CN103555787A - 一种具有抗氧化活性的金耳发酵液多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物工程技术应用领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的金耳发酵液多糖的制备方法。该多糖为白色或淡黄色粉末，是金耳斜面菌种通过活化，摇瓶液体发酵，乙醇沉淀，脱蛋白，葡聚糖凝胶柱G-100层析、透析后冷冻干燥得到的。产量为6.6mg/100mL发酵液，用苯酚-硫酸法测得多糖含量为85.85％，可应用于制备具有抗氧化，防衰老功能的保健品。

Description

一种具有抗氧化活性的金耳发酵液多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有抗氧化活性的金耳发酵液多糖的制备方法。属生物工程技术应用领域。

背景技术

金耳为担子菌纲，银耳目，银耳科，银耳属的干燥子实体，主要分布于我国西藏云南等地，野生资源稀有，古籍文献记载用于肺热、痰多、咳嗽、气喘等症的治疗，具有较高的药用价值。研究表明，金耳深层发酵液中含有人体必需的氨基酸，并且有钾、钠、钙、镁、铁、锌等矿质元素。是一种集营养、保健、理疗于一身的绿色食品。通过热水浸提获得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可应用于保健品行业。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗氧化活性的金耳发酵液多糖的制备方法

本发明的技术方案为：将金耳斜面保藏菌种活化，接种至摇瓶种子液体培养基中培养，待菌丝体分散后将培养好的种子液接入摇瓶发酵液体培养基培养。发酵结束后，抽滤收集发酵液，浓缩后乙醇沉淀，脱蛋白、葡聚糖凝胶柱G-200层析、透析后冷冻干燥得到金耳发酵液多糖，最后进行体外抗氧化实验。

本发明发明的金耳发酵液多糖具有一定的抗氧化活性。可以作为原料应用于保健食品等领域。

上述技术方案中，摇瓶种子培养基为PDA1L加磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，VB1 10-20mg，pH6.0，发酵培养基为葡萄糖4g/100mL、酵母粉1g/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、硫酸镁0.15g/100mL、VB1 1-2mg/100mL，pH6.0，250mL三角瓶装培养基100mL于28℃，220r／min，振荡培养10-14d。多糖提取方法为发酵结束后抽滤取发酵液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1／5，加入4倍体积95％乙醇在4℃醇析，沉淀物用蒸馏水复溶后用Sevage法去除游离蛋白，葡聚糖凝胶G-100层析柱纯化，蒸馏水透析，冷冻干燥后得到金耳发酵液多糖。抗氧化试验将总还原能力，清除羟基自由基、DPPH的能力作为指标。

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实例一

1.发酵液制备

出发菌种为本实验室金耳斜面保藏菌种；

(1)摇瓶种子培养

摇瓶种子培养基：PDA1L加磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，VB1 10-20mg，pH6.0；

培养方法：从斜面菌种中取3～4块黄豆大小相同的菌块，接种于摇瓶种子培养基中，250mL三角瓶装培养基100mL于28℃，220r／min，振荡培养10d；摇瓶中预先装有经过消毒灭菌的玻璃珠，用于打散菌丝体。

(2)摇瓶发酵培养

发酵培养基：葡萄糖4g/100mL、酵母粉1g/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、硫酸镁0.15g/100mL、VB1 1-2mg/100mL，pH6.0；

培养方法：将培养好的种子以15％的接种量接入摇瓶发酵培养基中28℃，220r／min，振荡培养14d；

(3)发酵液浓缩，醇沉，脱蛋白，凝胶柱层析，透析

培养后抽滤，取发酵液用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1／5，加入4倍体积95％乙醇在4℃醇析过夜，离心收集沉淀物，用95％乙醇、无水乙醇、丙酮洗涤数次。待有机溶剂挥发完毕，将沉淀物用蒸馏水完全溶解，用Sevage法去除游离蛋白，具体为按发酵液1／5的体积加入氯仿，然后加入氯仿体积1／5的正丁醇，混合后振荡20min。蛋白质与氯仿-正丁醇生成凝胶，4000rpm离心20min，收集上清液，反复操作8次至氯仿-正丁醇层不浑浊为止。收集上清液用SephadexG-100凝胶层析对多糖进行纯化，流动相为0.1MNaCl，流速0.5mL／min，每管3mL。以苯酚-硫酸法在490nm处检测每管的糖浓度，测定该多糖的纯度。多糖复溶后装入透析袋中，扎紧袋口，悬浮于蒸馏水中，透析48h，中间每隔12小时换水一次，然后冷冻干燥，得多糖样品，采用苯酚-硫酸法测总糖含量，为85.85％。

实例二

将制备得到的金耳发酵液多糖进行抗氧化活性实验，以蒸馏水为空白对照，以抗坏血酸为阳性对照，数据经SPSS13.0软件分析。

1.实验方法

(1)还原力测定：

在具塞试管中加入1.0mL不同浓度的金耳发酵液多糖样品(50-1000ug/mL)、0.2mLPBS(2.0M，pH6.6)和0.25mL1％铁氰化钾溶液。置50℃恒温水浴中反应20min，迅速冷却，再加入0.5mL的10％(w／v)三氯乙酸溶液，3000g离心10min，取上清液1.5mL，加入0.1mL1％三氯化铁溶液和3.0mL去离子水，振荡均匀，静置5min，在700nm处以蒸馏水为空白测定其吸光值，吸光值越大，说明其还原力越高。

(2)对羟自由基的清除：

在试管中依次加入1.0mL不同浓度的金耳菌丝体多糖(发酵液多糖)样品(50-1000ug/mL)，0.9mL的FeSO₄(0.15mM)，0.5mL水杨酸(9mM)0.5mLH₂O₂(8.8mM)，37℃反应60min，于510nm处测得不同多糖浓度下的吸光值A_i，用水替代多糖样品时的吸光值A_j，用水代替多糖和H₂O₂时测得空白对照吸光值A₀.按下式计算羟自由基(·OH)的清除率：·OH清除率(％)=[(A_i-A_j)／(A₀-A_j)]×100

(3)对DPPH·自由基的清除

样品管中加入1.0mL不同浓度的多糖溶液(50-1000ug/mL)与3.0mL的0.004％溶于95％乙醇的DPPH溶液，对照管用95％乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸馏水代替多糖溶液。以上三组置于室温静置30min后，用0.55mL蒸馏水和3.0mL95％的乙醇调零，于517nm处测定吸光值。

结果显示：

(1)还原力测定：试验组和阴性对照组比较，P＜0.01，显示在还原力方面两者有高度显著性差异，表明其具有一定的还原力；各多糖还原能力随多糖浓度的增加呈现出稳定增长趋势；试验组与阳性对照组相比，P＜0.05，表明多糖的还原力不及抗坏血酸。

(2)对羟基自由基的清除：试验组和阴性对照组比较，P＜0.05，显示两者在对羟基自由基的清除方面有显著性差异，表明金耳发酵液多糖具有一定的清除羟基自由基能力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，随着多糖浓度的增加，对DPPH自由基清除能力均呈现增长的趋势；试验组与阳性对照组相比，P＜0.05，表明多糖对羟基自由基的清除能力不及抗坏血酸。

(3)对DPPH的清除能力：试验组和阴性对照组比较，P＜0.01，显示两者在对DPPH的清除能力方面有高度显著性差异，表明多糖具有一定的清除DPPH能力；试验组不同浓度的多糖之间进行比较时，随着多糖浓度的增加，各多糖对羟基自由基清除能力呈稳定的增长；试验组与阳性对照组相比，P＜0.05，表明多糖对DPPH的清除能力不及抗坏血酸。

Claims (4)

1.一种具有抗氧化活性的金耳发酵液多糖的制备方法，其特征在于多糖外观为白色或淡黄色粉末，是将金耳斜面菌种，移至摇瓶种子培养基中培养，将培养好的种子液接入摇瓶发酵培养基培养，发酵结束后，抽滤取发酵液浓缩，乙醇沉淀，脱蛋白，凝胶层析柱纯化，透析后冷冻干燥得到金耳发酵液多糖，多糖含量为85.85％，最后进行体外抗氧化实验，显示该多糖具有一定的抗氧化活性。

2.如权利要求1所述的摇瓶种子培养基和摇瓶发酵液体培养基，其特征在于两者的组成分别为：PDA1L加磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，牛肉膏2g，蛋白胨1g，VB1 10-20mg，pH6.0和葡萄糖4g/100mL、酵母粉1g/100mL、磷酸二氢钾0.3g/100mL、硫酸镁0.15g/100mL、VB1 1-2mg/100mL，pH6.0。

3.如权利要求1所述的在摇瓶种子培养基中培养的方法和在摇瓶发酵培养基中培养的方法，其特征在于前者为28℃，220r／min，振荡培养10d，后者为28℃，220r／min，振荡培养14d。

4.如权利要求1所述的凝胶层析柱纯化，其特征在于用的是葡聚糖凝胶G-100填料。