CN101553238A - 具有保肝作用的组合物 - Google Patents

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CN101553238A CNA2006800561809A CN200680056180A CN101553238A CN 101553238 A CN101553238 A CN 101553238A CN A2006800561809 A CNA2006800561809 A CN A2006800561809A CN 200680056180 A CN200680056180 A CN 200680056180A CN 101553238 A CN101553238 A CN 101553238A
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Abstract

本发明涉及含有牛樟芝中性多糖的注射用组合物，该中性多糖具有如下特征：(a)外观：无色、无定形粉末，(b)pH：中性，(c)分子量：如图4所示，HPLC测定为899.5～1670.5kDa，(d)旋光度：〔α〕D+115.0°(c＝0.4433，H2O)，(e)特性粘度：〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g－1，(f)比热容：0.2536～0.3995Cal/g·℃，(g)红外光谱：如图5所示，(h)核磁共振氢谱：如图6所示，(i)核磁共振碳谱：如图7所示，以及(j)气相色谱－质谱分析：如图8所示。本发明还涉及含有牛樟芝中性多糖的口服用组合物，该中性多糖具有如上的特征(a)－(j)。

Description

具有保肝作用的组合物
技术领域
本发明涉及用于注射和口服给药的组合物。
背景技术
牛樟芝(Antrodia camphorata)(又名牛樟菇)是薄孔菌属(genusAntrodia)(非褶菌目，多孔菌科)的一个新种，其寄生在特有树种牛樟树(cinnamomum Kanehirai Hay)的树洞中。它是台湾的濒危物种。牛樟芝的子实体为多年生，并具有强烈的气味。其与普通的灵芝有许多不同，有板状(plate-shaped)或钟状(bell-shaped)的外观。板状的为橙红(黄)色，其表面遍布小孔，并且在底层具有淡黄的白色木栓组织。其通过将木栓组织黏附在空心牛樟芝内部的内壁来生长。钟状的子实体层(钟面)也呈橙(黄)色，内部布满小孔，内有孢子，味苦、新鲜时呈橙红色，后呈橙棕色、棕色。钟体为深绿棕色的外壳。在显微镜下观察，孢子外表光滑、透明，呈稍微弯曲的柱状。
牛樟芝(Antrodia camphorata)传统上用于治疗因食物、酒精或药物引起的中毒，以及腹泻、腹痛、高血压、皮肤瘙痒和癌症(沈等，2004，FEMSMicrobiol.Lett.，231：137-143)。过去，植物化学的研究已经实现了一系列新的类固醇酸、三萜酸和多糖的分离(刘等，2004，Toxicol.Appl.Pharmacol.201：186-193)。
多糖是有生命的有机体中常见的结构性耐储存聚合物，占植物干重的75％以上。这些化合物的结构研究中糖缀合物的组成分析是重要的。多糖由于具有多种生物活性，如促有丝分裂活性、激活补体旁路(alternative-pathway complement，APCs)以及血浆凝固活性(李等，2002，FEMS Microbiol.Lett.，209：63-67；陈等，2005，Life Sciences，76：3029-3042)，因此是医药用途方面很可能有用的生物活性成分。
从牛樟芝中提取的多糖的作用有抗乙肝作用、抗炎活性、抗血管生成活性以及抗肿瘤作用(李等，2002，FEMS Microbiol.Lett.，209：63-67；沈等，2004，FEMS Microbiol.Lett.，231：137-143；陈等，2005，Life Sciences，76：3029-3042；刘等，2004，Toxicol.Appl.Pharmacol.201：186-193)。然而，从牛樟芝中提取的多糖的成分、结构或其它特征尚未被清楚地鉴定。
肝炎是世界上尤其是发展中国家的常见病。然而，还没有能治疗该病的有效药物。近些年，科学家对传统药物进行了大量的研究，试图开发出治疗肝炎的新药。能通过增强对抗毒性刺激的防御机制来降低肝细胞的坏死损伤或者能改善损伤肝细胞的修复的化合物被认为对人类肝炎的治疗是潜在有用的。
附图说明
图1表示通过DE-52离子交换柱层析对牛樟芝(ACN)的洗脱图(以苯酚-硫酸法检测)。
图2表示通过HW-65凝胶过滤柱层析对ACN的洗脱图(以苯酚-硫酸法检测)。
图3表示通过HW-65凝胶过滤柱层析对ACN2的洗脱图(以苯酚-硫酸法检测)。
图4表示通过HW-65凝胶过滤柱层析对ACN2-1的洗脱图(以苯酚-硫酸法检测)。
图5表示ACN2a的红外光谱(以溴化钾(KBr)法测定)。
图6表示ACN2a的核磁共振氢(1H-NMR)谱(在重水(D2O)中测定)。
图7表示ACN2a的核磁共振碳(13C-NMR)谱(在D2O中测定)。
图8表示ACN2a的糖组分的气相色谱-质谱(GC-MS)分析。
图9表示ACN2a的组分糖的绝对构型(D/L)的测定。
图10表示不同时间点的血清谷草转氨酶(AST)水平。Nor：正常对照；Con6：静脉注射脂多糖(LPS)后6小时采集血样；Con12：静脉注射LPS后12小时采集血样；Con18：静脉注射LPS后18小时采集血样；结果表示每组10只ICR小鼠所得值的平均值±标准差(mean±S.D.)。用student’s t-检验时，与相应的痤疮丙酸杆菌和脂多糖(P.acnes-LPS)对照组比较，*：P＜0.05以及**：p＜0.01。
图11表示不同时间点的血清谷丙转氨酶(ALT)水平。Nor：正常对照；Con6：静脉注射LPS后6小时采集血样；Con12：静脉注射LPS后12小时采集血样；Con18：静脉注射LPS后18小时采集血样；结果表示每组10只ICR小鼠所得值的平均值±标准差。用student’s t-检验时，与相应的P.acnes-LPS对照组比较，*：P＜0.05以及**：p＜0.01。
图12表示口服给予ACN2a对P.acnes-LPS诱发的小鼠肝损伤的影响。A：正常对照，B：P.acnes-LPS，C：FK5061mg/kg+P.acnes-LPS，D：ACN2a 0.2g/kg+P.acnes-LPS，E：ACN2a 0.4g/kg+P.acnes-LPS和F：ACN2a 0.8g/kg+P.acnes-LPS。
图13表示ACN2a对由P.acnes-LPS诱发的肝损伤ICR小鼠的血清ALT水平的影响。Nor：正常对照，Con：P.acnes-LPS，A0.2：ACN2a 0.2mg/kg(体重，静脉注射)+P.acnes-LPS，A0.4：ACN2a 0.4mg/kg(体重，静脉注射)+P.acnes-LPS，A0.8：ACN2a 0.8mg/kg(体重，静脉注射)+P.acnes-LPS以及FK506：FK506 1mg/kg(体重，口服)+P.acnes-LPS。结果表示每组10只ICR小鼠所得值的平均值±标准差。用student’s t-检验时，与相应的P.acnes-LPS对照组比较，*：P＜0.05以及**：p＜0.01。
图14表示静脉注射给予ACN2a对P.acnes-LPS诱发的小鼠肝损伤的影响。A：正常对照，B：P.acnes-LPS，C：FK506 1mg/kg+P.acnes-LPS以及(G：ACN2a 0.2mg/kg，H：ACN2a 0.4mg/kg，I：ACN2a 0.8mg/kg)(体重，静脉注射)+P.acnes-LPS。
图15表示ACN2a对肝增殖细胞的影响。Nor：正常对照，Con：P.acnes-LPS，A0.4g：ACN2a 0.4g/kg(口服)+P.acnes-LPS，A0.4mg：ACN2a0.4mg/kg(体重，静脉注射)+P.acnes-LPS，以及增殖的细胞(箭头)。
图16表示ACN2a对由P.acnes-LPS诱发的肝损伤ICR小鼠中血清ALT水平的影响。Nor：正常对照，Con：P.acnes-LPS，A0.2：ACN2a 0.2g/kg(体重，口服)或ACN2a 0.2mg/kg(体重，静脉注射)+P.acnes-LPS，A0.4：ACN2a 0.4g/kg(体重，口服)或ACN2a 0.4mg/kg(体重，静脉注射)+P.acnes-LPS，A0.8：ACN2a 0.8g/kg(体重，口服)或ACN2a 0.8mg/kg(体重，静脉注射)+P.acnes-LPS，以及FK506：FK5061mg/kg(体重，口服)+P.acnes-LPS。结果表示每组10只ICR小鼠所得值的平均值±标准差。用student’s t-检验时，与相应的P.acnes-LPS对照组比较，*：P＜0.05以及**：p＜0.01。
图17表示对牛樟芝的热水提取物进行分离。
图18表示动物实验(通过口服)时间表。
图19表示动物实验(通过静脉注射)时间表。
图20表示动物实验(治疗作用)时间表。
图21表示P.acnes-LPS诱发肝毒性的机制。
发明内容
本发明提供了一种包含牛樟芝中性多糖的注射用组合物，该中性多糖具有如下特征：(a)外观：无色、无定形粉末，(b)pH：中性，(c)分子量：如图4所示，HPLC测定为899.5～1670.5千道尔顿(kDa)，(d)旋光度：〔α〕D+115.0°(c＝0.4433，H2O)，(e)特性粘度：〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g-1，(f)比热容：0.2536～0.3995Cal/g·℃，(g)红外光谱：如图5所示，(h)1H-NMR谱：如图6所示，(i)13C-NMR谱：如图7所示，以及(j)GC-MS分析：如图8所示。
本发明还提供了一种包含牛樟芝中性多糖的口服用组合物，该中性多糖具有如下特征：(a)外观：无色、无定形粉末，(b)pH：中性，(c)分子量：如图4所示，HPLC测定为899.5～1670.5kDa，(d)旋光度：〔α〕D+115.0°(c＝0.4433，H2O)，(e)特性粘度：〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g-1，(f)比热容：0.2536～0.3995Cal/g·℃，(g)红外光谱：如图5所示，(h)1H-NMR谱：如图6所示，(i)13C-NMR谱：如图7所示，以及(j)GC-MS分析：如图8所示。
发明的详细说明
本发明提供了一种包含牛樟芝中性多糖的注射用组合物，该中性多糖具有如下特征：(a)外观：无色、无定形粉末，(b)pH：中性，(c)分子量：如图4所示，HPLC测定为899.5～1670.5kDa，(d)旋光度：〔α〕D+115.0°(c＝0.4433，H2O)，(e)特性粘度：〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g-1，(f)比热容：0.2536～0.3995Cal/g·℃，(g)红外光谱：如图5所示，(h)1H-NMR谱：如图6所示，(i)13C-NMR谱：如图7所示，以及(j)GC-MS分析：如图8所示。
在优选实施例中，HPLC测定的多糖分子量为1092.25～1477.75kDa。在更优选的实施例中，HPLC测定的多糖分子量为1285kDa，多糖的特性粘度为0.0417dl·g-1，以及多糖的比热容为0.2663Cal/g·℃。
多糖的红外光谱显示组分糖包含半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖和半乳糖胺。多糖的1H-NMR谱显示组分糖包含D-半乳糖、D-葡萄糖、L-岩藻糖和D-甘露糖。组分糖所含半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖和半乳糖胺的比例为1∶0.46∶0.035∶0.016∶0.092。组分糖具有由下列组成的主链：(a)末端残基：岩藻糖或葡萄糖以及(b)中间残基：1，3-连接的葡萄糖，1，4-连接的葡萄糖，1，6-连接和1，2，6-连接的半乳糖，其中，1，2，6-连接的半乳糖残基通过支链连接在2位氧。本发明的多糖在骨架上具有半乳糖，并且可以是直链或支链形式。本发明的多糖用水从牛樟芝中提取。
多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.01-5.0mg。在优选实施例中，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.05-3.0mg。在更加优选的实施例中，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.1-2.0mg。在最优选的实施例中，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.1-1.0mg。该注射用组合物能抗肝毒性或肝损伤。
上述组合物进一步包含药学上的载体。在优选实施例中，载体为注射用液态或半固态。
适合的载体为极性溶剂，比如水、醇、酮、酯以及上述溶剂的混合物，优选水、醇和水/醇的混合物。对于优选实施例，适合的载体为水、生理盐水、缓冲水溶液和缓冲盐等。与本发明的组合物一起使用的载体还可以是乳糖、糊精和淀粉及硬脂酸钠。
本发明还提供了一种包含牛樟芝中性多糖的口服用组合物，该中性多糖具有如下特征：(a)外观：无色、无定形粉末，(b)pH：中性，(c)分子量：如图4所示，HPLC测定为899.5～1670.5kDa，(d)旋光度：〔α〕D+115.0°(c＝0.4433，H2O)，(e)特性粘度：〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g-1，(f)比热容：0.2536～0.3995Cal/g·℃，(g)红外光谱：如图5所示，(h)1H-NMR谱：如图6所示，(i)13C-NMR谱：如图7所示，以及(j)GC-MS分析：如图8所示。
在优选实施例中，HPLC测定的多糖分子量为1092.25～1477.75kDa。在更加优选的实施例中，HPLC测定的多糖分子量为1285kDa，多糖的特性粘度为0.0417dl·g-1，以及多糖的比热容为0.2663Gal/g·℃。
多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.01-5.0g。在优选实施例中，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.05-3.0g。在更加优选的实施例中，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.1-2.0g。在最优选的实施例中，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.1-1.0g。该口服用组合物能抗肝毒性或肝损伤。
上述组合物进一步包含药学上的载体。在优选实施例中，载体是用于口服给药的固态、液态或半固态。
适合的载体为极性溶剂，比如水、醇、酮、酯以及上述溶剂的混合物，优选水、醇和水/醇的混合物。对于优选实施例，适合的载体为水、生理盐水、缓冲水溶液和缓冲盐等。与本发明的组合物一起使用的载体还可以是乳糖、糊精和淀粉及硬脂酸钠。用于口服给药的液体载体包括水、豆油、酒和汁液等。
实施例
下面的实施例是非限制性的，并且仅仅是本发明代表性的几个方面和特点。
实施例1
(A)材料
牛樟芝菌丝体由善笙生物科技股份有限公司(Simpson Biotech Co.Ltd.)(台湾)提供。支链淀粉(pullulans)的标准品(Shodex Standard P-82)购自昭和电工株式会社(Showa Denko Co.Ltd.)(日本)。
(B)总的实验过程
用JASCO DIP-360全自动旋光仪在水中测定旋光度。用SHIMADZUUV-2200UV-VIS记录式分光计检测紫外吸收。使用JASCO FT/IR-230红外分光计以溴化钾片或液膜法记录红外光谱。用Varian Unity Plus 500(氢在500MHz，碳在125MHz)和Varian GEMINI 300(氢在300MHz，碳在75MHz)核磁共振波谱仪记录核磁共振波谱。多糖的重水溶液用1，4-二氧己环(1，4-diozane)作为外部参照来测定。在配有JEOL质谱仪的SHIMADZUGC-17A气相色谱仪上进行GC-MS分析。在预制的硅胶60F254板(默克公司，0.25毫米)、纤维素F板(默克公司，0.1毫米)上进行薄层层析(TLC)，通过10％硫酸喷雾或通过100℃下加热的层次分析法(AHP)来检测斑点。通过苯酚-硫酸法来检测碳水化合物。
实施例2牛樟芝中性多糖的制备
(A)多糖的提取和分离
室温下，将牛樟芝的冻干粉末(1.5kg)用氯仿(CHCl3)(41×3次)提取1天，然后过滤并干燥。室温下将残渣浸于水中1小时，并于100℃下提取(3次)2小时。将热水提取物合并并浓缩至800ml，向提取物中加入3200ml的乙醇。将混合物搅拌混匀并在冰箱中放置一夜。过滤沉淀物并用冷乙醇洗涤，然后干燥。将沉淀物用10％的三氯乙酸(trichloroaceticacid，TCA)处理后，将通过离心(3000转/分钟×10分钟)得到的TCA-可溶部分用蒸馏水透析3天。将未透析的部分冻干得褐色残留物(AC)。产量为14.25g。
(B)AC的离子交换柱层析
将AC(100mg)溶于水中，上样到DE-52(沃特曼国际公司(Whatmaninternational Ltd.)，英国。2.0×20cm)柱中。依次用60ml的水、60ml的0.5M NaCl、60ml的1M NaCl、60ml的2M NaCl洗脱，每2ml收集流分。将水流分(ACN)浓缩并冻干，得产物68.3mg。
(C)ACN的凝胶过滤
将ACN(68.3mg)溶于0.2M NaCl溶液中，并上样到Toyopearl HW-65(Tosoh，日本东京。2.0×90cm)柱中。用同样的溶剂洗脱柱子，每5ml收集流分。根据在480nm下由苯酚-硫酸法制备的洗脱图，将洗脱的流分分成两部分(ACN1和ACN2)。产量：ACN1：19mg，ACN2：49mg。在与上述相同的条件下进一步通过HW-65柱层析对ACN2进行纯化。得无色多糖(命名为ACN2a，产量：41mg)。
如图17所示，对牛樟芝的热水提取物进行分离。10％TCA可溶部分的未透析部分(AC)具有保肝活性，并且由于苯酚-硫酸反应是阳性，因而含有多糖。如图1所示，通过DE-52纤维素的离子交换柱层析对AC进行分离。然后对最有效的水部分(CAN)通过凝胶过滤进行分离(图2)。第二部分ACN2a进一步通过HW-65凝胶过滤进行纯化，得保肝组分无色多糖(ACN2a)(图3)。
实施例3
牛樟芝中性多糖的结构分析
(A)分子量的估算
通过HPLC分析估算多糖(ACN2a)的平均分子量。将样品上样到TSK-GMPWXL凝胶过滤柱(7.8×300mm i.d.，Tosoh公司，日本东京)，用0.2M NaCl以1ml/分钟的速率洗脱。使用商业上可购得的支链淀粉(Shodex Standard P-82)作为标准品。
HPLC(图4)证明该多糖(ACN2a)是单一流分，并且，用HPLC估算其表观分子量为1285320。多糖为无色、无定形粉末，其旋光度为：〔α〕D+115.0°(c＝0.4433，H2O)；特性粘度为：〔η〕＝0.0417dl·g-1(用奥式粘度计测定)，以及比热容为：0.2663Cal/g·℃(由差示扫描量热计(differential scanning calorimeter，DSC)法测定)。在ACN2a中有0.20％的蛋白(由Bradford法测定)和0.12％的氮(通过元素分析法测定)；ACN2a中无硫酸盐(由钡-玫瑰红酸(Barium rhodizonate)法测定)。
(B)组分糖的鉴定
将多糖(2mg)溶于2ml的2N三氯乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)中并密封。在蒸汽高压釜中125℃水解1小时后，通过将反应混合物蒸发至干除去TFA。水解产物用硼氢化钠(NaBH4)还原。用silblender-HTP试剂制成三甲基硅烷化产物用于GC-MS分析。(色谱柱：DB-1，J&WScientific，0.25mm柱径(i.d.)×30m；柱温：以5℃/分钟的速率从50℃升温190℃；然后190℃下保持12分钟；氦载气流4.25kgf/cm)。
根据对组分糖的鉴定结果(图5)，上述多糖由半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、甘露糖和半乳糖胺(1∶0.46∶0.035∶0.016∶0.092)组成。组分糖约62.38％的糖是半乳糖。ACN2a的旋光度是+115.0°(c＝0.4433，H2O)。该结果提示组分糖可能具有α-D-或β-L-构型(根据Hudson的等旋定律(isorotation law))。根据对组分糖绝对构型的测定(图6)，组分糖的绝对构型分别是L-岩藻糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖。
(C)组分糖绝对构型的测定
根据Hara等的报道对组分糖的绝对构型进行测定。将多糖(1mg)置2N三氯乙酸(TFA)中，125℃下水解1小时。蒸发除去TFA，得糖部分。将糖部分(2mg)的吡啶溶液(0.5ml)与L-半胱氨酸甲酯盐酸盐(3mg)混合，60℃下温热1.5小时，然后用氮气干燥。将干燥的样品用silblender-HTP(0.4ml)在60℃下三甲基硅烷化1小时。用氯仿(3ml)和水(3ml)分层后，通过GC-MS(色谱柱：DB-wax，J&W Scientific，30m×0.25mm；柱温：以10℃/分钟的速率从50℃升温至230℃；然后于230℃下保持12分钟；氦载气流4.25kgf/cm)分析氯仿萃取物。
(D)甲基化分析
通过Anumula和Taylor’s法用碘化甲烷对多糖(5mg)进行甲基化。在蒸汽高压釜中用4N三氟乙酸(TFA)将甲基化的多糖125℃水解90分钟。蒸发除去TFA后，用1M含3mg/ml NaBH4的NH4OH将水解产物转变为糖醇，然后乙酰化。通过GC和GC-MS(色谱柱：Sp-2330，Supelco，Bellefnte，Pa.，60m×0.25mm，0.20um的薄膜厚度。载气为氦气，柱温：以2℃/分钟的速率从160℃升温至210℃，然后以5℃/分钟的速率从210℃升温至240℃，以及240℃下保持14分钟)分析部分甲基化了的糖醇乙酯。使用已公布的摩尔响应因子(molar response factors)校正峰面积。通过比较其相对于1，5-二-氧-乙酰基-2，3，4，6-四-氧-甲基葡糖醇(1，5-di-O-acety 1-2，3，4，6-tetra-O-methylglucitol)的相对保留时间及其GC-EI-MS裂解方式来鉴定衍生的化合物。
如图6所示，在傅立叶变换-红外(FT-IR)光谱中，由于在1153.22cm-1、1079.94cm-1和1033.66cm-1处观察到三个吸收带(呋喃型在该区域仅有两个吸收带)，提示存在吡喃型结构。由于在917.95cm-1处有吸收带，提示存在D-吡喃型葡萄糖。此外，在873.6cm-1处的带是吡喃型甘露糖和吡喃型半乳糖的特定吸收带。由于在1637.27cm-1处观察到a-NH2的吸收带，提示存在氨基糖。以上与元素分析的分析结论一致。
在HNMR谱中(图7)，在大于4.8ppm(4.885、4.909、4.963ppm)处观察到H-1信号，提示组分糖具有α-构型。这与旋光度的分析结论一致。此外，在小于4.8ppm(4.738、4.663ppm)处，也观察到H-1信号。上述结果提示组分糖也具有少量的β-构型。在1.134ppm处观察到甲基质子信号，其应归属于岩藻糖残基的甲基。在小于5.0ppm处检测到呈单峰的端基异构体信号。这些结果提示岩藻糖残基具有β-L-构型。(α-L-岩藻糖的端基异构体信号在大于5.0ppm处。)
在CNMR谱中(图8)，在小于80ppm处观察到C-4和C-5信号。上述结果提示组分糖为吡喃型(呋喃型C-4和C-5的化学位移出现在80～85ppm区域)。这与红外分析结论一致。此外，在13.7ppm处观察到甲基信号，其应归属于盐藻糖残基的甲基。上述结果提示岩藻糖残基为L-岩藻糖(D-岩藻糖的C-6信号在60～65ppm区域)。这与HNMR谱的分析结论一致。
如表1所总结的，甲基化分析结果表明ACN2a由末端-岩藻糖、1，4-连接的葡萄糖、1，6-连接和1，2，6-连接的半乳糖残基、以及少量末端和1，3-连接的葡萄糖残基组成。通过甲基化分析，ACN2a包括由α-D-1，6-半乳糖(α-D-1，6-和α-D-1，2，6-)半乳糖组成的骨架，其约为72.82％。支链端点的数目约为总残基数目的15.75％，支链连接在主链半乳糖残基的2位O上。
表1：ACN2a的甲基化分析结果
Figure A20068005618000151
TR是各组分相对于1，5-氧-2，3，4，6-四甲基-葡萄糖的相对保留时间
实施例4
中性多糖(ACN2a)对P.acnes-LPS诱发的肝毒性的保护作用
(A)P.acnes和试剂的准备
将P.acnes(ATCC 6919)用添加有L-半胱氨酸(0.03％)和吐温80(0.03％)的脑心浸液培养基(brain heart infusion medium)(日本和光纯药工业株式会社(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，日本大阪)在37℃厌氧条件下培养48小时。将培养物在4℃以5500×g离心15分钟，并用磷酸缓冲盐(phosphate-buffered saline，PBS)洗涤。用300ml的PBS将菌团重新悬浮，80℃加热处理30分钟灭活细胞，然后冻干，制得加热灭活的P.acnes粉。来自埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)055：B5的LPS购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich，Inc.)(德国Steinheim)。FK506(他克莫司水合物)购自日本第一制药株式会社(FujisawaPharmaceutical Co.，Ltd.)(日本大阪)。
(B)动物
四周龄雄性ICR小鼠(18～20g)、雄性BALB/C(18～20g)以及雄性wistar大鼠(106～180g)(SLC公司，日本滨松)用于抗P.acnes-LPS.55，56)诱发的肝毒性的保护作用实验。试验前使动物适应一周。
(C)保肝实验(通过口服)
利用下面的实验研究ACN2a的保肝活性：A：ICR小鼠的(1)正常对照组(未处理)；(2)P.acnes-LPS(0.15mg-0.05μg/小鼠)处理对照组；[(3)0.2g/kg/天、(4)0.4g/kg/天、(5)0.8g/kg/天，按体重(body weight(b.w.)计)，口服(P.O.)]加P.acnes-LPS处理组；以及(6)FK506(1mg/kg，b.w.，P.O.)加P.acnes-LPS处理组。
B：BALB/C小鼠的(1)正常对照组(未处理)；(2)P.acnes-LPS(0.20mg-0.075μg/小鼠)处理对照组；(3)ACN2a(0.4g/kg/天，b.w.，P.O.)；(4)ACN2a(0.4g/kg/天，b.w.，P.O.)加P.acnes-LPS处理组。
C：wistar大鼠的(1)正常对照组(未处理)；(2)P.acnes-LPS(5mg-5μg/rat)处理对照组；(3)ACN2a(0.2g/kg/天，b.w.，P.O.)加P.acnes-LPS处理组。
将悬浮于盐液中的加热灭活的P.acnes细胞经尾静脉注射(图18)。七天后，通过静脉注射LPS诱发急性肝损伤。通过胃管连续7天每天给予动物一次ACN2a。在第8天，给予ACN2a后1小时，注射LPS。用FK506作为阳性对照药，并在静脉注射LPS前48、36、24、12和1小时通过胃管给药。采集血样至试管中，用于分析LPS注射后6小时的肝损伤，并处死这些动物。在3500×g下，将试管离心15分钟，使用血清作为样本。将所有样本储存于-20℃下，直至实验。使用测定酶活性的试剂盒(转氨酶C II-test Wako)(日本和光纯药工业株式会社，日本大阪)，来检测肝细胞损伤的标志物血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)的活性。
(D)肝组织学
采集血液后将小鼠处死，快速获得肝脏。将肝切片，并立即固定于10％的缓冲福尔马林磷酸盐溶液中，用50-100％的乙醇溶液脱水，并固定于石蜡中。切下4～5微米片段，并用苏木精伊红(hematoxylin-eosin)染色。
(E)保肝实验(通过静脉注射)
使用下列实验研究ACN2a的保肝活性：
A ICR小鼠的(1)正常对照组(未处理)；(2)P.acnes-LPS(0.15mg-0.05μg/小鼠)处理对照组；[(3)0.2g/kg/天，(4)0.4g/kg/天，(5)0.8g/kg/天)，b.w.，静脉注射(i.v.)]加P.acnes-LPS处理组；以及(6)FK506(1mg/kg，b.w.，P.O.)加P.acnes-LPS处理组。
B(1)正常对照组(未处理)；(2)P.acnes-LPS(0.15mg-0.05μg/小鼠)处理对照组；[(3)0.4g/kg/天，(4)0.8g/kg/天，b.w.，i.v.)，P.O.]加P.acnes-LPS处理组。
如上诱发急性肝损伤的实验模型。A静脉注射方法与口服给药相同。B静脉注射方法是在第8天，将ACN2a与LPS的盐溶液经尾静脉仅注射一次(图19)。采集血样至试管中，用于分析LPS注射后6小时的肝损伤，然后将这些动物处死。将试管以3500×g离心15分钟，并将血清用作样本。将所有的样本储存于-20℃下直至实验。使用测定酶活性的试剂盒来检测血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性。
(F)ACN2a对P.acnes-LPS诱发的小鼠肝损伤的治疗作用
利用下列实验研究ACN2a的治疗作用：
(1)正常对照组(未处理)；(2)P.acnes-LPS(0.15mg-0.05μg/小鼠)处理对照组；[(3)0.4g/kg/天，(4)0.8g/kg/天，(5)1.6g/kg/天，(6)3.2mg/kg/天，(7)6.4mg/kg/天，)，按体重(b.w.)计，静脉注射]加P.acnes-LPS处理组；以及(6)FK506(1mg/kg，b.w.，P.O.)加P.acnes-LPS处理组。
如上诱发急性肝损伤的实验模型。在第8天，给予LPS 3小时后，将ACN2a盐溶液经尾静脉仅注射一次(图20)。一个P.acnes-LPS处理组注射LPS 3小时后，采集血样至试管中，采集注射LPS后6小时的其它血样至试管中用作肝损伤的分析，然后处死这些动物。将试管在3500×g下离心15分钟，并将血清用作样本。将所有的样本储存于-20℃下直至实验。使用测定酶活性的试剂盒来检测肝细胞损伤的标志物血清谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性。
(G)结果
a.模型动物的评价
先注射P.acnes、接着注射LPS对于建立急性肝损伤的实验模型是有用的。大多数动物在注射LPS的24小时内死于严重的肝损伤。在本实验中，我们找到了P.acnes-LPS的最佳剂量(0.15mg-0.05ug/小鼠)。所有的动物幸免于严重的肝损伤，并且在静脉注射LPS后12小时肝损伤最为严重(图10和11)。因此在本发明中，采集注射LPS后6小时的血样用于肝损伤的分析。
b.口服给予ACN2a的保肝作用
表2表示ACN2a对用P.acnes-LPS处理过的小鼠血清中ALT和AST水平的影响。在所有用0.4和0.8g/kg体重的ACN2a预处理过的动物中，急性肝毒性反应被显著地(P＜0.05)抑制。因此ACN2a具有抗P.acnes-LPS诱发的小鼠肝毒性的保护作用；而且，还发现这些保护作用具有剂量依赖性。此外，在所有用0.4g/kg体重的ACN2a预处理过的BALB/c小鼠中，和所有用0.25g/kg体重的ACN2a预处理过的Wistar大鼠中，急性肝毒性反应也被显著地(p＜0.05)抑制，表明ACN2a对P.acnes-LPS诱发的鼠科动物的肝毒性具有保护作用。
表2ACN2a对P.acnes-LPS诱发的鼠科动物肝损伤中血清ALT和AST水平的影响
上述值表示为母组10只或8只动物的平均值±标准差(means±S.D.)。用Student’s t-检验检查，与相应的P.acnes-LPS组比较，*：p＜0.05以及**：p＜0.001。
通过组织学观察证实了ACN2a的保肝作用(图12)。注射P.acnes-LPS引起了ICR小鼠肝脏的肉芽肿、出血坏死和细胞浸润。然而，ACN2a的预处理降低了细胞浸润的损伤分值，并且抑制了肝细胞的坏死(表3)。气球状的肝细胞有不同尺寸，并且远远大于正常的肝细胞。
表3.肝脏在不同剂量ACN2a下的组织学损伤分值
Figure A20068005618000192
经光学显微镜检查对肝损伤肝脏进行评分：0＝无可见细胞损伤；1＝局灶性肝细胞损伤占组织的比例＜25％；2＝局灶性肝细胞损伤占组织的比例＜25-50％；3＝广泛、但为局灶性的肝细胞损坏；4＝全部肝细胞坏死。
c.通过静脉注射给予ACN2a的保肝作用
图13表示ACN2对P.acnes-LPS处理过的ICR小鼠血清中ALT水平的影响。在所有被通过尾静脉注射0.2和0.4mg/kg体重的ACN2a处理过的ICR小鼠中，急性肝毒性反应被剂量依赖性地显著(p＜0.05)抑制，表明通过尾静脉注射ACN2a对P.acnes-LPS诱发的ICR小鼠肝毒性也具有保护作用。
通过组织学观察证实了静脉注射ACN2a的保肝作用(图14)。注射P.acnes-LPS引起了ICR小鼠肝脏的气球样变性、出血坏死和细胞浸润。然而，ACN2a预处理降低了细胞浸润的损伤分值并抑制了肝细胞的坏死(表4)。
表4.肝脏在不同剂量ACN2a下的组织学损伤分值
Figure A20068005618000201
经光学显微镜检查对肝损伤肝脏进行评分：0＝无可见细胞损伤；1＝局灶性肝细胞损伤占组织的比例＜25％；2＝局灶性肝细胞损伤占组织的比例＜25-50％；3＝广泛、但为局灶性的肝细胞损坏；4＝全部肝细胞坏死。
此外，通过组织学观察(图15)发现用ACN2a预处理过的小鼠肝细胞增殖期可以促进肝细胞的增殖并改善损伤肝细胞的修复。
d.口服给药和静脉注射保肝作用的比较
(图16)比较了用P.acnes-LPS处理过的ICR小鼠ACN2a的不同给药途径对ICR小鼠血清中ALT水平的影响。在所有用0.2、0.4和0.8ACN2ag/kg(b.w.，p.o.)，以及0.2和0.4ACN2a mg/kg(b.w.，p.o.)处理过的ICR小鼠中，急性肝毒性反应被剂量依赖性地显著(p＜0.05)抑制，表明通过口服给药和静脉注射给药的ACN2a对P.acnes-LPS诱发的ICR小鼠肝毒性都具有保护作用。此外，虽然通过静脉注射给予的剂量仅为通过口服给予剂量的1/1000，但是通过静脉注射是通过口服给药方式保肝作用的100倍，表明静脉注射是最优选的方法。
总之，ACN2a无论通过口服还是静脉注射，都表现出了对P.acnes-LPS诱发的鼠科动物(ICR小鼠、BALB/c小鼠和Wistar大鼠)肝损伤的保肝作用。
实施例5保肝模型的机制
图21所示为P.acnes-LPS诱发的实验模型的机制。将P.acnes经尾静脉注射到小鼠导致肝脏的单核细胞浸润，因此肝巨噬细胞增多，并且随后静脉注射的少量LPS激活了肝巨噬细胞。肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、可溶性白细胞介素-2(IL-2)受体等的细胞因子离开肝巨噬细胞并且增多。然后，这些细胞因子经三种途径对肝脏造成损伤：1).TNF和IL-1经血小板激活因子(platelet activatingfactor，PAF)和白三烯(leukotriene)等使肝细胞广泛地坏死。2).TNF和IL-1经中性粒细胞和微循环障碍使肝细胞广泛地坏死。在这种方式中，氧自由基起到了关键作用。3).IL-2由于与可溶性IL-2受体结合而减少，导致抑制性T细胞(suppressor T cell)减少和细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)增多。CTL使大量的肝细胞坏死。
牛樟芝的粗多糖对清除氧自由基形态和增加IL-2是有效的。本发明中，发现粗多糖和中性多糖(ACN2a)对P.acnes-LPS诱发的小鼠肝毒性都具有保护作用。牛樟芝的多糖可能通过至少部分清除氧自由基形态、从而阻断了P.acnes-LPS以方式2)诱发的肝毒性，或者通过使IL-2增多而达到减少CTL和保护肝脏(图21)，从而发挥其保肝活性。
虽然已经足够详细地描述并举例说明了本发明，使本领域的技术人员能够制造和利用它，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下，对本发明所进行的各种替换、更改以及改进是显而易见的。
本领域的技术人员很容易领会本发明能够很好地实现其目的并获得上述的结果和优点及其中内在的特点。胚胎、动物以及制造它们的过程和方法代表优选的实施例，为示例性的，并不用来限定本发明的范围。本领域的技术人员可以想到其中的更改以及其它用途。这些更改也落在本发明的思想范围内，并受到权利要求保护范围的限定。

Claims (24)

1.含有牛樟芝中性多糖的注射用组合物：该中性多糖具有如下特征：
(a)外观：无色、无定形粉末，
(b)pH：中性，
(c)分子量：如图4所示，HPLC测定为899.5～1670.5kDa，
(d)旋光度：〔α)D+115.0°(c＝0.4433，H2O)，
(e)特性粘度：〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g-1，
(f)比热容：0.2536～0.3995Cal/g·℃，
(g)红外光谱：如图5所示，
(h)核磁共振氢谱：如图6所示，
(i)核磁共振碳谱：如图7所示，以及
(j)气相色谱-质谱分析：如图8所示。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.01-5.0毫克。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.05-3.0毫克。
4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.1-2.0毫克。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.1-1.0毫克。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，HPLC测定的多糖分子量为1092.25～1477.75kDa。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，HPLC测定的多糖分子量为1285kDa。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，多糖的特性粘度为0.0417dl·g-1。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，多糖的比热容为0.2663Cal/g·℃。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物能够抗肝毒性或肝损伤。
11.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物进一步包含药学上可接受的载体。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，载体为液态或半固态。
13.含有牛樟芝中性多糖的口服用组合物，该中性多糖具有如下特征：
(a)外观：无色、无定形粉末，
(b)pH：中性，
(c)分子量：如图4所示，HPLC测定为899.5～1670.5kDa，
(d)旋光度：〔α〕D+115.0°(c＝0.4433，H2O)，
(e)特性粘度：〔η〕＝0.03971～0.06255dl·g-1，
(f)比热容：0.2536～0.3995Cal/g·℃，
(g)红外光谱：如图5所示，
(h)核磁共振氢谱：如图6所示，
(i)核磁共振碳谱：如图7所示，以及
(j)气相色谱-质谱分析：如图8所示。
14.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.01-5.0克。
15.如权利要求14所述的组合物，其特征在于，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.05-3.0克。
16.如权利要求15所述的组合物，其特征在于，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.1-2.0克。
17.如权利要求16所述的组合物，其特征在于，多糖的有效治疗量为每公斤患者体重0.1-1.0克。
18.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，HPLC测定的多糖分子量为1092.25～1477.75kDa。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，HPLC测定的多糖分子量为1285kDa。
20.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，多糖的特性粘度为0.0417dl·g-1。
21.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，多糖的比热容为0.2663Cal/g·℃。
22.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，该组合物能够抗肝毒性或肝损伤。
23.如权利要求13所述的组合物，其特征在于，该组合物进一步包含药学上可接受的载体。
24.如权利要求23所述的组合物，其特征在于，载体为固态、液态或半固态。
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