CN105767385A

CN105767385A - 一种翠叶金丝保健茶的制备方法

Info

Publication number: CN105767385A
Application number: CN201610269613.4A
Authority: CN
Inventors: 刘文洪; 杨明; 陈建赟; 李俊峰; 叶志青; 周琢艳
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2016-04-27
Publication date: 2016-07-20

Abstract

本发明涉及一种翠叶金丝保健茶的制备方法，利用药用真菌桑黄发酵中药桑叶，以获得更好抗肿瘤活性代谢产物，通过进行药用真菌和中药桑叶的配伍发酵，实现提高药效、降低毒副作用的目的。本发明结果表明桑黄发酵桑叶后得到的发酵产物(翠叶金丝保健茶)具有比桑黄更好的抗肿瘤活性，具有比桑叶更好的降糖作用，该发酵产物具有明显的增强免疫力等保健功能。

Description

一种翠叶金丝保健茶的制备方法

技术领域

本发明属于药用真菌发酵技术领域，具体地说是涉及一种翠叶金丝保健茶的制备方法。

背景技术

桑黄是一种寄生在桑属植物(MorusL.)上的珍稀药用真菌，最早见于2000年前汉朝的《神农本草经》中的“桑耳”，到明代李时珍的《本草纲目》也明确记载了桑黄及其药效，特别是现代大量药理学研究表明桑黄具有抗癌、护肝、降血糖、抗炎、抗氧化以及免疫调节等诸多药理学作用。近年来，国内外学者对桑黄化学成分进行了大量研究，从中分离鉴定出多糖、黄酮、三萜、酚类物质、香豆素、麦角甾醇、落叶松覃酸、脂肪酸、芳香酸和多种氨基酸，并对其药理活性进行了研究。目前的研究表明桑黄主要有：(1)提高免疫力和免疫调节作用，这也是桑黄最基本的药理作用，桑黄多糖的许多活性作用如抗肿瘤、保护肝损伤、降血糖、抗氧化等都与其免疫调节功能有关。(2)抗氧化性是桑黄另一大特点，有研究表明桑黄菌发酵产物和新鲜子实体分离出的类黄酮提取物对鳃鱼酱的抗氧化作用，表明类黄酮提取物可明显提高鱼子酱抗氧化的敏感性。(3)桑黄的药用价值尤其在抗癌领域的研究一直是备受关注的热点，桑黄菌多糖的抗癌活性物质通过参与相关免疫调节，可有效阻止癌细胞的生成和扩大。

桑叶为桑科桑属植物桑的干燥叶。主要分布在江浙一带，是重要的传统中药，始载于《神农本草经》具有“补肝益肾、滋液熄凤、凉血明目、消炎退人中，清上焦和润肺热”。又称“神仙叶”、“铁扇子”。药典记载：桑叶甘、苦、寒，归肺、肝经，能疏风散热，清肺润燥，清肝明目，用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头痛，目赤昏花等症。现代大量药理学研究证明桑叶具降血糖、降血压、清除自由基、抗炎和抗病毒，抑制癌细胞等诸多药理作用。国内外学者对桑叶化学成分进行了大量研究，从中分离鉴定出黄酮类、多糖类、多羟基生物碱类、苯并呋喃类、三萜类、香豆素类、甾醇类以及氨基酸等多种化学成分，并对其药理活性进行了一定的研究。MagdalenaJS研究表明，桑叶多糖在胰岛素合成、释放过程中参与细胞内信号传递，增加胰岛素分泌，可用于治疗链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病。EunkyoP等报道，桑叶提取物可通过抑制血管紧张素转化酶的活性，或者升高慢性糖尿病大鼠体内血管扩张剂水平，发挥其降血压作用。侯瑞宏研究发现，桑叶多糖通过提高免疫低下小鼠的血清溶血素水平、脾淋巴细胞转化能力及NK细胞活性等，达到增强免疫力的效果。Park等报道桑叶提取物可有效抑制核因子转录，从而减少促炎介质和细胞因子产生，来发挥抗炎活性，提高小鼠免疫力。在癌症研究方面，桑叶也有独特的治疗效果，有研究报道桑叶提取物能在人类结肠癌(HCT-15)细胞和乳腺癌(MCF-7)细胞中诱导细胞毒性，导致细胞显著的形态学改变，DNA断裂以及激活半胱天冬酶-3为特征的细胞凋亡，同时可诱导一氧化氮(iNOS)的激活而导致一氧化氮(NO)产物数量的下调。韩国学者Park等也报道了桑叶提取物在体外通过抑制MMP-2的活性和表达而抑制神经母细胞瘤细胞的侵袭力。

发明内容

本发明提供了一种桑黄发酵桑叶后得到的发酵产物-翠叶金丝保健茶的制备方法。该发酵产物具有比桑黄更好的抗肿瘤活性，具有明显的增强免疫力等保健功能。

一种翠叶金丝保健茶的制备方法，包括下述步骤：

(1)桑叶的选用及处理：将桑叶冲洗后晾晒干；

(2)一级母种的制备：晾晒干后的桑叶打粉后加入适量的水，配制成含水量50～90％的桑叶培养基后灭菌，将桑黄菌种接种至培养基中，置于恒温培养箱中培养；

(3)桑黄发酵桑叶：

(a)将晾晒干后的桑叶配制成含水量50～90％的桑叶培养基后灭菌，将一级母种接种在该桑叶上，置于温室中无光培养；

(b)温室温度、湿度进行梯度控制下发酵；

(4)烘焙后得成品。

作为优选，步骤(2)中，桑叶培养基的含水量为75～85％。

作为优选，步骤(2)中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为2h。

作为优选，步骤(a)中，桑叶培养基的含水量为75～85％。

作为优选，一级母种接种在桑叶上的接种量为2～8％。

作为优选，桑黄发酵桑叶过程具体为：

(a)取4～8g晾干的霜桑叶装进组培瓶中，加入三倍重量的水后121℃灭菌，2h；将4cm³大小的一级母种接种在桑叶上，置于28℃温室中无光培养；

(b)培养15天后，温室温度调整为25℃，房间湿度调整为40％；

(c)培养8天后，温室温度调整为22℃，房间湿度调整为50％；每天紫外线与日光灯交替照射0.5h，重复3次；

(d)培养10天后，温室温度调整为18℃，房间湿度调整为10％；散射光照射5h/天；

(e)培养10天后，发酵终止。

作为优选，步骤(a)中，桑叶的高度不得低于3cm，不得高于6cm。

作为优选，步骤(a)中，房间湿度保持在20％，组培瓶的放置密度不得低于1dm³/个。

本发明鉴于桑黄和桑叶均具有良好的抗肿瘤作用，而且两者在生态上具有天然的联系，首次提出利用药用真菌桑黄发酵中药桑叶，以获得更好抗肿瘤活性代谢产物，通过进行药用真菌和中药桑叶的配伍发酵，实现提高药效、降低毒副作用的目的。本发明结果表明桑黄发酵桑叶后得到的发酵产物(翠叶金丝保健茶/发酵茶)具有比桑黄更好的抗肿瘤活性，具有比桑叶更好的降糖作用，该发酵产物具有明显的增强免疫力等保健功能。

附图说明

图1为不同含水量对桑黄生长的影响曲线图；

图2为添加不同碳源对桑黄生长速度的影响柱状图；

图3为添加不同氮源对桑黄生长速度的影响柱状图；

图4为常用营养素对桑黄生长的影响柱状图；

图5为不同空气相对湿度对菌丝体生长速度的影响曲线图；

图6为不同空气相对湿度对发酵茶干重的影响曲线图；

图7为不同空气湿度对桑黄出黄的影响曲线图；

图8为不同空气湿度对桑黄成熟的影响曲线图；

图9为不同光照时间对桑黄出黄的影响曲线图；

图10为不同光照时间对桑黄成熟的影响曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明所要保护的范围并不限于此。

实施例1

一种翠叶金丝保健茶的制备方法，包括下述步骤：

(1)桑叶的选用及处理

用自来水轻轻冲洗产于安徽亳州的霜桑叶30s，将冲洗净的霜桑叶放在晾席上晾晒干(注意防尘)；

(2)一级母种的制备

取6g晾干的霜桑叶打粉后装进组培瓶中，加入18g水后121℃灭菌，2h；将试管内的桑树桑黄菌种接种在灭菌后的霜桑叶上并置于28℃的恒温培养箱中培养；20天后，桑黄菌丝长至瓶底，菌丝发白，部分为淡黄色，此时一级母种制备完成；

(3)桑叶发酵茶制备

(a)取4～8g晾干的霜桑叶装进组培瓶中，加入三倍重量的水后121℃灭菌，2h(桑叶的高度不得低于3cm，不得高于6cm)；将4cm³大小的一级母种接种在桑叶上，置于28℃温室中无光培养，房间湿度保持在20％，组培瓶的放置密度不得低于1dm³/个；

(b)培养15天后，温室温度调整为25℃，房间湿度调整为40％；

(e)培养10天后，发酵终止；

(4)桑叶发酵茶烘焙

将桑叶发酵茶取出，两两重叠压实，茶饼高度为2cm，直径为9cm；将茶饼依次放置在105℃、80℃的环境中烘烤3分钟，以除去桑黄菌的霉味；用喷水器轻轻喷湿茶饼后，放入鼓风干燥箱中50℃干燥3h，将茶叶内部的香甜气味烤出来；干燥后用洁净的牛皮纸包好，放置在干燥阴凉处保存；该桑叶发酵茶即为翠叶金丝保健茶。

实施例2

桑叶培养基研究

1、培养基含水量筛选

取3g桑叶粉，加入适量的水，配制成为含水量(重量％)60％、70％、75％、80％、85％、90％的桑叶培养基后高压灭菌。将桑黄菌种接种至培养基中，放置于28℃恒温箱中培养7日后测量桑黄的生长直径并计算日均生长速度。

对含水量筛选培养基中的桑黄生长直径进行测量，并对其生长速度进行计算，不同含水量对桑黄生长的影响如图1所示，由图1分析可知：含水量85％为桑叶培养基最佳含水量。

2、培养基含水量验证

取6g桑叶，加入适量的水，配制成为含水量(重量％)50％、60％、70％、75％、80％、85％的桑叶培养基后高压灭菌。将桑黄菌种接种至培养基中，放置于28℃恒温箱中培养15天后观察桑黄出黄及长势情况。

对探究较低含水量的实验中的桑黄长势进行观察记录发现：含水量50％，60％，70％的桑黄长势明显劣于75％，80％，85％。含水量75％的桑黄出黄情况稍劣于80％，85％，而生长速度相近。故可以知道含水量75％的培养基可以作为用于之后的桑黄发酵，以便于后期加工。

3、培养基外加碳、氮源筛选

向桑叶粉固体培养基(桑叶粉固体培养基：6g桑叶粉，40g水，0.8g琼脂，高压灭菌)中分别加入0.8g蔗糖、淀粉、葡萄糖、麦芽糖，配置成四种不同碳源的培养基。向桑叶粉固体培养基中分别加入0.04g胰蛋白胨、酵母浸出粉、氯化铵、硫酸铵，配置成四种不同氮源的培养基。将培养基高压灭菌冷却后，接种桑黄菌种。放置于28℃恒温箱中培养7日后测量桑黄的生长直径并计算日均生长速度。

对碳源筛选培养基中的桑黄生长直径进行测量，并对其生长速度进行计算，利用SPASS19.0对结果进行分析，记录得到图2。由图2可知：葡萄糖、蔗糖与麦芽糖对桑黄生长有一定的促进作用，淀粉对桑黄的生长有一定的抑制作用。这可能是因为淀粉破坏原有桑叶培养基中的碳、氮比例导致桑黄菌株生长受阻。而通过SPASS分析发现，外加碳源对桑黄的生长没有显著性影响。因此，可以看出，桑叶作为桑黄的培养基时能提供充足的碳源不需要添加其他碳源物质。

对氮源筛选培养基中的桑黄生长直径进行测量，并对其生长速度进行计算，利用SPASS19.0对结果进行分析，记录得到图3。由图3可知：硫酸铵对桑黄生长有一定的促进作用，氯化铵，蛋白胨与酵母浸出粉对桑黄的生长有一定的抑制作用。氯化铵可能是因为氯离子对桑黄菌株生长有抑制作用。蛋白胨与酵母浸出粉可能是因为破坏了原有桑叶培养基中的碳、氮比例导致桑黄菌株生长受阻。而通过SPASS分析发现，外加氮源对桑黄的生长没有显著性影响。因此，可以看出，桑叶作为桑黄的培养基时能提供充足的氮源不需要添加其他氮源物质。

4、培养基外加常用营养素筛选

配制桑叶粉固体培养基，使得培养基中分别含KH₂PO₄(0.1％)、MgSO₄(0.075％)、VB₁(0.001％)。将培养基高压灭菌冷却后，接种桑黄菌种。放置于28℃恒温箱中培养7日后测量桑黄的生长直径并计算日均生长速度。

对常用营养素筛选培养基中的桑黄生长直径进行测量，并对其生长速度进行计算，利用SPASS19.0对结果进行分析，记录得到图4。由图4可知：常用营养素对桑黄生长有一定的抑制作用。通过SPASS分析发现，VB1对桑黄的生长显著性抑制作用。MgSO₄，KH₂PO₄，VB₁为一般桑黄人工栽培所使用的营养素。在此次实验中表现出抑制作用，有可能是桑叶培养基的营养充分，这些营养素的加入反而破坏了原有的适宜水平。因此，可以看出，桑叶作为桑黄的培养基时能提供充足的各种元素源，不需要添加MgSO₄，KH2PO₄，VB₁。

5、最佳接种方式的筛选

分别取用PDA固体培养基(土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，高压灭菌)、PDA液体培养基(土豆200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1L，高压灭菌)、桑叶培养基(6g桑叶粉，18g水，高压灭菌)、桑叶粉固体培养基(6g桑叶粉，40g水，0.8g琼脂，高压灭菌)上的桑黄1cm³大小接种于含水量为75％的桑叶培养基。将培养基高压灭菌冷却后，接种桑黄菌种。放置于28℃恒温箱中培养12日后，统计桑黄的长势。

观察统计桑黄的长势并定义处于萌发状态的桑黄为1，半长满状态的桑黄为2，近长满状态的桑黄为3，长满状态的桑黄为4。则：液体PDA组，桑叶组，PDA组，桑叶粉固体培养基组的桑黄生长状态的平均值及标准偏差如表1所示：

表1

实验组	平均值	标准偏差
			液体PDA组	1.75	0.71
桑叶组	3	0.58
			PDA组	2.375	1.06
桑叶粉固体培养基组	2.125	0.35

由表1可知：接种方式选用桑叶粉桑黄接种(桑叶培养基)时，桑黄既有较快生长速度，又能较为稳定地萌发生长。故接种方式选用桑叶粉桑黄接种为栽培时的最佳接种方式。

通过上述实验可以发现，含水量75％的桑叶培养基为桑黄以桑叶为主要基质发酵的最适培养基。桑叶粉桑黄接种为栽培时的最佳接种方式，即为桑叶发酵茶制备时母种的接种方式。

实施例3

桑黄发酵桑叶工艺

1、发酵空气相对湿度筛选

a.菌体迅速生长期

取6g桑叶，加入适量的水，配制成为含水量75％桑叶培养基后高压灭菌。待培养基冷却后，接种一级母种，接种量为2％～8％。将接种后的桑叶放置在28℃的温室中，并设置空气相对湿度10％，20％，30％，40％，50％，60％六组实验组发酵桑叶。记录不同空气相对湿度下，桑黄长至瓶底的时间。

统计各组菌丝体长至瓶底的时间发现，当空气相对湿度为10～20％时，菌丝体的生长速度随空气相对湿度的增加而加快；空气相对湿度为20～60％时，菌丝体的生长速度随空气相对湿度的增加无明显变化；结果如图5所示。故空气相对湿度20％为菌体迅速生长期时的最适湿度。

b.菌体缓慢生长期

取桑黄长至瓶底的放置在25℃的温室中，并设置空气相对湿度10％，20％，30％，40％，50％，60％五组实验组发酵桑叶。每两天记录不同空气相对湿度下，发酵茶干重变化。

统计各组发酵茶的干重变化发现，当空气相对湿度为10～40％时，发酵茶的干重随空气相对湿度的增加而减少；空气相对湿度为40～60％时，发酵茶的干重随空气相对湿度的增加无明显变化；结果如图6所示，空气相对湿度40～60％时，菌体能快速达到生长稳定期。故空气相对湿度40％时为菌体缓慢生长期最适湿度。

c.菌体生长稳定期

取菌体缓慢生长期的桑黄桑叶放置在22℃的温室中，并设置空气相对湿度10％，20％，30％，40％，50％，60％五组实验组发酵桑叶。记录不同空气相对湿度下，桑黄变为土黄色的时间。

统计各组桑黄变色情况发现，当空气相对湿度为10～50％时，桑黄变成棕色的速度随空气相对湿度的增加而加快；空气相对湿度为50～60％时，桑黄变成棕色的速度随空气相对湿度的增加无明显变化，结果如图7所示。

d.发酵终止期

取菌体生长稳定期的是桑黄桑叶放置在18℃的温室中，并设置空气相对湿度10％，20％，30％，40％，50％，60％五组实验组发酵桑叶。记录不同空气相对湿度下，桑黄变为棕褐色的时间。

统计各组桑黄变色情况发现，当空气相对湿度为10～60％时，桑黄变成褐色的速度与空气相对湿度无明显关系，结果如图8所示。

2、光照条件筛选

a.菌体生长稳定期

取菌体缓慢生长期的桑黄桑叶放置在22℃，最适空气相对湿度的温室中，并设置每天紫外光，日光灯交替照射3次，每次0min，30min，60min三组实验组发酵桑叶。记录不同光照条件下，桑黄变为土黄色的时间。

统计各组桑黄变色情况发现，当紫外光与日光灯交替照射30min时，桑黄变为土黄色的速度最快(见图9)。

b.发酵终止期

取菌体生长稳定期的是桑黄桑叶放置在18℃，最适空气相对湿度的温室中，并设置每天散射光照射3h，4h，5h，6h四组实验组发酵桑叶。记录不同光照条件下，桑黄变为棕褐色的时间。

统计各组桑黄变色情况发现，当散射光照射3～5h时，桑黄变成棕色的速度随空气相对湿度的增加而加快；当散射光照射5～6h时，桑黄变成棕色的速度随空气相对湿度的增加无明显变化(见图10)。

研究结果表明，发酵茶的最适工艺流程如下：按2～8％的接种量将一级母种接种在桑叶上，置于28℃温室中暗培养，房间空气相对湿度保持在20％。培养15天后，温室温度调整为25℃，房间空气相对湿度调整至40％。培养8天后，温室温度调整为22℃，房间空气相对湿度调整至50％，每天紫外线与日光灯交替照射0.5h，重复3次。培养10天后，温室温度调整为18℃，房间空气相对湿度调整至10％，散射光照射5h/天。培养10天后，终止发酵。

实施例4

桑黄桑叶抗肿瘤活性

A：空白组；B：桑叶低剂量(0.5mg/mL)组；C：桑叶中剂量(1.0mg/mL)组；D：桑叶高剂量(2.0mg/mL)组；E：桑黄低剂量(0.5mg/mL)组；F：桑黄中剂量(1.0mg/mL)组；G：桑黄高剂量(2.0mg/mL)组；H：桑黄桑叶低剂量(0.5mg/mL)组；I：桑黄桑叶中剂量(1.0mg/mL)组；J：桑黄桑叶高剂量(2.0mg/mL)组。

各处理组对HepG2细胞形态的影响：

作用48小时后，不同浓度给药组细胞完全贴壁。在倒置显微镜下观察发现空白对照组细胞正常生长，贴壁紧密，排列规则，细胞形态清晰，数量多；B、C、D组细胞轮廓清楚，细胞与正常组细胞无差异；E、H组(低剂量组)少量细胞丧失原有的形态，细胞间隙变宽，排列不规则，出现少量的细胞凋亡现象；F、I组(中剂量组)部分细胞丧失原有的细胞形态，悬浮细胞增多，贴壁细胞减少，出现细胞凋亡现象；G、J组(高剂量组)大量细胞丧失原有细胞形态，细胞变圆变小，细胞大部分凋亡。实验结果表明，桑叶组能够促进细胞的生长，抑制细胞的凋亡；桑黄组和桑黄桑叶组具有较强的抗肿瘤活性，并呈剂量依赖性。

MTT法检测HepG2细胞的活性：

实验结果显示，不同浓度桑叶组、桑黄组及桑黄桑叶组作用于HepG2细胞48h后，与空白对照组A相比，B、C、D组并没有显示抗肿瘤活性，反而促进细胞生长；E、F、G、H、I、J组细胞显著受到抑制，有显著性差异(P<0.05或P<0.01)；相同药物处理，不同浓度间差异有统计学意义(P﹤0.01)，且随着剂量的增加，抑制率升高，不同处理组对HepG2细胞活性的影响(n＝3)结果如表2所示。

表2

组别	OD值	抑制率(％)
			A(空白组)	0.673±0.031	-
B(桑叶低剂量组)	0.709±0.041	-5.4
			C(桑叶中剂量组)	0.766±0.038*	-13.8
D(桑叶高剂量组)	0.789±0.025**	-17.2
			E(桑黄低剂量组)	0.580±0.044*	13.9
F(桑黄中剂量组)	0.524±0.044**	22.1
			G(桑黄高剂量组)	0.397±0.008**^▲▲	41.1
H(桑黄桑叶低剂量组)	0.553±0.015**	17.8
			I(桑黄桑叶中剂量组)	0.323±0.026**^▲▲△△	52.0
J(桑黄桑叶高剂量组)	0.271±0.014**^▲▲△△	59.7

注：与A组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01；与E组比较，^▲▲P﹤0.01；与H组比较，^△△P﹤0.01

实验结果表明，桑叶组能够促进细胞增殖，桑黄组、桑黄桑叶组呈剂量依赖性促进细胞的凋亡，且桑黄桑叶组抗肿瘤效果较桑黄组明显。

桑叶桑黄降血糖作用

4周龄雄性db/db小鼠24只，适应性喂养1周，同周龄db/m雄性小鼠6只，作为对照组，均给予基础饲料喂养。喂养前即行尾静脉采血，以随机血糖大于11.1mmol/L，判定2型糖尿病小鼠模型合格。造模成功后持续给予基础饲料，直至实验结束。

动物分组：

随机分成5组：正常对照组、病理模型组、桑黄组、桑叶组、桑黄桑叶组。

糖代谢变化：

实验为期5周，适应性喂养一周，给药4周。对实验组和对照组小鼠使用血糖仪测定禁食4h空腹血糖水平。血糖直接采用血糖仪测定尾静脉血。比较统计对照组和模型组糖代谢的变化。

不同给药组对2型糖尿病模型小鼠血糖的影响(n＝3)结果如表3所示：

表3

组别	给药前(mmol/L)	给药25天后(mmol/L)
			正常对照组	7.00±0.26	7.8±0.90
病理模型组	18.60±1.11	21.1±0.44*
			桑黄组	18.63±2.21	18.27±0.35^##
桑叶组	18.47±0.51	17.2±0.66^##
			桑黄桑叶组	18.57±1.37	15.43±1.10*^##

注：与同组给药前比较，*P﹤0.05；与模型组给药后比较，^##P﹤0.01

同一组内，病理模型组、桑黄桑叶组给药25d后与未给药时比较对2型糖尿病模型小鼠血糖水平有显著影响(P<0.05)，正常对照组、桑黄组和桑叶组无显著差异。给药25d后各组与病理模型组比较，桑黄组、桑叶组和桑黄桑叶组均有极显著差异(P<0.01)，其中，桑黄桑叶组血糖水平降低较明显。

Claims

1.一种翠叶金丝保健茶的制备方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)桑叶的选用及处理：将桑叶冲洗后晾晒干；

(3)桑黄发酵桑叶：

(b)温室温度、湿度进行梯度控制下发酵；

(4)烘焙后得成品。

2.根据权利要求1所述的翠叶金丝保健茶的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中，桑叶培养基的含水量为75～85％。

3.根据权利要求1所述的翠叶金丝保健茶的制备方法，其特征在于：

步骤(2)中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为2h。

4.根据权利要求1所述的翠叶金丝保健茶的制备方法，其特征在于：

步骤(a)中，桑叶培养基的含水量为75～85％。

5.根据权利要求1所述的翠叶金丝保健茶的制备方法，其特征在于：

一级母种接种在桑叶上的接种量为2～8％。

6.根据权利要求1所述的翠叶金丝保健茶的制备方法，其特征在于：

桑黄发酵桑叶过程具体为：

(b)培养15天后，温室温度调整为25℃，房间湿度调整为40％；

(e)培养10天后，发酵终止。

7.根据权利要求6所述的翠叶金丝保健茶的制备方法，其特征在于：

步骤(a)中，桑叶的高度不得低于3cm，不得高于6cm。

8.根据权利要求6所述的翠叶金丝保健茶的制备方法，其特征在于：

步骤(a)中，房间湿度保持在20％，组培瓶的放置密度不得低于1dm³/个。