KR100450061B1 - 홍삼으로부터 분리된 항암 면역 조절효과를 갖는 신규산성다당체 및 이를 함유하는 항암 면역 조절용 조성물 - Google Patents

홍삼으로부터 분리된 항암 면역 조절효과를 갖는 신규산성다당체 및 이를 함유하는 항암 면역 조절용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍삼으로부터 분리된 항암 면역 조절효과를 갖는 산성다당체 (red ginseng acid polysaccharide, RGAP) 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 면역 조절용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 홍삼으로부터 추출, 투석 및 침전에 의하여 분리되고, 글루쿠론산 (glucuronic acid) 41.6 ~ 60.0 몰%, 갈락투론산 (galacturonic acid) 2.7 ~ 7.5 몰%, 글루코오스 (glucose) 18.8 ~ 33.4 몰%, 아라비노오스 (arabinose) 1.1 ~ 2.1 몰%를 포함하며, 분자량이 12,000 내지 450,000인, 항암 면역 조절효과를 갖는 새로운 산성다당체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 면역 조절용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 산성다당체는 암세포 사멸효과를 보여주는 항암 면역 조절효과, 암세포 이식쥐의 수명 연장효과 및 항종양 효과를 나타내므로 이를 함유하는 약학 조성물은 면역조절에 의한 항암활성을 갖는 항암 면역 조절제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

홍삼으로부터 분리된 항암 면역 조절효과를 갖는 신규 산성다당체 및 이를 함유하는 항암 면역 조절용 조성물{NOVEL ACID POLYSACCHARIDE HAVING ANTI-CANCER IMMUNOREGULATORY EFFECT WHICH IS PURIFIED FROM RED GINSENG AND COMPOSITION FOR ANTI-CANCER IMMUNOREGUATION COMPRISING SAME}
본 발명은 홍삼으로부터 분리된 항암 면역 조절효과를 갖는 산성다당체 (red ginseng acid polysaccharide, RGAP) 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 면역 조절용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 홍삼으로부터 추출, 투석 및 침전에 의하여 분리되고, 글루쿠론산 (glucuronic acid) 41.6 ~ 60.0 몰%, 갈락투론산 (galacturonic acid) 2.7 ~ 7.5 몰%, 글루코오스 (glucose) 18.8 ~ 33.4 몰%, 아라비노오스 (arabinose) 1.1 ~ 2.1 몰%를 포함하며, 분자량이 12,000 내지 450,000인, 항암 면역 조절효과를 갖는 새로운 산성다당체 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 면역 조절용 약학 조성물에 관한 것이다.
식물, 동물, 광물 등의 천연물을 소재로 하는 생약은 기원, 산지, 수치법 등에 따라 형태가 다르고 함유 성분과 약리 활성도 차이가 있는 것으로 알려지고 있다. 한방 처방에 사용되고 있는 생약 중에는 오랜 경험으로부터 단순히 신선한 재료를 그대로 혹은 건조된 것을 사용하는 것 이외에도 특정한 가공처리를 한 후 사용하는 예가 많다. 한방에서는 이러한 가공조제를 수치 (중국에서는 포적, 포제라고도 함)라고 일컫는다. 일예로서, 맹독성 알칼로이드를 함유하고 있는 부자 (Aconiti Tuber)는 수치를 해서 감독시킨 후 사용하게 되는데 수치법에 따라 천부자, 염부자, 포부자, 백하부자 등이 있다. 또한, 감초와 자감초, 생강과 건강, 지황에 있어서 생지황, 건지황, 숙지황 등이 그 좋은 예가 된다.
인삼 (Panax ginsengC. A. Meyer)도 수치에 따라 백삼 및 홍삼으로 분류되며 백삼은 수삼을 그대로 건조 가공하는 것으로서 수삼을 박피, 건조한 것이 대부분이고 껍질을 벗기지 않는 것도 있다. 가공 형태에 따라 곡삼, 반곡삼, 직삼이 있으며 년근에 따라서, 특히 저년근, 즉 3년근을 이용하여 주로 제조하는 생건삼, 묘삼을 건조한 춘미 등도 있다. 홍삼은 수삼 (약 70% 수분 함유)을 증숙하여 건조, 가공, 제조한 것으로서 가공 형태에 따라 원형 유지삼과 여러 가지 가공제품으로 구분된다. 원형 유지삼은 품질에 따라 천삼, 지삼, 양삼, 잡삼의 4등급이 있다. 홍삼은 증숙·건조하므로 전분질이 호화되고 갈색화 반응이 촉진되어 외관은 담갈색 내지 적갈색을 띠고 있다. 인삼의 약효 성분으로 알려져 온 사포닌은 홍삼제조시 일부가 수치에 의해 화학적으로 변화되어 홍삼 특유의 사포닌이 생성되는 것으로 확인되었다. 이러한 화학적 변화에는 하기와 같은 세 종류의 과정이 알려져 있다.
첫째, 사포닌 성분은 탈말론산화 (demalonylation) 및 탈탄산화 (decarboxylation) 과정에 의해 백삼 중에 존재하는 말로닐 진세노사이드 (malonylginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd가 탈말론산화되어 진세노사이드 (ginsenoside) Rb1, Rb2, Rc, Rd로 되거나, 탈탄산화되어 진세노사이드 Rs1, Rs2및 퀸퀘노사이드 (quinquenoside) R1으로 전환된다. 또한, 홍삼제조 시 C-20에서 글리코실 (glycosyl) 잔기가 이탈되거나 C-20에서 수산기가 이성화되어 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Rd가 20(R&S)-진세노사이드 Rg3로 전환되며, 진세노사이드 Re가 20(R&S)-진세노사이드 Rg2로 전환되어 홍삼 특유의 사포닌으로서 20(R)-진세노사이드 Rg2, 20(S)-진세노사이드 Rg3, 20(R)-진세노사이드 Rh1, 20(S)-진세노사이드 Rh2등이 생성된다. 진세노사이드 Rh2는 항암활성 및 암세포 분화유도 (즉, 정상 세포화) 작용이, 진세노사이드 Rh1은 암전이 억제 및 혈소판 응집 억제 작용이, 진세노사이드 Rg3는 암세포의 혈관신생 억제 및 항암제 내성억제 작용이 있는 것으로 알려져 있다. 마지막으로 C-20 및 C-24에서 수산기의 이탈 및 이중결합이 생성되어 진세노사이드 Rg2또는 Rg3가 진세노사이드 Rg5, Rf2, Rh4, Rs3, Rs4등으로 전환된다.
둘째, 비사포닌 지용성 성분인 수삼 중의 파낙시돌 (panaxydol, 암세포의 세포독성 성분)이 증숙 과정 중 가수분해되어 파낙시트리올 (panaxytriol)로 전환되어 홍삼 특유의 폴리아세틸렌 (polyacetylene) 성분이 된다.
셋째, 비사포닌 수용성 성분으로서 말토오스 (maltose)로부터 밀라드 (maillard) 반응에 의해 아르기닌 (Arginine)-프럭토오스 (Fructose)-글루코오스라는 혈관을 확장시키는 생리활성을 갖는 새로운 성분이 생성되며, 인슐린 (Insulin) 유사작용을 하는 아데노신 (adenosine), 피로글루탐산 (pyroglutamic acid)이 생성되기도 한다. 또한, 말토오스로부터 말톨 (maltol), 2-옥소프로필-α-D-글루코피라노사이드 (2-oxopropyl-α-D-glucopyranoside) 및 이소말톨-α-D-글루코피라노사이드 (isomaltol-α-D-glucopyranoside) 등 페놀 배당체가 생성된다. 이와 같이 홍삼 특유의 성분으로서 얻어지는 사포닌 또는 비사포닌 성분은 홍삼 제조과정에서 분해되어 생성되는 것으로 알려지고 있다.
이와 같이 홍삼은 제조과정 중 화학성분의 변화가 일어나 백삼에 존재하지 않는 새로운 생리활성 성분의 생성과 함량 증가가 일어난다.
한편, 인삼의 다당류는 면역 조절효과, 항암 효과, 항당뇨 효과 및 항위궤양 작용 등이 보고되어 있으며 중국에서는 암치료에 임상적으로 다당 분획을 사용하고 위암, 대장암에 대해서도 일정한 효과를 나타낸다고 보고하고 있다.
이러한 비사포닌 수용성 물질은 백삼으로부터 글리칸 (glycan)인 파낙산 A - U (panaxan A - U) 등 21종이 분리·보고되었다. 그 중 산성다당체는 8종이고 나머지는 중성다당체로 알려져 있다. 일반적으로, 산성다당체는 다당류에 갈락투론산 (galacturonic acid), 글루쿠론산 (glucuronic acid) 및 만뉴론산 (mannuronic acid)이 결합된 다당체로서 분자량이 보통 15,000 이상이다. 특히, 산성다당체의 경우 암세포 분비 독소 (Toxohormone L) 길항 작용, 체지방 분해 억제 및 암환자 체중감소 억제효과가 알려져 있다. 또한, 백삼의 산성다당체 분획이 항암제 (cyclophosphamide) 면역독성 억제효과와 암세포 (sarcoma-180) 이식 마우스의 암발생 억제 및 망내계의 탐식활성 증대효과를 가지고 있음이 본 발명자들에 의해 보고된 바 있다 (Kim, Y. S. et al.,Arch. Pharm. Res., 13:330, 1990). 아울러, 백삼으로부터 분리한 단백다당체인 진산은 벤조피렌 (Bezopyrene, BP)으로 유도한 마우스 폐종양에 대한 면역조절 기능으로서 항암효과를 보여주고 내생 싸이토카인 유도체 (cytokine inducer)로서 작용하여 암의 면역학적 예방효과를 보여준다고 보고되었다. 또한, 이러한 진산의 조성은 글루코오스 및 갈락토오스가 40 내지 50%, 산성당인 갈락투론산이 41 내지 45% 함유되어 있으며 단백질이 3.7 내지 5.2% 함유되어 있고 분자량이 50 내지 150 kD으로서 면역증강효과를 나타낸다고 하였다 (대한민국 특허등록 제144130호, 1998년 4월 15일). 그러나, 홍삼의 산성다당체에 대한 화학적, 약리학적 연구는 거의 이루어지지 않은 실정이다.
이에 본 발명자들은 6년근 홍삼을 중심으로 새로운 산성다당체 분획의 분리 및 항암면역 활성비교를 통하여 항암면역 조절제의 소재를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 홍삼으로부터 백삼의 단백다당체 (진산)와는 다른 새로운 당조성의 산성다당체 (red ginseng acidic polysaccharide, RGAP)를 분리하고 상기 산성다당체가 면역 조절효과에 의한 항암활성을 가지고 있어 항암 면역 조절제의 개발에 유용하게 사용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 면역 조절효과에 의한 항암활성을 가지고 있어 항암 면역 조절제의 개발에 유용하게 사용될 수 있는 산성다당체를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 신규 홍삼 유래 산성다당체 (red ginseng acidic polysaccharide, 이하 'RGAP'라 약칭함)를 홍삼으로부터 추출, 투석 및 침전에 의하여 분리하는 과정을 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 RGAP의 분자량을 측정하기 위하여 겔 여과 크로마토그래피를 수행한 결과이고,
A: 표준물질로 사용된 싸이로글로불린 (분자량 669,000), 알콜디하이드로게나제 (분자량 150,000), 알부민 (분자량 66,000) 및 카본언하이드라제 (분자량 24,000)의 분자량 그래프
B: RGAP의 겔 여과 크로마토그램
도 3은 본 발명의 RGAP의 화학적 조성을 분석한 결과로서 중성당의 GC 크로마토그램을 나타낸 것이고,
Ara: 아라비노오스 Glc: 글루코오스
도 4는 본 발명의 RGAP의 화학적 조성을 분석한 결과로서 산성당의 GC 크로마토그램을 나타낸 것이다.
Glc: 글루쿠론산 Gal: 갈락투론산
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍삼으로부터 추출, 투석 및 침전에 의하여 분리되고 새로운 당 조성을 가지며 면역 조절효과에 의한 항암활성을 나타내는 산성다당체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 산성다당체를 유효성분으로 함유하여 항암 활성을 나타내는 항암 면역 조절용 약학 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 홍삼으로부터 추출, 투석 및 침전에 의하여 분리되고 새로운 당 조성을 가지며 면역 조절효과에 의한 항암활성을 나타내는 산성다당체를 제공한다.
본 발명의 산성다당체를 홍삼으로부터 분리하는 방법은
1) 홍삼에 저급 알콜을 첨가하고 가열하면서 추출한 후 상등액과 잔사를 분리하는 단계;
2) 상기 잔사에 물을 첨가하고 가열하면서 추출하여 열수 추출액을 얻는 단계;
3) 상기 열수 추출액을 투석하여 투석내액을 얻는 단계;
4) 상기 투석내액을 원심분리하여 침전물과 상등액을 분리하는 단계;
5) 상기 상등액에 저급 알콜을 첨가한 후 원심분리하여 산성다당체를 포함하는 분획을 얻는 단계로 구성된다 (도 1참조).
단계 1에서는 홍삼 시료 1 ㎏당 저급 알콜을 8 내지 15 ℓ첨가하여 60 내지75℃에서 2 내지 5회 추출을 반복한다. 이때, 추출용매로 사용되는 저급 알콜로는 메탄올 또는 메탄올 수용액, 에탄올 또는 에탄올 수용액, 노말프로판올, 이소-프로판올, 노말 부탄올 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 바람직한 실시예로서 85% 에탄올을 사용하여 70℃에서 3회 추출을 반복하였다. 이로부터 얻어진 추출물들을 합친 후 원심분리하여 상등액과 잔사를 분리하였다.
단계 2는 열수 추출단계로, 단계 1에서 얻어진 잔사에 중량비로 5 내지 10배의 물을 가한 후 60 내지 100℃에서 1 ∼ 6시간 정도 추출을 2 내지 4회 반복한다.
단계 3에서는 단계 2에서 얻은 열수 추출액을 분자량 컷오프 (cut-off) 값이 12 kD 이상의 투석막을 사용하여 증류수 중에서 3 내지 6일간 투석을 수행한다.
단계 5에서 사용되는 저급 알콜은 단계 1에서 추출용매로 사용된 것과 동일한 것을 사용하며 원심분리는 6,000 내지 10,000 rpm에서 10 내지 30분간 수행한다. 본 발명의 바람직한 하나의 실시예에서는 85% 에탄올을 상등액 부피의 5배 정도 가하여 8,000 rpm에서 20분간 원심분리함으로써 홍삼으로부터 산성다당체를 분리하였다.
상기와 같이 홍삼으로부터 분리된 산성다당체의 분자량은 겔 여과 크로마토그래피 (Gel filtration chromatography)로 분석한 결과, 12,000 내지 450,000 kD로 확인되었다 (도 2의 B 참조).
본 발명의 홍삼 유래 산성다당체는 19.9 내지 35.5 몰%의 중성당과 44.1 내지 67.5 몰%의 산성당을 포함하고 단백질 및 인삼의 유효성분으로 알려진 사포닌은 전혀 포함하지 않는 순수한 다당체 분획이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 산성다당체는 산성당으로 글루쿠론산을 41.6 내지 60.0 몰%, 갈락투론산을 2.5 내지 7.5 몰%로 함유하고 있으며, 중성당으로 글루코오스를 18.8 내지 33.4 몰%, 아라비노오스를 1.1 내지 2.1 몰%로 함유하고 있다 (도 3및도 4참조).
상기와 같이 기존에 보고된 단백다당체와는 전혀 다른 새로운 조성을 갖는 본 발명의 홍삼 유래 산성다당체는 농도 의존적 양상으로 항암 면역 조절효과, 암세포 이식 마우스의 수명 연장효과 및 항종양 효과를 나타내므로 이를 함유하는 약학 조성물은 항암 면역 조절제로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 산성다당체를 유효성분으로 함유하여 항암 활성을 나타내는 항암 면역 조절용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 임상 투여시에 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며 일반적인 의약품 대체 치료의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 상기 약학 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 홍삼 유래 산성다당체에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조대체 치료, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 산성다당체의 통상적인 1일 투여량은 사람의 경우 2 내지 50 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 5 내지 30 ㎎/㎏ 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 홍삼으로부터 RGAP의 분리
홍삼 1 ㎏에 85% 에탄올 10 ℓ를 첨가하여 70℃에서 3회 추출한 후 원심분리하여 잔사를 회수하고 이를 통풍 건조시킨 뒤 80℃에서 10 ℓ의 물로 4회 추출하여 수용성 추출물을 얻었다. 상기 추출물을 분자량 컷오프 (cut-off) 값이 12 kD 이상인 투석막을 이용하여 냉장실에서 4일간 증류수로 투석하여 12 kD 이상의 고분자 투석내액을 얻고 이를 8,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액에 5배의 85% 에탄올을 첨가하여 침전시킨 후 이로부터 원심분리 (8,000 rpm, 30분)에 의해 얻은 침전물을 냉동·건조하여 산성다당체 RGAP 분획 (수득율 6.7%, 67 g)을 제조하였다 (도 1).
<실시예 2> RGAP의 분자량 측정
본 발명의 홍삼 유래 산성다당체 RGAP의 분자량을 측정하기 위하여 싸이로글로불린 (thyroglubulin, 분자량 669,000), 알콜디하이드로게나제 (alcohol dehydrogenase, 분자량 150,000), 알부민 (bovine albumin, 분자량 66,000) 및 카본언하이드라제 (carbonic anhydrase, 분자량 24,000)를 분자량 표준물질로 사용하여 (도 2의 A) 겔 여과 크로마토그래피 (Gel filtration chromatography)를 수행하였다. 홍삼 RGAP의 분자량은 하기수학식 1에 따라 계산하였다. 우선, 세파크릴 S-300 겔 여과 컬럼 (sephacryl S-300 HR, Pharmacia Biotech사, Sweden)에 덱스트란을 0.3 M NaCl이 함유된 트리스 완충용액 (tris buffer)으로 용출시켜 이를 공부피 (이하 'Vo'라 약칭함)로 하고 각각의 표준물질을 통과시켜 용출부피 (이하 'Ve'라 약칭함)를 구하였다. 그리고 겔 베드 (gel bed)의 총량은 Vx로 하였다. 이로부터 얻은 겔 베드의 총량 Vx는81.75 ㎖이었고, 용출부피 Vo은 35.28 ㎖이었다. 또한, 각각의 표준물질을 통과시켜 얻은 용출부피 Ve는 분자량 669,000 Da의 싸이로글로불린: 125.2 ㎖; 분자량 150,000 Da의 알콜디하이드로게나제: 147.3 ㎖; 분자량 66,000 Da의 알부민: 158.7 ㎖; 및 분자량 14,000 Da의 카본언하이드라제: 173.4 ㎖이었다.
우선 상기와 같이 측정된 표준물질들의 용출부피를수학식 1에 대입하여 각각의 Kav(distribution coefficient)을 구해서 표준곡선을 작성하였다. 그 다음, 본 발명의 홍삼 RGAP를 동일한 컬럼에 첨가한 후 0.3 M NaCl이 함유된 트리스 완충용액 (tris buffer)을 0.3 ㎖/분의 속도로 용출시키면서 당을 측정하여 RGAP의 용출 패턴을 구하였다. 그 결과, RGAP는 두 개의 분획으로 분리되었으며 각각의 용출부피는 A 분획: 133.5 ㎖이었고, B 분획: 179.2 ㎖이었다. 상기 두 분획을 표준곡선에 대비하여 분자량을 조사한 결과, 홍삼의 RGAP는 분자량이 450,000 Da (A)와12,000 Da (B)인 2개 화합물의 혼합물로 확인되었다 (도 2의 B).
<실시예 3> RGAP의 화학적 조성 분석
(3-1) RGAP의 중성당, 산성당 및 단백질의 조성비
총 당은 딤러 등의 방법 (Dimler et al,Anal. Chem., 24:1411, 1952)에 따라 안쓰론 (Anthrone)-H2SO4방법으로 글루코오스를 표준물질로 하여 정량하였으며, 산성당은 갈람비스 등의 방법(Galambis et al,Anal. Biochem., 19:119, 1967)에 따라 카바졸 (Carbazole)-H2SO4방법으로 글루쿠론산을 표준물질로 하여 정량하였다. 한편, 단백질은 로우리 방법 (Lowry et al,J. Biol. Chem., 193:265, 1951)으로 우 혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 표준물질로 하여 정량하였고, 사포닌은 리버만-버차드 (Libermann-Burchard) 반응으로 사포닌의 확인여부를 조사하였다. 중성당은 총당에서 산성당의 함량을 제외하여 계산하였다.
그 결과, 본 발명의 RGAP는 28.3% 내외의 중성당과 56.9% 내외의 산성당을 함유하고 있지만 단백질은 검출되지 않았다. 또한, 인삼의 유효성분으로 알려진 사포닌 확인반응 결과 음성으로 나타나 상기 분획은 사포닌 및 단백질이 없는 순수한 다당체 분획이었다.
(3-2) 중성당 및 산성당 중 단당류의 몰 조성비 조사
(단계 1) 완전 산가수 분해 및 단당류의 환원
상기 실시예 (3-1)로부터 얻은 다당체 분획 시료 10 ㎎을 튜브에 넣고 밀봉하여 121℃ 에서 1시간 동안 가수분해한 후 이로부터 얻은 가수분해물을 여과하고 농축하였다. 잔사에 NaBH410 ㎎을 함유한 1.0 M NH4OH 2 ㎖를 가하고 반응액을 냉장고에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 과량의 소디움 보로하이드라이드 (sodium borohydride)를 초산분해 방법인 상법으로 제거하여 잔사를 획득하였다.
(단계 2) 알디톨과 알돈산의 분리
단계 1에서 얻은 잔사를 물 5 ㎖에 용해시키고 IRA-68 음이온 교환수지 (시그마사) 10 g을 첨가해 실온에서 30분간 반응한 후 여과지 (시그마사)를 통하여 여과하고 수지를 물로 2번 세척하였다. 이로부터 얻은 여액과 세척액을 증발·건고하여 알디톨 (alditol)을 분리하였다. 상기 수지를 1.0 M HCl 10 ㎖에 분산시켜 실온에서 1시간 동안 저으면서 알돈산 (aldonic acid)을 용리시키고 수지는 여과지로 여과하여 여액을 얻었다.
(단계 3) 알디톨 및 알돈산의 유도체화
단계 2에서 얻은 알디톨에 무수초산과 피리딘을 가해 실온에서 하루 동안 방치하여 아세틸화한 후 이로부터 얻은 아세틸화물을 하기표 1과 같은 가스 크로마토그래피 조건으로 분석하여 중성당의 몰 조성을 측정하였다 (도 3). 별도로, 단계 2에서 얻은 여액을 농축하여 KOH 펠렛 (pellet)의 존재 하에 진공농축기에서 방치하고 남은 염산을 제거하였다. 건조한 시료는 10 mM 소디움 보레이트 (sodium borate)에 용해하고 소디움 보로하이드라이드 20 ㎎을 첨가하여 혼합물을 냉장고에서 12시간 동안 반응시킨 후 증발 농축하였다. 농축 후 잔사에 피리딘 (pyridine, 5 ㎖)과 아세트산 무수물 (acetic anhydride, 5 ㎖)를 첨가한 후 실온에서 24시간 동안 아세틸화 (acetylation)시켜 알디톨 아세테이트 (alditol acetate)를 얻었다. 상기 아세테이트물 역시 상법에 의하여 증발 건조시킨 후 하기표 1과 같은 가스 크로마토그래피 조건으로 분석하여 산성당의 몰 조성을 측정하였다 (도 4).
가스 크로마토그래피의 분석 조건
컬럼 실리카 캐필러리 컬럼(Φ 0.32 ㎜ × 30 m)
검출기검출기 온도주입구 온도컬럼온도이동가스 불꽃이온화 검출기 (FID)260℃250℃초기 2분동안 200℃에서 2분간 가온한 후 4℃/분의 비율로 250℃로 증가시키고 10분간 유지함질소 (30 ㎖/분)
상기에서 측정된 RGAP 중의 중성당 및 산성당의 조성비를 하기표 2에 나타내었다.
산성다당체 조성당의 몰% 비율
구성당 몰%*
글루쿠론산갈락투론산글루코오스아라비노오스 51.8 ± 10.2 %5.1 ± 2.4 %26.1 ± 7.3 %1.6 ± 0.5 %
* 5 종의 시료에 대한 평균 ± 표준편차임
상기표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 RGAP는 산성당으로 글루쿠론산을 51.8 몰%, 갈락투론산을 5.1 몰% 함유하고 있으며, 중성당으로 글루코오스를 26.1 몰%, 아라비노오스를 1.6 몰% 함유하고 있다.
<시험예 1> RGAP가 자연살해세포 활성에 미치는 영향
면역계에서 자연살해세포 (natural killer cell, NK cell)는 공격 대상세포의 표현여부에 상관없이 비특이적인 세포독성을 발휘하며, 과거에 감작을 받지 않은 암세포나 바이러스에 감염된 세포도 인지하여 파괴할 수 있는 능력을 가진 면역세포이다. 이러한 면역세포의 암세포 사멸활성에 미치는 본 발명의 산성다당체 RGAP의 효과를 측정하기 위하여 하기와 같은 동물실험을 실시하였다.
C57BL/6 마우스 (수컷, 20-23 g, 대한바이오링크사)를 각 군당 10 마리로 하여 상기 실시예 1의 산성다당체 RGAP를 7일간 매일 30, 100, 300 ㎎/㎏의 용량으로 마우스에 복강 투여하였다. 대조군 마우스에는 산성다당체 RGAP를 투여하지 않았다. 효과기 세포 (Effector cell)로는 마우스의 비장세포를 사용하고 목적 세포 (target cell)로는 100 uCi의 Na2 51CrO4로 1 내지 1.5 시간 동안 표지한 YAC-1 임파종 세포 (1×104세포/웰) (ATCC 번호: TIB-160)를 사용하여 비율이 100 : 1, 50 : 1, 25 : 1이 되도록 96 웰 플레이트 (96 well plate)에 분주한 후 4시간 동안 37℃, CO2배양기에서 반응시켰다. 자연 방출 (spontaneous release)은 목적 세포에배지를 첨가하고, 최대 방출 (maximum release)은 1% NP-40 100 ㎕를 첨가하고 측정하였다. 이들 혼합액을 1,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액 100 ㎕를 취하여 γ-계수기 (γ-counter)로 방사능을 측정하였고, 이를 이용하여 자연살해세포의 암세포 살해능을 하기수학식 2에 따라 계산하여 그 결과를 하기표 3에 나타내었다.
RGAP 투여 후 자연살해세포의 암세포 살해능 유도
시험군 투여량 (㎎/㎏) 암세포 살해능 (%) (임파구:암세포)
25 : 1 50 : 1 100 :1
대조군RGAP"" -30100300 4.1±1.89.9±1.4*16.0±2.6*14.9±2.0 7.4±0.815.3±2.1*19.7±4.0*23.4±5.1 13.4±1.022.0±3.0*26.1±6.2*30.0±3.8*
* p < 0.01 수준에서 통계적으로 유의성이 있음
상기표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 산성다당체 RGAP가 투여되지 않은 대조군 자연살해세포의 암세포 살해능은 각각의 비율에서 4.1 내지 13.4%에 불과하였으나, RGAP가 투여된 시험군 자연살해세포의 암세포 살해능은 각각의 비율에서 투여량 30 ㎎/㎏의 경우에는 9.9 내지 22.0%, 100 ㎎/㎏의 경우에는 16.0 내지 26.1%, 300 ㎎/㎏의 경우에는 14.9 내지 30.0%로 나타나, 본 발명의 산성다당체 RGAP가 자연살해세포의 암세포 사멸활성을 농도 의존적 양상으로 증가시킴을 확인하였다.
<시험예 2> RGAP가 세망내피계의 탐식작용에 미치는 영향
세망내피계 (대식세포 [macrophage]가 간장, 비장 등 여러 조직에서 망을 형성하여 탐식작용을 하는 집합체) 내 대식세포의 탐식작용에 미치는 RGAP의 효과를 조사하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
Balb/C 마우스 (20-23 g, 숫컷)를 각 군당 10마리로 하여 RGAP를 하루에 한번씩 7일간 매일 30, 100, 300 ㎎/㎏으로 복강 투여하였다. 8일째 꼬리정맥으로 먹물을 0.1 ㎖/10 g 체중을 주사한 후 2분, 5분에 안와 정맥에서 20 ㎕의 혈액을 채혈하여 2 ㎖의 0.1% Na2CO3용액에서 용혈시킨 뒤 600 nm에서 흡광도를 측정하고 탐식능 (Phagocytic index)을 하기수학식 3및4에 의해 산출하였고, 그 결과를 하기표 4에 나타내었다. 이때,수학식 4의 a 교정계수는 각 동물의 간장과 비장 및 체중이 다르기 때문에 탐식능을 간, 비장과 체중에 대하여 보정하기 위하여 사용하였다.
상기 식에서 OD1은 먹물 주사 후 2분에서의 흡광도를, OD2는 먹물 주사 후 5분에서의 흡광도를, t1은 먹물 투여하고 2분 경과 후를, t2는 먹물 투여하고 5분 경과 후를 나타낸다.
대식세포의 탐식작용에 미치는 영향
시험군 투여용량 탐식능 (corrected phagocytic index)
대조군RGAP"" -30 ㎎/㎏100 ㎎/㎏300 ㎎/㎏ 3.711 ± 0.914 (100 %)5.456 ± 0.956*(147 %)6.028 ± 0.887*(162 %)5.553 ± 0.778*(150 %)
* p < 0.01 수준에서 통계적으로 유의성이 있음
상기표 4에 나타난 바와 같이, 대조군 세망내피계의 탐식능을 100%로 하였을 때 본 발명의 산성다당체 RGAP가 30 ㎎/㎏ 투여된 경우에는 대조군에 비하여 탐식능이 47%, 100 ㎎/㎏ 투여된 경우에는 탐식능이 62%, 300 ㎎/㎏이 투여된 경우에는 탐식능이 50% 정도 증가되어, 본 발명의 산성다당체 RGAP가 대식세포의 탐식작용을 증가시켜 면역 증강효과를 보여줌을 확인하였다.
<시험예 3> RGAP가 대식세포의 수 및 NO 분비에 미치는 영향
대식세포가 활성화되면 외부 항원에 대한 탐식능이 증가하고 암세포 파괴물질인 NO (nitric oxide)를 분비하게 되므로 본 발명의 산성다당체 RGAP의 항암 면역조절 효과와 NO 분비와의 상관관계를 구명하기 위하여 NO 생성능을 동물실험을 통하여 관찰하였다.
Balb/c 마우스 (20-25 g, 수컷)를 각 군당 10마리로 하여 RGAP를 100 및 300 ㎎/㎏ 농도로 7일간 매일 한번씩 복강 주사하였다. 3일 후 10 U/㎖ 헤파린 (heparin)을 함유하는 RPMI 완전 배지 (complete medium) (10% 우 태아 혈청, 100 U/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 함유, GIBC BRL사)로 복강 내막을 세척하여 복강 대식세포를 수집하고 테플론-코팅된 접시 (teflon-coated dish)에 2시간 동안 부착시켜 부유 세포를 제거하고 순수한 대식세포만을 얻어 세포수를 측정하였다.
각 대식세포를 2×105세포/웰의 농도로 분취하고 37℃ CO2배양기에서 2시간 동안 배양한 후 부착되지 않는 죽은 세포를 제거하고 10 U/㎖ 인터페론-γ (interferon-γ)와 RGAP를 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 배양 상등액 중의 아질산염 (nitrite, NO의 안정한 수화합물)을 NaNO2를 표준물질로 하고 그리스 시약 (Griess reagent, 0.05% naphthylethylene diamine, 0.5% sulfanilamide in 2.5 % H3PO4, 시그마사)을 이용하여 정량하였고, 그 결과를 하기표 5에 나타내었다.
마우스의 복강삼출세포 및 NO 생성능
시험군 투여용량 복강삼출세포(106/마우스) 아질산염 (μM)
대조군RGAP" -100 ㎎/㎏300 ㎎/㎏ 206.5 ± 6.5347.7 ± 12.8*693.5 ± 57.5* 8.05 ± 0.5532.39 ± 1.52*57.27 ± 4.26*
* p < 0.01 수준에서 통계적으로 유의성이 있음
상기표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 산성다당체 RGAP는 대식세포의 수를 평가할 수 있는 복강삼출세포를 농도 의존적 양상으로 증가시켰다. 구체적으로, RGAP가 100 ㎎/㎏이 투여된 경우에는 대조군에 비하여 59%, 300 ㎎/㎏이 투여된 경우에는 335% 정도 복강삼출세포가 증가하였다. 또한, NO 생성의 평가지표인 아질산염도 RGAP가 100 ㎎/㎏ 투여된 경우에는 대조군에 비하여 4배, 300 ㎎/㎏ 투여된 경우에는 7배나 강한 생성효과를 보여주어 RGAP가 NO 생성에 의한 항암 면역조절효과를 가지고 있음을 강력히 시사하였다.
<시험예 4> RGAP가 대식세포의 암세포 사멸효과에 미치는 영향
RGAP의 투여에 의해 활성화된 대식세포가 암세포의 세포사를 효율적으로 유도하는지를 규명하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
Balb/C 마우스 (수컷, 20-23 g)를 각 군당 10마리로 하여 RGAP를 100 및 300 ㎎/㎏의 농도로 7일간 매일 한번씩 복강 투여하였다. 양성 대조군의 마우스에는 함암 효과가 있는 폴리싸카라이드-K (광동제약)를 100 ㎎/㎏의 양으로 투여하였으며, 대조군 마우스에는 아무것도 투여하지 않았다. 복강 대식세포를 순수하게 분리하여 5 × 103세포/웰의 WEHI164 섬유종 암세포 (수탁번호: KCLB 21751, 한국세포주은행)와 암세포 : 대식세포의 비율이 1 : 5 및 1 : 10이 되게 혼합하였다. 48시간 배양한 후 암세포의 세포사를 세포 역가 96R아쿠오스 비-방사성 증식 키트 (Cell Titer 96RAQueous Non-radioactive Proliferation kit, Promega사)를 이용하여 정량하였다. 이때, 대식세포를 혼합하지 않은 암세포의 세포수를 기준 (100 %)으로 계산하였다.
대식세포에 의한 암세포 살해능 조사
시험군 투여용량 세포사 (%)
암세포:대식세포(1:5) 암세포:대식세포(1:10)
대조군RGAPRGAP폴리싸카라이드-K -100 ㎎/㎏300 ㎎/㎏100 ㎎/㎏ 30.6 ± 4.438.1 ± 5.1*49.4 ± 1.3*42.9 ± 8.6* 48.2 ± 6.155.1 ± 4.0*65.7 ± 8.4*45.9 ± 7.6
* p < 0.01 수준에서 통계적으로 유의성이 있음
상기표 6에 나타난 바와 같이, 암세포 : 대식세포가 1 : 10일 때 본 발명의 산성다당체 RGAP를 100 ㎎/㎏ 농도로 투여한 경우에는 대조군에 비해 14.3%, 300 ㎎/㎏ 농도로 투여한 경우에는 36.3%의 암세포 살해능의 증가가 나타났으며, 양성 대조군인 폴리싸카라이드-K (polysaccharide-K, 운지버섯의 다당체) 보다도 동일 용량에서 강한 효과를 보여주었다. 따라서, 본 발명의 산성다당체 RGAP는 농도 의존적 양상으로 유의성 있게 대식세포의 암세포 살해능을 증가시켜 항암 면역조절 효과를 나타냄을 확인하였다.
<시험예 5> RGAP가 암세포 이식 마우스의 수명 연장효과에 미치는 영향
본 발명의 산성다당체 RGAP의 항암 면역효과를 보다 실험적으로 입증하기 위하여 하기와 같은 실험을 통해 암세포 이식 마우스의 수명 연장효과에 미치는 영향을 검정하였다.
1 × 106개의 육종 (sarcoma) 180 세포를 각 군당 10 마리로 구성된 ICR 마우스 (대한바이오링크사)에 복강 이식하고 RGAP를 50, 100, 300 ㎎/㎏의 용량으로 1일 1회 연속 7일간 복강 투여한 후 마우스의 생존 일수를 관찰하여 수명 연장효과를 관찰하였다. 양성 대조군에는 폴리싸카라이드-K를 100 ㎎/㎏의 용량으로 동일하게 투여하였다.
암세포 이식 마우스에 대한 수명 연장효과 (항암 효과)
시험군 투여용량 평균생존일 연명율
대조군RGAPRGAPRGAP폴리싸카라이드-K -50 ㎎/㎏100 ㎎/㎏300 ㎎/㎏100 ㎎/㎏ 14.4 ± 1.419.4 ± 5.2*25.4 ± 7.5*29.6 ± 6.6*17.7 ± 4.7 100.0 %134.7 %176.4 %205.6 %122.9 %
* p < 0.01 수준에서 통계적으로 유의성이 있음
상기표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 산성다당체 RGAP가 투여된 암세포 이식 마우스는 대조군에 비해 50 ㎎/㎏ 농도에서 134%, 100 ㎎/㎏ 농도에서 176%, 300 ㎎/㎏ 농도에서 205%로 수명 연장효과를 농도 의존적 양상으로 나타내었으며 양성 대조군인 폴리싸카라이드-K 보다도 동일한 용량에서 50% 정도 더 강한 수명 연장효과를 나타내었다.
<시험예 6> RGAP가 암세포 이식 마우스의 항종양 효과에 미치는 영향 1
RGAP의 항암 면역효과를 입증하기 위하여 암세포 이식 마우스에서의 수명 연장효과 외에 고형암 발생 동물모델을 이용하여 항종양 효과를 측정하였다.
육종 180 세포에 의한 고형암 유도는 5 × 106개의 세포를 각 군당 10마리로 구성된 ICR 마우스 (20 - 25 g)의 좌측 서혜부에 피하 이식하고, 암세포 이식 24시간 후부터 본 발명의 산성다당체 RGAP를 100 및 300 ㎎/㎏의 농도로 1일 1회 연속적으로 7일간 복강 투여하고 암세포 이식 22일째 생성된 고형암의 무게를 측정하여 그 결과를 하기표 8에 나타내었다.
암세포 이식 마우스에 대한 항종양 효과
시험군 투여용량 종양무게
대조군RGAPRGAP -100 ㎎/㎏300 ㎎/㎏ 1.47 ± 0.1 g1.38 ± 0.1 g*1.03 ± 0.2 g*
* p < 0.01 수준에서 통계적으로 유의성이 있음
상기표 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 산성다당체 RGAP가 투여된 마우스에서는 대조군에 비하여 종양 무게가 감소하였으며, 특히 300 ㎎/㎏ 농도로 투여된 암세포 이식 마우스에서 종양의 무게는 평균 1.03 g으로 대조군에 비해 약 30%의 억제율을 보여주었다.
<시험예 7> RGAP가 암세포 이식 마우스의 항종양 효과에 미치는 영향 2
고형암 발생 동물모델을 이용하여 RGAP의 항종양 효과를 측정하고자 3LL 루이스 폐암 세포 (3LL Lewis lung carcinoma) 1 × 106개를 각 군당 10 마리로 구성된 BDF1 마우스 (수컷, 20 - 25 g) (대한바이오링크사)의 좌측 서혜부에 주사하고 암세포 이식 24시간 후부터 RGAP를 100 및 300 ㎎/㎏의 농도로 1일 1회 연속적으로 7일간 복강 주사하고 암세포 이식 22일째에 암세포 괴의 크기를 측정하였다. 3LL 암세포에 의하여 생성된 암세포 괴의 크기 (cell volume)는 하기수학식 5에 의해 측정하였고 그 결과를 하기표 9에 나타내었다.
3LL 암세포 이식 마우스에 대한 항종양 효과
시험군 투여용량 암세포괴 크기 억제율
대조군RGAPRGAP -100 ㎎/㎏300 ㎎/㎏ 2.3 ± 0.42.1 ± 0.4*1.4 ± 0.3* -8.7 %39.1 %
* p < 0.01 수준에서 통계적으로 유의성이 있음
상기표 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 산성다당체 RGAP가 투여된 마우스에서는 대조군에 비하여 암세포 괴의 크기가 감소하였으며, 300 ㎎/㎏ 농도로 투여된 암세포 이식 마우스에서 대조군 대비 약 40%의 종양 감소효과를 나타냄을 관찰하였다.
<실시예 8> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험
본 발명의 홍삼 유래 산성다당체 RGAP의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
6주령의 특정병원부재 (SPF) SD계 랫트 (대한바이오링크사)를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 산성다당체 RGAP를 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 2 g/㎏의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 본 발명의 산성다당체 RGAP는 랫트에서 2 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 2 g/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 홍삼으로부터 분리된 산성다당체는 항암 면역 조절효과, 암세포 이식 마우스의 수명 연장효과 및 항종양 효과를 나타내므로 이를 함유하는 약학 조성물은 항암 면역 조절제로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 홍삼으로부터 분리되고, 글루쿠론산 (glucuronic acid) 41.6 ~ 60.0 몰%, 갈락투론산 (galacturonic acid) 2.5 ~ 7.5 몰%, 글루코오스 (glucose) 18.8 ~ 33.4 몰%, 아라비노오스 (arabinose) 1.1 ~ 2.1 몰%를 포함하며, 분자량이 12,000 내지 450,000인 항암 면역 조절효과를 갖는 산성다당체.
  2. 제 1항에 있어서,
    홍삼으로부터 추출, 투석 및 침전과정에 의하여 분리되는 것을 특징으로 하는 산성다당체.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 추출용매로서 에탄올 또는 에탄올 수용액 및 물을 순차적으로 사용하는 것을 특징으로 하는 산성다당체.
  4. 1) 홍삼에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 첨가하고 가열하면서 추출한 후 상등액과 잔사를 분리하는 단계;
    2) 상기 잔사에 물을 첨가하고 가열하면서 추출하여 열수 추출액을 얻는 단계;
    3) 상기 열수 추출액을 투석하여 투석내액을 얻는 단계;
    4) 상기 투석내액을 원심분리하여 침전물과 상등액을 분리하는 단계;
    5) 상기 상등액에 에탄올 또는 에탄올 수용액을 첨가한 후 원심분리하여 산성다당체 분획을 얻는 단계를 포함하는, 홍삼으로부터 제 1항의 산성다당체를 분리하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 4항에 있어서,
    단계 3)의 투석은 분자량 컷오프 (cut-off) 값이 12 kD 이상인 투석막을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항의 산성다당체를 유효성분으로 함유하여 항암활성을 나타내는 항암 면역 조절용 약학 조성물.
KR10-2001-0033115A 2001-06-13 2001-06-13 홍삼으로부터 분리된 항암 면역 조절효과를 갖는 신규산성다당체 및 이를 함유하는 항암 면역 조절용 조성물 KR100450061B1 (ko)

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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006043783A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Kt & G Corporation Pharmaceutical compositions, comprising red ginseng acid polysaccharide and lentinus edodes, of preventing and treating cancer
KR100832321B1 (ko) 2005-04-18 2008-05-26 주식회사 케이티앤지 고지혈증 개선을 위한 홍삼 산성다당체 함유 건강기능식품
KR101018989B1 (ko) 2007-10-31 2011-03-07 내추럴초이스 (주) 홍삼박을 이용한 홍삼 다당체의 생산방법
KR20200120801A (ko) 2019-04-11 2020-10-22 도담제약 주식회사 사포닌과 고순도의 산성다당체를 함유하는 홍삼 추출물, 그 제조방법 및 이를 포함하는 건강기능성 식품

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2388478C2 (ru) 2003-10-24 2010-05-10 Н.В. Нютрисиа Иммуномодулирующие олигосахариды
KR100759774B1 (ko) * 2006-12-27 2007-10-04 홍림통산(주) 유산균의 안정화 및 유산균 증식효과를 갖는 인삼 다당체조성물
KR100815277B1 (ko) * 2007-04-27 2008-03-19 주식회사 케이티앤지 홍삼 산성다당체 및 구기자추출물을 함유하는 항고지혈증제

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06122634A (ja) * 1992-01-20 1994-05-06 Nippon Fine Chem Co Ltd リポソームを用いるガン診断薬およびガン治療薬
JPH0741505A (ja) * 1993-07-27 1995-02-10 Nippon Oil Co Ltd 抗ウイルス物質
JPH07113001A (ja) * 1993-08-23 1995-05-02 Tsumura & Co 新規多糖体及び該多糖体を有効成分とする放射線防護剤
US5760213A (en) * 1995-06-05 1998-06-02 Tayca Corporation Immunoactivating agent

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06122634A (ja) * 1992-01-20 1994-05-06 Nippon Fine Chem Co Ltd リポソームを用いるガン診断薬およびガン治療薬
JPH0741505A (ja) * 1993-07-27 1995-02-10 Nippon Oil Co Ltd 抗ウイルス物質
JPH07113001A (ja) * 1993-08-23 1995-05-02 Tsumura & Co 新規多糖体及び該多糖体を有効成分とする放射線防護剤
US5760213A (en) * 1995-06-05 1998-06-02 Tayca Corporation Immunoactivating agent

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1쪽 , Planta medica, 64, 1998, 110-115 *
1쪽 요약, Pharm. Res. 13(8), 1996,1196-1200, Hua Gao *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006043783A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Kt & G Corporation Pharmaceutical compositions, comprising red ginseng acid polysaccharide and lentinus edodes, of preventing and treating cancer
KR100832321B1 (ko) 2005-04-18 2008-05-26 주식회사 케이티앤지 고지혈증 개선을 위한 홍삼 산성다당체 함유 건강기능식품
KR101018989B1 (ko) 2007-10-31 2011-03-07 내추럴초이스 (주) 홍삼박을 이용한 홍삼 다당체의 생산방법
KR20200120801A (ko) 2019-04-11 2020-10-22 도담제약 주식회사 사포닌과 고순도의 산성다당체를 함유하는 홍삼 추출물, 그 제조방법 및 이를 포함하는 건강기능성 식품

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