CN102108090B

CN102108090B - 一种二氢异香豆素葡萄糖苷化合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN102108090B
Application number: CN 200910200557
Authority: CN
Inventors: 徐小军; 王光强; 吴元锋; 余国珍; 金志平; 陈见阳
Original assignee: INNER MONGOLIA JINGXIN PHARMACEUTICAL CO Ltd; Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: INNER MONGOLIA JINGXIN PHARMACEUTICAL CO Ltd; Zhejiang Jingxin Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2029-12-23
Also published as: CN102108090A

Abstract

本发明公开了式I所示的一种二氢异香豆素葡萄糖苷类新化合物，它是从美洲大蠊(Periplaneta americana)药材中提取分离的。经小鼠耳肿胀和大鼠肉芽组织增生等试验，结果表明具有抗炎、促进创伤愈合等作用，本发明化合物可用于制备治疗炎症、溃疡、外伤、金疮、瘘管、烧伤、烫伤等的药物，尤其是制备预防与治疗与抗炎、促进肉芽组织增生、创伤愈合等有关疾病的药物，有较大的临床应用价值。本发明提供了化合物I的制备方法。

Description

一种二氢异香豆素葡萄糖苷化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及药物化学，具体涉及一种从美洲大蠊(Periplaneta americana)药材中提取分离的二氢异香豆素葡萄糖苷新化合物及其制备方法与应用。

背景技术

美洲大蠊Periplaneta americana为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》，并把它列为中品，谓“味：咸、寒；治：血瘀症坚寒热、破积聚、喉咽闭、内寒无子”。“蟑螂”为其俗名首见于《本草纲目拾遗》，也称为石姜、滑虫，各地方有其不同的称法，如偷油婆、灶蚂子等。蜚蠊科Blattidae作为一个庞大的昆虫家族在地球上已存在了3.2亿年，与恐龙属同一时代出现的生物。它是世界上生命力最强、最古老、至今繁衍最成功的昆虫类群之一。目前据统计全世界的蜚蠊已接近5000种，其中，中国记载为253种，主要分布于热带、亚热带地区的室内或野外。美洲大蠊是少数几种家居蜚蠊品种之一。它作为室内害虫，主要栖息于厨房、食堂、仓库等处损害食物，衣服，书籍等，同时取食并污染食物，传播痢疾，伤寒，蛔虫，蛲虫等多种疾病。胡修元报道(中国媒介生物学及控制杂志，1999，10(3)：168.)室居蜚蠊可能携带的肠道和呼吸道致病细菌高达34种，霉菌12种，以及包括骨髓灰质炎病毒等在内的多种病毒。然而，面对各种杀灭剂，这一昆虫群体依然十分活跃，表明其体内应具有某些特殊的物质和特有的作用机制，这引起了国内外一些学者的关注。从众多对美洲大蠊的研究报道文献来看，目前的报道主要集中在各种蜚蠊的分布及杀灭情况报告；各种杀灭剂对其杀灭的效率比较与杀灭机理的研究；其基因表达及致敏作用方面的研究。另一方面，开始将其作为药物进行研究，对其化学成分，包括各种酶、肽及蛋白质的提取，分离，鉴定及其生理功能与作用机制方面的研究等。通过对已有的产品及相关药理活性研究情况分析，美洲大蠊体内药效成分的生物活性主要具有抗炎、消肿、促进细胞增殖和新生肉芽组织增长，加速病损组织修复，加快坏死组织脱落等作用，对各种外伤创面及机体溃疡具有良好的组织修复活性(产品：康复新液)；具有升压、改善血液循环的活性(产品：心脉龙)。具有抗菌抗病毒的活性(产品：肝隆)；具有抗肿瘤、增强免疫功能活性(产品：消症益肝片)等。但上述产品因其所含成分复杂，真正的活性物质尚不明确。目前报道美洲大蠊中的化学成分主要为信息素类及氨基酸和各种昆虫神经肽类，此外还有蜚蠊酸、蜚蠊酮、蟑螂油、过敏原成分、酶、细胞色素A、B、C、甲壳素、烟酸及微量元素等，但是，有明确药效活性化学成分的报道较少。目前公开的专利主要是提取物、组合物，并未从分子水平上阐明其活性物质基础，不能以明确的成分作为质控指标。

本发明人对美洲大蠊提取物进行了深入的化学成分研究，并通过活性跟踪筛选，成功地分离到了具有显著的抗炎、促进肉芽组织增生、创伤愈合等活性作用的新化合物单体成分，并确证了其化学结构。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于从美洲大蠊中研究开发具有抗炎、创伤愈合等方面药理活性的天然化合物成分，用于制备具有抗炎、促进肉芽组织增生、创伤愈合等作用的药物组合物。

本发明提供一种二氢异香豆素葡萄糖苷新化合物，该化合物具有式I所示的化学结构式：

化学名：(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷

英文名：pericanaside

代号：KFX-4(本发明人指定的代号)

经文献检索未见报道，为一种新化合物，命名为pericanaside。

化合物I为微黄色粉末，易溶于水、乙醇、甲醇等；

高分辨电喷雾质谱测定分子式C₁₇H₂₂O₁₀，m/z 385.1139[M-H]；

计算值385.1135；不饱和度＝7。

紫外光谱吸收谱带在λmax：221，264.7，306.2nm。

红外光谱提示结构中存在羟基(v3416cm-1，强宽峰)，酯基(v1659cm-1)和芳环v1625，1588cm-1)。

化合物I的¹HNMR图谱揭示：δ2.98(1H，dd，J＝16.4Hz；3.6Hz)，2.89(1H，dd，J＝16.4Hz；11.2Hz)和δ4.75(1H，m)为一个ABX自旋系统；H-HCOSY谱δ1.42(3H，d，J＝6.0Hz)与δ4.75(1H，m)相关。δ4.50(2H，ABq，J＝11.2Hz)为一个羟甲基(-CH2-OH)的信号，羟甲基的两个氢由于所处化学环境不同，致使其化学位移不等价，表现为AB自旋系统。δ6.64(1H，s)系孤立的芳氢信号。δ11.43(1H，br)信号提示结构中存在一个与羰基螯合的酚羟基，即C-8羟基。¹³CNMR：δ101.76，74.20，77.07，70.35，78.16和61.40信号提示结构中存在一个吡喃葡萄糖单元，考虑到1HNMR δ4.90(1H，d，J＝7.20Hz)，该葡萄糖单元应为β-D-吡喃葡萄糖苷。13CNMR显示17条峰，其中δ170.50为羰基信号，一个甲基δ21.10，3个CH2，7个CH，5个来自苯环贡献的季碳信号。HMBC揭示：H-9与C-3，C-4存在远程相关H-5与C-4，C-6，C-8a相关；H-4与C-3，C-8a相关；H-9和H-1’与C-6相关。C-3的立体化学，C-4上的两个同碳氢化学位移不等价，同碳耦合表现为AB自旋系统，这两个氢分别与H-3耦合形成ABX自旋系统的AB部分。由以上波谱特征数据推断，该化合物应为3-甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素葡萄糖苷化合物。

表1 ¹H and ¹³CNMR化合物I(pericanaside)

Position

δH

COSY

δC

DEPT

HMBC

1			170.50	C
						2
3	4.75(1H，m)	H-9，H-4	76.52	CH
						4	2.98(1H，dd，J＝16.4；3.6)2.89(1H，dd，J＝16.4；11.2)	H-3	34.76	CH2
4a			142.09	C
						5	6.64(1H，s)		116.97	CH
6			162.6	C	34.76，162.24
						7			106.39	C
8			161.60	C
						8a			103.37	C
9	1.42(3H，d，J＝6.0)		21.10	CH3	76.5，34.76
						10	4.50(2H，ABq，J＝11.2		52.08	CH2	116.97，116.60
1’	4.90(1H，d，J＝7.20)	H-2’	101.76	CH	162.24
						2’	3.30		74.20	CH
3’	3.27(1H，t，J＝8.4)		77.07	CH
						4’	3.19(1H，t，J＝8.8)		70.35	CH
5’	3.35(m)		78.16	CH
						6’	3.70(1H，dd，J＝11.6；3.2)3.49(1H，dt，J＝11.6；5.6	H-6’H-5’	61.40	CH2	78.16
2’-OH	5.44(1H，br.s)
						3’-OH	5.15(1H，br.s)
4’-OH	5.10(1H，br.s)
						6’-OH	4.62(1H，t，J＝5.2)
8-OH	11.43(1H，br)

Assignments were made by1D and 2DNMR 1H-1H-COSY，HSQC，HMBC，andNOE experiments；δin ppm，J in Hz.

NMR Experiments：with a Bruker DPR-400 spectrometer，at 400(1H)and 100MHz(13C)；chemical shifts δin ppm rel.to DMSO-d6(2.50，1H；40.35，13C)

本发明的另一目的是提供了上述一种二氢异香豆素葡萄糖苷化合物的制备方法，该方法包括下列步骤：

(1)提取：

用蜚蠊科昆虫美洲大蠊Periplaneta americana干燥或鲜成虫为原料，用溶剂提取1-3次；

(2)萃取：上述提取液减压浓缩回收溶剂后的浓缩液加水萃取1-3次，水的用量为浓缩液的2-4倍(w/w)，加水后充分搅拌，静置分层，取水层；

(3)吸附：水层经大孔吸附树脂或活性炭吸附，吸附物用洗脱液洗脱；

(4)分离：洗脱液用硅胶柱层析法、LH-20柱层析法或反相柱层析法或制备型HPLC法的一种或多种方式分离，用水、乙醇、甲醇、正丁醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯或石油醚或它们的至少两种混合物作洗脱剂洗脱，采用薄层层析法或UV检测，合并含目标物的洗脱液，真空冷冻干燥或真空加温干燥50-70℃后，得目标物(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本发明方法所述步骤(1)对原料进行提取时，在常温或加热，常压或减压状态下，以20％-100％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液为溶剂提取；每次提取溶剂的用量为原料的4-10倍w/w；提取方法为煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉或微波提取，优选50-95％乙醇加热提取1-3次；提取时间每次3-12小时。

本发明方法所述步骤(3)大孔吸附树脂为聚苯乙烯型吸附树脂，包括D101、MN200、HPD100、HPD400、HPD450、AB-8、D4020、S-8，HZ806或HP-20，优选D101、MN200或HPD100型大孔吸附树脂；洗脱溶剂为水、含水乙醇、含水甲醇、含水丙酮或含水丙醇，含水溶剂的含水量在5％-95％v/v；洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱。

所述步骤(3)采用大孔吸附树脂法时，先用1-8倍柱体积的水洗；再用或不用5％-20％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液清洗，进一步去除杂质，用量为1-3倍柱体积；最后用20％-95％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液洗脱，用量为2-8倍柱体积，收集洗脱液，回收溶剂，即得含有(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的部分。所述步骤(3)采用活性炭吸附法的活性炭为粉状活性炭或颗粒状活性炭；洗脱溶剂为水、含水乙醇、含水甲醇、含水丙酮或含水丙醇，含水溶剂的含水量在5％-95％；洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱。

所述步骤(3)活性炭吸附时，先用1-8倍柱体积水洗；再用或不用5％-20％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液清洗，进一步去除杂质，用量为1-3倍柱体积；最后用20％-95％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液洗脱，用量为2-8倍柱体积，收集洗脱液，回收溶剂，即得含有(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的部分。

本发明方法所述步骤(4)柱层析所用的硅胶柱层析为常压或加压柱层析，所用填料为100-400目硅胶，用乙酸乙酯、正丁醇、水、丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、石油醚或正己烷或它们的至少两种混合物为洗脱剂，洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱；

所述步骤(4)采用sephadex LH-20柱层析时，采用常压或加压柱层析，所用填料为sephadex LH-20葡聚糖凝胶，采用乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的含水溶液为洗脱剂，洗脱剂含水10％-90％v/v，洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱；

所述步骤(4)采用反相柱层析法时，采用常压或加压柱层析或制备型HPLC法，所用填料为十八烷基键合相或八烷基键合相，采用含水乙醇、含水甲醇、含水丙酮或含水丙醇中的一种或几种为洗脱剂，洗脱剂含水比例10％-90％v/v，洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱。

本发明的又一目的是提供了上述一种二氢异香豆素葡萄糖苷化合物在制备药物中的应用。

本发明化合物I的抗炎活性试验(对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响)结果与模型对照组比较，KFX-4低、高剂量组比阳性对照组小鼠的耳肿胀度明显降低(P＜0.01)，62.5mg·kg^-1KFX-4的抗炎效果与25mg·kg^-1氢化可的松相当；初步试验结果显示，KFX-4可有效抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，表明KFX-4有明显的抗炎作用。

本发明化合物的促进肉芽组织增生试验，结果显示与空白组比较，KFX-4组大鼠的肉芽肿湿重和干重明显增加(P＜0.01)。病理检查结果各组样本均见新生肉芽组织和异物肉芽组织，亦见局部坏死组织，肉芽组织内大量梭形成纤维细胞，局部可见毛细血管和异物巨噬细胞，并有淋巴细胞和嗜中性粒细胞等炎症细胞浸润。试验结果表明，KFX-4能显著促进肉芽组织增生。

上述试验结果表明本发明化合物可用于制备预防与治疗炎症、溃疡、外伤、金疮、瘘管、烧伤、烫伤等药物，尤其是制备预防与治疗与抗炎、促进肉芽组织增生、创伤愈合等有关的疾病的药物。所述的药物由本发明二氢异香豆素葡萄糖苷化合物作为活性成分与药用辅料制成的药物组合物。包括合剂、口服液、凝胶剂、软膏剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂和注射剂等。

附图说明

图1.化合物1的紫外吸收图

图2.化合物1的红外光谱图

图3.化合物1的高分辨电喷雾质谱图

图4.化合物1的1H-NMR图

图5.化合物1的1H-NMR局部放大图(a)

图6.化合物1的1H-NMR局部放大图(b)

图7.化合物1的13C-NMR图

图8.化合物1的DEPT135图

图9.化合物1的DEPT90图

图10.化合物1的DEPT45图

图11.化合物1的1H-1H COSY图

图12.化合物1的HMBC图

图13.化合物1的HSQC图

图14.化合物1的NOESY图

图15.化合物1的CD(圆二色谱)图

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明，但本发明的内容并不仅仅局限于所列举的实施例。

实施例1

美洲大蠊(Periplaneta americana)干燥成虫20kg，用95％乙醇60℃温浸提取3次，每次用量分别为160kg、120kg、120kg，提取时间每次12小时。提取液减压浓缩(60℃，-0.08MPa)回收溶剂至无醇味，得浓缩液10kg，加20kg-40kg去离子水搅拌溶解，静置使分层，取水层，减压浓缩(60℃，-0.08MPa)至稠膏(相对密度1.20-1.30)，即得美洲大蠊提取物(含新化合物I)1.35kg。

实施例2

美洲大蠊(Periplaneta americana)干燥成虫10kg，用50％乙醇加热回流提取3次，每次用量分别为100kg、80kg、60kg，提取时间每次3小时。提取液减压浓缩(60℃，-0.08MPa)回收溶剂至无醇味，得浓缩液5kg，加20kg去离子水搅拌溶解，静置使分层，取水层，减压浓缩(60℃，-0.08MPa)至稠膏(相对密度1.20-1.30)，即得美洲大蠊提取物(含新化合物I)740g。

实施例3

取实施例1(或实施例2)提取的美洲大蠊提取物300g，加水900ml溶解，上D101大孔吸附树脂(用量1kg，也可以用其它型号如MN200、HPD100、HPD400、HPD450、AB-8、D4020、S-8，HZ806、HP-20等树脂)，上样毕，吸附物先用5倍柱体积的水洗，再用2倍柱体积10％的乙醇水溶液清洗去除杂质，再用5倍柱体积30％的乙醇水溶液洗脱，收集30％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得含有KFX-4的部分。再经硅胶柱层析，径高比1∶50，硅胶(300-400目)用量100g，洗脱剂：正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝3；12∶1；每20ml收集1流份，TLC法检测各流份(展开剂：正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝3；6∶1；显色剂：10％F_eCl₃试液)，收集KFX-4所在流份，合并KFX-4所在流份后，60℃减压浓缩至3-5ml，上LH-20柱层析，甲醇∶水＝1∶1洗脱，收集流份，TLC法检测各流份，合并KFX-4单一斑点的流份，回收溶剂，冻干即得新化合物I(61mg)。

实施例4

取实施例1(或实施例2)提取的美洲大蠊提取物200g，加水600ml溶解，上D101大孔吸附树脂吸附(用量600g)，上样毕，吸附物先用5倍柱体积的水洗，再用2倍柱体积10％的乙醇水溶液清洗去除杂质，再用5倍柱体积40％的乙醇水溶液洗脱，收集40％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得含有KFX-4的部分。再上LH-20柱层析，甲醇∶水＝1∶1洗脱，收集流份，TLC法检测各流份，合并KFX-4所在流份，回收溶剂即为KFX-4粗品；粗品再经ODS柱层析(制备型HPLC)，流动相：甲醇∶水＝1∶3，UV265nm检测，收集KFX-4峰流份，回收溶剂后，冻干即得新化合物I(40mg)。

实施例5

取实施例1(或实施例2)提取的美洲大蠊提取物200g，加水600ml溶解，上MN200大孔吸附树脂(用量600g)，上样毕，先用6倍柱体积水洗，再用2倍柱体积20％的乙醇水溶液清洗去除杂质，再用5倍柱体积40％的乙醇水溶液洗脱，收集40％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得含有KFX-4的部分，上LH-20柱层析，甲醇∶水＝1∶1洗脱，收集流份，TLC法检测各流份，合并含KFX-4流份，回收溶剂即为KFX-4粗品；粗品再经ODS柱层析(制备型HPLC)，流动相：甲醇∶水＝1∶3，UV265nm检测，收集KFX-4峰流份，回收溶剂后，冻干即得新化合物I(37mg)。

实施例6

取实施例2(或实施例1)提取的美洲大蠊提取物200g，加水500ml溶解，加活性炭100g，搅拌使充分吸附，装柱，先用5倍柱体积去离子水洗，再用5倍柱体积95％乙醇洗脱，收集95％乙醇洗脱液，回收乙醇，即得含有KFX-4的部分。上LH-20柱层析，甲醇∶水＝1∶2洗脱，收集流份，TLC法检测各流份，合并KFX-4所在流份，减压浓缩(60℃，-0.08MPa)后再经硅胶柱层析，洗脱剂：正丁醇∶乙酸乙酯∶水＝3；12∶1；收集流份，TLC法检测各流份，合并KFX-4单一斑点的流份，回收溶剂，干燥即得新化合物I(35mg)。

实施例7

取实施例1(或实施例2)提取的美洲大蠊提取物100g，加水300ml溶解，上HPD100大孔吸附树脂吸附(用量400g)，上样毕，先用8倍柱体积水洗去除杂质，再用6倍柱体积50％乙醇水溶液洗脱，收集50％乙醇洗脱部位，回收溶剂，即得含有KFX-4的部分，上LH-20柱层析，乙醇∶水＝1∶1洗脱，依次收集流份，每份10ml，TLC法检测各流份，合并含KFX-4流份，回收溶剂即为KFX-4粗品；粗品再经ODS柱层析(制备型HPLC)，流动相：甲醇∶水＝1∶3，UV265nm检测，收集KFX-4峰流份，回收溶剂后，干燥即得新化合物I(20mg)。

实施例8

KFX-4(实施例5制备)对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

取21～23g的雄性ICR小鼠50只，按体重随机分5组：正常对照组、模型对照组、KFX-4低剂量组(KFX-4 25mg·kg^-1)、KFX-4高剂量组(KFX-4 62.5mg·kg^-1)、阳性对照组(氢化可的松25mg·kg^-1)，每组10只，各组腹腔注射相应的药物和溶剂后30min，除正常对照组外，取30μl二甲苯均匀涂抹于小鼠左耳(正方两面各15μL)，致炎45min后，用打孔器取下小鼠左右耳，并用分析天平精确称重，计算小鼠耳肿胀度：(左耳-右耳)/右耳。

表KFX-4对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响(X±s，n＝10)

注：与正常对照组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与模型对照组比较组，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

与模型对照组比较KFX-4低、高剂量组和阳性对照组小鼠的耳肿胀度明显降低(P＜0.01)，62.5mg·kg^-1KFX-4的抗炎效果与25mg·kg^-1氢化可的松相当；初步试验结果显示，KFX-4可有效抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，表明KFX-4有明显的抗炎作用。

实施例9

KFX-4(实施例3制备)促进肉芽组织增生试验

取体重为270～300g的雄性SD大鼠20只，按体重随机分2组：空白对照组、KFX-4组，各组大鼠用3％戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔麻醉后，大鼠背部用剃毛刀剃毛，并用碘伏消毒，在无菌条件下，皮下放置塑料环，环与皮肤接触处缝合一针，环口露于皮肤外，呈开放式。手术后1天，各组大鼠在塑料环开口处滴入相应的浓度的药物或溶剂0.5ml，每日二次，每次0.25ml，连续给药10天，末次给药24h后，将各组动物处死，取肉芽组织，用滤纸吸干组织液，并用分析天平称重，取一半肉芽肿置于65℃烘箱中烘烤24h后测定干重，另一半肉芽肿用甲醛固定进行病理检查，观察是否为肉芽组织。

表KFX-4对大鼠肉芽肿的影响(X+s，n＝10)

注：与空白对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表1结果可见，与空白组比较，KFX-4组大鼠的肉芽肿湿重和干重明显增加(P＜0.01)。病理检查结果各组样本均见新生肉芽组织和异物肉芽组织，亦见局部坏死组织，肉芽组织内大量梭形成纤维细胞，局部可见毛细血管和异物巨噬细胞，并有淋巴细胞和嗜中性粒细胞等炎症细胞浸润。

试验结果表明，KFX-4能显著促进肉芽组织增生。

Claims

1.一种二氢异香豆素葡萄糖苷化合物，其特征在于该化合物具有式I所示的化学结构式：

2.一种如权利要求1所述二氢异香豆素葡萄糖苷化合物I的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)提取：

用蜚蠊科昆虫美洲大蠊Periplaneta americana干燥或鲜成虫为原料，在常温或加热，常压或减压状态下，以20％-100％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液为溶剂提取1-3次；每次提取溶剂的用量为原料的4-10倍w/w；提取方法为煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、温浸、渗漉或微波提取；

(2)萃取：上述提取液减压浓缩回收溶剂后的浓缩液加水萃取1-3次，水的用量为浓缩液的2-4倍w/w，加水后充分搅拌，静置分层，取水层；

(3)吸附：水层经大孔吸附树脂或活性炭吸附，吸附物用洗脱液洗脱；所述大孔吸附树脂为D101、MN200、HPD100、HPD400、HPD450、AB-8、D4020、S-8，HZ806或HP-20大孔吸附树脂；洗脱溶剂为水、含水乙醇、含水甲醇、含水丙酮或含水丙醇，含水溶剂的含水量在5％-95％；洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱；

3.根据权利要求2的方法，其特征在于所述步骤(1)对原料进行提取时，在常温或加热，常压或减压状态下，以50-95％乙醇的水溶液为溶剂加热提取1-3次；提取时间每次3-12小时。

4.根据权利要求2的方法，其特征在于所述步骤(3)大孔吸附树脂为D101、MN200或HPD100型大孔吸附树脂。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于所述步骤(3)过大孔吸附树脂，先用1-8倍柱体积的水洗；再用或不用5％-20％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液清洗，进一步去除杂质，用量为1-3倍柱体积；最后用20％-95％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液洗脱，用量为2-8倍柱体积，收集洗脱液，回收溶剂，即得含有(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的部分。

6.根据权利要求2的方法，其特征在于所述步骤(3)活性炭吸附法的活性炭为粉状活性炭或颗粒状活性炭；洗脱溶剂为水、含水乙醇、含水甲醇、含水丙酮或含水丙醇，含水溶剂的含水量在5％-95％，洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱。

7.根据权利要求6的方法，其特征在于所述步骤(3)活性炭吸附时，先用水洗1-8倍柱体积；再用或不用5％-20％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液清洗，进一步去除杂质，用量为1-3倍柱体积v/v；最后用20％-95％的乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的水溶液洗脱，用量为2-8倍柱体积v/v，收集洗脱液，回收溶剂，即得含有(3R)-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的部分。

8.根据权利要求2的方法，其特征在于所述步骤(4)柱层析所用的硅胶柱层析为常压或加压柱层析，所用填料为100-400目硅胶，用乙酸乙酯、正丁醇、水、丙醇、乙醇、甲醇、丙酮、石油醚或正己烷或它们的至少两种混合物为洗脱剂，洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱；或所述步骤(4)LH-20柱层析，采用常压或加压柱层析，所用填料为sephadex LH-20葡聚糖凝胶，采用乙醇、甲醇、丙酮或丙醇的含水溶液为洗脱剂，洗脱剂含水10％-90％v/v，洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱；所述步骤(4)反相柱层析法，采用常压或加压柱层析或制备型HPLC法，所用填料为十八烷基键合相或八烷基键合相，采用含水乙醇、含水甲醇、含水丙酮或含水丙醇中的一种或几种为洗脱剂，洗脱剂含水比例10％-90％v/v，洗脱方法为等度洗脱或梯度洗脱。

9.一种如权利要求1所述二氢异香豆素葡萄糖苷化合物在制备预防与治疗和抗炎、促进肉芽组织增生或创伤愈合有关疾病的药物中的应用。

10.根据权利要求9的应用，其特征在于所述应用为在制备预防与治疗炎症、溃疡、外伤、金疮、瘘管、烧伤或烫伤的药物中的应用。

11.根据权利要求9的应用，其特征在于所述的药物为含权利要求1所述二氢异香豆素葡萄糖苷化合物作为活性成分与药用辅料制成的药物组合物，包括合剂、口服液、凝胶剂、软膏剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂和注射剂。