CN101182562B - 通过金耳液体发酵生产胞外多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物发酵及医药领域，为一种通过金耳液体发酵生产胞外多糖的方法以及用途。本发明以金耳为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，得到含有胞外多糖的金耳发酵液。通过对金耳液体深层发酵得到的发酵液进行超滤、酒精沉淀或者浓缩酒精沉淀得到胞外多糖粗品。其中胞外多糖的总收率可达0.3～1克/升发酵液，所获得的胞外多糖纯度在30～60％。由此方法获得的胞外多糖可用于生产具有调节血糖的药物或保健食品。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵及医药领域，具体为一种通过金耳液体发酵生产胞外多糖的方法及其用途。
背景技术
糖尿病是目前中老年人的常见病和多发病，由糖尿病引起的并发症严重危及人们的生命健康。现有西药类降糖药物难免有副作用，而天然中药类降糖药物大多数降糖不明显，同时受物种资源的限制。而以药用真菌发酵生产降糖药物则没有上述缺点。
金耳，是一种稀有野生名贵食用菌和药用菌。该菌属于银耳属的一种真菌，学名Tremella aurantialba，生长在壳斗科植物腐木上。其药用价值在《本草纲目》、《中国药用真菌》、《中国中药大典宗旨》和《云南食用菌》等书籍中均有详细介绍。金耳性温寒，味甘，能化痰，止咳，定喘，调气，平肝阳；临床上治神经衰弱，肺热，哮喘，慢性支气管炎，高血压，肝炎等疾病。由于金耳生长在海拔1900-3300米。不易人工栽培，资源受到限制因此金耳的液体深层发酵，具有十分广阔的应用前景。
近年来国内外对金耳的研究主要集中于它的驯化栽培、营养成分分析、液体培养以及菌丝体内多糖及药效等方面。日本kiho等(Biol Pharm Bull，2001，24，1400-3)和华东师范大学瞿伟菁(营养学报.2004，26，300-303.)等人进行了菌丝体内多糖降血糖作用的研究，证明了其多糖可开发成预防和治疗糖尿病的保健品和(或)药品的可能性；熊耀康(浙江中医学院学报.2000，24，71-72；浙江中医学院学报.1999，23，50-51)报道复方金耳能提高气管平滑肌的松弛百分率，对气管平滑肌有松弛作用，并能延长药物引喘的潜伏期，故复方金耳具有较强的平喘作用。同时他们证明复方金耳可提高机体免疫功能和较强的止咳作用。李秀花杨莉莉等(山西医科大学学报.2000，31，206-207)通过实验提出金耳浓缩液有明显提高小鼠非特异性免疫作用，并且呈现剂量依赖性关系。刘春卉(天然产物的研究与开发.2003，15，289-292.)报道金耳菌丝发酵产物能明显对小鼠体内血栓形成有显著的抑制作用。张志才(食品科学.2005，26(11)，145-148)详述了利用碱水解与超滤相结合生产金耳菌丝体胞内多糖的方法。张志才(天然产物的研究与开发.2006，18，613-616.)报道了金耳发酵液不含有多糖大孔树脂提取物物具有显著降低链脲佐菌素诱导的高血糖小鼠血清中葡萄糖浓度的作用，极显著降低果糖胺和三磷酸甘油酯水平等功效，并申请了相关专利。
本发明与上述文献或相关专利区别在于本发明侧重于菌丝体液体培养过程中去除菌丝体后的发酵液中多糖的提取方法及其被用于生产降血糖产品或药品。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种以金耳为原料进行液体深层发酵的方法，由该发酵方法制备的金耳发酵液，该发酵液中含有胞外多糖类化合物，以及可以用此发酵液和胞外多糖粗品制备具有调节血糖作用的药物或保健食品。
本发明所使用的金耳菌种可选用任意一种金耳菌种，例如云南、西藏或山西的野生金耳经常规组织分离得到的菌种。其以金耳为出发菌株，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，得到含有胞外多糖的金耳发酵液；其中所述的一级种子培养的培养基组成为：葡萄糖5～10，玉米粉15～25，黄豆饼粉3～10，KH2PO4 3～6，MgSO4 1～4，豆油0.2～0.5，组成单位为克/升为；加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0，接种量体积百分比为5～10％，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1∶1v/v/m，培养时间24～72小时；所述发酵培养的培养基组成为：含大量纤维素物质粉末25～55，玉米粉10～20，麸皮5～10，黄豆饼粉3～10，KH2PO4 2～4，MgSO4 1～4，CaCO3 0.5～1组成单位为克/升；消泡剂0.2～0.5，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；接种量5～10％v/v，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时。
具体的，在本发明所述的发酵工艺中，其中所述的斜面培养基是现有技术中常用的斜面培养基，例如常用的是PDA培养基，此类培养基的组成和所用可参见诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367。
由本发明的方法获得的金耳发酵液为淡黄色到棕色的、有一定粘度的粘稠液体，其中含有菌丝体残渣形成的沉淀，该发酵液中胞外多糖的含量可达0.3～1.5克/升。
在本发明的发酵工艺中，上述各发酵步骤的培养基使用比为：所述一级种子培养基的使用比为当本发明上述的一级种子罐的容积为50～100L时，其中装有的一级种子培养基的量相应为30～70L；所述发酵培养基的使用比为当本发明上述的发酵罐的容积为500～2000L时，其中装有的发酵培养基的量相应为300～1400L。
在本发明的金耳深层发酵工艺中，所述发酵培养工艺适于在500L～2000L的发酵罐中进行。
根据本发明所述适于在500～2000L的发酵罐规模进行的发酵培养工艺，结合本领域的基本知识可以进一步根据生产需要扩大发酵规模，以进行工业化规模的生产。
本发明的另一目的是提供了一种以金耳为原料通过液体深层发酵生产金耳胞外多糖的工艺，其特征是将上述通过金耳液体深层发酵得到的发酵液进行超滤、酒精沉淀或者浓缩酒精沉淀得到胞外多糖粗品。由此方法获得的胞外多糖可用于生产具有调节血糖的 药物或保健食品。
具体的，本发明制备胞外多糖的方法为：将得到的含有胞外多糖的金耳发酵液离心，将离心得到的上清液超滤，滤液经浓缩，酒精沉淀，酒精洗涤，干燥得到的胞外多糖粗品；具体包括以下步骤：
(1)将所述含有多糖的金耳深层发酵液经3000rpm离心；
(2)得到的上清液用0.05～0.15微米的膜微滤；再用分子量4500～10000的膜超滤；(3)真空浓缩上一步骤获得的滤液，所得到的浓缩液经冷冻干燥后得到金耳多糖粗品，或者上一步的超滤液用四倍酒精沉淀，沉淀物酒精洗涤后烘干，得到金耳多糖。
应用本发明上述制备胞外多糖的总收率可达0.3～1克/升发酵液。所得到的粗品中多糖的含量可达30～60％。
选取空腹血糖水平在3.5～6.3mmol/L范围的正常雄性昆明小鼠，以柠檬酸缓冲液(pH4.6)灭菌后配制的4％alloxan注射液，按体重2000mg/kg剂量一次性腹腔注射造型，72小时后，选择血糖值大于10mmol/L的小鼠随机分为5组，每组12只，组间差异小于0.5mmol/L，设阳性对照(I)灌胃给予生理盐水；阳性药物(II：二甲双胍)剂量120mg/kg体重；金耳胞外多糖粗品治疗低、中、高三种剂量组(分别为III、IV、V组)，分别以20、40、80mg/kg体重灌胃。
上述试验给药7d后，金耳胞外多糖组与对照组相比，治疗组血糖均极显著降低(p＜0.01)，可见金耳胞外多糖7d即能显著降低高血糖小鼠血糖。
本发明经试验研究发现应用本发明的发酵方法生产的发酵液及胞外多糖经口服途径给予高血糖小鼠可显著降低其血糖和果糖胺，因此证实了金耳发酵液和胞外多糖具有制备具有降血糖功能的保健饮品或药品的用途。应用本发明的金耳深层发酵方法，可以大规模或工业化生产金耳发酵液，以及生产其次生产品胞外多糖和含有该多糖的药物组合物。由于该药物组合物中所含的金耳发酵液或由该发酵液制备的胞外多糖来源于天然菌种的发酵，因此没有任何毒副作用，从而为糖尿病患者提供了理想的药物。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明的技术方案所涉及的材料及工艺，给出了下述实施例。但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
金耳菌种的组织分离
取云南野生金耳新鲜未开伞的子实体，削去菌柄基部和菌柄外表皮，用75％乙醇进行子实体表面消毒后，移人超净工作台，紫外灯照射20min。将解剖刀在酒精灯火焰上灼烧后放人无菌水中降温，确保解剖刀温度不会损伤子实体组织。将子实体一分为二， 在菌柄内(柄中)、菌柄与菌盖交界处(交界)、菌盖和菌褶处切割表皮内组织，黄豆大小的小块，切割时不能切透子实体表面组织。用无菌镊子接人试管斜面培养基(即为PDA培养基)，每种组织各接10支，25-28℃暗培养，每天定时观测菌丝生长污染情况，当长至4-10天时，用PDA培养基试管斜面转接。
实施例1 金耳发酵液的制备
1、在新配制的土豆培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P 367)中接入实施例1得到的金耳菌种，培养温度27℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有60mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，于27℃、150转/分钟摇床培养24小时。其中所述摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉5，KH2PO4 3，MgSO4 1，起始pH值为6.3。
2、将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共24瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入11mL摇瓶种子，于27℃、150转/分钟摇床培养24小时。其中所述扩大培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉5，KH2PO4 3，MgSO4 1，起始pH值为6.3。
3、将上述扩大培养的菌种3600mL接入装有44.9L一级种子培养基的75L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为48.5L；维持罐温27℃，罐压0.05MPa，搅拌速率120转每分钟，通风量1∶0.6v/v/m，发酵时间85小时。其中种子罐中的一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉8，KH2PO4 3，MgSO4 1，消泡剂0.35，起始pH值为6.3。
4、将48.5L一级种子菌种接入装有600L发酵培养基的1000L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为648.5L。维持罐温27℃，罐压0.05MPa，搅拌速率100转每分钟，通风量1∶0.5v/v/m，发酵时间144小时。其中发酵罐中的发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖50，玉米粉10，麸皮10，黄豆饼粉8，KH2PO4 2，MgSO4 1，CaCO3 1，，消泡剂0.35，起始pH值为6.0。
经上述步骤后得到金耳发酵液，该发酵液桔黄色，具有香味，胞外多糖含量为1.5g/L，该发酵液菌丝体经水洗、烘干，得干菌丝体，重为18Kg，
实施例2 金耳发酵液和胞外多糖粗品的制备
此实施例所用的菌种为实施例1得到的菌种。
1、在新配制的PDA培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)中接入组织分离法得到的金耳菌种，培养温度25℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，22℃、120转每分钟摇 床培养36小时。
2、将此摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，25℃、120转每分钟摇床培养36小时。
3、将此扩大培养的菌种1500mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间90小时。
4、将30L一级种子菌种接入装有320L发酵培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为350L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间180小时，得到金耳发酵液。该发酵液为金耳保健饮品，菌丝体干重0.63Kg，该发酵液对胞外多糖含量为0.8g/L。
上述步骤使用的各种培养基的配方如下：
摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉5，KH2PO4 3，MgSO4 1，起始pH值为6.3。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖10，玉米粉10，黄豆饼粉8，KH2PO4 3，MgSO4 1，消泡剂0.35，起始pH值为5.8。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖50，玉米粉10，麸皮15，黄豆饼粉8，KH2PO4 2，MgSO4 1，CaCO3 1，消泡剂0.35，起始pH值为6.0。
5、将实施例2得到的发酵液，经3000rpm离心30分钟后，上清液用非极性大孔树脂吸附吸附，流速为1/20柱体积/min，吸附结束后树脂柱用大量水冲洗至无色后，用50％乙醇溶液洗脱，洗脱液经真空浓缩，浓缩液冷冻干燥得到胞外多糖粗品，其中所含成分及含量类似于实施例3的胞外多糖粗品。
最终获得的胞外多糖类粗品得率为0.42克/升发酵液和胞外多糖粗品对体外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的测试方法同实施例3。
实施例3 金耳发酵液和胞外多糖粗品的制备
此实施例所用的菌种为实施例1得到的菌种。
1、在新配制的PDA培养基(诸葛健，王正祥，工业微生物实验技术手册，1994：P367)中接入实施例1得到的金耳菌种，培养温度25℃，待菌丝体长满斜面后，将斜面菌种接入装有75mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共3瓶)，22℃、120转每分钟摇床培养36小时。
2、将上述摇瓶菌种接入装有150mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接种量为每500mL三角瓶接入15mL摇瓶种子，25℃、120转每分钟摇床培养36小时。
3、将上述扩大培养的菌种1500mL接入装有28.5L一级种子培养基的50L种子罐中，种子罐中发酵液的总体为30L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶1v/v/m，发酵时间90小时。
4、将30L上述一级种子菌种接入装有320L发酵培养基的500L发酵罐中，发酵罐中发酵液的总体为350L；维持罐温25℃，罐压0.05MPa，搅拌速率90转每分钟，通风量1∶0.8v/v/m，发酵时间180小时。得到发酵液，该发酵液为金耳保健饮品，菌丝体干重7.35Kg。
上述各步骤使用的培养基的配方如下：
摇瓶培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖5，玉米粉15，黄豆饼粉5，KH2PO4 3，MgSO4 1，起始pH值为6.3。
扩大培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖10，玉米粉10，黄豆饼粉5，KH2PO4 3，MgSO4 1，起始pH值为5.8。
一级种子培养基的配方为(单位为克/升)：葡萄糖10，玉米粉10，黄豆饼粉8，KH2PO4 3，MgSO4 1，消泡剂0.35，起始pH值为5.8。
发酵培养基的配方为(单位为克/升)：含大量纤维素物质粉末50，玉米粉10，麸皮15，黄豆饼粉8，KH2PO4 2，MgSO4 1，CaCO3 1，消泡剂0.35，起始pH值为6.0。
将上述发酵液经3000rpm离心10分钟；得到的上清液用0.05～0.15微米的膜微滤，收集滤液，再用分子量4500～10000的膜超滤浓缩； 浓缩液进一步真空浓缩，所得到的浓缩液，冷冻干燥后得到金耳多糖粗品，或者将实施例3含有金耳多糖的金耳深层发酵液经3000rpm离心10分钟；上清液用四倍酒精沉淀，沉淀物酒精洗涤后烘干，得到金耳多糖。所得到的金耳发酵液中的胞外多糖含量可35％；应用本发明上述制备胞外多糖的总收率可达0.5克/升发酵液。。
实施例4金耳发酵液的胞外多糖类组合物降低四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠血糖试验。
实验动物：昆明小白鼠，雄性，体重为21-26g，由中科院上海实验动物中心提供。糖尿病小鼠模型制备：雄性小鼠禁食24小时后，腹腔注射160-200ug/kg四氧嘧啶造模型，5天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值＞10mmol/l为实验性糖尿病模型鼠。
实验模型鼠按禁食3-5小时的血糖水平随机分组，分为一个模型对照组和3个试验组，试验组分四个剂量(低剂量浓度为50mg/100mL，中剂量浓度为100mg/100mL，高剂量浓度为200mg/100mL)和阳性药物(二甲双胍，100mg/100mL)试验组按照剂量标准分别灌胃，对照组灌以自来水。连续给予受试物30天，测空腹血糖值。
三个实施例制得的发酵液或胞外多糖粗品降血糖试验结果(下表)显示中剂量组及 高剂量组血糖值显著低于与对照组的血糖值(P＜0.05或P＜0.01)，低剂量组尽管低于对照组，但是无显著性(P＞0.05)。这显示金耳胞外多糖具有降低四氧嘧啶诱导的糖尿病鼠血糖的作用。
表：不同实施例产品降血糖试验结果
| 实施例 | 例1 | 例2 | 例3 | ||
| 给药后 | 给药前 低剂量 中剂量 高剂量 | 血糖值 降低绝对值 血糖值 降低绝对值 血糖值 降低绝对值 | 19.21±2.13 18.43±1.97 0.78 16.12±2.51 3.09 15.53±2.70 3.68 | 18.73±2.73 18.04±2.64 0.69 16.52±2.03 2.21 15.91±1.99 2.82 | 19.75±2.44 18.49±2.71 1.26 15.92±2.50 3.83 15.17±2.43 4.58 |
以上已详细描述了本发明的实施方案，对本领域技术人员来说很显然可以做很多改进和变化而不会背离本发明的基本精神。所有这些变化和改进都在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.通过金耳（Tremella aurantialba）液体发酵生产胞外多糖的方法，其特征是以金耳为出发菌株，进行金耳菌种的斜面培养、液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养和发酵培养，得到含有胞外多糖的金耳发酵液；其中所述的一级种子培养的培养基组成为：葡萄糖5～10，玉米粉15～25，黄豆饼粉3～10，KH2PO4 3～6，MgSO4 1～4，豆油0.2～0.5，组成单位为克/升，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；接种量体积百分比为5～10％，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1∶1v/v/m，培养时间24～72小时；所述发酵培养的培养基组成为：含大量纤维素物质粉末25～55，玉米粉10～20，麸皮5～10，黄豆饼粉3～10，KH2PO4 2～4，MgSO4 1～4，CaCO3 0.5～1，消泡剂0.2～0.5，组成单位为克/升，加水至适当体积，起始pH值为5.8～7.0；接种量5～10％v/v，培养温度22～30℃，搅拌速率90～150转/分钟，通风量1∶0.3～1v/v/m，培养时间120～180小时；然后将所得到的含有胞外多糖的金耳发酵液经3000rpm离心10分钟，得到的上清液用0.05～0.15微米的膜微滤，收集滤液，再用分子量4500～10000的膜超滤浓缩，浓缩液进一步真空浓缩，所得到的浓缩液冷冻干燥后得到金耳胞外多糖粗品；或将所得到的含有胞外多糖的金耳发酵液经3000rpm离心10分钟，上清液用四倍酒精沉淀，沉淀物酒精洗涤后烘干，得到金耳胞外多糖。
2.根据权利要求1所述的通过金耳液体发酵生产胞外多糖的方法，其特征是上述各发酵步骤的培养基使用比为：所述一级种子培养基的使用比为当上述的一级种子罐的容积为50～100L时，其中装有的一级种子培养基的量相应为30～70L；所述发酵培养基的使用比为当上述的发酵罐的容积为500～2000L时，其中装有的发酵培养基的量相应为300～1400L。
3.根据权利要求1所述的通过金耳液体发酵生产胞外多糖的方法，其特征是金耳液体发酵工艺中，所述发酵培养工艺在500L～2000L的发酵罐中进行。
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