KR100796303B1

KR100796303B1 - 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법

Info

Publication number: KR100796303B1
Application number: KR1020070062755A
Authority: KR
Inventors: 박동기; 하야시 토시미쑤
Original assignee: 박동기
Priority date: 2007-06-26
Filing date: 2007-06-26
Publication date: 2008-01-21

Abstract

본 발명은 키토산 및 생약 추출물에 대두를 침지 시키는 대두침지단계와; 상기 대두침지단계후에 침지된 대두를 발아시키는 대두발아단계와; 상기 대두발아단계후에 그 발아된 대두에 동충하초 종균을 접종시켜 일정기간 배양하는 종균배양단계와; 상기 종균배양단계후에 종균이 배양된 대두를 동결 건조 후 발아대두 동충하초를 생산하는 동충하초생산단계와; 상기 동충하초생산단계후에는 발아대두 동충하초의 유효성분을 용매를 사용하여 물, 또는 용매로 추출하는 유효성분 추출단계를 포함하여 구성되는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법을 제공한다.

상기와 같은 본 발명은 발아대두 동충하초로부터 수용성 고분자 분획으로부터 Influenza A의 항 바이러스효과를 확인하였고, 특히 Cormilan이란 성분을 분리하여 이 성분이 Influenza A에 대한 항 바이러스 효과가 뛰어남을 밝혔으며, 또한, 본발명의 발아대두 동충하초가 Influenza A 감염에 뛰어난 효과를 발휘함이 밝혀져 주류독감 예방 및 치료제로 개발할 수 있는 효과도 있다.

발아대두 동충하초, Cormilan, influenza A 바이러스

Description

조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법{manufactruring method of the germiated soybean Cordyceps militaris having a bird flu preventing function}

도 1은 발아대두 동충하초의 생산방법 및 공정을 설명하는 설명도.

도 2는 발아대두 동충하초 열수 추출물의 액체 크로마토 그래피(LC)의 프로파일(profile)을 설명하는 설명도.

도 3은 발아대두 동충하초의 다당류 분획으로부터 cormilan의 분리 정제를 설명하는 설명도.

도 4는 cormilan의 HPLC 및 전기영동 패턴을 설명하는 설명도.

도 5는 마우스에 Infulenza A 바이러스를 재 감염시킨 다음 나타난 중화항체유도활성을 설명하는 설명도.

본 발명은 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법에 관한 것으로, 특히 발아대두에 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)버섯 종균을 접종시켜 발아대두 동충하초를 생산하고 그 생산된 발아대두 동충하초로부터 다당류를 분리, 정제시키므로써, 그 분리 정재된 다당류중 Cormilan의 항 바이러스를 통해 조류독감을 예방할 수 있는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 동충하초는 중국, 일본 등지에서 일찍이 불로장생의 비약으로 알려져 있고, 이를 이용하여 아편 해독제, 병후 보양 및 강장제, 폐병 치료제, 면역증강제 등으로 그 가치를 인정받고 있다. 뿐만아니라, 전세계적으로도 미래의 식량자원으로서 균류에 대한 관심이 집중되면서 특히, 동충하초균과 같은 고등균류에 대한 연구가 기초적인 연구뿐만 아니라 이를 이용하여 식품, 의약품 및 천연농약제제로서 상품화 연구가 진행 중에 있다. 그리고, 한국내에서는 번데기 동충하초(Cordyceps militaris)와 눈꽃동충하초(누에동충하초, Paecilomyces tenupis)를 번데기나 누에에서 인공배양에 성공하여 실용화되고 있으며, 최근 암, 뇌졸중, 심장병과 같은 성인병에 대한 예방 및 개선효과가 발견되어 무한한 잠재력을 가진 소재로 각광받고 있다. 또한, 상기와 같은 동충하초에서 유래된 코디세핀(Cordycepin), 다당체 등의 각종 생리활성 성분이 B cell 활성증가, 마크로파지 탐식능 활성화 등에 관여하여 항암효과를 나타냄이 보고되고 있다. 그리고, 상기와 같은 동충하초로부터 밝혀진 유효활성 물질로는 Cordycepin, D-mannitol, quinic acid 등과 함께 다량의 다당체 등이다.

그런데, 상기와 같은 종래 동충하초의 재배방법은 누에번데기를 비롯한 곤충류에 균주를 접종시켜 배양한 것이 대부분이고, 발아대두에 종균을 접종시켜 생산 된 식물성 동충하초를 생산하는 것은 전무하였으며, 또한, 상기와 같은 동충하초의 다당류를 분리 정제하는 것이 전무하므로 그에 따라 그 동충하초의 효능, 특히 항 바이러스성 활성에 대한 효능을 활용하지 못한다는 문제점이 있었다.

이에 본 발명은 상기와 같은 제반 문제점을 해결하기 위해 발명된 것으로, 발아대두에 밀리타리스 동충하초 종균을 접종시켜 식물성 동충하초인 발아대두 동충하초를 제조하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 또다른 목적은 발아대두 동충하초로부터 다당류인 Cormilan을 분리, 정제하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법을 제공하는데 있다.

더나아가, 본 발명의 다른 목적은 면역 생화학적 연구 자료를 제공함과 더불어 다당류인 influenza A virus에 대한 면역기능을 활용하여 조류독감을 예방시키는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명은 키토산 및 생약 추출물에 대두를 침지 시키는 대두침지단계와;

상기 대두침지단계후에 침지된 대두를 발아시키는 대두발아단계와;

상기 대두발아단계후에 그 발아된 대두에 동충하초 종균을 접종시켜 일정기간 배양하는 종균배양단계와;

상기 종균배양단계후에 종균이 배양된 대두를 동결 건조 후 발아대두 동충하 초를 생산하는 동충하초생산단계와;

상기 동충하초생산단계후에는 발아대두 동충하초의 유효성분을 용매를 사용하여 물, 또는 용매로 추출하는 유효성분 추출단계를 포함하여 구성되는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 첨부된 예시도면에 의거 상세히 설명한다.

본 발명의 방법은 대두침지단계(S1)로 진행하여 키토산 및 생약 추출물에 대두를 침지 시킨다. 그리고, 상기 대두침지단계(S1)후에 대두발아단계(S2)로 진행하여 침지된 대두를 발아시킨다. 그리고, 상기 대두발아단계(S2)후에 종균배양단계(S3)로 진행하여 그 발아된 대두에 동충하초 종균을 접종시켜 일정기간 예컨대, 약 6주동안 배양한다.

여기서, 상기 종균배양단계(S3)중의 배양기간은 6주을 포함한다.

한편, 상기 종균배양단계(S3)후에 동충하초생산단계(S4)로 진행하여 종균이 배양된 대두를 동결 건조 후 발아대두 동충하초를 생산한다.

그리고, 상기 동충하초생산단계(S4)후에는 추출단계(S5)로 진행하여 발아대두 동충하초의 유효성분을 물, 또는 용매로 추출한다.

여기서, 상기 추출단계(S5)에는 용매를 메탄올, 에탄올, 부탄올 등 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤중 어느하나를 사용하는 용매선택단계를 더 포함한다.

그리고, 상기 추출단계(S5)에는 메탄올, 에탄올, 부탄올 등 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤중 어느하나와 물을 혼합한 혼합 용매를 사용하여 동충하초의 유 효성분을 추출하는 혼합용매사용단계를 더 포함한다.

또한, 상기 추출단계(S5)에는 용매로 물을 사용하여 추출할 경우, 4～6시간 추출 후 얻어진 발아대두 동충하초의 추출물중 잔사(추출되지 않은 성분)를 여과하여 제거 한 다음 그 추출된 유효성분만을 취해서 열풍 혹은 동결건조시켜 발아대두 동충하초 고형분을 얻는 고형분 추출단계를 더 포함한다.

여기서, 상기 추출단계(S5)중의 용매는 용질의 4～8배가 적합하다.

한편, 상기 상기 추출단계(S5)후에 최종검토단계(S6)로 진행하여 산출된 고형물의 추출물중에 수용성의 주성분인 다당류의 성분이 있는지를 규명하고, 이 다당류 분획의 항 바이러스 활성을 비교,검토한 다음 대두발아 동충하초를 최종산출한다.

여기서, 상기 최종검토단계(S6)에는 다당류 분획의 Herpes와 influenza A 바이러스의 억제 실험을 통해서 각 분획물, 혹은 단일 물질의 항 바이러스(조류독감바이러스) 효과를 세포 및 동물실험을 통해서 규명하는 효과규명단계를 더 포함한다.

또한, 상기 최종검토단계(S6)에는 추출된 동충하초를 사용한 이차 감염 후 항체 유도 활성을 측정하여 바이러스 감염 예방 효과를 검토하는 예방효과검토단계를 더 포함한다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 다만, 이하의 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일뿐, 본 발명 의 범위가 이하의 실시예로만 제한 되는 것은 아니다.

<실시예 1>

발아대두 동충하초의 생산법

발아대두 동충하초 생산방법은 도 1에 도시된 바와같이 대두를 0.01%의 키토산과 0.01% 농도의 황기 추출물이 함유된 용액에 하루 침지 시킨 뒤 싹이 튼 발아대두에 멸균 후 선발된 동충하초 균주를 접종한다. 배지습도는 65%로 유지하고, 배양 온도는 28～30℃로 유지하면서 30～60일 동안 배양한 다음, 열풍 건조시켜 발아대두 동충하초를 생산한다.

<실시예 2>

발아대두 동충하초 추출물의 액체 크로마토 그래피(LC)의 프로파일( profile )

건조 발아대두 동충하초를 4～10배의 물을 넣고 80～120℃에서 6～12시간 열수 추출 후 추출물의 LC profile은 도 2에 도시된 바와같이 나타난다.

<실시예 3>

다당류 분획으로부터 Cormilan 의 분리 정제

발아대두 동충하초 열수추출물을 도 3에 도시된 바와같이 투석(dialysis)시켜 남은 성분(CH)를 2번의 Toyopeal DEAE(650m)를 이용한 이온교환과 Sephacryl S-500의 겔 여과를 통해서 분자량 5.76×105인 Cormilan을 단리하였다. 그리고, 상기 분리된 Cormilan의 HPLC 및 전기영동 패턴을 통해서 도 4에 도시된 바와같이 단일 물질임을 확인하였다.

상기 Cormilan의 당 조성은 표 1과 같았다.

표 1은 발아대두 동충하초로부터 분리한 cormilan 의 당조성.

상기 주요 당쇄의 구조는, 표 2와 같이 →5-Araf-(1→,→4)-Galp-(1→), (→4)- Gal Ap-(1→) 였다.

표 2는 cormilan의 주된 당쇄의 구조.

<실시예 4>

발아대두 동충하초의 조류 독감 억제 효과

발아대두 동충하초로부터 고분자, 저분자 분획 및 Cormilan에 대한 조류독감(Influenza A) 바이러스 억제효과를 검토한 결과 표 3과 같았다. 항 바이러스 효과는 고분자 분획이 저분자 분획보다 높게 나타났으며, 정확한 비교를 위한 Selectivity index 상에서도 고분자 다당류 분획이 높게 나타남으로써 자체 독성을 배제한 순수한 항 바이러스 효과는 고분자 다당류 분획임을 알 수 있었다. Cormilan은 저분자 분획보다는 높은 항 바이러스 효과를 나타냈으며, 완전히 감염된 이후보다 infection과 동시에 첨가하는 경우에 항 바이러스 효과가 높게 나타났다.

표3은 발아대두 동충하초로부터 분리한 고분자 및 저분자 분획과 cormilan에 대한 조류독감 바이러스의 억제 효과.
여기서, 상기 [표 3]중“CH" 은 “hot water extract”을 의미하고, "CL"은 “acidic polysaccharid”을 의미한다.

<실시예 5>

Influenza A 바이러스 감염 마우스에 대한 Cormilan 의 효과

Influenza A 바이러스 감염에 의한 치사율을 검토한 결과 표 4와 같이 물만 먹인 경우 70%의 치사율을 나타낸 반면, cormilan 투여 시 치사율이 18%로 줄어 들었다.

표4는 Infuenza A 바이러스 감염 마우스에 대한 cormilan의 치유효과.

<실시예 6>

Cormilan 의 Influenza A 바이러스 재 감염에 대한 억제 효과

마우스에 Influenza A 바이러스를 재 감염시켜 중화항체(neutralizing antibody)유도활성을 조사한 결과 도 5에 도시된 바와 같았다. 혈청중의 항체의 활성은 Influenza A 바이러스 감염을 50% 저해하는 농도를 기준으로 하였다. cormilan을 투여시 중화항체의 유도활성은 40,000정도로 물만 투여한 대조군에 비해 현저히 높게 나타났다. 특히 현재 지금까지 유일하게 널리 쓰여지고 있는 항 Influenza A 제재인 osmeltamivic 의 경우보다 4배이상 높게 나타나, cormilan은 이차 감염 되었을 때 항 Influenza A 바이러스로서 뛰어난 효과를 확인할 수 있었다.

여기서, 상기 본 발명에 사용되는 대두는 양질의 식물성 단백질을 많이 함유하고 있으며, 필수아미노산과 비타민 등이 풍부하며 레시틴, 이소플라본 등 각종 생리활성효능을 가진 성분들이 밝혀지면서 혈행개선, 갱년기 여성치료, 고지혈증 치료 등에 널리 사용되고 있다.

그리고, 상기와 같은 대두, 현미 등 각종 발아시킨 곡류에서 GABA, 아라비녹실란 등과 같은 각종 생리활성성분이 함유되어 있음이 밝혀져 새로운 소재로 부각되고 있다.

본 발명은 발아시킨 현미에 상황버섯을 접종하여 배양시켜 균사체를 제조하는 기술을 확립하고 천연 상황버섯보다 높은 항암 및 면역조절 효과를 나타냄을 확인함으로써 발아시킨 곡류로부터 각종 균사체의 생리활성 시너지 효과가 나타남을 확인하였다(한국특허등록번호 제0334248호 참조).

본 발명에 의하면, 발아대두 동충하초 추출물 중 수용성 다당류 분획에 함유된 Cormilan이 조류독감의 예방 및 치료에 사용할 수 있다는 것이다.

이상 설명에서와 같이 본 발명은 발아대두 동충하초로부터 수용성 고분자 분획으로부터 Influenza A의 항 바이러스효과를 확인하였고, 특히 Cormilan이란 성분을 분리하여 이 성분이 Influenza A에 대한 항 바이러스 효과가 뛰어남을 밝혔으며, 또한, 본발명의 발아대두 동충하초가 Influenza A 감염에 뛰어난 효과를 발휘함이 밝혀져 조류독감 예방 및 치료제로 개발할 수 있는 효과도 있다.

Claims

키토산 및 생약 추출물에 대두를 침지 시키는 대두침지단계와;

상기 대두침지단계후에 침지된 대두를 발아시키는 대두발아단계와;

상기 대두발아단계후에 그 발아된 대두에 동충하초 종균을 접종시켜 30 ~ 60일간 배양하는 종균배양단계와;

상기 종균배양단계후에 종균이 배양된 대두를 동결 건조 후 발아대두 동충하초를 생산하는 동충하초생산단계와;

상기 동충하초생산단계후에는 발아대두 동충하초의 유효성분을 물, 또는 용매로 추출하는 유효성분 추출단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 추출단계후에는 산출된 고형물의 추출물중에 수용성의 주성분인 다당류의 성분이 있는지를 규명하고, 이 다당류 분획의 항 바이러스 활성을 비교,검토한 다음 대두발아 동충하초를 최종산출하는 최종검토단계를 더 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 종균배양단계에는 그 배양기간이 6주인 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 추출단계에는 용매를 에탄올 이나 부탄올이 포함된 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤중 어느하나를 사용하는 용매선택단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 추출단계에는 에탄올 이나 부탄올이 포함된 알코올, 에틸아세테이트, 아세톤중 어느 하나와 물을 혼합한 혼합 용매를 사용하여 동충하초의 유효성분을 추출하는 혼합용매사용단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 추출단계에는 용매로 물을 사용하여 추출할 경우, 4 내지 6시간 추출 후 얻어진 발아대두 동충하초의 추출물중 잔사(추출되지 않은 성분)를 여과하여 제거 한 다음 그 추출된 유효성분만을 취해서 열풍 혹은 동결건조시켜 발아대두 동충하초 고형분을 얻는 고형분 추출단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 추출단계에는 용매가 용질의 4 내지 8배로 설정되는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 최종검토단계에는 다당류 분획의 Herpes와 influenza A 바이러스의 억제 실험을 통해서 각 분획물, 혹은 단일 물질의 항 조류독감바이러스 효과를 세포 및 동물실험을 통해서 규명하는 효과규명단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 최종검토단계에는 추출된 동충하초를 사용한 이차 감염 후 항체 유도 활성을 측정하여 바이러스 감염 예방 효과를 검토하는 예방효과검토단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조류독감 예방기능이 구비된 발아대두 동충하초의 제조방법.