之免疫特性測試
本發明較佳實施例係將該ACP-1多株抗體進行免疫分析法(immunoassay)測試，該免疫分析法係選擇間接性酵素連結免疫吸附測試(indirect ELISA)，測試該ACP-1多株抗體之免疫活性及特異性。
間接性酵素連結免疫吸附測試
取該ACP-1多株抗體進行間接性酵素連結免疫吸附測試，將不同的濃度之多醣體ACP-1溶於PBSN中，係選擇之濃度分別為0.2,1,5及10 μg/mL，再取不同濃度之LPS及未經牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體 ACP-1免疫抗體誘導之紐西蘭大白兔血清(空白血清)溶於PBSN中，做為positive control，另取阻斷緩衝液(blocking buffer)做為空白組(negative control)。分別加入100 μL之上述不同的濃度之多醣體ACP-1、LPS、空白血清及阻斷緩衝液於96孔盤各well中，於4℃作用一個晚上，用無菌水洗2次以上，加入200 μL blocking buffer於每well，於室溫反應30分鐘，以無菌水洗3次，再加入由blocking buffer稀釋成不同濃度之抗體血清，係選擇稀釋為100X、1000 X、10000 X及20000 X，分別加入100 μL之不同稀釋濃度抗體血清，於室溫作用約2小時，無菌水清洗3次後，再於每well加入200 μL blocking buffer，並於室溫作用10分鐘後，以無菌水清洗3次，再於每well加入50 μL affinity purified antibody phosphatase labeled goat anti-rabbit IgG(Protein DetectorTM ELISA kit,KPL,USA)，於室溫作用2小時，以無菌水清洗3次後，於每well加入200 μL blocking buffer，於室溫作用10分鐘，之後以無菌水清洗3次後，每well加入50 μL呈色劑enzyme substrate(BluePhos Solution A and BluePhos Solution B,KPL,USA)，於室溫作用10分鐘後，加入50 μL phosphatase stop solution(BluePhos Stop Solution,KPL,USA)停止呈色，利用ELISA reader測其OD630 之吸光值，結果如附件一所示。本發明分別以未經牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1免疫抗體誘導實驗兔之血清及已經受ACP-1免疫抗體誘導實驗兔之血清當做抗體血清，進行間接性酵素連結免疫吸附測試OD630 之吸光值，於未經ACP-1免疫抗體誘 導實驗兔之抗體血清試驗結果顯示，只有抗原為空白血清有吸光值，其餘加入的不同濃度的不同抗原之吸光值皆與空白組相近，表示本發明較佳實施例所使用之實驗兔子本身原本血清中並未含任何可抗該ACP-1多醣體之抗體，且本ELISA所使用的二抗功能良好；於經牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1免疫抗體誘導實驗兔之抗體血清試驗結果顯示，該ACP-1抗體血清可與ACP-1抗原反應呈色，吸光值較高者為ACP-1多醣體濃度為10 μg/mL與稀釋100倍的ACP-1抗體血清作用後，吸光值為0.359，且吸光值在ACP-1多醣體濃度為5 μg/mL與稀釋1000倍的ACP-1抗體血清作用後，吸光值仍有0.075，表示本發明之該ACP-1抗體血清其呈色強度與ACP-1多醣體濃度具正向相關性，且該ACP-1抗體血清具有專一性免疫辨識的功能。
間接性酵素連結免疫吸附測試
本發明較佳實施例取該具抗ACP-1抗體的實驗兔血清，進一步純化取得一ACP-1多株抗體進行免疫擴散試驗。首先製作一瓊脂膠擴散盤，再利用打孔器於瓊脂膠上輕壓出數個孔洞，再選擇將10 μL該ACP-1多株抗體(10 μg/mL)注入該瓊脂膠之中央孔洞，再分別取10 μL之不同抗原LPS、ACP-3、ACP-2及ACP-1注入週圍孔洞內，上述抗原濃度皆為1 mg/mL，將瓊脂膠擴散盤置於培養皿之微濕過濾紙上，選擇維持潮濕於37℃下反應一個晚上。結果如附件二所示，標號1至5號，分別為ACP-1多株抗體、ACP-3多醣體、ACP-2多醣體、LPS及ACP-1多醣體，該 ACP-1多株抗體只會與該ACP-1多醣體(抗原)產生顯著的免疫沉澱反應，而不會與其他抗原ACP-2、ACP-3或LPS產生免疫沉澱反應。結果顯示本發明已成功製備得一具免疫專一性之ACP-1多株抗體。
由上述免疫分析法試驗得知，將該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1免疫一實驗動物後，能成功從該實驗動物血清中分離純化得該ACP-1多株抗體，且該ACP-1多株抗體具免疫活性及特異性。
本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，係由以上免疫實驗證實為一牛樟芝菌絲體固態醱酵產物有效藥理活性成份，可有效刺激免疫細胞活化者。
本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，係醱酵一牛樟芝NPU-50菌株成一固態醱酵物，經萃取及分離純化該固態醱酵物，可大量獲得該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1。
本發明之牛樟菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1誘導週邊血液單核球細胞及脾臟免疫細胞增殖的效果佳，不論是單獨刺激或與能刺激免疫細胞活化的LPS或ConA共同刺激，皆能提升免疫細胞活化，有效引發產生免疫反應，且達到刺激免疫系統細胞增殖的功效。
本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1是由不同種六碳單糖以特殊鍵結所組成的多醣體，且含有多醣體的特殊官能基Poly-OH，及-COOH的C=O，該牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1內之特殊的單糖結構和鍵結皆具功能性調節的功效。
本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物ACP-1多醣體免疫一實驗動物後，有效誘發產製ACP-1多株抗體，該ACP-1多株抗體具抗原辨識特異性的功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1圖：本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1分離純化後之HPLC-RI圖譜。
第2圖：本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1刺激大鼠的周邊血液單核球細胞增殖反應圖。
第3圖：本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1刺激大鼠的脾臟免疫細胞增殖反應圖。
第4圖：本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1與LPS或ConA共同刺激大鼠的周邊血液單核球細胞增殖反應圖。
第5圖：本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1與LPS或ConA共同刺激大鼠的脾臟免疫細胞增殖反應圖。
附件一：本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1免疫誘導之實驗兔血清進行間接性酵素連結免疫吸附試驗。
附件二：本發明之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1多株抗體之免疫擴散試驗。

Claims (9)

  1. 一種牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，其係分離自Antrodia camphorata NPU-50菌株且具有下列特性：(1)構成醣：由果糖(fructose)、阿拉伯糖(arabinose)、甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)及半乳糖(galactose)等所構成，其中，該果糖：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖：半乳糖之構成比為5：5：22：43：104；(2)分子量：2.9×104 Da；(3)構成單位：由半乳糖1,6鍵結為主與其他單醣鍵結構成；(4)鍵結種類：由果糖以T-進行鍵結、甘露糖以T-進行鍵結、半乳糖以T-、1,6及1,3,4進行鍵結、葡萄糖以1,2,4進行鍵結、阿拉伯糖以1,2,4進行鍵結；(5)官能基：含多醣體的特殊官能基Poly-OH，及-COOH的C=O，且含有α-D-半乳糖與β-D-半乳糖；及(6)結構鑑定：含有α-D-果糖-(1→、α-D-甘露糖-(1→及α,β-D-半乳糖-(1→的結構；其中該Antrodia camphorata NPU-50菌株係寄存於食品工業研究所，寄存編號為BCRC930127。
  2. 依申請專利範圍第1項所述之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，其係由牛樟芝菌絲體固態醱酵物之粗多醣體，經分離純化製得。
  3. 依申請專利範圍第2項所述之牛樟芝菌絲體固態醱酵 產物之單一多醣體ACP-1，其中，該牛樟芝菌絲體固態醱酵物係由該Antrodia camphorata NPU-50菌株進行固態醱酵得之。
  4. 依申請專利範圍第1項所述之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，其中，該分子量係以高效能液相層析儀(HPLC)進行測定。
  5. 依申請專利範圍第1項所述之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，其中，該鍵結種類係以氣相層析質譜儀(GC/MS)進行分析。
  6. 依申請專利範圍第1項所述之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，其中，該官能基係以傅立葉紅外線光譜儀進行分析。
  7. 依申請專利範圍第1項所述之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1，其中，該結構鑑定係以核磁共振(NMR)進行分析鑑定。
  8. 一種牛樟芝菌絲體固態醱酵產物多醣體ACP-1抗體，其中，該抗體專一性辨識一抗原，該抗原係如申請專利範圍第1項所述之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ACP-1。
  9. 依申請專利範圍第8項所述之牛樟芝菌絲體固態醱酵產物多醣體ACP-1抗體，其中，該抗體係為多株抗體。
TW99130552A 2010-09-09 2010-09-09 牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－１及其抗體 TWI394837B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW99130552A TWI394837B (zh) 2010-09-09 2010-09-09 牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－１及其抗體

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW99130552A TWI394837B (zh) 2010-09-09 2010-09-09 牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－１及其抗體

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201211261A TW201211261A (en) 2012-03-16
TWI394837B true TWI394837B (zh) 2013-05-01

Family

ID=46764220

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW99130552A TWI394837B (zh) 2010-09-09 2010-09-09 牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－１及其抗體

Country Status (1)

Country Link
TW (1) TWI394837B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106723054A (zh) * 2016-11-15 2017-05-31 林树芳 一种多糖蛋白肽口服液及制作方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030148517A1 (en) * 2000-11-13 2003-08-07 Jinn-Chu Chen Preparation and compositions for antrodia camphorata mycelium biologically active material
TW200638867A (en) * 2005-05-06 2006-11-16 Golden Biotechnology Corp Incubation and application methods for the culture of antrodia camphorata

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030148517A1 (en) * 2000-11-13 2003-08-07 Jinn-Chu Chen Preparation and compositions for antrodia camphorata mycelium biologically active material
TW200638867A (en) * 2005-05-06 2006-11-16 Golden Biotechnology Corp Incubation and application methods for the culture of antrodia camphorata

Also Published As

Publication number Publication date
TW201211261A (en) 2012-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Comparison of antitumor activities of different polysaccharide fractions from the stems of Dendrobium nobile Lindl
Dong et al. In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis
Grienke et al. European medicinal polypores–A modern view on traditional uses
Lau et al. Ethnomedicinal uses, pharmacological activities, and cultivation of Lignosus spp.(tiger׳ s milk mushrooms) in Malaysia–A review
Wu et al. Characterization of bioactive polysaccharides from Cordyceps militaris produced in China using saccharide mapping
Wu et al. Characterization of water and alkali-soluble polysaccharides from Pleurotus tuber-regium sclerotia
Kralovec et al. Immunostimulatory principles from Chlorella pyrenoidosa—Part 1: Isolation and biological assessment in vitro
KR101467903B1 (ko) 흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 면역증강제
Tsai et al. Finding of polysaccharide-peptide complexes in Cordyceps militaris and evaluation of its acetylcholinesterase inhibition activity
Bae et al. Changes of ginsenoside content by mushroom mycelial fermentation in red ginseng extract
Wu et al. Effect of various extracts and a polysaccharide from the edible mycelia of Cordyceps sinensis on cellular and humoral immune response against ovalbumin in mice
KR102036282B1 (ko) 신규한 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 DU.LAB.H01를 이용한 바다제비집-홍삼 복합 발효물 및 이의 제조방법
WO2019205662A1 (zh) 一种蛹虫草培养基多糖及其分离纯化方法和用途
JP2003081863A (ja) 楠茸の菌糸体生物活性物質、その組成物質及びその製造方法
Xiang et al. Therapeutic efficacy of a polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis on hypertensive rats
Gao-Sheng et al. Accumulation of biomass and four triterpenoids in two-stage cultured Poria cocos mycelia and diuretic activity in rats
KR101356611B1 (ko) 고추잎 발효식초 및 이의 제조방법
CN111410699B (zh) 西藏灵芝多糖glp-3及其制备方法与应用
TWI394837B (zh) 牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－１及其抗體
KR100796303B1 (ko) 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법
KR20120075214A (ko) 곤충유래 헤파린대체 제제 조성물의 제조방법 및 이의 용도
TWI398518B (zh) 牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－３
TWI398519B (zh) 牛樟芝菌絲體固態醱酵產物之單一多醣體ａｃｐ－２
He et al. Structural characteristics and immunomodulation activity of a polysaccharide from purslane (Portulaca oleracea)
Hikino et al. Isolation and Hypoglycemie Activity of Oryzarans A, B, C, and D: Glycans of Oryza sativa Roots1

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees