KR20200064624A - 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물은 세포 독성을 나타내지 않고, LPS로 자극된 대식세포의 NO 활성을 억제시키며, 염증 조절 마커인 iNOS 및 COX2, 염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α, MAPK 신호전달 인자 p-JNK, p-p38 및 p-ERK, 염증 관련 전사 인자 p-NFκB 및 p-IκB 의 발현을 억제시키고, 베타-헥소사미니다제 분비량을 감소시키며, Type I 및 Type IV 알러지 동물모델에서 항알러지 효과를 나타내므로, 염증성 질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
염증(inflammation)이란 외부 감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻한다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식하면 조직 내의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정 중 발생하는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입받은 조직 내로 융해되어 농양이 형성된다. 염증에 의한 농양의 치료는 소염작용을 통하여 촉진될 수 있는데, 소염작용이란 항균제를 이용하여 침입균의 증식을 억제하거나 농양 중에 축적된 이물질들을 탐식하는 대식세포(macrophage)의 상기 이물질들을 소화 및 배설하는 기능을 항진시키는 등의 염증치료 촉진작용이다.
지금껏 일류가 개발한 약제 중 가장 강력한 항염작용을 지니고 있는 약제는 스테로이드 제제이나, 이는 장기 사용 시 부작용을 수반하게 된다. 따라서 염증 치료에 있어 스테로이드제는 처음 사용할 때 놀라울 정도의 효과를 발휘하여 증상을 완전 소실시켜버리지만 이는 잠시일 뿐이고, 스테로이드 사용을 중지함과 함께 증상은 다시 나타나며 반복사용과 함께 더욱 심해져 간다. 스테로이드제의 부작용으로는 둥근 다혈성의 얼굴, 체액의 저류, 부신억제, 감염에 대한 감수성의 증가와 기타 정신병, 백내장, 녹내장, 소화성 궤양, 창상치유지연, 초기 감염의 재활성화 등이 있다.
따라서 천연식물 추출물을 유효성분으로 포함하는 의약품과 같이, 별도의 정제 과정 없이 안전하게 섭취할 수 있으며 염증을 억제할 수 있는 효과가 있는 물질에 대한 연구가 필요한 실정이다. 지금까지 다래 추출물을 이용한 알레르기 치료제, 천연초 선인장 발효추출물을 이용한 알레르기성 피부염 치료제, 특정 유산균을 이용한 항염증 질환 치료제 개발 등이 이루어져 왔다.
동충하초는 겨울에 곤충의 체내에 서식하면서 양분을 흡수하고 여름이 되면 곤충 밖으로 자실체가 성장하는 것으로, 분류학상 자낭균강(Ascomycota), 맥각균목 (Clavicipitales), 맥각균과(Calvicipitaceae)에 속하며 전세계적으로 현재까지 약 800여 종이 알려져 있고 이 중 국내에서 채집 및 분류된 것은 약 80여종이다. 동충하초는 인삼, 녹용과 더불어 중국의 3대 보약 중의 하나로 불로장생 및 강장의 비약으로 알려져 있으며, 기능성 지표물질인 코디세핀이 다량 존재하고 노화억제, 피로회복과 같은 효능이 있는 것으로 보고되어 있다.
이에, 본 발명자들은 항염증 효과를 나타내는 천연물 소재를 찾기 위해 노력하던 중, 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물이 LPS로 자극된 대식세포의 NO 활성을 증가시키고, 염증 관련 사이토카인 또는 MAPK 신호전달경로 인자의 발현을 저해하며, 베타-헥소사미니다제 분비량을 감소시키고, 알러지 동물모델에서 항알러지 효과를 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물의 염증성 질환의 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 피부외용제를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 제공한다.
또한, 본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 피부외용제를 제공한다.
본 발명의 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물은 세포 독성을 나타내지 않고, LPS로 자극된 대식세포의 NO 활성을 억제시키며, 염증 조절 마커인 iNOS 및 COX2, 염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α, MAPK 신호전달 인자 p-JNK, p-p38 및 p-ERK, 염증 관련 전사 인자 p-NFκB 및 p-IκB 의 발현을 억제시키고, 베타-헥소사미니다제 분비량을 감소시키며, Type I 및 Type IV 알러지 동물모델에서 항알러지 효과를 나타내므로, 염증성 질환의 치료, 예방 또는 개선에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 ON89A 균주의 16S rRNA 염기서열을 이용한 동정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 발효하지 않은 발아서목태에서 배양한 동충하초(GRC) 및 발아서목태 동충하초 발효물의 에탄올 추출물(GRC-ON89A EtOH)의 총 폴리페놀(A) 및 플라보노이드(B) 함량을 확인한 결과이다.
도 3은 LPS로 자극된 대식세포에서 발아서목태 동충하초 발효물의 에탄올 추출물의 헥산 분획물(Hex), 에틸 아세테이트 분획물(EA), 부탄올 분획물(BuOH) 또는 물 분획물(Water)에 의한 NO 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 GRC-ON89A Hex에 의한 iNOS, COX2, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA의 발현 변화를 확인한 결과이다:
A: RT-PCR 결과;
B: RT-PCR 결과를 정량화한 그래프.
도 5는 GRC-ON89A Hex에 의한 iNOS 및 COX2 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다:
A: 웨스턴 블롯 결과;
B: 웨스턴 블롯 결과를 정량화한 그래프.
도 6은 GRC-ON89A Hex에 의한 MAPK 신호전달 인자인 p-JNK, p-p38 및 p-ERK 및 염증 관련 전사 인자 p-NFκB 및 p-IκB 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다:
A: 웨스턴 블롯 결과;
B: 웨스턴 블롯 결과를 정량화한 그래프.
도 7은 GRC-ON89A Hex의 처리 농도에 따른 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase) 분비량 변화를 확인한 결과이다:
Con(-): 무처리군
Con(+): 음성 대조군
pp2: 양성 대조군(src 티로신 키나아제 억제제 처리군).
도 8은 PCA로 유도된 1형 알러지 동물모델에서 GRC-ON89A Hex에 의한 혈관투과성 변화를 확인한 결과이다:
A: 에반스 블루 염색한 마우스의 귀 모습;
B: 에반스 블루 염색 결과를 정량적으로 나타낸 결과.
도 9는 DNFB로 유도된 4형 알러지 동물모델에서 GRC-ON89A에 의한 귀 조직의 두께 변화를 확인한 결과이다:
A: 마우스의 염증성 부종 결과 및 H&E 염색된 마우스 귀 조직의 현미경 사진;
B: 마우스 귀 조직 내 침윤한 면역세포의 수;
C: 마우스 귀 조직의 두께;
D: 마우스 귀 조직에서의 염증성 사이토카인의 발현을 확인한 RT-PCR 결과.
도 10은 GRC-ON89A Hex에 의한 세포 독성을 확인한 결과이다.
도 2는 발효하지 않은 발아서목태에서 배양한 동충하초(GRC) 및 발아서목태 동충하초 발효물의 에탄올 추출물(GRC-ON89A EtOH)의 총 폴리페놀(A) 및 플라보노이드(B) 함량을 확인한 결과이다.
도 3은 LPS로 자극된 대식세포에서 발아서목태 동충하초 발효물의 에탄올 추출물의 헥산 분획물(Hex), 에틸 아세테이트 분획물(EA), 부탄올 분획물(BuOH) 또는 물 분획물(Water)에 의한 NO 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 GRC-ON89A Hex에 의한 iNOS, COX2, IL-1β 및 TNF-α의 mRNA의 발현 변화를 확인한 결과이다:
A: RT-PCR 결과;
B: RT-PCR 결과를 정량화한 그래프.
도 5는 GRC-ON89A Hex에 의한 iNOS 및 COX2 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다:
A: 웨스턴 블롯 결과;
B: 웨스턴 블롯 결과를 정량화한 그래프.
도 6은 GRC-ON89A Hex에 의한 MAPK 신호전달 인자인 p-JNK, p-p38 및 p-ERK 및 염증 관련 전사 인자 p-NFκB 및 p-IκB 단백질의 발현 변화를 확인한 결과이다:
A: 웨스턴 블롯 결과;
B: 웨스턴 블롯 결과를 정량화한 그래프.
도 7은 GRC-ON89A Hex의 처리 농도에 따른 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase) 분비량 변화를 확인한 결과이다:
Con(-): 무처리군
Con(+): 음성 대조군
pp2: 양성 대조군(src 티로신 키나아제 억제제 처리군).
도 8은 PCA로 유도된 1형 알러지 동물모델에서 GRC-ON89A Hex에 의한 혈관투과성 변화를 확인한 결과이다:
A: 에반스 블루 염색한 마우스의 귀 모습;
B: 에반스 블루 염색 결과를 정량적으로 나타낸 결과.
도 9는 DNFB로 유도된 4형 알러지 동물모델에서 GRC-ON89A에 의한 귀 조직의 두께 변화를 확인한 결과이다:
A: 마우스의 염증성 부종 결과 및 H&E 염색된 마우스 귀 조직의 현미경 사진;
B: 마우스 귀 조직 내 침윤한 면역세포의 수;
C: 마우스 귀 조직의 두께;
D: 마우스 귀 조직에서의 염증성 사이토카인의 발현을 확인한 RT-PCR 결과.
도 10은 GRC-ON89A Hex에 의한 세포 독성을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 동충하초는 배양한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 일례로 통상적으로 건강식품으로 사용되는 동충하초의 건조 분말, 구체적으로 동충하초의 자실체 분말, 동충하초의 균사체 분말 또는 이들의 혼합을 사용하거나, 발아 곡류에서 배양한 것, 구체적으로 발아서목태(rhynchosia nulubilis)에서 배양한 것을 사용할 수 있다.
상기 동충하초는 번데기동충하초(Cordyceps militaris), 박쥐나방과(Hepialidae)의 유충에서 나온 동충하초(Cordyceps sinensis), 왕잠자리동충하초(Hymenostilbe odonatae), 노린재동충하초(Cordyceps nutans), 풍뎅이동충하초(Tilachlidiopsis nigra), 눈꽃동충하초(Paecilomyces japonica), 거품벌레동충하초(Cordyceps tricentri) 및 벌동충하초(Cordyceps sphecocephala) 등을 모두 포함할 수 있고, 구체적으로 번데기동충하초일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 발아서목태 동충하초 발효물은 발아서목태에서 배양한 동충하초에 유산균을 처리하여 발효시킨 것일 수 있고, 상기 유산균은 카르노박테리움(Carnobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptoccccus), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 바이셀라(Weissella) 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 등을 포함할 수 있고, 구체적으로 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarium), 락토바실러스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 및 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria) 등을 포함할 수 있으며, 더 구체적으로 수탁번호 KFCC 11786P로 기탁된 페디오코커스 펜토사세우스 ON89A(Pediococcus pentosaceus ON89A) 균주일 수 있다.
상기 발아서목태 동충하초 발효물 제조 시, 동충하초의 수분함량은 35 내지 45%, 37 내지 43%, 또는 39 내지 41%일 수 있다. 상기 유산균은 상기 동충하초에 15 내지 25%(v/w), 17 내지 23%(v/w), 또는 19 내지 21%(v/w)로 접종될 수 있다. 발효 온도는 36 내지 39℃, 또는 36 내지 38℃일 수 있고, 발효 시간은 36 내지 60시간, 42 내지 54시간, 또는 46 내지 50시간일 수 있다. 구체적으로, 상기 발아서목태 동충하초 발효물은 수분함량이 35 내지 45%인 동충하초에 유산균을 15 내지 25%(v/w)로 접종하고 36 내지 39℃에서 36 내지 60시간 동안 발효시킨 것일 수 있다.
상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용할 수 있고, 구체적으로 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용할 수 있다. 상기 추출용매를 발아서목태 동충하초 발효물 분량에 5 내지 15배 첨가하여 추출할 수 있고, 구체적으로 8 내지 12배 첨가하여 추출할 수 있다. 추출온도는 20 내지 40℃일 수 있고, 구체적으로 20 내지 30℃일 수 있고, 더 구체적으로 25 내지 30℃일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 추출시간은 1일 내지 5일일 수 있고, 구체적으로 2일 내지 4일일 수 있고, 더 구체적으로 30 내지 40시간일 수 있다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회일 수 있고, 구체적으로 1 내지 3회 반복 추출할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압 농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있다.
본 발명의 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물의 분획물은 상기 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 유기용매로는 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 또는 물일 수 있다. 상기 분획물로는 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 단계적으로 첨가한 후, 각 용매 첨가 단계에서 가용성 분획을 획득한 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올 분획물, 및 상기 부탄올 분획물을 제거하고 남은 물층을 농축한 물 분획물이 모두 사용가능하나, 구체적으로 헥산 분획물일 수 있다.
상기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 천식, 아토피 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 발아서목태 동충하초 발효물(GRC-ON89A)은 배양하지 않은 발아서목태 동충하초(GRC)보다 코디세핀, 베타-글루칸 및 SCFA(short chain fatty acid)의 함량이 증가함을 확인하였다(표 1 내지 표 3 참조). 또한, 상기 발아서목태 동충하초 발효물의 에탄올 추출물(GRC-ON89A EtOH)은 발효하지 않은 발아서목태 동충하초(GRC)보다 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증가하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명의 GRC-ON89A EtOH을 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 가하여 수득한 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물 분획물을 LPS로 자극된 대식세포에 처리하였을 때, 헥산 분획물(GRC-ON89A Hex)이 NO 활성을 유의적으로 억제하였다(도 3 참조).
또한, GRC-ON89A Hex은 세포 독성을 나타내지 않고, 염증 조절 마커인 iNOS 및 COX2의 mRNA와 단백질의 발현을 감소시키고, 염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현, MAPK 신호전달경로 인자 및 염증 관련 인자의 단백질 발현을 감소시키며, 알러지 유발원인인 탈과립률을 감소시켰다(도 4 내지 도 7 및 도 10 참조).
또한, GRC-ON89A Hex은 1형 알러지 동물모델에서 조직의 혈관투과성을 감소시키고, 4형 알러지 동물모델에서 조직의 두께를 감소시켰다(도 8 및 도 9 참조).
따라서, 본 발명의 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물은 염증성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 전체 중량에 대하여 유효성분인 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 주사제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 분획물은 상기 서술한 바와 같다. 구체적으로, 상기 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 발아서목태 동충하초 발효물은 발아서목태에서 배양한 동충하초에 유산균을 처리하여 발효시킨 것일 수 있고, 상기 유산균은 카르노박테리움(Carnobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 스트렙토코커스(Streptoccccus), 엔테로코커스(Enterococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 류코노스톡(Leuconostoc), 페디오코커스(Pediococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 바이셀라(Weissella) 및 프로피오니박테리움(Propionibacterium)속 등을 포함할 수 있고, 구체적으로 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarium), 락토바실러스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 류코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), 스트렙토코커스 살리바리우스(Streptococcus salivarius), 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis) 및 바이셀라 사이바리아(Weissella cibaria) 등을 포함할 수 있으며, 더 구체적으로 수탁번호 KFCC 11786P로 기탁된 페디오코커스 펜토사세우스 ON89A(Pediococcus pentosaceus ON89A) 균주일 수 있다.
상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C1 내지 C2 저급 알코올을 이용할 수 있고, 구체적으로 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압 농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있다.
본 발명의 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물의 분획물은 상기 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 유기용매로는 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 또는 물일 수 있다. 상기 분획물로는 헥산, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 단계적으로 첨가한 후, 각 용매 첨가 단계에서 가용성 분획을 획득한 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물, 및 상기 부탄올 분획물을 제거하고 남은 물층을 농축한 물 분획물이 모두 사용가능하나, 구체적으로 헥산 분획물일 수 있다.
상기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 천식, 아토피 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물은 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증제를 제공한다.
상기 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물은 상기 서술한 바와 같다.
아울러, 본 발명은 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 피부 외용제를 제공한다.
상기 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물은 상기 서술한 바와 같다.
상기 피부 외용제에서 본 발명의 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물은 전체 외용제 총 중량에 대하여 0.001 내지 5 중량%의 함량으로 배합하여 사용할 수 있고, 단독으로, 또는 비슷한 활성을 갖는 다른 화합물을 함께 배합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
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실시예
1> 유산균의 선별
동충하초(Cordyceps militaris) 발효물을 제조하기에 앞서, 발효물 제조에 적합한 유산균을 선별하고자 하였다.
동충하초는 발아서목태(rhynchosia nulubilis)에서 배양한 발아서목태 동충하초(GRC. Cordyceps militaris grown on germinated Rhynchosia nulubilisa, Kucati: 0093, (주)세포활성연구소, 성남시, 경기도)를 이용하였으며, 유산균은 식품(김치, 젓갈, 단호박, 양파, 장아찌 등)으로부터 분리하였다. 구체적으로, 각 식품 시료 0.5~2 g을 멸균생리식염수(3M, USA) 5~12 mL에 현탁한 후 이를 희석하여 BCP 평판 측정용 배지(plate count agar; 에이켄 케미컬, 일본)에 30~60 μL씩 도말하였다. 이를 35~39℃에서 20~27시간 배양한 후 노란색 환이 생성된 단일 집락을 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주 중에서 발아서목태 동충하초에서 생장할 수 있는 균주를 선별하기 위해, 각 균주를 발아서목태 동충하초를 포함하는 고체배지(0.5~2%(w/v)의 발아서목태 동충하초, 1~2% 한천에 이쑤시개를 이용하여 접종하고 집락을 형성하는지 확인하였다. 발아서목태 동충하초에서 생육활성이 우수한 균주를 2차 선별한 뒤, 이들 중 발효 시 우수한 생리활성을 나타내는 균주를 더 선별하기 위해 각 균주의 DPPH 라디칼 소거능을 측정하였다. 이를 위해, 멸균된 발아서목태에 2차 선별된 각 균주를 접종하고 20~27시간 동안 배양한 후, 13,200 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 각 균주의 발아서목태 동충하초 발효액을 수득하였다. 수득된 발효액의 DPPH 소거능을 측정하기 위해, 각 발효액 70~120 μL을 동량의 333 μM DPPH 용액(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl, 시그마 알드리치, 미국)에 첨가하고 암소에서 30분 동안 반응시킨 뒤 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로 1 mM의 아스코르브산(시그마 알드리치, 미국)을 사용하였고, 아래의 계산식에 적용하여 DPPH 소거능(%)을 산출하였다.
DPPH 라디칼 소거능 활성(%) = 
A = 샘플 테스트 (DPPH + 각 시료, A450 nm)
B = Blank (시료 + 메탄올, A450 nm))
C = 대조군 (DPPH + 증류수, A450 nm)
1차 선별 결과, 총 313종의 균주가 분리되었으며, 그 중 발아서목태 동충하초에서 생육 활성이 우수한 균주 81종을 2차 선별하였다. 2차 선별된 균주는 Pediococcus 속, Weissella 속, Enterococcus 속, Lactobacillus 속, Lactococcus 속에 해당되며, 낙지젓갈에서 25균주, 양파에서 19균주, 더덕장아찌에서 12균주, 고구마에서 6균주, 우엉장아찌와 감장아찌에서 각각 4균주, 브로콜리와 조개젓갈에서 각각 3균주, 단호박에서 2균주, 서리태콩에서 1균주가 분리되었다. 2차 선별된 균주 81종 중에서 10종의 균주의 DPPH 활성을 비교하였다. 그 중 ON89A 균주의 DPPH의 소거능이 약 99.4%로 가장 높은 활성을 나타냈다.
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실시예
2> 유산균의 동정
최종 선별된 유산균 ON89A를 동정하기 위해 16S rRNA 염기서열을 분석하였다.
구체적으로, Lactobacilli MRS 액체배지(Difco, 미국)에 단일 집락을 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양액 3 mL을 13,200 rpm에서 1분간 원심분리하여 균체를 얻고, 상등액을 제거하였다. 이후 AccuPrep Genomic DNA Extraction kit(바이오니어, 한국)를 이용하여 제조사의 실험방법에 따라 균주의 게놈 DNA(genomic DNA)를 분리하였다. 게놈 DNA을 Wizard genomic DNA purification kit (프로메가, 미국)를 이용해 정제한 후 16S rRNA 유니버셜 프라이머(universal primer)인 27F(서열번호 1: 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R(서열번호 2: 5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT-3') 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel 및 PCR clean-up system(프로메가, 미국)을 이용하여 정제하고, 정제된 PCR 산물은 마크로젠(한국)에 의뢰하여 ABI PRISM 3700 DNA Analyzer로 염기서열을 분석하였다. 염기서열 결과는 BLASTN 프로그램을 이용하여 GenBank의 ribosomal DNA 염기서열과 비교하였으며, 염기서열의 상동성은 Clustal X 와 Mega 5 program을 이용하여 비교 분석하였다.
그 결과, ON89A 균주의 16S rRNA 서열(서열번호 3)은 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) DSM20과 높은 상동성을 나타내었다(도 1). 따라서, 최종 선별된 ON89A 균주를 페디오코커스 펜토사세우스 ON89A(Pediococcus pentosaceus ON89A)로 명명한 후, NCBI의 Genbank에 등록(KX387352)하고 2018년 8월 17일자로 한국미생물보존센터에 상기 균주를 기탁하였다 (기탁번호 KFCC11786P).
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실시예
3>
페디오코커스
펜토사세우스
ON89A로
발효시킨
발아서목태
동충
하초의 발효물(GRC-ON89A) 제조
동충하초는 발아서목태(rhynchosia nulubilis)에서 배양한 발아서목태 동충하초 (GRC, Kucati: 0093, (주)세포활성연구소, 성남시, 경기도) 1 kg 에 40% (v/w)의 수분을 가하고, 121℃에서 15분 동안 가열하였다. 가열한 발아서목태 동충하초에 페디오코커스 펜토사세우스 ON89A 균주를 20%(v/w)의 농도로 접종하고 37℃에서 48시간 동안 발효하여, 페디오코커스 펜토사세우스 ON89A로 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물(이하 GRC-ON89A)를 제조하였다.
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실시예
4>
GRC
-
ON89A의
분획물
제조
<4-1>
GRC
-
ON89A
에탄올 추출물(
GRC
-
ON89A
EtOH
)의 제조
실시예 3에서 제조한 GRC-ON89A 20 g에 80% 에탄올 200 ml를 첨가하고 27℃에서 3일동안 추출하였다. 상기 추출액을 0.45 μm 필터를 이용하여 여과하고 감압 농축하여 에탄올 추출물(이하 GRC-ON89A EtOH) 20 g을 수득하였다.
<4-2>
GRC
-
ON89A
추출물의
분획물
제조
실시예 4-1에서 제조한 GRC-ON89A의 에탄올 추출물 20 g을 용매를 증발시키고 수득한 잔사에 물과 헥산을 넣어 헥산층을 분리하여 17.12 g의 GRC-ON89A 추출물의 헥산 분획물(이하 GRC-ON89A Hex)을 수득하였다(수율 17.12%(w/w)). 헥산층을 제외한 물층에 에틸 아세테이트를 혼합한 후 에틸 아세테이트층을 분리하여 0.22 g의 에틸 아세테이트 분획물(이하 GRC-ON89A EA)을 수득하였다(0.22%(w/w)). 또한, 에틸 아세테이트층을 제거한 후 부탄올을 혼합하고 부탄올 층을 분리하여 1.58 g의 부탄올 분획물(이하 GRC-ON89A BuOH)을 수득하였다(1.58%(w/w)). 마지막으로 부탄올층을 제거하여 1.10 g의 물 분획물(이하 GRC-ON89A Water)을 수득하였다(1.10%(w/w)).
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비교예
1> GRC의 제조
동충하초는 발아서목태(rhynchosia nulubilis)에서 배양한 발아서목태 동충하초 (GRC, Kucati: 0093, (주)세포활성연구소, 성남시, 경기도) 15 g을 멸균된 증류수 10 ㎖에 첨가하여 녹였다. 녹인 용액을 고온 멸균기에 넣고 121℃가 되도록 15분 동안 가열 멸균한 후, 면포에 여과시켜 여과액을 수득하였다.
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실험예
1>
GRC
-
ON89A의
성분 분석
<1-1> 코디세핀(
cordycepin
)의 함량
실시예 4-1에서 제조한 GRC-ON89A EtOH에서 동충하초 약리활성 지표물질인 코디세핀의 함량을 측정하였다.
구체적으로, 동결 건조된 시료(GRC 및 GRC-ON89A EtOH)를 증류수 또는 에탄올 1 mL로 재구성하고 500 μg/mL의 농도로 1.5 ml 튜브에 분주한 후, 회전 진공 농축기(SCANVAC, 한국)를 사용하여 완전히 건조시켜 농축시켰다. 케톤과 알데히드 그룹을 보호하기 위해, 메톡시아민하이드로클로라이드에 녹인 피리딘(40 mg/ml) 5 μl를 넣고 30℃에서 90분 동안 진탕시켰고, 트리메틸 실릴화를 위해, N-메틸-N-트리메틸 실릴 트리플루오로 아세트아미드(MSTFA 1 % TMCS, Thermo) 45 μl를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 준비된 시료를 0.5 μL를 GC 시스템(Agilent 7693 ALS, Agilent Technologies, 미국)에 주입하였다. 컬럼 온도를 50℃에서 1분 동안 일정하게 유지한 다음, 20℃/분의 속도로 330℃까지 증가시키고, 그 온도에서 5분 동안 유지시켰다. MS 분석은 LECO ChromaTOF 소프트웨어 4.50 버전(LECO, 미국)이 장착된 LECO Pegasus HT TOF 질량 분석기로 수행되었다. 데이터 전처리는 정점 질량 값, 전체 스펙트럼, 머무름 시간, 피크 순도 및 신호 대 잡음비 데이터 획득 후 ChromaTOF 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 코디세핀 표준 물질은 시그마 알드리치에서 구입하여 사용하였다.
| GRC | GRC-ON89A EtOH |
| 6.35 μg | 10.45 μg |
그 결과, GRC-ON89A EtOH의 코디세핀 함량은 유산균 발효하지 않은 GRC보다 증가하였다(표 1).
<1-2> 베타-글루칸(beta-
glucan
)의 함량
실시예 4-1에서 제조한 GRC-ON89A EtOH에 존재하는 베타-글루칸의 함량을 측정하였다.
구체적으로, 베타-글루칸의 함량은 Megazyme K-YBGL 키트(Megazyme, Bray, 아일랜드)를 사용하였고 제조사가 제공하는 프로토콜에 따라 분석을 진행하였다.
베타-글루칸 함량 (% w/w) = 총 글루칸 함량 (% w/w) - 알파-글루칸 (% w/w)
총 glucan 함량을 측정하기 위해, 시료를 2시간 동안 얼음에서 12 M H2SO4와 혼합하고 물을 첨가하였다. 강하게 교반한 후, 튜브를 약간 열고 100℃의 물에서 2시간 동안 정치하였다. 시료와 10 M KOH 용액 6 mL를 부피 플라스크에 넣고 200 mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5)으로 부피를 조정하였다. 이를 폴리프로필렌 시험관 튜브에 나누어 1,500×g에서 10 분간 원심분리하였다. Exo-1,3-β-glucanase 및 β-glucosidase 효소를 첨가하고 40℃에서 60 분간 배양하였다. GOPOD 시약을 각 튜브에 첨가하고 40℃에서 20분 동안 배양하였다. 모든 시료의 흡광도를 510 nm에서 측정하였다.
알파-글루칸 함량을 측정하기 위해, 시료를 2 M KOH 및 1.2 M 아세트산나트륨 완충액(pH 3.8)과 혼합하고 0.2 mL의 amylo-glucosidase (1,630 U/mL) 및 invertase (500 U/mL)를 첨가하였다. 40℃에서 30 분 동안 배양 및 혼합한 후, 0.1 mL의 아세트산나트륨 완충제(200 mM, pH 5.0) 및 3 mL의 GOPOD 시약을 첨가하였다. 각 혼합물을 40℃에서 20분 동안 배양하고, 510 nm에서의 모든 샘플의 흡광도를 측정하였다.
| 시료 | 총 글루칸 (g/100 g) |
알파-글루칸 (g/100 g) |
베타-글루칸 (g/100 g) |
| GRC | 19.67±0.24 | 7.86±0.14 | 11.81±0.35 |
| GRC-ON89A EtOH | 24.64±0.91 | 5.38±0.30 | 19.26±0.61 |
그 결과, GRC-ON89A EtOH의 베타-글루칸 함량은 유산균 발효하지 않은 GRC보다 증가하였다(표 2). 이는 새로운 베타-글루칸이 합성되었다기 보다는 발아서목태 동충하초 내 고분자의 베타-글루칸이 발효 과정을 인해 저분자의 베타-글루칸으로 분해된 것으로 판단된다.
<1-3>
SCFA
(short chain fatty acid)의 함량
실시예 4-1에서 제조한 GRC-ON89A EtOH의 SCFA(short chain fatty acid)의 함량을 측정하였다.
페디오코커스 펜토사세우스 ON89A로 발효하기 전과 후의 SCFA 함량 변화를 건국대학교 이충환 교수님 연구실에 의뢰하여 UPLC-Q-TOF-MS 분석으로 측정하였다. Waters Acquity UPLCTM system(Waters Corp., 미국)기기, Waters Acquity BEH C18 컬럼(i.d., 100 mm X 2.1 mm, 1.7 μm particle size)을 사용하였고, 컬럼 온도 37℃, 주입 부피 5μL, 주입 속도 0.3 mL/분 조건에서 수행하였다. 분석에 이용한 용매는 0.1 % Formic acid in Water 와 0.1 % in Formic acid in Acetonitrile 이며, MS 장비는 Waters Q-TOF Premier(Micromass MS Technologies, 영국)를 사용하여 분석하였다. 분석의 용매조건은 0-1분은 5% (B), 10-11분은 100%, 14분은 5%로 조절하여 진행하였다.
| SCFA의 종류 | GRC(μg/ml) | GRC-ON89A EtOH(μg/ml) |
| 아세트산 | 508.0 | 665.0 |
| 프로피온산 | 0.2 | 1.9 |
| 젖산 | 8795.5 | 9155.5 |
그 결과, GRC-ON89A EtOH의 아세트산, 프로피온산 및 젖산의 함량이 유산균 발효하지 않은 GRC보다 증가하였다(표 3).
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실험예
2>
GRC
-
ON89A
EtOH의
총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정
실시예 4-1에서 제조한 GRC-ON89A EtOH의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드의 함량을 측정하였다.
총 폴리페놀 함량은 GRC-ON89A EtOH 50μL, Folin-Ciocalteu 시약 100 μL 및 7 % 탄산나트륨 용액 750 μL과 혼합한 후, 실내 온도에서 30분간 반응시킨 후 720 nm에서 흡광도를 판독하였다. 갈산을 표준 물질로 사용하였다.
총 플라보노이드 함량은 GRC-ON89A EtOH를 50μL와 5%의 아질산나트륨 용액 15 μL를 혼합하고, 5분 후에 10μM의 질산 알루미늄 용액 15μL를 첨가한 다음, 100μL의 1N 수산화나트륨 용액을 첨가하였다. 흡광도는 암실에서 상온에서 11분 동안 반응시킨 후 510 nm에서 판독하였다. 퀘르세틴을 표준 물질로 사용하였으며 그 결과는 GRC 및 GRC-ON89A EtOH의 g 당 QE (mg QE/g)로 기재하였다.
그 결과, GRC-ON89A EtOH의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 유산균으로 발효하지 않은 GRC보다 유의적으로 증가하였다(도 2).
<
실험예
3>
GRC
-
ON89A
EtOH의
분획물에
의한 NO 활성 측정
쥐 유래 대식세포에서 GRC-ON89A EtOH로부터 수득된 각 분획물이 LPS로 자극된 대식세포에서 증가된 NO 활성을 억제하는지 확인하였다.
구체적으로, 쥐 유래 대식세포인 RAW264.7(KCLB No. 40071)세포주가 MEM 배지(FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 1% 포함)가 첨가된 플레이트에 접종하였다. 여기에, 실시예 4-2에서 제조한 GRC-ON89A EtOH의 각 분획물을 0.025, 0.05 또는 0.1%로 처리하였다. 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 2시간 동안 배양한 뒤, 상층액 일부를 취해서 동량의 그리스(1% 술파닐아미드, 0.1% 나프탈렌디아민 디하이드로클로라이드 및 0.5% H3PO4) 시약과 혼합하였다. 이를 10분 동안 어두운 곳에서 반응시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, GRC-ON89A Hex을 처리한 대식세포에서 NO 활성이 유의적으로 억제되었다(도 3).
<
실험예
4>
GRC
-
ON89A
Hex에 의한 염증 관련 인자의
mRNA
및 단백질 발현량 변화 측정
<4-1> 염증 조절
마커
및 염증성 사이토카인의
mRNA
발현량 측정
쥐 유래 대식세포에서 GRC-ON89A Hex에 의한 염증 조절 마커인 iNOS 및 COX2와 염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현량을 측정하였다.
GRC-ON89A Hex를 처리한 RAW 264.7 대식세포 내 total RNA를 분리하기 위해 Trizol regent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하였고, ReverTra Ace® qPCR RT kit(Toyobo, 일본)으로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, 독일)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR 조건은 초기 단계에서 94℃에서 2분, 35주기 반복단계에서 94℃에서 20초, 60℃에서 10초, 72℃에서 30초, 그리고 최종 확장 단계는 72℃에서 5분이었다. 각각의 mRNA 발현량 분석을 위한 프라이머(primer) 서열은 다음과 같다:
iNOS (forward): 5'-CTT CAA CAC CAA GGT TGT CTG CA -3' (서열번호 4);
iNOS (reverse): 5'-ATG TCA TGA GCA AAG GCG CAG AA-3' (서열번호 5);
COX-2 (forward): 5'-AAC CGT GGG GAA TGT ATG AGC A-3' (서열번호 6);
COX-2 (reverse): 5'-AAC TCT CTC CGT AGA ACC TTT TCC A-3' (서열번호 7);
IL-1β (forward): 5'-TAC AAG GAG AAC CAA GCA ACG ACA-3' (서열번호 8);
IL-1β (reverse): 5'- TGT CGT TGC TTG GTT CTC CTT GTA -3' (서열번호 9);
TNF-α (forward): 5'- ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC CG-3' (서열번호 10);
TNF-α (reverse): 5'-CCA AAG TAG ACC TGC CCG GAC TC-3' (서열번호 11);
GAPDH (forward): 5'-CAT ATT TCT CGT GGT TCA CAC CC -3' (서열번호 12); 및
GAPDH (reverse): 5'- CAT ATT TCT CGT GGT TCA CAC CC-3' (서열번호 13);.
RT-PCR의 산물은 1.5% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동되었고, Odyssey LCI Image software (LI-COR Biosciences, 미국)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, GRC-ON89A Hex를 처리한 대식세포에서 염증 조절 마커인 iNOS 및 COX2와 염증성 사이토카인 IL-1β 및 TNF-α의 mRNA 발현이 유의적으로 감소되었다(도 4).
<4-2> 염증 조절
마커
단백질의 발현량 측정
쥐 유래 대식세포에서 GRC-ON89A Hex에 의한 염증 조절 마커인 iNOS 및 COX2 단백질의 발현량을 측정하였다.
쥐 유래 대식세포에 GRC-ON89A Hex)를 처리하고 2시간 후 LPS(Lipopolysaccharides)로 염증 반응을 유도하였다. 각 세포를 인산염 완충식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척한 후 RIPA Lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하였다. 단백질의 농도는 Pierce bicinchonicic acid(BCA) protein assay kit(ThermoFisher Scientific)를 사용하여 측정하였다. 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE(Bio-Rad Laboratories, Inc., 미국)을 사용하여 분리하고 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad Laboratories, Inc., 미국)에 옮긴 후, TBST(Tris-buffered saline plus Tween)으로 만든 5% 스킴 밀크로 1시간 처리하였다. 확인하고자 하는 단백질에 특이적인 1차 항체(Cell signaling, 미국)를 반응시키고, horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체(Anti-goat 혹은 Anti-rabbit antibody, Cell signaling, 미국)를 이용하여 화학발광 검출방법으로 분석하였다. (사용하신 항체의 제품명, 제품번호를 기재 부탁드립니다.)
그 결과, GRC-ON89A Hex를 처리한 대식세포에서 염증 조절 마커인 iNOS 및 COX2 단백질 발현이 유의적으로 억제되었다(도 5).
<
실험예
5>
GRC
-
ON89A
Hex에 의한
MAPK
신호전달 인자 및 염증 인자 단백질 발현량 변화 측정
쥐 유래 대식세포에서 GRC-ON89A Hex에 의한 항염증 작용과 관련된 MAPK 신호전달경로의 신호전달 인자인 p-JNK, p-p38 및 p-ERK와 염증 관련 전사 인자인 p-NFκB 및 p-IκB 단백질의 발현량을 항체(Cell signaling, 미국)를 이용하여 실험예 4-2의 기재된 방법과 동일하게 측정하였다.
그 결과, GRC-ON89A Hex를 처리한 대식세포에서 신호전달 인자인 p-JNK, p-p38 및 p-ERK와 염증 관련 전사 인자인 p-NFκB 및 p-IκB 단백질의 발현이 억제되었다(도 6).
<
실험예
6>
GRC
-
ON89A에
의한 베타-
헥소사미니다제
(beta-
hexosaminidase
) 분비량 변화 측정
쥐 유래 비만세포에서 GRC-ON89A EtOH에 의한 베타-헥소사미니다제(beta-hexosaminidase) 분비량 변화를 측정하여 탈과립률 변화를 확인하였다.
구체적으로, 쥐 유래 비만세포인 RBL-2H3(KCLB NO. 22256)세포주를 MEM 배지(FBS 15%, 페니실린/스트렙토마이신 1% 포함)가 첨가된 100 mm 세포배양접시에 접종하였다. 여기에 IgE를 처리하고 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 다음 날, 배지를 제거하고 시라가니안 버퍼(Siraganian buffer, 25 mM PIPES(pH 7.2), 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.4 mM MgCl2 ·6H2O, 1M MCaCl2, 5.6M glucose, 40mM NaOH, 그리고 0.1% BSA)로 세포를 세척한 후, 시라가니안 버퍼, 실시예 4-1에서 제조한 GRC-0N89A-EtOH를 처리한 후, 항원을 첨가하여 알러지 생성 반응을 확인하였다. 반응이 끝난 뒤, 0.1M의 Na2CO3/NaHCO3 용액을 넣어 반응을 종결시키고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, GRC-ON89A-EtOH가 200 μg/ml 또는 400 μg/ml로 처리된 비만세포는 베타-헥소사미니다제의 분비량이 유의적으로 감소하였다(도 7). 이 때, pp2(Calbiochem, 미국)는 Src 티로신 키나아제 억제제로, 양성 대조군으로 사용하였다.
<
실험예
7> 1형
알러지
동물모델에서
GRC
-
ON89A
Hex의 항염 또는
항알러지
효과 확인
1형(Type I) 알러지 동물모델인 PCA(Passive cutaneous anaphylaxis) 동물모델에서 GRC-ON89A Hex에 의한 귀 조직의 혈관투과성 변화를 측정하였다.
구체적으로, 암컷 BALB/c, C57BL/j 마우스(7주령, 체중 18~20g)를 22±2℃의 온도, 55±5%의 습도, 12시간의 명암주기 하에서 사육하였고, 실험은 가천대학교 실험 동물 윤리 위원회의 심의 하에 수행하였다(GIACUC-R2015014). 0.5 μg의 IgE를 마우스 양쪽 귀에 주사하고 하룻밤 뒤, GRC-ON89A Hex를 경구투여하였다. 1시간 후 1% 에반스 블루(Evans blue)에 0.5 mg/ml 농도로 용해시킨 항원을 마우스 꼬리에 정맥 투여하였다. 1시간 후, 마우스를 희생시키고 귀를 자른 후, 포름아미드(formamide)에 넣고 60℃에서 밤새 정치시켜 귀에 염색된 에반스 블루 염색약의 함량을 620 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.
그 결과, 알러지가 유발된 PCA(+) 대조군 및 GRC 실험군과 비교하여 GRC-ON89A Hex를 경구 투여한 마우스는 알러지 반응에 의한 혈관투과성이 유의적으로 억제되었다(도 8).
<
실험예
8> 4형
알러지
동물모델에서 GRC-
ON89A의
항염 또는
항알러지
효과 확인
4형(Type IV) 알러지 동물모델인 DNFB(dinitrofluorobenzene)로 유도된 접촉성 알러지 피부염 동물모델에서 GRC-ON89A에 의한 귀 조직의 두께 변화를 측정하였다.
7주령의 쥐는 (주)오리엔트 바이오(Eumsung, Republic of Korea)에서 구입하였고, 본 동물실험은 가천대학교(Gyeonggi-do, Republic of Korea)에서 국제동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 지침사항에 의거하여 진행되었다 (GIACUC-R2018001). 각 쥐의 등을 면도하고 아세톤/올리브오일 (4:1, v/v)의 용매로 0.5% DNFB를 제조하고 100 μL씩 1, 2, 3, 5, 7일마다 등에 도포하여 감작시켰다. 9일 경과 후 0.2% DNFB를 우측 귀에 25 μL씩 도포하여 알레르기 반응을 유도하였다. 대조군의 경우 DNFB를 제외한 아세톤/올리브오일 (4:1, v/v)용액을 동일 양으로 처리하였고, 덱사메타손(Dexamethasone, 3mg/kg/day)은 대조 약물로 등에 처리되었고, GRC-ON89A는 10일 동안 25mg/kg/day으로 경구 투여되었다.
9일 경과 후, 각 쥐의 귀 조직을 수득하여 mRNA 분석을 진행하였다. 구체적으로, 귀 조직의 전체(totla) RNA를 분리하기 위해 Trizol regent (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하였고, ReverTra Ace qPCR RT kit(Toyobo, 일본)으로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 QIAGEN Multiplex PCR Kit (Qiagen, 독일)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. RT-PCR 조건은 초기 단계에서 94℃에서 2분, 35주기 반복단계에서 94℃에서 20초, 60℃에서 10초, 72℃에서 30초, 그리고 최종 확장 단계는 72℃에서 5분이었다. 각각의 mRNA 발현량 분석을 위한 프라이머(primer) 서열은 다음과 같다:
iNOS (forward): 5'-CTT CAA CAC CAA GGT TGT CTG CA -3' (서열번호 4);
iNOS (reverse): 5'-ATG TCA TGA GCA AAG GCG CAG AA-3' (서열번호 5);
COX-2 (forward): 5'-AAC CGT GGG GAA TGT ATG AGC A-3' (서열번호 6);
COX-2 (reverse): 5'-AAC TCT CTC CGT AGA ACC TTT TCC A-3' (서열번호 7);
GAPDH (forward): 5'-CAT ATT TCT CGT GGT TCA CAC CC -3' (서열번호 12); 및
GAPDH (reverse): 5'- CAT ATT TCT CGT GGT TCA CAC CC-3' (서열번호 13);.
RT-PCR의 산물은 1.5% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동되었고, Odyssey LCI Image software (LI-COR Biosciences, 미국)를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 알러지가 유발된 DNFB(+) 대조군과 비교하여 GRC-ON89A Hex를 처리한 마우스는 염증성 부종 생성이 억제되고, 침윤된 면역세포의 수가 감소하며, 귀 조직의 두께가 감소하는 것으로 나타났다 (도 9). 또한, 귀 조직 내 mRNA 발현량을 분석한 결과, 대식세포에서 염증 조절 마커인 iNOS 및 COX2 mRNA 발현이 유의적으로 감소되었다 (도 9).
<
실험예
9>
GRC
-
ON89A
Hex의 독성 평가
쥐 유래 대식세포에서 GRC-ON89A Hex의 세포독성을 평가하였다.
쥐 유래 대식세포에 대한 세포독성은 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 분석법(DOJINDO Laboratories, Kumamoto, Japan)을 사용하여 측정되었다. 2×104 세포/웰의 대식세포를 96웰 플레이트에 분주하고 GRC-ON89A Hex를 다양한 농도 (250, 500 및 1000 μg/ML)로 48시간 동안 처리하였다. 그 후, CCK-8 용액을 첨가하고 2시간 동안 배양한 다음, 450 nm에서 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 세포 생존률을 측정하였다.
세포 독성평가 결과, GRC-ON89A Hex는 독성을 나타내지 않았다(도 10).
<110> Cell Activation Research Institute
<120> Pharmaceutical composition for treating or preventing
inflammatory diseases comprising fermented cordyceps militaris
extract or fractions thereof as an active ingredient
<130> 2018P-05-043
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal primer 27F
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> universal primer 1492R
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1441
<212> DNA
<213> Pediococcus pentosaceus
<400> 3
gcagtcgaac gaacttccgt taattgatta tgacgtactt gtactgattg agattttaac 60
acgaagtgag tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccagaa gtaggggata 120
acacctggaa acagatgcta ataccgtata acagagaaaa ccgcatggtt ttcttttaaa 180
agatggctct gctatcactt ctggatggac ccgcggcgta ttagctagtt ggtgaggtaa 240
aggctcacca aggcagtgat acgtagccga cctgagaggg taatcggcca cattgggact 300
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atggacgcaa 360
gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt 420
aaagaagaac gtgggtaaga gtaactgttt acccagtgac ggtatttaac cagaaagcca 480
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 540
ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggtcttt taagtctaat gtgaaagcct tcggctcaac 600
cgaagaagtg cattggaaac tgggagactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt 720
ctgcaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 780
tccatgccgt aaacgatgat tactaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc 840
taacgcatta agtaatccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaagaattg 900
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatcttct gacagtctaa gagattagag gttcccttcg gggacagaat 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttattact agttgccagc attaagttgg gcactctagt gagactgccg 1140
gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200
tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agtcgcgaga ccgcgaggtt aagctaatct 1260
cttaaaacca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg cctacacgaa gtcggaatcg 1320
ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcacacca tgagagtttg taacacccaa agccggtggg gtaacctttt aggagctagc 1440
c 1441
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS forward primer
<400> 4
cttcaacacc aaggttgtct gca 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> iNOS reverse primer
<400> 5
atgtcatgag caaaggcgca gaa 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 forward primer
<400> 6
aaccgtgggg aatgtatgag ca 22
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COX-2 reverse primer
<400> 7
aactctctcc gtagaacctt ttcca 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1beta forward primer
<400> 8
tacaaggaga accaagcaac gaca 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IL-1beta reverse primer
<400> 9
tgtcgttgct tggttctcct tgta 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha forward primer
<400> 10
atgagcacag aaagcatgat ccg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TNF-alpha reverse primer
<400> 11
ccaaagtaga cctgcccgga ctc 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward primer
<400> 12
catatttctc gtggttcaca ccc 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse primer
<400> 13
catatttctc gtggttcaca ccc 23
Claims (16)
- 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 발아서목태 동충하초 발효물은 발아서목태에서 배양한 동충하초에 유산균을 처리하여 발효시킨 것인, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 유산균은 수탁번호 KFCC 11786P로 기탁된 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) ON89A 균주인, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출된, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 분획물은 상기 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물에 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물을 순차적으로 가하여 수득된 것인, 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 천식, 아토피 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제8항에 있어서, 상기 발아서목태 동충하초 발효물은 발아서목태에서 배양한 동충하초에 유산균을 처리하여 발효시킨 것인, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제9항에 있어서, 상기 유산균은 수탁번호 KFCC 11786P로 기탁된 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) ON89A 균주인, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제8항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출된, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제11항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제8항에 있어서, 상기 분획물은 상기 동충하초 발효물의 추출물에 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물을 순차적으로 가하여 수득된 것인, 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제8항에 있어서, 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 천식, 아토피 및 건선으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증제.
- 발아서목태에서 배양한 동충하초를 발효시킨 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 피부외용제.
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| KR1020210037137A KR102314999B1 (ko) | 2018-11-29 | 2021-03-23 | 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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| KR20200064624A true KR20200064624A (ko) | 2020-06-08 |
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|---|---|---|---|
| KR1020180150936A KR20200064624A (ko) | 2018-11-29 | 2018-11-29 | 발아서목태 동충하초 발효물의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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|---|---|
| KR (1) | KR20200064624A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220132726A (ko) * | 2021-03-23 | 2022-10-04 | 박달수 | 발효 동충하초 추출물 및 그 제조방법 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100961217B1 (ko) | 2009-12-24 | 2010-06-03 | 충청남도 | 알레르기성 접촉성 피부염을 예방 및 치료할 수 있는 천년초선인장 발효물 |
-
2018
- 2018-11-29 KR KR1020180150936A patent/KR20200064624A/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR100961217B1 (ko) | 2009-12-24 | 2010-06-03 | 충청남도 | 알레르기성 접촉성 피부염을 예방 및 치료할 수 있는 천년초선인장 발효물 |
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| KR20220132726A (ko) * | 2021-03-23 | 2022-10-04 | 박달수 | 발효 동충하초 추출물 및 그 제조방법 |
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