CN103468019B - 一种利用果渣制备的天然色素及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种利用果渣制备的天然色素及其用途，属于食品添加剂技术领域。其特征在于将重量含量的以下物质混合均匀：桑椹果渣提取纯化物40%～70%，杨梅果渣提取纯化物30%～60%，硒酵母0.0005～0.0008%，即得到天然色素产品。上述一种利用果渣制备的天然色素，具有较强抗氧化、抗疲劳及降糖作用，采用该方法得到的天然色素外观为紫红色，天然色素中所含总花青素的含量高达30%～48%，该制备工艺绿色安全，利用桑椹果渣和杨梅果渣废弃物制备的天然色素功效成分含量高，且功效明显，可用作食品添加剂、抗氧剂及食品着色剂、染料等，大大提高了桑椹和杨梅的附加值和资源的利用率。

Description

一种利用果渣制备的天然色素及其用途
技术领域
本发明属于食品添加剂技术领域，具体一种利用果渣制备的天然色素及其用途。
背景技术
食品添加剂是指为有效改善食品的品质和色、香、味，以及为延长食品的贮存期而加入食品中的化学合成物质或天然物质。随着食品工业的迅速发展，现在有些食品添加剂有了保健、营养的功能，具有很好的保健、抗氧化、防腐等功能，极大地提高了食品的商品附加值和经济效益。随着人们饮食水平的不断提高和我国食品工业的迅速发展，食品添加剂正在逐步走进我们的生活，并被人们所了解，特别是饮食结构由解决温饱转向追求保健营养的变化，使消费者更加关注自己的饮食卫生和健康。因此，在崇尚自然的今天，消费者将会不断追求纯天然的、食用安全、无毒副作用的食品添加剂。  
人们因对人工合成抗氧化剂存在不放心心理而转向研发高效、无毒、安全的天然抗氧化剂。因此，近年来从自然界寻求天然抗氧化剂的研究已引起各国科学家的高度重视。目前，世界各国开发了大量天然抗氧化剂产品，如多酚类、天然黄酮类、类胡萝卜素、 中草药提取物等受到人们的普遍欢迎。而现有的天然食品添加剂，仅具有抗氧化或防腐作用，很少有在具有很强的抗氧化及防腐杀菌作用的同时还具有很好的营养保健价值及一定的辅助治疗作用的天然色素作为食品添加剂的问世。
在国内外高度重视资源与发展的今天，天然色素添加剂被广泛用于食品工业中。和人工合成色素相比，天然色素种类多，安全无副作用，而且可以从植物、动物和微生物中获取，种类丰富。据报道天然色素可以分为四大类：类胡萝卜素类、花青素类、吡咯类和其它类。天然色素广泛存在于植物花、茎叶和果实细胞的液泡内，这也是各种水果和蔬菜表现出不同的颜色的重要原因之一。正是花青素类的这种特殊性被广泛用于食品添加剂工业中，而且主要来源于葡萄皮、蓝莓，越橘，茄子皮，杨梅，桑葚等有色水果和蔬菜。
桑椹为（Mulberry），又名桑枣、桑果等，是桑科（Moraeeae）桑属（Morus）多年生木本植物桑树的成熟果实，主要分布在温带地区及亚热带、热带山区。目前我国的桑树育种工作者己选育出一批高产优质的桑果品种，如：河北省蚕桑研究所培育的“白玉王”，“红果1号”，“红果2号”和“红果4号”；陕西省蚕桑丝绸研究所培育的“陕桑408”和“陕桑761”，桑果紫黑色，大而且多；浙江省台州市临海蚕桑站培育的“大十”，桑果紫红色产量大。桑葚酸甜可口，营养价值丰富，受到消费者的一致好评，它的营养价值是苹果的5-6倍，是葡萄的4倍，而且被誉为“第三代水果王”。据报道称桑葚中除含有人体所需的大量氨基酸、多种维生素，还原糖和蔗糖外，还含有多种黄酮、酚酸等营养元素，特别是花青素是桑葚功效成分中的重要物质之一，花青素是一种花色素以糖苷键结合而成的衍生物。现代研究表明，成熟桑葚含有丰富的花色苷类化合物，其主要是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷。鉴于桑葚含有丰富的营养成分，近年来人们对桑葚的化学成分、药理作用、临床应用等方面进行了较深入的研究，在医药和食品领域中得到了广泛的应用，增加人们对桑葚食用价值的认识 。
杨梅（Myrica rubra Sieb. Et Zucc.）是杨梅科（Myricaceae）杨梅属（Myrica L.）的一种多年生绿色乔木植物，原产于中国，现广泛分部于中国、韩国和日本等亚热带国家。其中，中国种植杨梅的种植面积最大，历史也最悠久。杨梅在中国的栽培面积相当大，浙江、江苏、福建各省均有分布，种植面积及品质等以浙江省为最，其产量巨大，仅浙江省年产量就达数十万吨。 因杨梅含有多种对人体有益的物质，在初夏时节广受消费者青睐。杨梅的品种丰富，根据花青素的含量不同，不同品种的杨梅颜色差异也很大。花青素是杨梅果实中一类重要的功能性成分，又称花色苷，广泛存在于有色植物的花、果实中，所以花青素一直是食品工业中天然食用色素的良好来源。杨梅中花青素的含量不但相当丰富，而且种类单一，95%以上都是矢车菊-3-葡萄糖苷。这就解决了因花青素种类多、难分离的问题，也为研究矢车菊-3-葡萄糖苷的药理活性找到了理想的原料。研究发现矢车菊-3-葡萄糖苷的清除氧自由基的活性明显强于其它种类的花青素与水溶性维生素E，因此矢车菊-3-葡萄糖苷是使花青素发挥抗氧化活性的一类重要化合物。
桑葚和杨梅一直被视为具有较高营养价值的水果之一，在我国桑葚和杨梅的资源丰富，品种繁多，不同品种的桑葚和杨梅不仅在颜色、大小、成熟期上有明显的差异性，而且，在功能成分的含量和种类以及营养价值上也可能有一定差异。因此了解清楚国内大面积推广种植的桑葚和杨梅品种中花青素的含量和生物活性的关系对桑葚和杨梅的深度开发具有重要意义。由于桑葚和杨梅的特殊性，含水量，含糖量均高，且是一种季节性相当强的水果，常温下几天时间即变色腐烂，不耐贮运和保鲜，大多数人只把桑葚和杨梅作为解渴水果食用，当收获季节即将结束时，大量桑葚和杨梅因腐烂被弃去。这样并没有充分利用桑葚和杨梅而且还导致了资源的浪费。因此，为解决桑果浪费的问题并提高利用价值，食品加工企业开发出桑果汁等多种饮料，比如：桑葚果冻、果酱、果酒和果汁饮料等，然而桑葚榨汁一次利用后的果渣主要是作为废弃物和饲料，利用率极低。那么在桑椹和杨梅果渣中是否含有高含量的生物活性物质，可否深度利用，解决这些问题对桑葚和杨梅的增值加工及延长资源的产业链具有重要的意义。而现有的技术还没有解决对桑椹果渣和杨梅果渣高效再利用难题。因此，寻找一种既简便高效的再利用废弃果渣的方法，能极大程度的提高资源的利用率。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种利用果渣制备的天然色素及其用途的技术方案，使用优化的提取方法高效提取桑葚和杨梅果渣中的花青素，并采用大孔树脂富集纯化，除去提取物中多糖等大分子物质，获得富集后的总花青素干粉，然后按照科学配比，辅以微量元素硒，制得的天然色素产品具有较强抗氧化、抗疲劳及降糖作用，可用作食品添加剂、抗氧剂及食品着色剂、染料等，大大提高了桑椹和杨梅的附加值和资源的利用率。
桑椹果渣提取纯化物的制备：取大十品种桑葚榨汁，然后通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离果汁与果渣。果渣用体积比1:1～1:2的pH 3.5～pH 4.5的50%-60%的乙醇溶液浸泡提取3-5次，每次12-16 h，抽滤，合并浸提液，离心10～20 min（5000 rpm）后取上清液，用闪蒸浓缩装置在50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液。果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 3.5～pH 4.5，50%～70%的乙醇溶液洗脱1次，洗脱液流速为0.5-0.7 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在40-50 oC下减压浓缩，得到浓缩液后，再转移出浓缩液，通过旋转蒸发仪旋转真空干燥或喷雾干燥，得干粉后称重并计算得率，样品避光干燥保存。得到的桑椹果渣提取纯化物的收得率为0.40～0.68%，提取纯化物中总花青素的含量达到36～48%。
杨梅果渣提取纯化物的制备：：取荸荠品种杨梅，去核后榨汁，然后通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离果汁与果渣。果渣用体积比1:1～1:2的pH 3.5～pH 4.5的50%-60%的乙醇溶液浸泡提取3-5次，每次12 -16 h，抽滤，合并浸提液，离心10～20 min（5000 rpm）后取上清液，用闪蒸浓缩装置在50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液。果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 3.5～pH 4.5，50%～70%的乙醇溶液洗脱1次，洗脱液流速为0.5～0.6 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在50 oC下减压浓缩，得到浓缩液后，再转移出浓缩液，通过旋转蒸发仪旋转真空干燥或喷雾干燥，得干粉后称重并计算得率，样品避光干燥保存。得到的杨梅果渣提取纯化物的收得率为0.42～0.86%，提取纯化物中总花青素的含量达到22～40%。
天然色素的制备方法：将桑椹果渣提取纯化物，杨梅果渣提取纯化物，配以酵母硒，按照桑椹果渣提取纯化物40%～70%，杨梅果渣提取纯化物30%～60%，硒酵母0.0005～0.0008%的比例进行混合配比，得到性能稳定，自身具有防腐作用的天然色素产品。
上述一种利用果渣制备的天然色素，以桑椹和杨梅榨汁后剩余的果渣为原料，采用优化的工艺分别进行提取和富集纯化，得到桑椹果渣提取纯化物和杨梅果渣提取纯化物干粉，然后将两种提取物按照一定的比例混合，再辅以微量元素硒，得到具有较强抗氧化、抗疲劳及降糖作用的天然色素。采用该方法得到的天然色素外观为紫红色；天然色素中所含总花青素的含量高达30%～48%，该制备工艺绿色安全，利用桑椹果渣和杨梅果渣废弃物制备的天然色素功效成分含量高，且功效明显，可用作食品添加剂、抗氧剂及食品着色剂、染料等，大大提高了桑椹和杨梅的附加值和资源的利用率。
本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
桑椹果渣提取纯化物的制备：取大十品种桑葚榨汁，然后通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离果汁与果渣。果渣用体积比1:1的pH 4.0的50%的乙醇溶液浸泡提取3次，每次12 h，抽滤，合并浸提液，离心20 min（5000 rpm）后取上清液，用闪蒸浓缩装置在50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液。果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 4.0的60%的乙醇溶液洗脱，洗脱液流速为0.6 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在50 oC下减压浓缩，得到浓缩液后，再转移出浓缩液，通过旋转蒸发仪旋转真空干燥或喷雾干燥，得干粉后称重并计算得率，样品避光干燥保存。得到的桑椹果渣提取纯化物的收得率为0.45%，提取纯化物中总花青素的含量达到43%。
杨梅果渣提取纯化物的制备：取荸荠品种杨梅，去核后榨汁，然后通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离果汁与果渣。果渣用体积比1:1的pH 4.0的50%的乙醇溶液浸泡提取3次，每次12 h，抽滤，合并浸提液，离心20 min（5000 rpm）后取上清液，用闪蒸浓缩装置在50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液。果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 4.0，60%的乙醇溶液洗脱，洗脱液流速为 0.6 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在50 oC下减压浓缩，得到浓缩液后，再转移出浓缩液，通过旋转蒸发仪旋转真空干燥或喷雾干燥，得干粉后称重并计算得率，样品避光干燥保存。 得到的杨梅果渣提取纯化物的收得率为0.42%，提取纯化物中总花青素的含量达到31%。
天然色素的制备方法：将桑椹果渣提取纯化物，杨梅果渣提取纯化物，配以酵母硒，按照桑椹果渣提取纯化物50%，杨梅果渣提取纯化物50%，硒酵母0.0005%的比例进行混合配比，得到天然色素产品。
实施例2：
桑椹果渣提取纯化物的制备：取日本果桑品种的桑葚榨汁，然后通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离果汁与果渣。果渣用体积比1:1的pH 4.0的55%的乙醇溶液浸泡提取4次，每次16 h，抽滤，合并浸提液，离心20 min（5000 rpm）后取上清液，用闪蒸浓缩装置在50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液。果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 4.5的65%的乙醇溶液洗脱，洗脱液流速为0.6 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在50 oC下减压浓缩，得到浓缩液后，再转移出浓缩液，通过旋转蒸发仪旋转真空干燥或喷雾干燥，得干粉后称重并计算得率，样品避光干燥保存。得到的桑椹果渣提取纯化物的收得率为0.48%，提取纯化物中总花青素的含量达到45%。
杨梅果渣提取纯化物的制备：取东魁品种杨梅，去核后榨汁，然后通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离果汁与果渣。果渣用体积比1:2的pH 4.0的60%的乙醇溶液浸泡提取4次，每次15 h，抽滤，合并浸提液，离心20 min（5000 rpm）后取上清液，用闪蒸浓缩装置在50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液。果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 4.0，65%的乙醇溶液洗脱，洗脱液流速为 0.6 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在50 oC下减压浓缩，得到浓缩液后，再转移出浓缩液，通过旋转蒸发仪旋转真空干燥或喷雾干燥，得干粉后称重并计算得率，样品避光干燥保存。 得到的杨梅果渣提取纯化物的收得率为0.52%，提取纯化物中总花青素的含量达到35%。
天然色素的制备方法：将桑椹果渣提取纯化物，杨梅果渣提取纯化物，配以酵母硒，按照桑椹果渣提取纯化物60%，杨梅果渣提取纯化物40%，硒酵母0.0006%的比例进行混合配比，得到天然色素产品。
实施例3：
桑椹果渣提取纯化物的制备：取红玛瑙品种的桑葚榨汁，然后通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离果汁与果渣。果渣用体积比1:1.5的pH 4.0的55%的乙醇溶液浸泡提取3次，每次15 h，抽滤，合并浸提液，离心20 min（5000 rpm）后取上清液，用闪蒸浓缩装置在50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液。果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 4.0的60%的乙醇溶液洗脱，洗脱液流速为0.5 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在50 oC下减压浓缩，得到浓缩液后，再转移出浓缩液，通过旋转蒸发仪旋转真空干燥或喷雾干燥，得干粉后称重并计算得率，样品避光干燥保存。得到的桑椹果渣提取纯化物的收得率为0.46%，提取纯化物中总花青素的含量达到45%。
杨梅果渣提取纯化物的制备：取丁岙品种杨梅，去核后榨汁，然后通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离果汁与果渣。果渣用体积比1:1.5的pH 4.0的60%的乙醇溶液浸泡提取3次，每次13 h，抽滤，合并浸提液，离心20 min（5000 rpm）后取上清液，用闪蒸浓缩装置在50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液。果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 4.5，60%的乙醇溶液洗脱，洗脱液流速为 0.5 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在50 oC下减压浓缩，得到浓缩液后，再转移出浓缩液，通过旋转蒸发仪旋转真空干燥或喷雾干燥，得干粉后称重并计算得率，样品避光干燥保存。 得到的杨梅果渣提取纯化物的收得率为0.46%，提取纯化物中总花青素的含量达到33%。
天然色素的制备方法：将桑椹果渣提取纯化物，杨梅果渣提取纯化物，配以酵母硒，按照桑椹果渣提取纯化物60%，杨梅果渣提取纯化物40%，硒酵母0.0007%的比例进行混合配比，得到天然色素产品。
    现有的色素，大多数为合成色素，即使是从天然植物中提取的色素，也多是提取率较低，成本较高。本发明以桑椹和杨梅榨汁后废弃的果渣为原料，采用优化后的提取纯化工艺提取和分离富集功效成分，得到功效作用明显，花青素含量较高的天然色素产品。与现有技术相比，具有以下优势：
1、提取该天然色素产品中使用的浓缩方法是采用闪蒸浓缩装置进行浓缩。该装置是一种快速高效浓缩溶液或回收溶剂的闪蒸装置，基本原理是在减压下，使待浓缩的液体以细流匀速进入薄膜蒸发管中，在管中受热后形成薄膜，使部分溶剂气化而达到浓缩目的。使用该装置浓缩具有浓缩液受热温度低，被浓缩液体受热时间极短，有效保护热敏性成分花青素不被破坏，浓缩速度快、效率高，操作简单、使用方便、节能环保，溶剂的回收率高，仪器容量大，不受被浓缩液体积大小的限制等优势。得到的天然色素，提取率较高，其中桑椹果渣提取纯化物的提取率达到12%，杨梅果渣提取纯化物的提取率达到10%，提高了功效成分的提取率。
2、采用该工艺方法制备的桑椹果渣的提取纯化物和杨梅果渣提取纯化物所含花青素的含量远远大于果汁纯化物，表明桑葚果渣和杨梅果渣作为食品加工的废弃物具有更大的开发利用价值。通过对桑椹果渣和杨梅果渣的再利用，提高了植物废弃物的附加值和资源利用率。
3、桑椹果渣和杨梅果渣提取纯化物具有很强的抗氧化作用、抗疲劳作用和降血糖作用，同时功效成分花青素的含量较高，具有良好的保健功能和一定的治疗作用，安全无毒，工艺简单、成本低廉，可实现工业化生产，易于长期贮存和运输等优点，克服了现有技术的不足，在食品工业上可用做食品添加剂、抗氧剂、食品着色剂和染料。
4、桑葚和杨梅果实中含有大量糖分，直接食用或是饮料制品不利于老年人和糖尿病患者食用，这样限制了桑葚和杨梅产品的推广利用。本发明使用优化的提取纯化工艺对桑葚和杨梅果渣进行提取和纯化，得到了桑葚和杨梅的果渣提取纯化物。配伍后得到的天然色素不含水，不含糖，既解决了桑葚和杨梅含水量，含糖量高的问题，又克服了花青素不稳定的缺点，增加了桑葚和杨梅产品的使用人群。
5、本发明制备的天然色素具有很强的抗氧化、抑菌、防腐的作用，由于本身处于干燥粉末状态，又具有一定的抑菌及防腐作用，因此更易于长期贮存，延长了保质期，更易使消费者接受，使消费领域更为广阔。
以下通过相应试验进一步说明本发明的有益效果。
试验一、桑椹果渣与桑椹果汁的功效成分和活性测定及评价实验
1、从桑椹果渣中提取和纯化天然色素的工艺
提取工艺优选：以大十品种的桑椹为对象，考查桑葚花青素提取工艺。主要考查乙醇浓度、浸泡次数、提取溶剂pH及液料比4个因素，每次提取时间定为12小时。采用L934的正交试验，用紫外分光光度计通过测定吸光度进行跟踪测定。
结果桑椹果渣的最佳提取工艺为：A1B3C1D1，即乙醇浓度50%，提取液pH 4，料液比1:1，浸泡3次，每次12 h。
纯化富集工艺优选：利用单因素试验对桑葚果渣中花青素的纯化富集工艺进行考查。大孔树脂的筛选：Diaion HP 20，HP 2MGL和D101。将桑葚果渣浓缩液加入装有大孔树脂的柱子中，静态吸附24 h，过滤，测定滤液的吸光度，计算各树脂的吸附率。用pH 4的60%的乙醇溶液对已吸附的树脂进行解吸24 h，测定解吸液的吸光度，计算解吸率。结果HP2 MGL的吸附率和解析率最高，吸附力93.1%，解析率92.6%。洗脱溶剂浓度的选择：准备已经吸附有桑椹果渣花青素样品的大孔树脂，分别加入同体积的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的pH 4乙醇溶液，静态解吸24 h，测定洗脱液的吸光度，结果60%的乙醇溶液对花青素的洗脱能力最强。洗脱溶剂酸度的选择：准备已经吸附有桑椹果渣花青素样品的大孔树脂，分别加入同体积pH分别为1、2、3、4、5的60%乙醇溶液，静态解吸24 h，测定洗脱液的吸光度，结果pH为4时解吸能力最好。洗脱溶剂流速的选择：取筛选出的树脂4份，装柱后各加入桑葚浓缩液，吸附4 h后，分别用0.4 mL/min 、0.6 mL/min 、0.8 mL/min 、1.0 mL/min 流速洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液的吸光度。结果洗脱液流速越大，反而洗脱效果越差，同时，洗脱液流速为0.4 mL/min时，洗脱效果最好。但流速太小，洗脱时间延长，解吸速度变慢，综合考虑，最佳洗脱液流速为0.6 mL/min。因此，桑椹果渣最优纯化富集工艺是，桑葚果渣浓缩液通过HP 2 MGL大孔树脂柱，以0.6 mL/min的流速用pH 4的60%乙醇溶液洗脱液洗脱。
2、桑椹果汁提取纯化物和果渣提取纯化物中总黄酮总酚酸的含量测定
总黄酮的测定：参考NaNO2-Al(NO3)显色法。称取芦丁对照品适量，加70%乙醇溶解并定容，得对照品溶液。分别取上述芦丁对照品溶液，按照该显色方法配制溶液，于510 nm处测吸光度。得芦丁浓度与吸光度之间的回归方程Y= 9.8957x + 0.0011，R2 = 0.9999。分别吸取一定量样品溶液于容量瓶中，按照绘制芦丁标准曲线的方法测定吸光度，计算样品中总黄酮的含量，总黄酮的含量测定结果用芦丁当量RE表示。
总酚酸的测定：采用Folin-Ciocalteu法。 称取没食子酸对照品适量，用蒸馏水溶解并定容，制成对照品溶液。按照该显色方法配制溶液，于760 nm处测定吸光度，得没食子酸的回归方程Y= 80.743x + 0.0328，R2 = 0.9867。分别吸取一定量的样品溶液于容量瓶中，按照绘制没食子酸标准曲线的方法测定吸光度，计算样品中总酚酸的含量，总酚酸含量测定结果用没食子酸当量GAE表示。
 结果表明大十品种桑葚果渣中总黄酮和总酚酸的含量均高于果汁，也高于其他有色水果中总黄酮及总酚酸的含量，表明果渣比果汁含有更多的功能因子，具有更大的开发利用价值。采用日本果桑、红玛瑙、蜀果1号、红果2号等品种的桑椹进行含量测定，结果也表明果渣中总黄酮和总酚酸的含量均高于果汁，也高于其他有色水果中总黄酮及总酚酸的含量。
3、桑椹果汁提取纯化物和果渣提取纯化物中总花青素的含量测定
   pH示差法：待测液的制备：准确称取大十品种桑葚果汁和果渣纯化物10.0 mg，先用10%的稀醇溶解，用蒸馏水定容至10 mL。分别移取1 mL样液2份，分别用pH 1.0与pH 4.5的缓冲溶液定容至10 mL。暗处放置1 h后分别测定吸光值。花色苷含量(%，w/w)=(A/εL)×MW×DF×V/Wt×100%。
 
结果表明大十品种的桑椹果渣提取纯化物中总花青素的含量高，几乎是果汁提取纯化物中总花青素含量的2倍。采用日本果桑、红玛瑙、蜀果1号、红果2号等品种的桑椹进行总花青素的含量测定，结果也表明果渣提取纯化物中总花青素的含量比果汁提取纯化物中总花青素含量高很多。
由本发明得到的桑椹果渣提取纯化物（即桑椹花青素提取物）的含量可以达到38.3%～42.6%（413.49 mg/g），高于市面上各种花青素提取物中总花青素的平均含量（25%）。且桑葚果渣提取纯化物中总黄酮、总酚酸的含量和活性明显高于果汁提取纯化物，使得桑葚果渣成为开发天然色素以及功能性食品的廉价原料。
4、桑椹果汁提取纯化物和果渣提取纯化物中矢车菊素-3-葡萄糖苷的HPLC含量测定
色谱条件：使用配有Waters 2996 PDA二极管阵列检测器的Waters 2695高效液相色谱仪，色谱条件：SunfireC18色谱柱（5 μm, 4.6 mm×250 mm）；柱温30℃；流速1.0ml/min；流动相：A: 2%的盐酸甲醇B: 水:甲醇:乙腈:乙酸=160:90:90:40；检测波长530nm；采用梯度洗脱。
准确称取矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品，以2%的HCl色谱甲醇定容备用。精确称取不同品种桑葚果汁和果渣纯化物，以2%的HCl色谱甲醇定容备用。分别进标准品溶液，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标建立标准曲线：Y=3.96×106X-7.93×105，R2 = 0.9993。
 结果表明大十品种的桑椹果汁和果渣提取纯化物中花青素类物质是以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷为主，含量约是总花青50%左右，且果渣提取纯化物比果汁提取纯化物中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量高出几倍。采用日本果桑、红玛瑙、蜀果1号、红果2号等品种的桑椹进行含量测定，结果也表明果渣提取纯化物比果汁提取纯化物中矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量高出几倍。
5、桑椹果汁提取纯化物和果渣提取纯化物的抗氧化活性
DPPH法：采用96微孔板结合Infinite M 200酶标仪。准确量取Trolox 对照品适量，用无水乙醇定容得到Trolox原液。以Trolox (X)浓度为横坐标，以自由基清除率(Y)为纵坐标作标准曲线，Y= 3722.3X－1.6882，R2 =0.9994。计算DPPH自由基清除率（I%）= 1– (Ap – Ac ) / Amax × 100 %。 计算样品的TEAC ，以此来评价样品的抗氧化能力。
FRAP法：取醋酸缓冲液，TPTZ (溶于40 mmol/L盐酸)与三氯化铁溶液，以10:1:1的体积比混合配制而成。取FRAP试剂与样品溶液，反应10 min后在593 nm下测吸光值。以Trolox溶液为阳性对照，以Trolox (X)浓度为横坐标，以吸光值(Y)为纵坐标作标准曲线，Y=8.3839X+0.2026，R2=0.9998。样品抗氧化能力用TEAC 表示。
TRP的测定：取样品溶液加入到磷酸缓冲液中，然后加入1%的 K3Fe(CN)6，加热30 min后加入10 % 三氯乙酸, 混均后离心10 min。取上清液2.5 mL，迅速加入蒸馏水和0.1%三氯化铁混均，于波长700 nm处进行比色测定。以Trolox浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线， Y=54.282X－0.1478，R2=0.9788。  样品的总抗氧化能力以TEAC值表示。
桑葚果汁和果渣提取纯化物抗氧化活性的TEAC值（mg TE/g）
样品 DPPH FRAP TRP
大十果汁提取纯化物 154.43 24.43 103.84
大十果渣提取纯化物 698.57 56.18 120.02
结果表明大十品种的桑椹花青素均具有较强的抗氧化活性，其中大十品种的桑椹果渣提取纯化物比果汁提取纯化物具有更强的抗氧化活性。采用日本果桑、红玛瑙、蜀果1号、红果2号等品种的桑椹进行抗氧化活性试验，结果也表明果渣提取纯化物比果汁提取纯化物具有更强的抗氧化活性。
6、桑椹果汁提取纯化物和果渣提取纯化物的抗菌活性
按照制备培养基的方法制备PDA培养基。在超净工作台中，将每种菌接种到带有灭菌培养基的平皿中央，用打孔机打孔，25 oC温箱中培养3-4 d。称取大十品种桑葚果汁和果渣提取纯化物10 mg，分别用无水乙醇溶解，再用无菌蒸馏水配制成5 mg/mL的样品溶液，再逐级稀释成5个不同浓度，备用。
抑菌活性测定：在无菌操作台中，分别将不同浓度的样品溶液加入到制备好的斜面试管培养基中，放置1 h，待溶液渗入到培养基中后，再将配制好的菌悬液均匀加到斜面培养基表面上，封口，将试管放到恒温培养箱中培养48 h后，取出观察抑菌效果，观察不到菌丝生长的最低样品浓度为最低抑菌浓度（MIC）。 
结果表明大十品种桑葚果汁和果渣提取纯化物对8种致病真菌均有不同程度的抑制作用，其中，大十品种的果渣纯化物对植物病原真菌的抑菌作用比桑椹果汁强。采用日本果桑、红玛瑙、蜀果1号、红果2号等品种的桑椹进行抗菌活性试验，结果也表明果渣纯化物对植物病原真菌的抑菌作用比桑椹果汁强。
7、桑椹果汁提取纯化物和果渣提取纯化物的抗疲劳活性
采用昆明种小鼠雌雄各半，在给药前一个星期，饲以足够的水和标准鼠料供小鼠自由食用。实验动物随机分为正常对照组，阳性组，药物组，每组雌雄各半，分笼饲养。配制大十品种的桑葚果汁和果渣提取纯化物样品溶液作为受试药物。
指标测定：取已经分好组的小鼠，分别以待测溶液、阳性对照和溶剂溶液灌胃，每天灌胃一次，同时记录小鼠体重，每组灌胃0.4 mL。当小鼠体重达30 g后，灌胃剂量增加至0.6 mL。连续以口给予受试物，于末次给样30 min后对小鼠进行负重游泳实验。小鼠尾根部负小鼠体重10 %的铅皮，放入水温为25±0.5 ℃、水深35 cm的游泳箱中，参照力竭判断标准，即小鼠头部下沉于水面下10 s仍不能返回水面的时间，即为小鼠力竭时间。记录游泳时间。
   通过小鼠负重游泳实验，发现大十品种桑葚果汁和果渣提取纯化物均具有一定的抗疲劳活性，均可以一定程度地提高小鼠的运动耐力，其中果渣提取纯化物组小鼠游泳时间较果汁组长，即抗疲劳作用更强。采用日本果桑、红玛瑙、蜀果1号、红果2号等品种的桑椹进行抗疲劳活性试验，结果也表明果渣提取纯化物组小鼠游泳时间较果汁组长，即抗疲劳作用更强。
试验二、杨梅果渣与杨梅果汁的功效成分和活性测定及评价实验
1、从杨梅果渣中提取和纯化天然色素的工艺
提取工艺优选：主要考查乙醇浓度、提取时间、提取溶剂pH及液料比4个因素，每次提取次数定为3次。采用L934的正交试验，用紫外分光光度计通过测定吸光度进行跟踪测定。
结果杨梅果渣的最佳提取工艺为：A1B3C1D1，即乙醇浓度50%，提取液pH 4，料液比1:1，浸泡3次，每次12 h。
纯化富集工艺优选：杨梅花青素的纯化工艺研究包括填料的选择，洗脱溶剂浓度、洗脱流速和减压浓缩温度四个因素，分别设计单因素实验对四个因素，通过测定吸光度进行考查。结果最佳富集纯化工艺为使用HP2MGL作为大孔树脂柱色谱的填料，洗脱溶剂的浓度为60%，洗脱流速为0.6 mL·min-1，减压浓缩温度为60oC。
2、杨梅果渣提取纯化物中总黄酮总酚酸的含量测定
总黄酮的测定参考NaNO2-Al(NO3)显色法。以芦丁为对照品。总酚酸的测定采用Folin-Ciocalteu法，以没食子酸为对照品。按照绘制芦丁和没食子酸标准曲线的方法测定吸光度，计算样品中总黄酮和总酚酸的含量，含量测定结果用芦丁和没食子酸当量GAE表示。
杨梅果渣提取纯化物中总黄酮及总酚酸含量（mg·g-1）
样品编号 品种 总黄酮含量（mg RE / g） 总酚酸含量(mg GAE / g)
1 荸荠 4.64 2.08
结果表明荸荠品种的杨梅果渣提取纯化物中总黄酮和总酚酸的含量较高。采用东魁、丁岙、野生、炭梅、晚稻等品种的杨梅进行含量测定，结果也表明果渣提取纯化物中总黄酮和总酚酸的含量较高。
3、杨梅果渣提取纯化物中总花青素及矢车菊素-3-葡萄糖苷的含量测定
准确称取荸荠品种杨梅果汁和果渣纯化物10.0 mg，先用10%的稀醇溶解，用蒸馏水定容至10 mL。分别移取1 mL样液2份，分别用pH 1.0与pH 4.5的缓冲溶液定容至10 mL。暗处放置1 h后分别测定吸光值。花色苷含量(%，w/w)=(A/εL)×MW×DF×V/Wt×100%。
荸荠品种的杨梅果渣提取纯化物中总花青素的含量为22～25%，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的含量达到21~32%。采用东魁、丁岙、野生、炭梅、晚稻等品种的杨梅进行含量测定，测定结果基本和荸荠品种的杨梅相似。
4、杨梅果渣提取纯化物的抗氧化活性
DPPH法：采用96微孔板结合Infinite M 200酶标仪。准确量取Trolox 对照品适量，用无水乙醇定容得到Trolox原液。以Trolox (X)浓度为横坐标，以自由基清除率(Y)为纵坐标作标准曲线，y = 2.3787x+1.1152，R2 = 0.9975。计算DPPH自由基清除率（I%）= 1– (Ap – Ac ) / Amax × 100 %。 计算样品的TEAC ，以此来评价样品的抗氧化能力。
DPPH法测定杨梅果渣提取纯化物的抗氧化能力
品种 回归方程 IC50(μg·mL-1) TEAC(mmol·g-1)
荸荠 y = 2.4099x + 0.4117 0.0419 377.5
结果表明荸荠品种的杨梅果渣提取纯化物具有较强的抗氧化活性，采用东魁、丁岙、野生、炭梅、晚稻等品种的杨梅进行抗氧化活性试验，结果也表明杨梅果渣提取纯化物具有较强的抗氧化活性。
 5、杨梅果渣提取纯化物的抗菌活性
按照制备培养基的方法制备PDA培养基。称取荸荠品种杨梅果渣提取纯化物配制成样品溶液，再逐级稀释成不同浓度。采用MIC法对8种植物病原真菌抑菌活性测定，观察不到菌丝生长的最低样品浓度为最低抑菌浓度（MIC）。 
 
荸荠品种的杨梅果渣提取纯化物对玉米大斑和油菜菌核表现出了一定的抑制作用，对大麦赤霉、小麦赤霉和番茄灰霉等基本没有抑制作用。采用东魁、丁岙、野生、炭梅、晚稻等品种的杨梅进行抗菌活性试验，结果也表明果渣提取纯化物对玉米大斑和油菜菌核表现出了一定的抑制作用，对大麦赤霉、小麦赤霉和番茄灰霉等基本没有抑制作用。
6、杨梅果渣提取纯化物的抗疲劳活性
按照测定桑椹花青素的抗疲劳实验方法进行实验，取荸荠杨梅果渣提取纯化物，分别用羧甲基纤维素钠配制成浓度为高（0.3320 mg·mL-1）、中（0.2656mg·mL-1）、低（0.1992 mg·mL-1）三个浓度作为受试药物，物，溶剂对照为羧甲基纤维素钠。
 杨梅果渣提取纯化物的小鼠游泳时间的平均值
样品编号 药物剂量 动物数(n)   小鼠游泳时间（s）
1 高剂量组 12 1104.76
2 中剂量组 12 912.45
3 底剂量组 12 687.34
4 空白组 12 603.12
5 阳性组 12 1034.56
通过小鼠负重游泳实验表明杨梅果渣提取纯化物均具有一定的抗疲劳活性，可以一定程度地提高小鼠的运动耐力，特别是高剂量组抗疲劳活性最为明显。
试验三、天然色素产品的降糖作用
按照桑椹果渣提取纯化物40%～70%，杨梅果渣提取纯化物30%～60%，硒酵母0.0005～0.0008%进行混合配比得到的天然色素产品，进行降糖作用的动物实验。
实验动物：SD雄性大鼠，6-8周龄，180-200g，适应性饲养3天。大鼠造模前禁食12h，除正常对照组外，其余各组均按每天腹腔注射1%四氧嘧啶，连续7天，正常对照组给予等体积的生理盐水，7天后，禁食12 h，剪尾取血，测定血糖值（空腹血糖）。
将造模成功的大鼠随机分为5组，即模型，阳性，药物高、中、低剂量组，每组6只。阳性组一定浓度的二甲双胍灌胃，连续14天，空白组和模型组给予等体积的生理盐水。第14天给药前，禁食12h，给药2h后，用水合氯醛麻醉，断头取血，常规分离血清，测定血糖值。结果表明，高、中、低不同剂量组对大鼠血糖具有明显的降血糖作用。
天然色素产品对大鼠降血糖作用的实验结果
组别 动物数 剂量(g/kg) 血糖值（mmol/ L）
正常组 6 -- 5.456±2.353
模型组 6 -- 18.425±3.354
阳性组 6 0.1  6.314±4.023
高剂量组 6 1.2  6.026±3.674
中剂量组 6 0.6 7.220±5.834
低剂量组 6 0.3 7.887±3.739
结果发现一般认为没有太大利用价值的废弃果渣的提取纯化物，其功效成分的含量及生物活性远远大于果汁的提取纯化物。实验结果提示，桑葚果渣和杨梅果渣作为食品加工的废弃物开发天然色素，具有更大的开发利用价值。

Claims (10)

1.一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于采用以下方法制得：
1）桑椹果渣提取纯化物的制备：取桑葚榨汁，分离果汁与果渣，制得果渣备用，果渣用pH 3.5-4.5的50%-60%的乙醇溶液浸泡提取3-5次，果渣与乙醇溶液的体积比为1:1-2，浸泡提取时间为每次12-16 h，抽滤，合并浸提液，离心处理后取上清液，用闪蒸浓缩装置在40-50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液；果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 3.5-4.5、50%～70%的乙醇溶液洗脱1次，洗脱液流速为0.5-0.7 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在40-50 oC下减压浓缩，将得到的浓缩液干燥制得干粉，该干粉即为桑椹果渣提取纯化物；
2）杨梅果渣提取纯化物的制备：取杨梅去核榨汁，分离果汁与果渣，制得果渣备用，果渣用pH 3.5-4.5的50%-60%的乙醇溶液浸泡提取3-5次，果渣与乙醇溶液的体积比为1:1-2，抽滤，合并浸提液，离心处理后取上清液，用闪蒸浓缩装置在40-50℃下真空浓缩至无醇味，得果渣浓缩液；果渣浓缩液通过大孔树脂 Diaion HP 2MGL柱，经蒸馏水冲至无色透明后，改用pH 3.5-4.5、50%～70%的乙醇溶液洗脱1次，洗脱液流速为0.5-0.6 mL/min，收集有色的花青素洗脱液，使用闪蒸浓缩装置在40-50 oC下减压浓缩，将得到的浓缩液干燥制得干粉，该干粉即为杨梅果渣提取纯化物；
3）将重量含量的以下物质混合均匀：桑椹果渣提取纯化物40%～70%，杨梅果渣提取纯化物30%～60%，硒酵母0.0005～0.0008%，即得到天然色素产品。
2.如权利要求1所述的一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于步骤1）中：通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离桑葚果汁与果渣，桑椹果渣与乙醇溶液的体积比为1:1-1.5，浸泡提取时间为每次13-15 h；浸提液离心10～20 min，转速4000-5000 rpm处理后取上清液。
3.如权利要求1所述的一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于步骤1）中：乙醇洗脱溶液的浓度为55%～65%，洗脱液流速为0.6-0.65 mL/min。
4.如权利要求1所述的一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于步骤1）中：乙醇洗脱溶液的浓度为58%～60%。
5.如权利要求1所述的一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于步骤2）中：通过离心处理或采用滤布包裹果渣挤压分离杨梅果汁与果渣，杨梅果渣与乙醇溶液的体积比为1:1-1.5，浸泡提取时间为每次13-15 h；浸提液离心10～20 min，转速4000-5000 rpm处理后取上清液。
6.如权利要求1所述的一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于步骤2）中：乙醇洗脱溶液的浓度为55%～65%。
7.如权利要求1所述的一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于步骤2）中：乙醇洗脱溶液的浓度为58%～60%。
8.如权利要求1所述的一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于步骤3）中：桑椹果渣提取纯化物的重量含量为45%～65%，杨梅果渣提取纯化物的重量含量为35%～55%，硒酵母的重量含量为0.0006～0.0007%。
9.如权利要求1所述的一种利用果渣制备的天然色素，其特征在于步骤3）中：桑椹果渣提取纯化物的重量含量为50%～60%，杨梅果渣提取纯化物的重量含量为40%～50%。
10.如权利要求1所述的利用果渣制备的天然色素在制备食品添加剂、食品抗氧剂、着色剂、染料中的应用。
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