CN103819569B

CN103819569B - 一种抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法

Info

Publication number: CN103819569B
Application number: CN201310403702.XA
Authority: CN
Inventors: 宋爱荣; 赵晨; 孔超; 田雪梅; 梁大勇
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-09-09
Filing date: 2013-09-09
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2033-09-09
Also published as: CN103819569A

Abstract

本发明公开一种抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法，其方法包括樟芝发酵全液分离菌丝体或固体发酵后的菌丝体经过乙醇提取、过滤、减压浓缩、除色素、除小分子化合物、除脂肪、醇析、离心分离、收集物干燥、收集物粉碎等步骤。本发明的方法提取的樟芝发酵菌丝体粗多糖对禽流感病毒具有明显的抑制作用，该方法具有工艺简便、成本低、效果好的特点。

Description

一种抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法，尤其涉及樟芝（Antrodiacamphorata）Ac001，已于2005年9月21日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCCNo.1460，保藏地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。

背景技术

关于抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法，经检索到的相关专利有：中国专利申请号为99112556.8灰树花发酵液多糖提取方法，02136517.2灰树花发酵工艺及其多糖肽的生产方法，89105471一种云芝糖肽（PSP）的生产方法，92109345香菇多糖及香菇菌多糖提取工艺，96109095中国灵芝保健饮料，92111030灵芝营养保健液及其制法，93103116灵芝口服液等专利，这些专利内容大多以提取多糖为主要目的，其中灰树花、云芝和灵芝三种制备的活性物质提取物具有抗肿瘤、抗高血压、降低血糖、抗肥胖、抗肝炎等药效，但对于抗病毒作用鲜有报道，而对于抗禽流感病毒的报道更是没有检索到。

发明内容

本发明要解决的问题是，针对上述抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法以及其制备的发酵提取物的药理作用所存在的不足，提供一种抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法。利用本发明的方法提取的樟芝发酵菌丝体粗多糖对禽流感病毒具有明显的抑制作用，并且对正常细胞具有保护作用，且该方法具有工艺简便、成本低、药效好的特点。

本发明的抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法，包括两种制备形式：其一为直接从樟芝发酵全液中菌丝体分离出活性物质；其二为从樟芝固体发酵培养菌丝体中分离出活性物质。由以下步骤组成：

所述的抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法，其特征是，所述樟芝发酵菌丝体粗多糖由下述方法制得：

(1)加热提取：取经液体发酵或固体发酵的樟芝菌丝体放于容器内，加入10-20倍的蒸馏水或纯净水，调整其pH值为8～12，置60～120℃下加热100～240分钟，趁热过滤，滤渣再加入10倍的蒸馏水，重复上述步骤再次加热提取，然后过滤，将两次滤液合并；

(2)减压浓缩：合并收集的滤液，在温度50～70℃，压力0.2～0.6Kg/cm²，真空度为0.02～0.06Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10～1/20；

(3)除色素：取浓缩后的提取液，用氨水调pH至6.0～8.0，于30～45℃下搅拌，按每10ml滴加1ml～2ml10%～30%的H₂O₂，进行脱色10～24h，得到淡黄色液体，

(4)除小分子化合物：然后利用透析袋，截留分子量3000～5000以上，4℃～10℃条件下透析24h～48h，去除多余的H2O2、小分子化合物。

(5)除脂肪：取上述提取液，装入索氏提取器,石油醚加热回流提取2～6h,待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液。

(6)醇析：在回收的提取液中，加入量为其体积4～8倍的乙醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为30～60r/min，10～20分钟后，静置24～48小时进行醇析；

(7)离心分离：醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为3000～5000r/min离心20～30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；

(8)收集物干燥：将上述收集的离心沉淀物，在50～70℃温度条件下干燥36～48小时；

(9)收集物粉碎：取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后即为樟芝菌丝体粗多糖。

其中，所述的樟芝发酵全液是指樟芝（Antrodiacamphorata）发酵液与菌丝体的集合体。

步骤所述的樟芝菌丝体是指樟芝（Antrodiacamphorata）菌株液体发酵和固体发酵所得的菌丝体

所述樟芝通过以下步骤进行发酵：

（一）液体发酵

（1）液体种子培养：采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基，将10%的樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，调节pH为3-8，培养温度为20-35℃，摇瓶转速为80-280r/min，培养7-15天，即可得到樟芝液体种子；

（2）发酵罐发酵：先将发酵罐中的培养基进行灭菌，灭菌压力为0.1～0.2公斤/平方厘米，灭菌时间为1-2小时；当樟芝液体种子pH值降至2.5-4时，将摇瓶中的樟芝种子接种到发酵罐的培养液中，调整pH为5-8，培养温度25-35℃，通气量0.5-1.1vvm，搅拌转速100-250r/min，培养7-30天。

所述液体种子培养基或发酵培养基配方以克/100毫升计是：

马铃薯淀粉1～3%麦芽糖1～5%

蛋白胨0.2～0.6%酵母膏0.2～0.5%

硫酸镁0.1～0.3%磷酸二氢钾0.05～0.1%

（二）固体发酵

将樟芝液体菌种接种至事先制备的固体培养基的菌包中，其含水量约为65%，12×30cm、15×30cm或17×30cm菌袋，每袋重150g～1050g，pH自然，培养温度25℃～27℃、空气相对湿度50%～70%、黑暗培养100d～160d，定期检察并移除污染菌包，待菌包表面全部呈桔红色后，开包取出菌丝体，粉碎后进行提取。

所述固体培养基配方以百分含量计是：

玉米芯40%，樟木屑40%，麸皮15%，

乳糖3%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁1%

所述固体培养基还可使用谷物培养基，其配方是：

（1）小麦98%,碳酸钙1%，石灰1%(2)谷子98%，碳酸钙1%，石灰1%

(3)玉米98%，碳酸钙1%，石灰1%（4）大麦98%，碳酸钙1%，石灰1%;

谷物培养基的制备方法：

先将谷物加水浸泡12小时，加入石灰1%，煮沸后捞出，沥干表面水分，拌入1%碳酸钙后，装瓶，封口，然后植入高压锅中进行高压灭菌。121℃下保持2h,温度降到30℃后，取出，冷却后将樟芝液体菌种接种至固体培养基的中，培养温度25℃～27℃、空气相对湿度50%～70%、黑暗培养160d，检察并移除污染，待菌瓶表面全部呈桔红色后，取出菌丝体，进行提取。

采用本发明的抗禽流感病毒的樟芝发酵菌丝体粗多糖的制备方法，具有工艺简便、成本低、产量高的特点。该方法采用樟芝发酵菌丝体进行多糖提取，大大解决了樟芝子实体匮乏，原料极缺，活性物质提取无法实现的困境;解决了樟芝菌丝体人工培养难度大、时间长的技术问题;降低了原料成本和生产成本，提高了菌丝体的产量，提高了活性物质产率。

采用本发明的方法提取的樟芝粗多糖，经青岛农业大学药用真菌研究所在中国动物卫生与流行病学中心外来病研究中心所作的体外抗禽流感病毒药物筛选试验，樟芝发酵菌丝体粗多糖对禽流感病毒具有明显的抑制作用，并对细胞具有保护作用。

体外抗禽流感病毒药物筛选试验的具体方法如下：

、实验材料

1、细胞：MDCK细胞

2、病毒：禽流感病毒毒株为H5N1型

3、培养液：含10％胎牛血清的DMEM培养液

、实验条件

生物安全三级实验室

、实验步骤

1、CPE法测定病毒对MDCK细胞半数毒性浓度

按Reed-Muench法测定MDCK细胞的半数细胞感染物感染剂量（TCID50）。

2、CPE法结合MTT法确定药物对细胞的无毒浓度

用酶联免疫检测仪测定OD492值，计算出样品的最大无毒浓度(TC0)和半数中毒浓度(TC50)。

3、提取物的最大无毒浓度对禽流感病毒的药效测定

采用MTT法测定OD492值。当加样组的OD492值显著大于病毒对照组OD492时，表明此样液能够显著抑制病毒感染MDCK，具有抗病毒的活性。

、实验结果

1、病毒的TCID_5o为10^-4。

2、取樟芝提取物5个浓度即16、8、4、2、1mg／ml进行细胞毒性测定，每浓度做10个复孔，同时设细胞对照。结果显示最大无毒浓度为16mg／ml。

3、取16、5.3、2.65mg／ml药液，做10个复孔，观察对禽流感病毒的抑制作用。试验设病毒对照和细胞对照。结果显示樟芝提取物3个不同浓度药物对禽流感病毒具有很好的抑制作用。见下表。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

（四）具体实施方式

实施例1：

抗禽流感病毒的樟芝菌发酵菌丝体粗多糖的制备方法，

1.发酵培养基配方：

地瓜淀粉1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.2%，硫酸镁0.1%磷酸二氢钾0.05%。

2.液体种子培养：

采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基。发酵培养方法是，将10%的樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，调整pH6，以28℃条件下培养，摇瓶转速为150r/min，震动培养15天。即可得到樟芝液体种子。

3.发酵罐发酵：

采用50L发酵罐进行樟芝液体发酵，发酵罐灭菌压力为0.1～0.2公斤/平方厘米，灭菌时间为1.5小时，当罐体温度降到30℃以下，时，将pH3.5的樟芝液体种子转接到50L发酵罐内，温度控制在28℃，pH6，罐内通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度控制在200转/分的条件，培养15天，即可获得樟芝菌丝体发酵全液，经过滤得到菌丝体。

4.菌丝体粗多糖的提取：

(1)加热过滤：取发酵全液10L,进行过滤，得到樟芝（Antrodiacamphorata）菌丝体100克,放于3000ml容器内，加入2000ml纯净水，调整其pH值为8，置100℃下加热120min，趁热过滤，滤渣再加入10倍的蒸馏水，重复上述步骤再次加热提取，然后过滤，将两次滤液合并；

(2)减压浓缩：离心完毕后弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度55℃，压力0.5Kg/cm²，真空度为0.04Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10～1/20；

(3)除色素：取浓缩后的提取液，用氨水调pH至8.0，于45℃下搅拌，按每10ml滴加2ml30%的H₂O₂，进行脱色24h，得到淡黄色液体，

(4)除小分子化合物：然后利用透析袋，截留分子量5000以上，4℃条件下透析24h，去除多余的H₂O₂、小分子化合物。

(5)除脂肪：取上述提取液，装入索氏提取器,石油醚加热回流提取6h,待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液。

(6)醇析：在浓缩滤液中，加入量为其体积4倍的95%的乙醇并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，10分钟后，静置24h进行醇析；

(7)离心分离：醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为5000r/min离心25min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；

(8)收集物干燥：将上述收集的离心沉淀物，在55℃温度条件下的置鼓风干燥箱内干燥48小时；

(9)收集物粉碎：取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即得樟芝菌丝体粗多糖20.57克。

实施例2：

抗禽流感病毒的樟芝菌发酵菌丝体粗多糖的制备方法，

1.发酵培养基配方：

地瓜淀粉2%，葡萄糖3%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.3%，硫酸镁0.1%，磷酸二氢钾0.05%。

2.液体种子培养：

采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基。发酵培养方法是，将5%的樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，pH自然，以30℃条件下培养，摇瓶转速为200r/min，震动培养10天。即可得到樟芝液体种子。

3.发酵罐发酵：

采用50L发酵罐进行樟芝液体发酵，发酵罐灭菌压力为0.1～0.2公斤/平方厘米，灭菌时间为2小时，当罐体温度降到30℃以下，时，将pH3的樟芝液体种子转接到300L发酵罐内，温度控制在30℃，pH6，罐内通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度控制在180转/分的条件，培养10天，即可获得樟芝菌丝体发酵全液。

4.菌丝体粗多糖的制备：

将50L液体发酵的樟芝（Antrodiacamphorata）发酵全液进行过滤，将菌丝体转移到提取容器中，加纯净水10升，调整pH至9左右，加热升温，当温度升至100℃时开始计时，维持2h后停止升温，趁热用200目筛网过滤，重复上述步骤再次加热提取，然后过滤，将两次滤液合并，进行减压浓缩，浓缩温度控制在50℃，真空度为0.06Mpa，罐压控制在0.2Kg/cm²，浓缩至1升左右时，取浓缩后的提取液，用氨水调pH至7.0，于40℃下搅拌，按每10ml滴加1ml15%的H₂O₂，进行脱色10～24h，得到淡黄色液体，然后利用透析袋，截留分子量5000以上，8℃条件下透析36h，取上述提取液，装入索氏提取器,石油醚加热回流提取5h,待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液；在回收的提取液中，加入量为其体积6倍的醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为60r/min，20分钟后，静置48小时，醇析后弃上清液，沉淀物移入离心管中，以转速为4000r/min离心30min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物，将上述收集的离心沉淀物，在70℃温度条件下干燥36小时，取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后即为樟芝菌丝体粗多糖，称重量为50克。

实施例3：

抗禽流感病毒的樟芝菌发酵菌丝体粗多糖的制备方法，

1.固体发酵培养基配方：

固体培养基配方以百分含量计是：

玉米芯40%，樟木屑40%，麸皮15%，

乳糖3%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁1%

2、樟芝液体种子培养：

3、固体发酵

采用15×30cm菌袋，按上述培养基配方，称取原料，用纯净水搅拌，控制其含水量约为65%，封口后，置高压灭菌锅中，进行高压灭菌，121℃下保持2h,温度降到30℃后，取出，冷却后将樟芝液体菌种接种至固体培养基的菌包中，培养温度25℃～27℃、空气相对湿度50%～70%、黑暗培养160d，检察并移除污染菌包，待菌包表面全部呈桔红色后，开包取出菌丝体，粉碎后进行提取。

4、菌丝体粗多糖的提取：

(1)加热过滤：取固体发酵菌包100袋,捣碎后放于2000L容器内，加入1200L纯净水，调整其pH值为8，置100℃下加热150min，趁热以200目的筛网过滤,收集滤液，滤渣以其500L纯净水稀释，重复上述操作1遍，再收集滤液；

(2)减压浓缩：弃去滤渣，合并收集的滤液，在温度50℃，压力0.5Kg/cm²，真空度为0.04Mpa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10；

(3)除色素：取浓缩后的提取液，用氨水调pH至8.0，于45℃下搅拌，20%的H₂O₂进行脱色,24h后得到淡黄色液体；

(4)除小分子化合物：然后利用透析袋，截留分子量5000以上，10℃条件下透析48h，去除多余的H₂O₂、小分子化合物；

(5)除脂肪：取上述提取液，装入索氏提取器,石油醚加热回流提取6h,冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液。

(6)醇析：在浓缩滤液中，加入量为其体积5倍的95%的乙醇后不断搅拌，搅拌速度为60r/min，10分钟后，静置24h进行醇析；

(7)离心分离：醇析后弃上清液，沉淀物以转速为5000r/min离心15min，离心后弃去上清液，收集离心沉淀物；

(8)收集物干燥：将上述收集的离心沉淀物，在55℃温度条件下的置真空干燥箱内干燥70小时；

(9)收集物粉碎：取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后，即得樟芝菌丝体粗多糖560.57克。

Claims

1.一种抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征是，所述樟芝菌丝体粗多糖由下述方法制得：

(2)减压浓缩：取合并的滤液，在温度50～70℃，压力0.2～0.6kg/cm²，真空度为0.02～0.06MPa的条件下进行减压浓缩，使滤液浓缩至原有体积的1/10～1/20；

(3)除色素：取浓缩后的提取液，用氨水调pH至6.0～8.0，于30～45℃下搅拌，按每10mL滴加1mL～2mL10％～30％的H₂O₂，进行脱色10～24h，得到淡黄色液体；

(4)除小分子化合物：然后利用透析袋，截留分子量5000以上，4℃～10℃条件下透析24h～48h，去除多余的小分子化合物；

(5)除脂肪：取上述提取液，装入索氏提取器，石油醚加热回流提取2～6h，待冷却后，弃去石油醚层，回收余下的提取液；

(6)醇析：在回收的提取液中，加入量为其体积4～8倍的醇溶液并不断搅拌，搅拌速度为30～60r/min，10～20分钟后，静置24～48小时进行醇析；

(9)收集物粉碎：取上述烘干的收集物，进行粉碎，经200目筛网过筛后即为樟芝菌丝体粗多糖；

步骤(1)所述的樟芝菌丝体是指樟芝(Antrodiacamphorata)菌株液体发酵和固体发酵所得的菌丝体。

2.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征在于所述樟芝液体发酵或固体发酵经分离获得樟芝发酵菌丝体。

3.如权利要求1或2所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征在于，所述樟芝液体发酵通过以下步骤进行：

(1)液体种子培养：采用500毫升三角瓶，每瓶装200毫升液体培养基，将10％的樟芝菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，调节pH为3-8，培养温度为20-35℃，摇瓶转速为80-280r/min，培养7-15天，即可得到樟芝液体种子；

(2)发酵罐发酵：先将发酵罐中的培养基进行灭菌，灭菌压力为0.1～0.2公斤/平方厘米，灭菌时间为1-2小时；当樟芝液体种子pH值降至2.5-4时，将摇瓶中的樟芝种子接种到50L发酵罐的培养液中，调整pH为5-8，培养温度25-35℃，通气量0.5-1.1vvm，搅拌转速100-250r/min，培养7-30天，即可获得樟芝发酵全液，经过滤得到菌丝体。

4.如权利要求3所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征在于，所述液体种子培养基或发酵培养基配方以克/100毫升计是：

5.如权利要求1或2所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征在于，所述樟芝固体发酵通过以下步骤进行：

将樟芝液体菌种接种至事先制备的固体培养基的菌包中，其含水量约为65％，15×30cm菌袋，每袋重150g～1050g，期间不用调节pH，培养温度25℃～27℃、空气相对湿度50％～70％、黑暗培养100d～160d，待菌包表面全部呈桔红色后，开包取出菌丝体，粉碎后进行提取；

所述固体培养基配方以百分含量计是：

玉米芯40％，樟木屑40％，麸皮15％，

乳糖3％，磷酸二氢钾1％，硫酸镁1％。

6.如权利要求1或2所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征在于，所述樟芝固体发酵还可使用谷物培养基，其配方是：

(1)小麦98％,碳酸钙1％，石灰1％；或

(2)谷子98％，碳酸钙1％，石灰1％；或

(3)玉米98％，碳酸钙1％，石灰1％；或

(4)大麦98％，碳酸钙1％，石灰1％；

所述谷物培养基的制备方法及发酵步骤如下：

先将谷物加水浸泡12小时，加入石灰1％，煮沸后捞出，沥干表面水分，拌入1％碳酸钙后，装瓶，封口，然后植入高压锅中进行高压灭菌，121℃下保持2h,温度降到30℃后，取出，冷却后将樟芝液体菌种接种至谷物培养基中，培养温度25℃～27℃、空气相对湿度50％～70％、黑暗培养160d，待菌瓶表面全部呈桔红色后，取出菌丝体，进行提取。

7.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征在于步骤(6)中所述醇溶液为甲醇或乙醇水溶液，浓度为60-95％。

8.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征在于步骤(8)中所述收集物干燥使用真空干燥，真空度0.02-0.06MPa，干燥时间36-48小时。

9.如权利要求1所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖的制备方法，其特征在于步骤(9)中所述粗多糖粉碎时采用200目的中药粉碎机对粗多糖进行粉碎过筛。

10.如权利要求1所述的制备方法制备的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖在制备抗禽流感病毒药物中的用途。

11.如权利要求10所述的抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖在制备抗禽流感病毒药物中的用途，其特征在于所述抗禽流感病毒的樟芝菌丝体粗多糖在药物中的含量为10％-20％。