CN101766662B - 一种高效浓缩虫草菌丝体的工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效浓缩虫草菌丝体的工艺，该工艺采用超声提取得到超声浓缩液，所用条件为：超声温度20～30℃，提取液用质量百分浓度为30～50％的乙醇水溶液，超声时间为25～75min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶10～30kg/L，超声功率与提取罐的体积比为10～30kw/m³，再采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜浓缩，所得浓缩液再在温度≤30℃，真空度为5～10Pa条件下冷冻干燥35～40小时。通过本发明方法浓缩虫草菌丝体得到的浓缩冻干粉主要功效成分均显著提高。

Description

一种高效浓缩虫草菌丝体的工艺

技术领域

本发明属于中药领域，具体涉及一种高效浓缩虫草菌丝体的工艺。

背景技术

冬虫夏草，别名虫草，为麦角菌科虫草属的药用真菌。主产于青海、西藏、四川、云南、贵州等海拔4000m～5000m的山中、草甸土中。它是由冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis sall)寄生在蝙蝠科昆虫蝙蝠蛾(Hepfalus armoricanus oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体产生的复合体，为较常用的名贵中药材之一。

早在清代，吴仪洛在《本草从新》中对冬虫夏草就有翔实的记载：“冬在土中，身活如老蚕，有毛能动，夏至则毛出土上，连身俱化为草”；其性味功用为：“甘、平”“保肺益肾、止血化痰、以劳嗽”。《中华人民共和国药典》2005年版记载，其主要功效是“补肺益肾，止血，化痰；用于久咳虚喘，劳嗽咯血，阳痿遗精，腰膝酸痛”。现代医学研究发现，冬虫夏草具有抑制肿瘤、抗癌和显著提高人体免疫功能等独特功效。现代医学研究冬虫夏草含有免疫活性虫草腺苷、虫草多糖、甘露醇、蛋白质、氨基酸、脂肪酸、维生素和有机硒等多种微量元素，具有提高人体免疫力、耐力、活力、抗疲劳、延缓衰老、抗肿瘤、治疗肾和肺部疾病等多种药用功能。

但是，冬虫夏草有着极其苛刻的寄生性和特殊的生态环境，天然资源十分稀少，加之近年来人为地乱采乱挖，给自然环境造成了巨大的破坏，野生资源逐年萎缩，生态破坏愈演愈烈。冬虫夏草野生资源药材已无法满足人们保健和用药的要求。为了扩大虫草的药源，人们开始探索用人工方法培育仿冬虫夏草。20多年来，我国先后有60多个科研单位、数千人开展人工培育仿冬虫夏草的研究。虽然也有成功进行冬虫夏草蝙蝠蛾系统饲养繁育的报道，但这些距离全人工培育以及产业化尚有多个环节的关键技术有待攻克。不过人们采用新型生物技术液体发酵培养获得冬虫夏草菌丝体的技术已获得成功，并且此技术是目前解决虫草药源的唯一途径。20世纪80年代人们为了拓宽冬虫夏草的药源，专家学者们开展了冬虫夏草菌的人工培养，并对其化学成分、药理作用进行了大量的研究工作。经过大量的化学成分、药理作用研究发现：天然虫草以及虫草菌体中含有活性成分腺苷、甘露醇、生物碱、有机酸、维生素等化学成分，而且二者所含成分十分相近；药理作用研究表明，天然虫草及虫草菌丝制剂均具有良好的免疫调节作用。化学成分及药理作用的研究为天然虫草的替代提供了理论基础，为拓宽天然虫草的资源开辟了有效的途径，使其在医药、保健品的研发和生产展现出广阔的前景。

以下是虫草及其虫草菌丝的药用功能：

(1)增强机体免疫调节功能。资料报导，虫草及其虫草菌丝具有促进T和B淋巴细胞增殖作用，明显抑制小鼠脾细胞对刀豆蛋白A和细菌脂多糖的反应；减少小鼠特异抗体分泌细胞数；降低同种异型抗原诱导的迟发型超敏反应及混合淋巴细胞反应。

(2)抗炎、抗菌、抗病毒及抗肿瘤作用。人工发酵虫草菌丝体的水提液对小鼠，天然虫草对大鼠都具有明显的抗炎作用。虫草中的虫草素具有明显抑菌作用。虫草发酵液中含有耐热的广谱性抗菌物质，能够拮抗革兰氏阴性及阳性菌、芽孢菌和非芽孢菌、链霉菌，对酵母及丝状真菌则没有抗菌活性。虫草对慢性肝炎也有明显的治疗效果。此外，虫草对小鼠艾氏腹水癌、S-180肉瘤、Lewis肺癌、MA-737乳腺癌等肿瘤有明显的抑制作用。

(3)调节心血管功能。虫草有负性频率、降低心肌耗氧量、改善心肌缺血、抗血小板聚集、抗心律失常作用、减慢心率、增加心输出血量和冠脉血量、降低血压、扩张血管的功能，对阿霉素性心肌损伤具有明显的保护作用，能改善冠心病、高血压性心脏病患者左心室舒张功能。人工虫草菌丝体醇提取物和醚提取物抗心律失常作用都较强。虫草制剂对慢性心律失常有效，可提高心率，改善窦房结及房一室传导功能。虫草水提液具有良好的抗触发活动及触发性心律失常的作用。

(4)抗氧化。对冬虫夏草的子实体和虫体两部分的水萃取物的分析表明，化学成分相似，在黄嘌呤氧化酶分析、溶血诱导分析和脂过氧化反应分析中显示出相似的抗氧化活性。使用抗氧化活性指导的离子交换和凝胶过滤色谱分离法，可以从冬虫夏草菌丝培养液中分离到一种分子量约为210的多糖，该多糖具有较强的抗氧化活性。

(5)神经系统调节作用。虫草可明显减少小白鼠自发性活动，延长戊巴比妥钠睡眠时间和镇静、抗惊厥等作用。此外，虫草还具有明显促进机体代谢、调节内分泌功能、抗疲劳、耐缺氧、耐高温和低温作用。

(6)其他功效。冬虫夏草具抗菌、刺激生长、治疗支气管炎等功效。

目前虫草菌丝体中有报道通过水提醇沉工艺提取其中虫草多糖或通过醇提工艺提取其中虫草素，但都较为复杂烦琐且收率较低。而虫草菌丝体中含有多种有效成分，目前比较公认的有虫草素、虫草多糖、虫草酸、各种低分子蛋白质等等，而很难用一种方法将之充分提取浓缩，本发明专利选用超声提取，膜分离，冷却干燥工艺，可充分将其中有效成分富集浓缩且不发生破坏。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效浓缩虫草菌丝体的工艺。

本发明是通过以下方案实施的：

a、超声提取得到超声浓缩液：

超声温度20～30℃，提取液用质量百分浓度为30～50％的乙醇水溶液，超声时间为25～75min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶10～30kg/L，超声功率与提取罐的体积比为10～30kw/m³。

b、膜过滤浓缩：

取上述超声浓缩液，控制温度30℃以下，进行超滤，超滤膜采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜，压力为0.4～0.6MPa，超滤时间3～5小时，得到超滤后的浓缩液，体积为超声浓缩液的30～50％。

c、冷冻干燥：

将超滤后的浓缩液在温度≤30℃，真空度为5～10Pa的条件下冷冻干燥35～40小时。。

本发明优选通过以下方案实施：

a、超声提取得到超声浓缩液：

超声温度25℃，提取液用质量百分浓度30％的乙醇水溶液，超声时间为25min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶20kg/L，超声功率与提取罐的体积比为20kw/m³。

b、膜过滤浓缩：

取上述虫草超声浓缩液放入原料液储槽中，控制温度30℃以下，进行超滤分离，超滤膜采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜，压力控制在0.4～0.6MPa，超滤时间3.5小时，得到起滤后的浓缩液，体积为原提取液的40％。

c、冷冻干燥

将膜过滤浓缩液在温度≤30℃，真空度为5～10Pa条件下冷冻干燥35～40小时，得固体粉末。

本发明采用的参数筛选过程如下：

取虫草菌丝体(人工蛹虫草粉)

(1)超声提取

超声提取工艺正交设计方案，设定的五个考查因素：A超声温度；B.提取液(乙醇浓度)；C.超声时间；D.原料重量/提取液用量(kg/L)；E.超声机功率与提取罐体积比(kw/m³)

表1      提取条件优化设计的因素与水平列表

经实验，以虫草素提取率为考核指标，发现提取液(乙醇浓度)对提取效果影响最大，超声设备功率与提取罐体积比次之，超声温度又次之，原料重量与提取液用量比再次之，超声时间则影响最小。

最终确定最佳超声提取条件为：超声温度25℃，提取液用质量百分浓度为30％的乙醇水溶液，超声时间为25min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶20kg/L，超声设备功率与提取罐体积比为20kw/m³。

(2)膜过滤浓缩

虫草中公认的有效成分主要为虫草素、虫草多糖、虫草酸、必需氨基酸、蛋白质、超氧化物岐化酶等。其中虫草多糖为低分子多糖，蛋白质也为以小分子蛋白质为主，其余成分皆为小分子，单分子类成分。所以可以考虑去除虫草超声提取物中的大分子成分以达到对功效成分富集、浓缩的效果。

膜浓缩工艺中选用了①10000～20000道尔顿，②20000～40000道尔顿，③30000～80000道尔顿的3种聚酰胺卷式膜试验，结果①滤液难以通过，超滤时间过长，③基本未对超滤液起到分离作用，最终选择了②20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜。

具体工艺：

取虫草超声浓缩液放入原料液储槽中，控制温度30℃以下，进行超滤分离，起滤膜采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜，压力控制在0.4～0.6MPa，超滤时间3～5小时(优选3.5小时)，得到超滤后的浓缩液，超滤后的浓缩液体积为原虫草超声浓缩液的40％。

(3)冷冻干燥

将膜过滤浓缩液放入冻干机托盘中，冷冻干燥，温度≤30℃，真空度为5～10Pa，时间约35～40小时，得固体粉末。

超声提取膜分离浓缩冻干粉与原粉进行有效成分的含量对比：

人工蛹虫草粉(浙江长兴制药厂生产)；

超声提取膜分离浓缩冻干粉(按照实施例1方法制备得到)；

虫草素采用2005版《中国药典》中虫草素检测方法；

虫草多糖选用2005版《中国药典》中灵芝多糖的检测方法；

蛋白质选用国家标准GB/T5009.5-2003《食品中蛋白质的测定方法》；

虫草酸、必须氨基酸、超氧化物歧化酶检测方法采用卫生部颁布《保健食品检验与评价技术规范》。

虫草素

虫草多糖

虫草酸

必需氨基酸

蛋白质

超氧化物岐化酶

人工蛹虫草粉

0.007％

1％

6.5％

19.9mg/g

1.5％

10.3u/mi

超声提取膜分离浓缩冻干粉

0.47％

30％

50.2％

168mg/g

19.1％

184.4u/mi

对比倍数

67.1

30

7.7

8.5

12.7

17.9

与现有技术比较本发明的有益效果：通过本发明方法浓缩的虫草菌丝体得到的浓缩冻干粉主要功效成分均显著提高。原虫草药典推荐量为3～9g/人.日，本发明提取物仅需约0.6～1g/人.日即可。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行进一步阐述，所用人工蛹虫草粉均为浙江长兴制药厂生产。

实施例1

取人工蛹虫草粉10kg。

a、超声提取：

超声温度25℃，提取液用质量百分浓度为30％的乙醇水溶液，超声时间为25min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶20kg/L，超声设备功率为20kw，与提取罐体积比为20kw/m³。

b、膜过滤浓缩：

取上述虫草超声浓缩液，控制温度20℃，进行超滤，超滤膜采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜，压力控制在0.4～0.6MPa，超滤3.5小时，得到超滤后的浓缩液，体积为原提取液的40％。

c、冷冻干燥：

将超滤后的浓缩液在温度28℃，真空度为10Pa条件下冷冻干燥35小时，得到固体粉末895g。

实施例2

取人工蛹虫草粉10kg。

a、超声提取：

超声温度25℃，提取液用质量百分浓度为50％的乙醇水溶液，超声时间为50min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶10kg/L，超声设备功率为10kw，与提取罐体积比为10kw/m³。

b、膜过滤浓缩：

取上述虫草超声浓缩液，控制温度22℃，进行超滤，超滤膜采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜，压力控制在0.4～0.6MPa，超滤3.5小时，得到超滤后的浓缩液，体积为原提取液的30％。

c、冷冻干燥：

将超滤后的浓缩液在温度26℃，真空度为5Pa条件下冷冻干燥40小时，得到固体粉末830g。

实施例3

取人工蛹虫草粉10kg。

a、超声提取：

超声温度20℃，提取液用质量百分浓度为40％的乙醇水溶液，超声时间为75min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶30kg/L，超声设备功率为30kw，与提取罐体积比为30kw/m³。

b、膜过滤浓缩：

取上述虫草超声浓缩液，控制温度24℃，进行超滤，超滤膜采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜，压力控制在0.4～0.6MPa，超滤3.5小时，得到超滤后的浓缩液，体积为原提取液的50％。

c、冷冻干燥：

将超滤后的浓缩液在温度25℃，真空度为10Pa条件下冷冻干燥35小时，得到固体粉末733g。

Claims (2)

1.一种高效浓缩虫草菌丝体的工艺，其特征在于该工艺包括以下步骤：

a、超声提取得到超声浓缩液：

超声温度20～30℃，提取液用质量百分浓度为30～50％的乙醇水溶液，超声时间为25～75min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶10～30kg/L，超声功率与提取罐的体积比为10～30kw/m³；

b、膜过滤浓缩：

取上述超声浓缩液，控制温度30℃以下，进行超滤，超滤膜采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜，压力为0.4～0.6MPa，超滤时间3～5小时，得到超滤后的浓缩液，体积为超声浓缩液的30～50％；

c、冷冻干燥：

将超滤后的浓缩液在温度≤30℃，真空度为5～10Pa条件下冷冻干燥35～40小时。

2.根据权利要求1所述的高效浓缩虫草菌丝体的工艺，其特征在于该工艺包括以下步骤：

a、超声提取得到超声浓缩液：

超声温度25℃，提取液用质量百分浓度为30％的乙醇水溶液，超声时间为25min，人工蛹虫草与提取液质量体积比为1∶20kg/L，超声设备功率与提取罐体积比为20kw/m³；

b、膜过滤浓缩：

取上述虫草超声浓缩液，控制温度30℃以下，进行超滤，超滤膜采用截留分子量为20000～40000道尔顿的聚酰胺卷式膜，压力控制在0.4～0.6MPa，超滤时间3.5小时，得到超滤后的浓缩液，体积为原提取液的40％；

c、冷冻干燥：

将超滤后的浓缩液在温度≤30℃，真空度为5～10Pa条件下冷冻干燥35～40小时。