CN115737664B

CN115737664B - 一种具有抗炎活性的元宝枫叶提取物及其制备方法

Info

Publication number: CN115737664B
Application number: CN202310010585.4A
Authority: CN
Inventors: 龙春林; 范彦晓
Original assignee: Minzu University of China
Current assignee: Minzu University of China
Priority date: 2023-01-05
Filing date: 2023-01-05
Publication date: 2023-05-02
Anticipated expiration: 2043-01-05
Also published as: CN115737664A

Abstract

本发明属于医药领域，具体涉及元宝枫叶提取物及在制备抗炎药物或护肤产品的应用，并提供了制备该提取物的方法。所述制备方法，包括获取元宝枫叶片后阴干，阴干后的叶片用粉碎机进行粉碎，过筛后得到元宝枫叶粉末；添加有机溶剂后进行超声辅助提取；得到的浸提液用聚四氟乙烯膜过滤，或用孔径为10‑25μm的滤纸过滤进行过滤，过滤后的滤液用旋转蒸发仪减压条件下浓缩，获得干燥的元宝枫叶提取物。制备的提取物对炎症具有显著的抑制活性。本发明的提取方法，操作极为简便，所需设备、仪器也十分常见、价格便宜，生产成本低，有利于产业化的生产利用。

Description

一种具有抗炎活性的元宝枫叶提取物及其制备方法

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及元宝枫叶提取物作为抗炎药物或护肤产品的用途，并提供了一种制备该提取物的方法。

背景技术

元宝枫（ Acer truncatumBunge）为无患子科（Sapindaceae）槭属的落叶乔木，因其翅果酷似我国古代的金元宝而得名元宝枫。元宝枫自然分布于吉林、辽宁、陕西、北京、内蒙古、甘肃、河北、河南、山东、江苏。该植物在我国民间具有多种传统用途，包括食用、药用、观赏和文化价值等。民族植物学调查发现，蒙古族将元宝枫叶当茶叶长期泡水喝，来治疗高血压、高血脂。朝鲜族将元宝枫叶煮水服用来治疗咳嗽，去火。吉林、内蒙古、陕西和甘肃地区还有直接将元宝枫果实炒熟食用的传统，方法与炒食瓜子或豆子相似，炒熟后，剥去果壳，食其种子。

元宝枫叶、花、种子、种皮及种子油等不同植物部位的提取物或单体化合物具有多种生物活性，如抗菌、抗氧化、抗肿瘤、乙酰胆碱酯酶抑制及脂肪酸合成酶抑制等多种生物活性，活性化合物主要为黄酮类、单宁类、有机酸及生物源挥发性化合物等，尤其是延缓大脑衰老的重要成分神经酸，因此该植物在制药、食品、保健品和化妆品等领域具备较大开发潜力。

虽然元宝枫具有多种利用价值和较好的生物活性，但人们大量利用的却是其观赏价值，对其食用价值、药用价值的关注仍十分有限。且随着现代医疗事业的发展，民间与元宝枫相关的医药知识也濒临丧失，因此亟待对该植物资源的药用价值进行深度挖掘。

十二烷基硫酸钠（SDS），也称为十二烷基硫酸钠盐，是一种具有强清洁能力和强脱脂能力的表面活性剂。它也是最刺激的表面活性剂成分之一，广泛用于清洁、洗发水和沐浴露。然而，由于其强大的脱脂能力，很容易对敏感皮肤造成损害，因此，SDS也是人体皮肤刺激模型贴片试验的常见阳性对照。SDS刺激可诱导表皮炎性细胞浸润，中性粒细胞迁移至皮肤表皮，并诱导皮肤炎症。

HaCaT细胞约占人类表皮细胞的95%。皮肤被细菌和真菌感染后，导致炎症，HaCaT细胞将首先做出反应，然后在皮肤表面表现出各类症状。

皮炎是一种慢性皮肤炎性疾病，表现为严重瘙痒、反复发作和持续时间长。内部或外部因素均可通过破坏皮肤表皮引起皮炎。目前，皮炎的发病机制尚不清楚。免疫系统功能异常被广泛认为是主要原因。临床上使用激素药物和抗组胺药物进行治疗。然而，这些药物副作用大且无法根治。与西医相比，各种传统医疗系统，如中医药，具有长期实践、副作用小以及从根本上调节和治疗疾病的特点。传统药物中寻找治疗皮炎的可靠药物成为一个热门研究课题。

发明内容

目前关于元宝枫叶的抗炎活性研究或相关专利仍然未见报道。为充分挖掘元宝枫的价值，服务人类健康产业，本发明首次证明元宝枫叶提取物作为抗炎药物或护肤产品使用的可能性，由此完成本发明。

本发明因此提供一种具有抗炎活性的组合物，其特征在于，其包括下式所示化合物为活性成分：

其中上述结构式的化合物名称为：（A）山奈酚-3- O- α-L-吡喃鼠李糖苷，（B）槲皮素-3- O- α-L-吡喃鼠李糖苷，（C）山奈酚-3,7-di- O- α-L-吡喃鼠李糖苷，（D）1,2,3,4,6-penta- O-galloyl-β-d-glucose。优选地，各化合物的重量配比为式A: B: C: D =10-15:3-6: 4-8: 7-10。任选地，还包括其他药学上可接受的辅料等其他成分。优选地，各化合物的重量配比为式A: B: C: D=11-13: 4-5: 5-6: 8-9。

本发明提供一种具有抗炎活性的元宝枫叶提取物的制备方法，包括以下步骤：

（1）叶子清洗：采摘新鲜的元宝枫叶片，清洗后阴干；

（2）叶子粉碎：将阴干的叶子用电动粉碎机粉碎，粉碎后的叶子粉末过筛备用；

（3）粉末浸提：加入有机溶剂对叶子粉末进行常温浸提，并用超声辅助提取；

（4）浸提液过滤：将上清液用聚四氟乙烯膜过滤，得到滤液；

（5）减压浓缩：对得到的滤液进行减压浓缩，获得元宝枫叶提取物。

优选地，第（1）步中的叶子是取自7-8月份处于生长旺季的元宝枫的新鲜叶子，清水洗净后，再用去离子水冲洗，然后置于阴凉通风处阴干；第（2）步的叶片用电动粉碎机粉碎后，过40目筛得到叶子粉末，将粉末放置于阴凉干燥处；第（3）步中的有机溶剂是95%乙醇，重复浸提3次，每次24小时；第（3）步中的超声辅助提取时间为15-30分钟，具体操作条件是：频率为20-50 KHz，功率为50-500 W，并确保温度不超过40℃；第（4）过滤方法为：用孔径为0.45/0.22 μ m的聚四氟乙烯膜或尼龙膜过滤，或用孔径为10-25μm的滤纸过滤，除去杂质；第（5）步中采用旋转蒸发仪进行于45-50℃条件进行减压浓缩，减压真空度为8-600mbar。

更优选地，，得到的元宝枫叶提取物控制化合物的重量配比为A: B: C: D=10-15:3-6: 4-8: 7-10；所述各化合物的分子式如下：

。

进一步优选地，还包括将得到元宝枫叶提取物于-20℃封口储存的步骤。

本发明进一步提供所述的制备方法得到的具有抗炎活性的元宝枫叶提取物。

本发明尤其提供所述具有抗炎活性的组合物或所述的具有抗炎活性的元宝枫叶提取物制备抗炎产品中的应用。

具体地，所述抗炎产品是医药品、保健品、食品或日化用品。优选地，所述应用是指用于十二烷基硫酸钠导致的皮肤炎症。

本发明采用SDS诱导HaCaT细胞建立皮肤炎症模型对上述提取物进行抗炎活性研究。研究结果证明，该提取物对SDS所致炎症的抑制作用明显强于空白对照。化学成分研究表明元宝枫种子中具有多种活性成分，例如双黄酮类和单宁类化合物，为阐明其抗炎活性奠定了物质基础，因此有望进一步开发为抗炎药剂。本发明提供了一种具有显著抗炎活性的元宝枫叶提取物及其制备方法，能为治疗SDS导致的皮肤炎症提供了一种天然来源，也能够使元宝枫叶子“变废为宝”，进一步挖掘该植物的价值，进而促进该植物的保护和可持续利用。

本发明对仪器设备要求低，操作方法简易，提取物得率高，所用试剂污染小，对人体毒性小，回收率高，制备成本低。

附图说明

图1元宝枫叶子提取物的制备方法示意图。

图2 化合物A的Hspectrum图谱。

图3 化合物A的Cspectrum图谱。

图4 化合物B的Hspectrum图谱。

图5 化合物B的Cspectrum图谱。

图6 化合物C的Hspectrum图谱。

图7 化合物C的Cspectrum图谱。

图8 化合物D的Hspectrum图谱。

图9 化合物D的Cspectrum图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。

实施例一：提取物的制备实施例

一种具有抗炎活性的元宝枫叶提取物的制备方法（流程示意图见图1）包括以下详细步骤：

（1）叶子清洗：将新鲜采摘的元宝枫叶片用清水冲洗除去灰尘和杂质，之后用去离子水再次冲洗，然后将叶片置于阴凉通风处阴干。

（2）叶子粉碎：阴干的元宝枫叶片用电动粉碎机进行粉碎，得到的粉末过40目筛后自封袋封存，置于阴凉干燥处。

（3）常温浸提：过筛后的粉末用95%的乙醇溶液常温浸提（按1：10的比例，即1g粉末用10 ml溶剂浸泡），２天/次，每5h搅拌10 min。重复提取３次。

（4）过滤、浓缩：浸提液用聚四氟乙烯膜过滤，或用孔径为10-25μm的滤纸过滤进行过滤并合并，将合并后的滤液用旋转蒸发仪进行减压浓缩。

（5）冷冻干燥：浓缩的浸膏用冷冻干燥机干燥，干燥条件为：温度为-80℃，真空压力小于0 . 140 mbar，干燥时间为48 h，干燥后的的元宝枫叶提取物，即为本发明的元宝枫叶提取物，提取物于-20℃封口储存。

实施例二：提取物的活性验证实施例

采用SDS诱导HaCaT细胞炎症模型对元宝枫叶 95％乙醇提取物进行抗炎活性评价。

采用CCK-8法测定上述实施例一中得到的对元宝枫叶提取物对SDS诱导HaCaT细胞炎症抑制活性，具体包括以下步骤：

（1）细胞培养：由中国科学院细胞库提供的HaCaT细胞在25 cm²的细胞培养瓶中于恒温培养箱（37°C，5%CO₂）中培养24小时，其中含有1%双抗10%胎牛血清的DMEM作为培养基。24小时后更换培养基以除去未贴壁细胞，并每1至2天更换培养基，直到细胞贴壁达到70%至80%时，用0.25%EDTA胰蛋白酶消化液消化细胞并传代。

（2）药物配置：由于元宝枫叶提取物为水溶性，可直接溶解在DMEM培养基中，故可用DMEM培养基将提取物进行稀释得到一系列不同浓度的提取物溶液，浓度范围在2-0.1mg/mL。

（3）细胞种板：取对数生长期的HaCaT细胞，用细胞计数仪计数后，将HaCaT细胞悬液调整至8×10⁴个/mL的浓度按每孔100μL接种在96孔板中，以含有不同浓度提取物溶液作为培养基，于培养箱中培养24 h，不含提取物的DMEM培养液作为空白对照，每个处理五个重复。

（4）将96孔板上清液吸出后，每孔加入100 μL含有适当建模浓度SDS（0.1 mg/mL）的DMEM培养HaCaT细胞24小时，检测细胞活力，不含SDS的DMEM培养液作为空白对照，每个处理五个重复。

（5）吸光值测定：24小时后，在96孔板中每孔加入10μL CCK-8溶液，并将其置于培养箱中培养1-2小时。使用多功能酶标仪在450nm波长下的检测吸光度（OD），以计算细胞存活率。

细胞存活率 (%) = OD给药/OD对照×100%

计算结果经统计学处理，见表1。

表1. 元宝枫叶95％乙醇提取物对SDS诱导HaCaT细胞炎症的影响

组别	SDS	95％乙醇提取物+SDS	DMEM
				细胞存活率 (%)	38.8%	<![CDATA[51.7%<sup>*</sup>]]>	62.0%

注：95％乙醇提取物+SDS表明先用含提取物的对HaCaT细胞进行预处理在用适当含量的SDS对细胞进行刺激。与空白对照组相比，*P ＜ 0.05。

实施例三：提取物的化学成分分析

为了测定元宝枫叶的主要化学成分，将元宝枫叶95%乙醇提取物溶于水中。在搅拌和溶解过程中，尽可能少的加入乙醇以增加溶解度，乙醇的最终浓度小于10%。将样品溶液加入预活化的D101大孔树脂，样品1 g∶10 g大孔树脂，然后依次用纯水、20%、40%、60%、80%和95%乙醇溶液进行梯度洗脱。得到六个馏分A-F。用聚酰胺柱（200-300目）分离馏分C样品，并用甲醇-水溶液（v/v为l:1；2:1；4:1）进行梯度洗脱，以获得C_l-C₃组分。用凝胶SephadexLH-20（甲醇∶水为1:1）进一步分离和洗脱组分C₂，得到FrC_2-1-FrC_2-20，FrC_2-7通过薄层硅胶板刮板制备，然后用凝胶Sehadex LH-20在溶剂甲醇中纯化和洗涤，分别获得化合物A和化合物B。使用凝胶Sephadex LH-20分离并用溶剂（甲醇∶水为1:1）洗脱组分C₁，以获得FrC_1-1-FrC_1-20，通过高效液相色谱（HPLC）循环制备分离FrC_1-2后获得的主要点（90%甲醇）继续通过刮板纯化，获得化合物C。此外，将级分C₃分离并用凝胶Sephadex LH-20（甲醇∶水为1:1）洗脱以获得FrC_3-1-FrC_3-20；通过HPLC（80%甲醇）的循环制备分离FrC_3-6，得到化合物D。

通过波谱数据分析和高分辨质谱分析对化合物的结构进行鉴定。图2和图3分别显示化合物A的Hspectrum图谱和Cspectrum图谱。图4和图5分别显示化合物B的Hspectrum图谱和Cspectrum图谱。图6和图7分别显示化合物C的Hspectrum图谱和Cspectrum图谱。图8和图9分别显示化合物D的Hspectrum图谱和Cspectrum图谱。结果表明，化合物A为山奈酚-3- O- α-L-吡喃鼠李糖苷，化合物B为槲皮素-3- O- α-L-吡喃鼠李糖苷，化合物C为山奈酚-3,7-di- O- α-L-吡喃鼠李糖苷，化合物D为1,2,3,4,6-penta- O-galloyl-β-d-glucose。其中化合物A的质量为12 mg，B为4.8 mg，C为5.3 mg，D为8.2 mg。

据报道，化合物A可显著降低支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织中升高的炎性细胞数量，并显著抑制肺和BALF中Th2细胞因子的增加，从而完全维持其抗炎和抗哮喘作用。化合物B作为槲皮素衍生物已显示出抗炎和抗氧化作用。例如，化合物B可抑制TNF-α刺激的HaCaT细胞中细胞因子和趋化因子的产生，还可减弱TNF-β诱导的炎症介质的形成和NF-κB和ERIC的激活。在卡拉胶诱导的小鼠后爪水肿模型中，化合物C也显示出显著的抗炎作用，在50 mg/kg剂量下，化合物3显示出具有强大的抗伤害和抗炎活性，并且没有诱导任何明显的急性毒性和胃损伤。作为具有强抗炎、抗氧化和抗菌活性的多酚化合物，化合物D不仅通过调节细胞活性在单核细胞中显示出抗炎潜力，而且已被证明对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌具有广谱生长抑制作用，MIC在16-32μg/mL之间。综上所述，元宝枫叶片中的活性成分为阐明本发明提取物的抗炎药效奠定了物质基础。

Claims

1.一种元宝枫叶提取物的制备和纯化的方法，其特征在于，

所述元宝枫叶提取物的制备步骤如下：

（1）叶子清洗：采摘新鲜的元宝枫叶片，清洗后阴干；

（3）粉末浸提：加入95%乙醇对叶子粉末进行常温浸提，并用超声辅助提取；

（5）减压浓缩：对得到的滤液进行减压浓缩；

所述元宝枫叶提取物的纯化步骤如下：

将上述浓缩得到的元宝枫叶提取物溶于水中，在搅拌和溶解过程中加入最终浓度小于10%的乙醇以增加溶解度，由此得到样品溶液；按样品溶液1 g∶10 g的比例将样品溶液加入预活化的D101大孔树脂，然后依次用纯水、20%、40%、60%、80%和95%乙醇溶液进行梯度洗脱，分别得到六个馏分A-F；用200-300目聚酰胺柱分离馏分C样品，并用体积比l：1、2：1、4：1的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，以分别获得洗脱组分C_l-C₃；用凝胶Sephadex LH-20以甲醇∶水的比例1:1为作为溶剂进一步分离和洗脱组分C₂，得到FrC_2-1-FrC_2-20，FrC_2-7通过薄层硅胶板刮板制备，然后用凝胶Sehadex LH-20在溶剂甲醇中纯化和洗涤，以分别获得化合物A和化合物B；

以用甲醇∶水的比例为1:1作为洗脱溶剂，使用凝胶Sephadex LH-20分离对洗脱组分C₁进行分离，以获得FrC_1-1-FrC_1-20，以90%的甲醇作为溶剂，通过高效液相色谱循环制备分离FrC_1-2后获得的主要点继续通过刮板纯化，获得化合物C；

以甲醇∶水的比例为1:1作为洗脱溶剂，对洗脱组分C₃分离并用凝胶Sephadex LH-20纯化以获得FrC_3-1-FrC_3-20；以80%甲醇为溶剂，通过高效液相色谱循环制备分离FrC_3-6，得到化合物D；

其中化合物A、B、C和D的分子式如下：

。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，

第（1）步中的叶子是取自7-8月份处于生长旺季的元宝枫的新鲜叶子，清水洗净后，再用去离子水冲洗，然后置于阴凉通风处阴干。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第（2）步的叶片用电动粉碎机粉碎后，过40目筛得到叶子粉末，将粉末放置于阴凉干燥处。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第（3）步中用95%乙醇，重复浸提3次，每次24小时。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第（4）过滤方法为：用孔径为0.45/0.22 μ m的聚四氟乙烯膜或尼龙膜过滤，或用孔径为10-25μm的滤纸过滤，除去杂质。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第（5）步中采用旋转蒸发仪进行于45-50℃条件进行减压浓缩，减压真空度为8-600 mbar。