CN107155639A - 一种富含1‑脱氧野尻霉素的北虫草的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种富含1‑脱氧野尻霉素的北虫草的培养方法。一种富含桑叶有效活性成分的北虫草的培养方法，包括如下步骤：(1)向培养基中加入富含桑叶有效活性成分的原料，灭菌，制得富集培养基；(2)取蛹虫草子实体，经培养，制备北虫草菌液；(3)将北虫草菌液接种于富集培养基中，暗培养3～5天；然后培养2.5～3.5天；出草管理14～26天；收获即得。本发明通过在传统的北虫草的小麦培养料中加入桑叶或者桑叶的提取物，培养北虫草，获得的富含桑叶活性成分1‑脱氧野尻霉素的北虫草；且经过测定，其所含1‑脱氧野尻霉素的比例符合中医配伍用药，减少用药量，同时显著提高了北虫草的药用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种富含1-脱氧野尻霉素的北虫草的培养方法，属于食用菌栽培技术领域。
背景技术
冬虫夏草，被称为“神草”，具有催眠镇静、益肝肾、补虚损、防癌、抗癌、止血、化痰、平喘等多种功效，与人参、鹿茸并称为中国的三大滋补品。而北冬虫夏草(Cordycepsmilitaris)简称北虫草，是寄生于夜蛾科等蛹体上，不同于冬虫夏草的另一种虫草，它分布于世界各地，是既可食用又可药用的一种真菌，可在一定程度上代替冬虫夏草使用。
由于野生虫草资源匮乏，专家学者们致力于人工北虫草的相关研究，以满足人们日益增长的消费需求。研究表明，人工栽培北虫草是可行的，获得的人工北虫草同样具有补益功效,同时在免疫调节、抗肿瘤、抗癌、抗氧化等方面药效较佳。分析其活性成分发现，虫草素和虫草腺苷等含量均不低于野生的虫草。
桑科桑属(Morus.L)植物具有药食功能，桑叶早被我国药典收录,并被国家食品与药品监督管理局正是收录为既是食品又是药品目录。在《神农本草经》中就被誉为“神仙草”，其味苦、性寒，具有补血、疏风、散热、益肝通气、降压、利尿消渴等功效；现代医学也证明桑叶在降血糖、降血压、降血脂、抗炎、抗病毒、抗衰老以及减肥方面均有显著效果。因此，以桑叶为主要原料的食品、保健品深受消费者青睐。已有研究证明，桑叶中的1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,1-DNJ)具有对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，是桑叶具有降血糖、治疗糖尿病功效的主要活性成分，此外1-DNJ还具有抗病毒、抗肿瘤转移等药理作用。鉴于此，DNJ已成为近几年天然活性物质的研究热点。
中医临床上常将北虫草与各种中药配伍使用以达到协同增效的目的，虫草主要归肺肾两经，所以凡是肺上有病的，比如久咳劳嗽、有肺痨的人来说，服用之后的作用非常明显。虫草和中药沙参、川贝母、麦冬、陈皮、茯苓、阿胶、桑叶等配伍，不但可以止血化痰，还具有抗肿瘤、保肝、降血糖等作用，但患者在配伍使用中药时常常因服用量大、服用不便，导致中断使用药物，为此提高北虫草的利用率、简化中医配伍用药是必须首先解决的问题。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种富含桑叶有效成分1-脱氧野尻霉素及其衍生物的北虫草的培养方法，目的是简化中医配伍用药，减少用药量，同时提高北虫草的药用价值。
一种富含桑叶有效活性成分的北虫草的培养方法，包括如下步骤：
(1)向培养基中加入富含桑叶有效活性成分的原料，灭菌，制得富集培养基；
(2)取蛹虫草子实体，经培养，制备北虫草菌液；
(3)将步骤(2)制得的北虫草菌液接种于步骤(1)制得的富集培养基中，在温度20～22℃、相对湿度58～62％条件下暗培养3～5天；然后在白天20～22℃、夜晚8～12℃的条件下培养2.5～3.5天，期间白天采用太阳散射光照射，夜晚用日光灯照射；然后在温度20℃～22℃、相对湿度不低于85％的条件下进行出草管理14～16天；收获即得。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中富含桑叶有效活性成分的原料为：桑叶粉、桑叶水提物和/或鲜桑叶匀浆。
进一步优选的，所述的桑叶粉粒度不小于0.2mm2；所述桑叶水提物为新鲜桑叶与水按料液比1:(4～6)的比例混合后，单位g/L，超声波提取0.4～0.6h，离心，取上清，即得；所述的鲜桑叶匀浆为新鲜桑叶与水按料液比1:(3～5)的比例混合，单位g/L，匀浆，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中培养基为小麦培养基，组分如下：
小麦25～35g，水35～45mL，匀浆后进行封口、高压灭菌。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中富含桑叶有效活性成分的原料与培养基的质量比为(1～4):(3～10)。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中培养的具体步骤如下：
将蛹虫草子实体消毒后，用无菌水洗净，去除表层，取中间部位组织块切成组织片，接种于固体培养基中，于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min振荡1h，制得菌丝干重比为0.2～0.8mg/mL的北虫草菌液。
进一步优选的，所述步骤(2)中的消毒为浸入质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中3min；
进一步优选的，述步骤(2)中的组织片厚度为0.1mm；
进一步优选的，所述步骤(2)中的固体培养基，每升组分如下：
土豆200g煮水20分钟取滤液，琼脂20g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。
进一步优选的，所述步骤(2)中的液体菌种培养基，每升组分如下：
葡萄糖20g，蛋白胨30g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。
进一步优选的，所述步骤(2)中菌丝干重比为0.5mg/mL。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中接种为无菌接种，接种前，先用紫外线对富集培养基灭菌15min；接种前先对北虫草菌液稀释2～4倍。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，接种量为富集培养基体积的5～10％。
有益效果
1、本发明通过在传统的北虫草的小麦培养基中加入桑叶或者桑叶的提取物，培养北虫草，获得的富含桑叶活性成分1-脱氧野尻霉素的北虫草；且经过测定，其所含1-脱氧野尻霉素的比例符合中医配伍用药，减少用药量，同时显著提高了北虫草的药用价值。
2、本发明培育出的富含桑叶活性成分的北虫草，检测出桑叶独有的生物碱成分-1-脱氧野尻霉素，为食品、保健品和药品提供了更有利用价值的虫草原料；
附图说明
图1是实施例1制得的北虫草中检测得到的虫草素和腺苷的高效液相色谱图；
图2是实施例1制得的北虫草中检测得到的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)的高效液相色谱图；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
生物原料来源
桑叶购自山东省蚕业研究所烟台绿宝蚕用饲料厂。
小麦为普通市售产品，购自山东省蚕业研究所。
蛹虫草子实体购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CGMCC 5.700；
平菇子实体购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CGMCC 5.370；
猴头菇子实体购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种编号CGMCC 5.739；
蛹虫草子实体、平菇子实体和猴头菇子实体也可市场购得。
实施例中所述固体培养基，每升组分如下：
土豆200g煮水20分钟取滤液，琼脂20g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。
实施例中所述液体菌种培养基，每升组分如下：
葡萄糖20g，蛋白胨30g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。
实施例1
一种富含桑叶有效活性成分的北虫草的培养方法，步骤如下：
(1)将干桑叶粗粉碎至约0.5cm2，按照桑叶粉与小麦质量比3:10的比例加入到小麦培养基中，121℃灭菌1.5h后，取出，冷却，制得富集培养基；
所述小麦培养基，组分为：小麦30g，水40ml。
(2)将蛹虫草子实体置入0.1％(质量百分比)氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min培养1小时，制的菌丝干重为0.5mg/ml的北虫草菌液；
(3)取步骤(1)制得的富集培养基，紫外线灭菌15分钟后，取步骤(2)菌液稀释3倍后，于无菌操作台中按体积百分比的10％接种，经过发菌期(温度为20-22℃，相对湿度60％，光线为黑暗)、感光转色期(白天20℃-22℃，晚上10℃；光线白天利用太阳光散射光，晚上开启日光灯补充光照；每天通风2次，每次半小时)、出草期管理(温度20℃-22℃，相对湿度85％以上，光线为全明)、收获得富含桑叶有效活性成分的北虫草；上述富含桑叶有效活性成分的北虫草在40℃的低温烘干后，避光低温保存。
实施例2
一种富含桑叶有效活性成分的北虫草的培养方法，步骤如下：
(1)将按照料液比为1:5(单位g/L)超声波提取的桑叶水提物，加入到小麦培养基中，小麦与桑叶水提物的质量比3:4，121℃灭菌1.5h后，立刻取出，冷却，制得富集培养基；
所述小麦培养基，组分为：小麦30g，水40ml。
(2)将蛹虫草子实体置入0.1％(质量百分比)氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min培养1小时，制得接种菌液，制的菌丝干重为0.5mg/ml的北虫草菌液；
(3)取步骤(1)制得的富集培养基，紫外线灭菌15分钟后，取步骤(2)菌液稀释3倍后，于无菌操作台中按体积百分比的5％接种，经过发菌期(温度为20-22℃，相对湿度60％，光线为黑暗)、感光转色期(白天20℃-22℃，晚上10℃；光线白天利用太阳光散射光，晚上开启日光灯补充光照；每天通风2次，每次半小时)、出草期管理(温度20℃-22℃，相对湿度85％以上，光线为全明)、收获得富含桑叶有效活性成分的北虫草；上述富含桑叶有效活性成分的北虫草在40℃的低温烘干后，避光低温保存。
实施例3
一种富含桑叶有效活性成分的北虫草的培养方法，步骤如下：
(1)将鲜桑叶匀浆后，按照质量比1:3加入到小麦培养基中，121℃灭菌1.5h后，立刻取出，冷却，制得富集培养基；
所述小麦培养基，组分为：小麦30g，水40ml。
(2)将蛹虫草子实体置入0.1％(质量百分比)氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min培养1小时，制得接种菌液，制的菌丝干重为0.5mg/ml的北虫草菌液；
(3)取步骤(1)制得的富集培养基，紫外线灭菌15分钟后，取步骤(2)菌液稀释3倍后，于无菌操作台中按体积百分比的8％接种，经过发菌期(温度为20-22℃，相对湿度60％，光线为黑暗)、感光转色期(白天20℃-22℃，晚上10℃；光线白天利用太阳光散射光，晚上开启日光灯补充光照；每天通风2次，每次半小时)、出草期管理(温度20℃-22℃，相对湿度85％以上，光线为全明)、收获得富含桑叶有效活性成分的北虫草；上述富含桑叶有效活性成分的北虫草在40℃的低温烘干后，避光低温保存。
对比例1
(1)将小麦培养基在121℃灭菌1.5h后，立刻取出，冷却，制得小麦培养基；
所述小麦培养基，组分为：小麦30g，水40ml。
(2)将蛹虫草子实体置入0.1％(质量百分比)氯化汞溶液中消毒3min后，用无菌水洗净，刮掉表层取中间部位组织块切成0.1mm组织片，接种于固体培养基中于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min培养1小时，制得接种菌液，制的菌丝干重为0.5mg/ml的北虫草菌液；
(3)取步骤(1)制得的小麦培养基，紫外线灭菌15分钟后，取步骤(2)菌液稀释3倍后，于无菌操作台中接种，经过发菌期(温度为20-22℃，相对湿度60％，光线为黑暗)、感光转色期(白天20℃-22℃，晚上10℃；光线白天利用太阳光散射光，晚上开启日光灯补充光照；每天通风2次，每次半小时)、出草期管理(温度20℃-22℃，相对湿度85％以上，光线为全明)、收获得富含桑叶有效活性成分的北虫草；上述富含桑叶有效活性成分的北虫草在40℃的低温烘干后，避光低温保存。
对比例2
如实施例2所述的培养方法，不同之处在于，将蛹虫草子实体替换为平菇子实体。
对比例3
如实施例2所述的培养方法，不同之处在于，将蛹虫草子实体替换为猴头菇子实体。
试验例
检测方法参见“用反相高效液相色谱-紫外检测法测定1-脱氧野尻霉素的含量”《蚕业科学》2006年第01期，“高效液相色谱法测定虫草中虫草素和腺苷含量的研究”，《山东蚕业》2009第2期中所述方法，检测实施例1～3及对比例1的相关数据。
结果如表1所示。
表1
| 虫草素(mg/g) | 腺苷(mg/g) | 1-脱氧野尻霉素(mg/g) | |
| 实施例1 | 4.9 | 2.5 | 0.05 |
| 实施例2 | 4.5 | 2.7 | 0.17 |
| 实施例3 | 4.2 | 2.8 | 0.1 |
| 对比例1 | 4.3 | 2.6 | 0 |
| 对比例2 | 0 | 2.5 | 0 |
| 对比例3 | 0 | 2.6 | 0.08 |
结果分析
由表1的结果可以看出，对比例1和实施例1-3中的虫草素和腺苷均有一定的差别，但是差别未达到显著性差异；对比例1中的1-脱氧野尻霉素中没有1-DNJ，但是实施例中均检测到不同含量的1-DNJ,说明北虫草菌对桑叶中的1-DNJ具有富集作用，从而培养出了具有桑活性成分的北虫草，但是1-DNJ的含量不同主要是由于北虫草菌对于干桑叶、桑叶提取物以及鲜桑叶匀浆中活性成分的富集量不同，参照已有的药方：“沙参15，贝母12，麦冬15，陈皮6，茯苓12，阿胶10，桑叶12，虫草6”的量进行折算，认为实施例2中桑叶提取物的添加可以达到药方中的要求。
对比例2-3和实施例2的结果可以看出，菌对1-脱氧野尻霉素的富集具有特异性，在相同的培养条件下，平菇没有富集作用，而猴头菇虽然有富集作用，但显著低于北虫草。
Claims (10)
1.一种富含桑叶有效活性成分的北虫草的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向培养基中加入富含桑叶有效活性成分的原料，灭菌，制得富集培养基；
(2)取蛹虫草子实体，经培养，制备北虫草菌液；
(3)将步骤(2)制得的北虫草菌液接种于步骤(1)制得的富集培养基中，在温度20～22℃、相对湿度58～62％条件下暗培养3～5天；然后在白天20～22℃、夜晚8～12℃的条件下培养2.5～3.5天，期间白天采用太阳散射光照射，夜晚用日光灯照射；然后在温度20℃～22℃、相对湿度不低于85％的条件下进行出草管理14～26天；收获即得。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中富含桑叶有效活性成分的原料为：桑叶粉、桑叶水提物和/或鲜桑叶匀浆。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的桑叶粉粒度不小于0.2mm2；所述桑叶水提物为新鲜桑叶与水按料液比1:(4～6)的比例混合后，单位g/L，超声波提取0.4～0.6h，离心，取上清，即得；所述的鲜桑叶匀浆为新鲜桑叶与水按料液比1:(3～5)的比例混合，单位g/L，匀浆，即得。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中培养基为小麦培养基，组分如下：
小麦25～35g，水35～45mL，匀浆后封口、高压灭菌。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中富含桑叶有效活性成分的原料与培养基的质量比为(1～4):(3～10)。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中培养的具体步骤如下：
将蛹虫草子实体消毒后，用无菌水洗净，去除表层，取中间部位组织块切成组织片，接种于固体培养基中，于25℃黑暗培养7天；然后感光培养4天，选取转色为橘黄色的菌丝接种于液体菌种培养基中，黑暗条件下，继续于25℃培养3天，每天在恒温摇床上以200r/min振荡1h，制得菌丝干重比为0.2～0.8mg/mL的北虫草菌液；
进一步优选的，所述步骤(2)中的消毒为浸入质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中3min；
进一步优选的，述步骤(2)中的组织片厚度为0.1mm；
进一步优选的，所述步骤(2)中的固体培养基，每升组分如下：
土豆200g煮水20分钟取滤液，琼脂20g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。
7.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的液体菌种培养基，每升组分如下：
葡萄糖20g，蛋白胨30g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁3g，加水定容至1000ml，pH自然。
8.如权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中菌丝干重比为0.5mg/mL。
9.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中接种为无菌接种，接种前，先用紫外线对富集培养基灭菌15min；接种前先对北虫草菌液稀释2～4倍。
10.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中，接种量为富集培养基体积的5～10％。
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