KR20110078941A - 가래나무의 특이성분으로 알려져 있는 ＰＧＧ을 유효성분으로 염증유도 관련 분자（ＴＮＦ－α，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ ａｎｄ ＴＰＡ）에 의한 피부 염증 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가래나무 (Juglans mandshurica)로부터 유래되는 PGG (1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)을 유효 성분으로 하는 피부염증 질환 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 PGG는 in vitro 상에서 염증유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ)에 의한 피부염증관련 인자 CCL-17/TARC (thymus- and activation-regulated chemokine) 의 발현을 억제 시키고, 유전자 발현을 조절하는 전사인자(NF-κB and STAT1)의 활성화를 억제시켰으며, 또한 in vivo 상에서 TPA 에 의한 귀 부종 억제 및 염증관련 분자 (TNF-α, IL-1β, IL-6) 의 발현을 억제 시키는 바, 염증유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ) 과 TPA에 의한 피부 염증 및 피부 관련 염증 질환의 예방과 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

가래나무, TNF-α, IFN-γ, PGG, CCL-17/TARC, TPA, 전사인자, 피부관련 염증 질환

Description

가래나무의 특이성분으로 알려져 있는 ＰＧＧ을 유효성분으로 염증유도 관련 분자（ＴＮＦ－α，ＩＦＮ－γ，ＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γ ａｎｄ ＴＰＡ）에 의한 피부 염증 질환 치료용 조성물{COMPOSITION COMPRISING PGG AS SPEICIAL COMPONENT OF JUGLANS MANDSHURICA FOR THE PREVENTING INFLAMMATION-RELATED-MOLECULES INDUCED SKIN INFLAMMATORY DISEASES}

본 발명은 가래나무 (Juglans mandshurica)의 특이성분으로 알려져 있는 PGG(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)을 유효성분으로 염증유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ) 과 TPA에 의한 피부 염증 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

현재 피부면역 질환 치료에 사용되는 제제로는 우선 타르제제 (Tar preparation)가 있으나 냄새가 좋지 않으며 건조한 피부를 자극 하는 것으로 알려져 있다(참조: Bruner CR., et al., Dermatol. Online. J., 9(1):2, 2003). 또한 바르거나 먹는 스테로이드 제제의 경우 목, 겨드랑이, 사타구니 등과 같은 엷은 피부에는 사용이 제한 되어 있으며, 사용 양과 기간에 따라서 피부가 얇아 지거나 피부의 탈색 및 발진등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 대표적인 경구용 스테 로이드 제제인 하이드로코티손(Hydrocortisone), 프레드니손(Prednisone), 덱사메타손(Dexamethasone) 등은 스테로이드 성분이다. 이러한 제제는 백내장, 골다공증, 고혈압 등 부작용이 있어 급성·악화를 보이는 경우 사용이 제한되는 단점이 있어서 그 사용이 제한적이다(참조: Seth A and Aggarwal A., Indian. Pediatr. 41:349-57, 2004; Butani L., Ann. Allergy. Asthma. Immunol., 89:439-45; quiz 445-6, 502, 2002). 이와 같은 문제점으로 많은 제약회사들이 non-steroid 계 소염제 개발에도 주력하고 있다. 대표적인 non-steroid 계열의 면역조절 치료제로서 프로토닉(Protopic) 과 엘리델과(Elidel) 같은 치료제가 있는데 이들 역시 바른 직후 가려움증과 화끈거림 있으며, 바이러스성 피부염에는 사용이 제한 되는 단점을 가지고 있다. 특히 2005년 3월 미국 FDA 에서는 이들 약제의 고용량 및 장기간 사용시 부작용에 대한 검토를 요하는 경고가 있는 실정이다. 때문에 최근에는 부작용이 없는 소재를 천연물에서 개발하려는 노력이 진행되고 있다.

이에, 본 발명에서 사용된 천연물 PGG(1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose)는 생물체에 작용하는 탄닌 (tannin)으로, 많은 약제식물에 존재하고 항 산화 작용, 항암작용, 항 바이러스작용과 같은 다양한 생물학적 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(참조: B.M. Choi, et al., Neurosci. Lett, 328:185-189, 2002; L.L. Ho, et al., Eur. J. Pharmacol., 453:149-158, 2002; D.G. Kang, et al., Eur. J. Pharmacol., 524:111-119, 2005; S.J. Lee, et al., Biol. Pharm. Bull., 29:2131-2134,2006).그리고 PGG는 항 염증 활성도 가지고 있다. 하지만 그 기전은 완벽하게 확립되지 않았다. 이전연구에서 PGG가 인간 단핵세포에서 PMA 에 따른 NF-κB 와 IkB 의 활성을 억제함으로써 IL-8의 발현을 조절 하였다(참조: G.S. Oh, et al., Int. Immunopharmacol., 4:377-386, 2004). 또한, PGG가 사람 제대정맥내피세포 (HUVEC)에서 TNF-α 에 의해 유도된 염증 관련 분자 및 부착 분자 (adhesion molecules)의 발현을 억제 하였다(참조: D.G. Kang, et al., Eur. J. Pharmacol., 524:111-119, 2005). 게다가 PGG는 LPS에 의해서 활성화된 대식세포에서 iNOS와 COX-2의 활성을 억제하였다(참조: S.J. Lee, et al., Arch. Pharm. Res, 26:832-839, 2003). 앞선 여러 연구를 종합하여 볼 때, PGG가 다양한 항 염증 활성을 가진 것으로 예상하게 되었다.

이에, 본 발명자들은 효과적으로 피부관련 염증을 억제할 수 있는 물질을 개발 하 고자 예의 연구 노력한 결과, 가래나무과에 속하는 가래나무 (Juglans mandshurica)의 특이성분으로 알려져 있는 PGG(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)가 in vitro 상에서 염증 유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ) 에 의한 염증 관련 키모카인(chemokines) CCL-17 과 CXCL-9,10,11 발현을 억제함과 동시에 그에 관련된 전사인자(NF-κB 와 STAT1)의 활성화를 억제함을 확인하고, in vivo 상에서 TPA 에 의한 귀 부종 억제 및 염증관련 분자 (TNF-α, IL-1β, IL-6) 의 발현을 억제함을 확인 함으로써 본 발명을 완성하였다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 PGG를 유효성분으로 하는 피부염증 질환 치료 및 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 가래나무(Juglans mandshurica)의 특이성분으로 알려져 있는 PGG(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)을 유효성분으로 한다. 본 발명의 PGG는 염증 유도 관련 분자 (TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ) 및 TPA 의한 피부 염증으로 인한 피부 손상을 예방하고, 발생된 피부 염증을 억제 할 수 있으므로, 염증 유도 관련 분자 (TNF-α, IFN-γ and TNF-α/IFN-γ) 및 TPA 에 의한 피부 염증의 예방 및 염증 억제 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose (PGG) 는 생물체에 작용하는 탄닌 (tannin)으로, 많은 약제식물에 존재하고 항 염증, 항 산화 작용, 항암작용, 항 바 이러스작용과 같은 다양한 생물학적 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다(참조: B.M. Choi, et al., Neurosci. Lett, 328:185-189, 2002; L.L. Ho, et al., Eur. J. Pharmacol., 453:149-158, 2002; D.G. Kang, et al., Eur. J. Pharmacol., 524:111-119, 2005; S.J. Lee, et al., Biol. Pharm. Bull., 29:2131-2134,2006).

본 발명의 가래나무 PGG 추출물은 하기와 같이 수득 되었다.

가래나무의 수피를 채취 한 후, 수피를 기건 시킨 후 분말로 제조하여 3.2 kg을 20L유리병에 아세톤-물 (7:3,v/v)용액으로 침지하여 추출하였다. 추출액은 Whatman No. 2 여과지를 사용하여 감압플라스크로 여과하고 여과액은 농축기를 사용하여 40℃에서 농축하여 아세톤을 모두 제거하였다. 농축을 완료 한 후 분획깔떼기상에서 농축액에 n-hexane, CH2Cl2 및 EtOAc를 순차적으로 혼합하여 용해되는 각 부분을 분리하였으며 최종적으로 수용성 분획물을 얻었다. 각각의 분획물은 동결건조하여 분말상으로 제조하였다. 수피 EtOAc용성 분말 28.4 g을 유리컬럼에 Sephadex LH-20으로 충진하고 MeOH-H2O (3:1,v/v)을 용리용매로 사용하여 Fraction collector로 용출액을 모았다. 용출액은 일정 단위로 TLC (DC Plastikfolien cellulose F plates)에 점적하여 6% HOAc (전개용매)에 전개시켜 건조시킨 후 UV 램프 254 nm와 365nm에서 전개된 spot을 관찰하고 FeCl3 발색제 (1% FeCl3 (in EtOH))를 분무하고 가열하여 색을 관찰하였다. 비슷한 Rf (화학적 이동값) 값을 나타내는 부분을 하나의 소분획으로 하여 총 3개의 소분획으로 분리하였다. 그 중 3번째 분획을 메탄올에 재결정하여 PGG (589 mg)을 분리하였다. 화합물의 구조를 분석하기 위하여 NMR은 Bruker Avance DPX 600 MHz 기기를 사용하여 1H-NMR (600MHz), 13C-NMR (125MHz) 및 2D-NMR인 HSQC, HMBC 등을 측정하였으며 분석용매는 TMS를 첨가한 CD3OD (MeOH-d4)를 사용하였다. 분자량은 Voyager-DE STR 기기를 이용하여 MALDI-TOF-MS 스펙트럼을 측정하여 분석하였다.

본 발명자들은, in vitro 상에서 PGG가 염증 유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ) 을 처리한 인간의피부세포주(HaCaT)에서 CCL-17 의 발현을 저해함을 규명 하였다. 또한 chmokines 의 발현을 조절하는 전사인자 NF-κB 와 STAT-1 의 활성화가 PGG 에 의해 효과적으로 억제됨을 알 수 있었다. 게다가, in vivo 상에서 TPA 에 의한 귀 부종 억제 및 염증관련 분자 (TNF-α, IL-1β, IL-6) 의 발현을 억제함을 규명 하였다. 이러한 PGG는 피부염증이 발생한 후에 처리하여 염증을 완화 시킬 수도 있고, 피부염증이 발생하기 전에 처리하여 피부염증을 예방할 수도 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한 되지 않는다는 것은 당업계에서 통상적의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예>

실시예 1: 인간의 피부세포주HaCaT 세포에 미치는 PGG 의 세포독성 및 염증 유도 분자 ( TNF -α, IFN -γ 그리고 TNF -α+IFN-γ)에 따른 CCL -17의 발현에 있어서 PGG 의 억제효과

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose의 화학적 구조(참조: 도 1A)를 갖는 PGG가 인간의 피부 세포주 HaCaT 세포에서 세포독성 정도를 알아보기 위하여, 1.0×10⁵의 세포를 24-웰 마이크로플레이트에 옮기고, 10%(v/v)의 우태아 혈청이 포함된 DMEM에서 12시간 동안 배양하여, 각 농도의 PGG(1, 5, 10 ㎍/ml)을 처리하고, 다시 24시간 동안 배양한 다음, 1mg/ml 농도의 MTT가 포함된 배지를 넣어 준 후 3시간 반응시키고 570nm 에서 흡광도를 측정 하였다(참조: 도 1B). 이 때, 배지에 포함되어 있는 MTT는 살아있는 세포에서 생성되는 미토콘드리아 디하이드로게나제(mitochondria dehydrogenase)에 의해 검붉은 포마잔(formazan)을 생성함으로써, 살아있는 세포의 숫자를 상대적으로 확인하게 한다. 도 1B는 PGG의 농도에 따른 인간의 피부세포주의 세포독성 양상을 나타내는 그래프이다. 도 1B 에서 보듯이, PGG의 농도가 1-10 ㎍/ml 일 때 인간의 피부세포주의 생육에 별다른 영향을 주시 못함을 알 수 있었다. 때문에 PGG 1-10 ㎍/ml 의 농도를 이용하여 다음의 실험을 진행 하였다.

염증유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ)에 의한 CCL-17의 발현에 있어서 PGG의 효과를 알아보기 위하여, 1X10⁶의 인간의 피부 세포주 HaCaT 세포를 6-웰 마이크로 플레이트에 옮기고 10%(v/v)의 우태아 혈청이 포함된 DMEM에서 12시간 동안 배양하여, PBS로 세척한 후 serum free media 1ml에 PGG를 각각 1, 5, 10 ㎍/ml 농도로 1시간 처리 한 후 염증유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α +IFN-γ)를 처리한 다음 4시간(RNA level) 또는 18시간(protein level) 동안 배양 하였다(참조: 도 1C).RNA level에서의 CCL-17의 발현을 확인하기 위하여 Trizol reagent kit(Invitrogen, Gaithersburg, MD)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 주형으로 역전사를 수행하여 cDNA를 수득하였다. 즉, 2ug 에 역전사 완충용액(5mMMgCl2,1mMdNTP,2.5U/ulreversetranscriptase,and2.5uMoligo(dT)15asaprimer(omniscriptRTkit,Qiagen),0.5units의 RNase 억제제, 2.5 uM 올리고(dT)(oligo(dT)) 및 2.5 units 의 역전사 효소를 첨가하여 37°C에서 반응하여 cDNA를 수득 하였다.

수득한 cDNA를 정량하기 위하여, CCL-17을 위한 프로브 1:5'- CTT CTC TGC AGC ACA TCC-3' (서열번호1) 및 프로브 2:5'- AAG ACC TCT CAA GGC TTT G-3'(서열번호2)를 사용하고, 대조군으로서 β-actin을 위한 프로브 3: 5'- GCG GGA AAT CGT GCG TGA CAT T-3' (서열번호3) 및 프로브 4:5'- GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG.-3'(서열번호4)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 DNA는 1% agarose gel에 의해 확인되었다.

또한 단백질 수준에서 PGG의 효과를 알아보기 위하여, PGG를 각각 1, 5, 10㎍/ml 농도로 1시간 처리 한 다음, 염증유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ)를 처리한 후 18시간 동안 배양 하였다. 배지에 존재하는 CCL-17에 대한 단백질 양은 ELISA kit(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 확인 하였다. 96 웰판에 2 ㎍/ml capture 항체 (항-CCL17 항체) 50ul씩을 넣어 2시간 동안 코팅한 후, 1 % BSA 가 포함된PBS로 1시간 동안 블러킹(blocking) 하였다. 이어, 회수된 sample를 각각의 웰에 100 ul넣어 준 후 2시간 동안 반응 시켰다. PBST로 3회 세척 하고 각 웰에 100 ng/well 의 detector 항체 (항-CCL17 항체) 50 ul 를 넣고 2시간 동안 반응시켰다. PBST로 3회 세척하고 HRP가 접합된 항체를 1:200으로 희석하여 50ul씩 넣은 다음 30분 동안 반응시켰다. PBST로 충분히 세척한 후에 기질액(TMB)을 첨가하고 450nm 에서 흡광도를 측정하였다

도 1C에서 보듯이, PGG (1, 5 and 10㎍/ml) 을 1시간 처리 후 염증유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ)를 처리 하였을 때, RNA 와 protein level 모두에서 CCL-17의 발현이 PGG 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있었다.

실시예 2: TNF -α, IFN -γ 그리고 TNF -α+ IFN -γ 에 따른 CCL -17 발현 증가에 있어서 NF -κB( nuclear factor kappa B) 와 STAT1(Signal transducer and activator of transcription 1) 역할

전사인자NF-κB와 STAT1은 TNF-α 와 IFN-γ 에 의해 유도된 염증반응에서 중요한 조절인자(regulator) 이기 때문에(참조: J.E. Darnell Jr, et al., Science, 264:14151421, 1994; A. Dhar, et al., Mol. Cell. Biochem., 234235:185193, 2002), 우리는 먼저 HaCaT 세포주에서 시간 별로 TNF-α 와 IFN-γ 에 의한 NF-κB와 STAT1의 활성을 확인하였다. 전사인자 NF-κB와 STAT1의 활성을 알아 보았다. 1X10⁶의 인간의 피부 세포주 HaCaT 세포를 6-웰 마이크로 플레이트에 옮기고 10%(v/v)의 우태아 혈청이 포함된 DMEM에서 12시간 동안 배양하여, PBS로 세척한 후 serum free media 1ml에 PGG를 10 ㎍/ml 농도로 1시간 처리 한 후 TNF-α (10 ng/ml) 또는IFN-γ (10 ng/ml)또는 TNF-α (10 ng/ml)/IFN-γ (10 ng/ml)를 처리한 다음 15, 30 그리고 60분 동안 배양 하였다(참조: 도 2A). 배양된 세포를 세포 용해 완충용액 (150ml NaCl, 1mM EDTA, 1mM PASF, 1ug/ml leupeptin, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 1% NP-40, 0.25% Sodium deoxycholate) 40ul 를 처리하고, 4℃에서 30분간 방치하였다. 13000 rpm으로 4℃에서 10분간 원심 분리한 후 상층액으로 10% SDS-PAGE를 수행 하였다. 이어 래빗-항-포스포-p65 항체, 래빗-항-IκBa 항체, 래빗-항-포스포-STAT1 항체, 래빗-항-STAT1 항체, 래빗-항-actin 항체를 이용하여 western blot 을 수행 하였다(참조 도2A). 도 2A에서 보듯이, 예측한 대로 TNF-α 에 의해 자극된 세포는 p65의 인산화(phosphorylation) 와 IkB의 분해(degradation)를 증가시켰고, IFN-γ 에 의해 자극된 세포는 STAT1의 인산화가 증가되었다. 또한 TNF-α+IFN-γ 에 의해 자극된 세포는 p65와 STAT1의 인산화가 증가됨을 알 수 있었다. 다음으로 TNF-α+IFN-γ 에 의한 CCL-17의 발현에 있어서 NF-κB 와 STAT1의 역할을 알아보기 위하여 NF-κB inhibitor와 JAK/STAT pathway inhibitor를 사용하였다. 도 1C(proteinlevel,ELISA)와 동일한 방법으로 배양된 인간의 피부 세포주 HaCaT 세포에 NF-κB inhibitors (TLCK 50 μM and BMS345541 25 μM) 또는 JAK/STAT pathway inhibitors (Jak inhibitor I 20 μM, AG490 50 μM, and WHI-P154 30 μM) 1시간 처리 한 다음, TNF-α (10 ng/ml)+IFN-γ (10 ng/ml)를 18시간 동안 배양 하였다(참조: 도 2B). 배지에 존재하는 CCL-17 의 양은 ELISA 를 통해 확인하였다. 도 2B에서 보듯이, 전처리한 NF-κB inhibitor (TLCK, BMS345541)는 TNF-α +IFN-γ 에 따른 CCL17의 발현을 효과적으로 감소시켰다. 또 한 JAK/STAT pathway inhibitor (Jak inhibitor 1, AG490, WHI-P154) 역시 TNF-α +IFN-γ 에 따른 CCL17의 발현을 감소시켰다. 이러한 결과로 HaCaT 세포주에서 TNF-α +IFN-γ 에 따른 CCL17의 발현은 NF-κB와 STAT1의 활성에 의한 것으로 확인 되었다.

실시예 3: TNF -α+ IFN -γ에 따른 세포 내의 신호전달 경로에 있어서 PGG 의 효과

다음은 신호전달 경로에 있어서 PGG의 효과를 알아보기 위하여, 1X10⁶의 인간의 피부 세포주 HaCaT 세포를 6-웰 마이크로 플레이트에 옮기고 10%(v/v)의 우태아 혈청이 포함된 DMEM에서 12시간 동안 배양하여, PBS로 세척한 후 serum free media 1ml에 PGG를 10 ㎍/ml 농도로 1시간 처리 한 후 TNF-α (10 ng/ml)+IFN-γ (10 ng/ml)를 처리한 다음 15분 동안 배양 하였다. 배양된 세포의 핵 추출물(nucleus extract)을 얻기 위하여, 세포배양 플레이트로부터 배양액을 제거하고 미리 준비해 둔 10 ml ice-cold PBS로 2회 세척 한 후 cell scraper로 긁어주어 세포를 회수 하였다. 원심 분리 후 상층액을 제거 하였고 cytosolic extract buffer(10mM HEPES, pH 7.9, 10mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5mMPMSF)를 넣어 준 다음 4℃에서 15분 동안 보관 하였다. 이 후 NP-40를 6.25 % 되게 처리 한 후 suspension 하였다. 13000 rpm으로 4℃에서 2분간 원심 분리 하였다. 하층의 pellet 에 nuclear extract buffer(20mM HEPES, pH 7.9, 0.4M NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 1mM PMSF, 10% NP-40) 넣고 suspension 한 후 10 분 동안 vortex을 하였다. 13000 rpm으로 4 ℃에서 10분간 원심분리 한 후 상층액을 핵 추출물로서 사용 하였다.

얻어진 nuclear extract는 bradford assay 방법으로 단백질의 양을 정량 하였다. nuclear extract 8ug 에 reaction solution(10U/ml poly dI-dC 3.1ul, 50% Glycerol 3.2ul, TB buffer(10mM HEPES(pH 7.9), 100mM KCl, 0.05mM EDTA(pH 8.0), 2.5mM MgCl2, 6% Glycerol) 18ul, 0.2M DTT 4.5ul, H2O 1.2ul) 21ul와 ³²P로 표지된 oligomer 2ul를 넣고 37℃에서 30분간 반응하였다. 반응 후 4% nondenaturing PAGE 를 수행 하였다. gel dryer를 이용하여 gel 을 말린 후 필름을 덮고 필름을 현상하여 EMSA를 수행 하였다(참조: 도 3A). 도 3A에서 보듯이, 5 와 10 ㎍/ml 의 PGG 을 1시간 처리 후 TNF-α+IFN-γ을 처리하였을 때, TNF-α+IFN-γ에 의한 NF-κB DNA binding activity 가 PGG 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있었다. 또한 cell lysates를 얻어 NF-κB 및 STAT1 의 활성을 western blot 통하여 확인하였다. 그 결과 PGG는 TNF-α+IFN-γ 에 의해 증가된 p65의 핵으로의 이동 및 p65 와 STAT1 의 인산화 정도가 PGG 농도에 의존적으로 감소됨을 알 수 있었다(참조: 도 3B, 3C).

또한 우리는 GAS promoter 활성에 대한 PGG의 효능을 확인하기 위하여, pGAS promoter luciferase construct 또는 pCMV-b-galactosidase construct 를 AMAXA nucleofector system (Amaxa biosystems, Germany) 을 이용하여 transfection 한 후 24 시간 동안 배양 하였다. PBS로 세척한 후 serum free media 1ml 에 교환 한 후 IFN-γ (10 ng/ml) 처리 1시간 전에 PGG(1, 5, 10 ㎍/ml)를 처리 하였다. 24 시간 동안 배양 후 luciferase and b-galactosidase 활성을 측정 하였다. 도 3D 에서 보듯이, IFN-γ 에 의한 pGAS promoter 활성 증가가 PGG 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있었다. 이러한 결과를 통하여 TNF-α+IFN-γ 에 따른 CCL-17의 발현에 있어서 PGG의 억제 효과는 NF-κB와 STAT1 모두의 활성억제에 의해 조절 됨을 알 수 있었다.

실시예 4: IFN -γ에 따른 CXCL -9, CXCL -10 그리고 CXCL -11 발현 증가에 있어서 PGG 의 억제효과

Th1 (T helper 1) chemokines인 CXCL-9, 10, 11의 발현은 IFN-γ의 자극에 있어서 STAT과 같은 전사인자의 활성에 조절을 받는다 (참조: N. Kanda, et., Eur. J. Immunol., 37:338350, 2007; N. Kanda, et al., Endocrinology, 148:23172325,2007). 도 3C에서 IFN-γ의 자극에 따른 STAT1 의 활성화가 PGG에 의해 억제 되었으므로, 전사인자 STAT 에 조절 받은 chemokines (CXCL 9, 10 and 11) 의 발현에 있어서 PGG의 효능을 확인 하였다. 도 1C(proteinlevel,ELISA)와 동일한 방법으로 배양된 인간의 피부 세포주 HaCaT 세포에 각각 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ㎍/ml 농도의PGG를 1시간 처리 한 다음, IFN-γ (10 ng/ml)를24 시간 동안 배양 하였다(참조: 도 4A). 배지에 존재하는 chemokines (CXCL-9, 10 and 11) 의 양은 ELISA 를 통해 확인하였다. 도 4A 에서 보듯이, IFN-γ 에 의해 증가된 CXCL-9, 10의 단백질의 발현이 PGG 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있었다. CXCL-11의 단백질의 경우는 우리의 실험환경에서는 생산되지 않았다. 또한, RNA 수준에서 전사인자 STAT 에 조절 받은 chemokines (CXCL 9, 10 and 11) 의 발현에 있어서 PGG의 효능을 확인 하기 위하여 도 1C(RNAlevel,RT-PCR)와 동일한 방법으로 배양된 인간의 피부 세포주 HaCaT 세포에 각각 0.1, 0.5, 1, 5, 10 ㎍/ml 농도의PGG를 1시간 처리 한 다음, IFN-γ (10 ng/ml)를12 시간 동안 배양한 후 cDNA를 수득 하였다(참조: 도 4B). 수득한 cDNA를 정량하기 위하여, CXCL-9을 위한 프로브 5:5'- TGC AAG GAA CCC CAG TAG TGA -3' (서열번호5) 및 프로브 6:5'- GGT GGA TAG TCC CTT GGT TGG -3'(서열번호6)를 사용하고, CXCL-10을 위한 프로브 7:5'- GAA CCT CCA GTC TCA GCA CC-3' (서열번호7) 및 프로브 8:5'- GCT CCC CTC TGG TTT TAA GGA GAT-3'(서열번호8)를 사용하고, CXCL-11을 위한 프로브 9:5'- GCT ATA GCC TTG GCT GTG ATA TTG TG-3' (서열번호9) 및 프로브 10:5'- CTG CCA CTT TCA CTG CTT TTA CC '(서열번호10)를 사용하고 대조군으로서 β-actin을 위한 프로브 3: 5'- GCG GGA AAT CGT GCG TGA CAT T-3' (서열번호3) 및 프로브 4:5'- GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG.-3'(서열번호4)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 DNA는 1% agarose gel에 의해 확인되었다. 도 4B 에서 보듯이, IFN-γ 에 의해 증가된 CXCL-9, 10, 11의 유전자 발현이 PGG 농도 의존적으로 감소됨을 알 수 있었다. 이러한 결과로 HaCaT 세포주에서 PGG는 STAT1의 활성에 따른 신호 경로를 억제함으로써 Th1 chemokines의 발현에 억제 효능이 있음이 확인 되었다.

실시예 5: TPA (12-O- tetradecanoylphorbol -13- acetate ) 에 따른 생쥐 귀 부종에 있어서 PGG 의 억제 효과

앞선 실시예 1-4 에서 보듯이, 세포수준에서 PGG 의 염증관련 키모카인의 발현 억제 및 기작을 확인 하였다. 이러한 PGG 의 억제 효과가 동물 수준에서도 나타나는지를 확인 하기 위하여 생쥐의 귀 부종 정도를 면역조직염색 (Hematoxylin and Eosin (H&E) staining) 과 귀 두께 및 무게를 측정 하였다. 생쥐의 귀에 TPA (1 ㎍/ear) 를 1 시간 동안 처리 후 PGG 각각 100, 200, 400 (㎍/ear) 을 하루에 한 번 3일 동안 하였다. 4일 째 되는 날에 귀 부종 정도를 측정하였다. 우선 면역조직염색을 위해서 실험동물은 질소와 산소 혼합가스가 들어있는 3% isoflurance로 마취시킨 후 관류 세척하였다. 관류세척이 끝난 후, 적출된 장기는 paraformaldehyde를 함유한 0.1MPBS(pH7.4)으로 고정하고 고정이 끝난 조직은 조직을 떼어내어 4% paraformaldehyde 용액에 담가 보존하였다. 조직을 embedding medium (Reichert-Jung, Germany)으로 포매하고 동결박절기 (cryostat; Reichert-Jung, Germany)를 이용하여 section한 다음 사용하였다. 조직 절편은 0.01MPBS(PBS)로 10 분간 완충시킨 후 다시 증류수로 10분간 세척하였다. 7분씩 2회 PBS로 세척을 한 다음 조직내의 내인성 과산화효소 (peroxidase)를 제거하기 위해서 0.5% 과산화수소가 함유된 PBS 용액에서 20분간 반응시켰다. 이후 PBS로 7분씩 회 세척한 후 비-특이적 반응을 방지하기 위하여 조직을 PBS에 들어있는 5% 정상 염소 혈청에 30분간 반응시킨 다음 통상적인 streptavidin-biotin peroxidase 법을 이용한 면역조직화학반응을 실시하여 면역조직염색을 하였다. 도 5A 에서 보듯이 TPA 에 의해 유도된 귀 부종이 PGG 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. 또한 귀 부종 정도를 두께 (참조: 도 5B)와 무게(참조: 도 5C)를 측정함으로써 그 정도를 정량적으로 확인한 결 과 PGG 에 의해 유의성 있게 귀의 두께와 무게 모두 회복시키는 것을 알 수 있었다.

실시예 6: 생쥐의 귀에서 TPA 에 따른 염증관련 유전자( proinflammatory ) 발현에 있어서 PGG 의 억제 효과

TPA 에 의해 면역 반응이 일어난 생쥐 귀 조직에서 IL-1β, COX-2, iNOS, TNF-α, IL-6 등과 같은 염증관련 유전자(proinflammatory gene)등이 발현 되는 것으로 알려져 있다. 따라서 TPA에 의해 유도된 귀 부종에서 이러한 proinflammatory gene 발현에 PGG 의 효과를 확인하기 위하여 도 5 와 동일한 방법으로 TPA 및 PGG를 처리한 다음 생쥐의 귀 조직에서 protein extract 얻어 ELISA assay 를 수행 하였다. 도 6A-C 에서 보듯이, TPA 에 의해 유도된 염증관련 분자 (TNF-α, IL-1β, IL-6) 의 생성이 PGG 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다. 또한 RNA 수준에서 염증관련 유전자 발현에서 PGG 의 효과를 확인하기 위하여, 도 5 와 동일한 방법으로 TPA 및 PGG를 처리한 다음 생쥐의 귀 조직에서 RNA를 얻은 후 cDNA를 수득 하였다. 수득한 cDNA를 정량하기 위하여, TNF-α을 위한 프로브 11:5'-ACAAGCCTGTAGCCCACG-3'(서열번호11) 및 프로브 12:5'-TCC AAA GTA GAC CTG CCC 3'(서열번호12)를 사용하고, IL-1β을 위한 프로브 13:5'-TGCAGAGTTCCCCAACTGGTACATC-3'(서열번호13) 및 프로브 14:5'-GTGCTGCCTAATGTCCCCTTGAATC-3'(서열번호14)를 사용하고, IL-6을 위한 프로브 15:5'-CAAGAAAGACAAAGCCAGAGTCCTT-3'(서열번호15) 및 프로브 16:5'-TGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3'(서열번호16)를 사용하고 대조군으로서 β-actin을 위한 프로브 17: 5'-GGA CAG TGA GGC CAG GAT GG-3' (서열번호17) 및 프로브 18:5'-AGTGTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3'(서열번호18)를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 DNA는 1% agarose gel에 의해 확인되었다. 도 6D 에서 보듯이, TPA 에 의해 유도된 염증관련 유전자 (TNF-α, IL-1β, IL-6) 의 발현이 PGG 농도 의존적으로 억제됨을 알 수 있었다.

도 1 은 인간의 피부세포주HaCaT 세포에 미치는 PGG의 세포독성 및 TNF-α, IFN-γ 그리고 TNF-α+IFN-γ 에 따른 CCL-17의 발현에 있어서 PGG의 억제효과를 나타내는 사진이다.

도 2 은 TNF-α, IFN-γ 그리고 TNF-α+IFN-γ 에 따른 CCL-17 발현 증가에 있어서 NF-κB(nuclear factor kappa B) 와 STAT1(Signal transducer and activator of transcription 1) 역할을 나타내는 Western-blot 과 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)사진이다.

도 3은 TNF-α+IFN-γ 에 따른 세포 내의 신호전달 경로에 있어서 PGG의 효과를 나타내는 EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay), Western-blot 그리고 promoter assay 사진이다.

도 4은 IFN-γ 에 따른 CXCL-9, CXCL-10 그리고 CXCL-11 발현 증가에 있어서 PGG의 억제효과를 나타내는RT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 과 ELISA 사진이다.

도 5은 TPA 에 따른 생쥐 귀 부종에 있어서 PGG 의 억제 효과를 면역조직염색(H&E staining)과 귀 두께 및 무게 측정치를 나타내는 사진이다.

도 6은 생쥐의 귀에서 TPA 에 따른 염증관련 유전자(proinflammatory gene) 발현에 있어서 PGG 의 억제 효과를 나타내는 RT-PCR(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) 과 ELISA 사진이다.

Claims (3)

1. PGG을 유효성분으로 하고, 염증 유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ) 및 TPA 에 의한 피부 염증 및 피부 손상을 치료하는 치료용 조성물
2. 제 1항에 있어서, 염증 유도 관련 분자(TNF-α, IFN-γ and TNF-α+IFN-γ)에 의한 전사인자 NF-κB(nuclear factor kappa B) 와 STAT1(Signal transducer and activator of transcription 1)의 활성화 증가에 따른 피부염증 및 피부 손상을 치료하는 치료용 조성물
3. 제 1항 내지 2항 중 어느 한 항에 있어서, 피부염증을 예방하는 예방용 조성물

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