CN116515005A - 羊肚菌多糖及其制备方法和在制备用于预防和/或改善抗抑郁症的药物中的应用 - Google Patents
羊肚菌多糖及其制备方法和在制备用于预防和/或改善抗抑郁症的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了羊肚菌多糖及其制备方法和在制备用于预防和/或改善抗抑郁症的药物中的应用，属于食药用菌深加工技术领域。本发明的羊肚菌多糖是以羊肚菌作为原料，直接对羊肚菌进行超微粉碎，采用超声辅助碱性电解水浸提，经过一次醇沉，并利用浓缩、冷冻干燥等操作得到羊肚菌多糖，在保证羊肚菌多糖提取率的条件下，能够有效的保护提取成分较好的理化性质和生物活性。本发明提取得到的羊肚菌多糖能够在改善抑郁样行为中发挥重要作用，其健康效益显著，且无毒副作用，在制备用于预防和/或改善抗抑郁症的药物中有较好的前景用途。
Description
技术领域
本发明涉及羊肚菌多糖及其制备方法和在制备用于预防和/或改善抗抑郁症的药物中的应用，属于食药用菌深加工技术领域。
背景技术
食药用菌作为食品营养与健康的新抓手，目前产业规模已经成为仅次于菜、粮、果，超过油料和棉花的第四大农作物。食药用菌具有丰富多样的次级代谢产物，在慢病防控、精准营养等方面具有重要作用，是大健康产业的重要组成部分。
食用真菌的生物活性成分和营养价值不断被挖掘，一直是深入研究且极具开发潜力的生物活性成分，其健康益处及其作用机制引起了人们对食用菌深加工技术以及食品营养领域的极大兴趣。传统食用菌多糖提取多采用热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法提取，但热水浸提法具有多糖提取率低、杂质多的特点，且长时间高温处理会破坏多糖链；多糖的酸碱浸提法极易破坏多糖的结构，还存在环境污染问题。
食用真菌中最丰富的生物大分子是多糖。它们具有广泛的生物活性，包括抗肿瘤、抗菌、免疫调节、抗炎和抗氧化活性等。羊肚菌是一种营养价值丰富，珍贵稀少，医用价值高的食药用菌。近年来，关于羊肚菌多糖的理化性质、结构和在抗氧化、抗肿瘤、保肝以及发挥免疫调节活性方面已有很多研究。然而，目前尚未发现羊肚菌多糖在发挥抗抑郁功能方面的研究与报道。
因此，亟需开发一种简单、环保、廉价的食用菌多糖的制备方法，并进一步开发其在发挥抗抑郁活性方面的应用，以拓展其利用价值。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中羊肚菌多糖提取效率低、杂质多、多糖成分易破坏等技术问题，同时提供一种羊肚菌多糖在制备抗抑郁药物中的新应用。
本发明提供了一种具有抗抑郁活性的羊肚菌多糖的制备方法，该方法不仅具有较高的羊肚菌多糖提取率，而且能够有效的保护提取成分具有较好的理化性质和生物活性，使得制备出的羊肚菌多糖具有较好的抗抑郁性能且无毒副作用，作为抗抑郁活性成分具有广泛的应用。
本发明的第一个目的是提供一种制备具有抗抑郁活性的羊肚菌多糖方法，所述方法包括如下步骤：
(1)取粉碎过筛后的羊肚菌溶于碱性电解水中，在80～90℃，超声辅助浸提60～180min，得浸提液；然后将浸提液离心，取上清液旋转浓缩，浓缩液再用无水乙醇进行醇沉，收集沉淀、冷冻干燥，得冻干粉；
(2)将步骤(1)得到的冻干粉溶解配制成羊肚菌多糖溶液，按多糖溶液:Sevag试剂＝1:1的体积比加入Sevag试剂(氯仿:正丁醇＝4:1，v/v)振荡、离心，吸取上清，重复萃取2～3次，最后一次离心后，取上清液旋转浓缩，干燥后粉碎，即得羊肚菌多糖。
在一种实施方式中，步骤(1)所述碱性电解水的pH为10～12。
在一种实施方式中，步骤(1)所述羊肚菌与碱性电解水的料液比为1:(30～40)g/mL。
在一种实施方式中，步骤(1)所述超声功率为300～350W。
在一种实施方式中，步骤(1)所述离心的条件为：4000～8000r/min，时间为10～15min。
在一种实施方式中，步骤(1)所述旋转浓缩是在45～50℃真空条件下进行。
在一种实施方式中，步骤(2)所述羊肚菌多糖溶液的浓度为50～80mg/mL。
在一种实施方式中，步骤(1)所述羊肚菌包括羊肚菌的子实体、菌丝体、菌柄中的一种或多种。
本发明的第二个目的是提供一种由上述所述方法制备得到的羊肚菌多糖。
在一种实施方式中，所述羊肚菌多糖中多糖含量为75～79％；羊肚菌多糖的数均分子量为1300～1800kDa；羊肚菌多糖包含摩尔比为(60.05～61.10):(49.22～50.94):(30.31～30.34):(0.99～1.00):(1.22～1.24):(0.32～0.36):(3.11～3.14)的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖。
本发明的第三个目的是提供一种由上述所述的羊肚菌多糖在制备用于预防和/或改善抗抑郁症药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种抗抑郁症的药物，所述药物包括采用上述所述的羊肚菌多糖作为抗抑郁药物的活性成分。
本发明的第五个目的是提供一种用于缓解动物抑郁症状的饲料，所述饲料包含上述所述的羊肚菌多糖。
本发明的优点和效果：
(1)本发明的羊肚菌多糖制备方法中，采用的碱性电解水是具有碱性特质、强渗透性的小分子水，可以破坏细胞膜并渗入，用于活性成分的提取，并且具有一定的负氧化还原电位，作为溶剂，在提取过程中可以保护活性基团，在提取后无需特殊处理，自然状态下接触光、活性氧等后逐渐分解，还原为普通水，对环境友好；与现有方法相比，在保证提取物产量的条件下，保护了羊肚菌有效成分较好的理化性质和生物活性。
(2)本发明制备的羊肚菌多糖在改善抑郁样行为中发挥重要作用，开发了食用真菌深加工产物的应用，提高了食用真菌的经济价值，推动食用菌活性成分提取、加工、再加工商品化全产业链发展。
附图说明
图1为本发明实施例2中MCP改善CUMS小鼠的抑郁行为数据图；(A)实验流程图；(B)体重变化数据图；(C)糖水偏好指数变化数据图；(D)悬尾试验中的不动时间数据图；(E)强制游泳试验中的不动时间数据图；
图2为本发明实施例2中MCP改善CUMS小鼠的促炎因子水平数据图；
图3为本发明实施例2中MCP改善CUMS小鼠的海马体中的5-HT水平数据图。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明进行详细描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，但并不以任何方式限制本发明。在不背离本发明的技术解决方案前提下，凡是利用本发明说明书内容所作的、本领域普通科技人员易于实现的任何改动或改变都将包括在本发明的专利保护范围内。
实施例1
羊肚菌多糖的制备，具体包括如下步骤：
(1)取羊肚菌子实体烘干至恒重，超微粉碎后过250目筛，得到均匀的粉末样品；将样品置于pH＝12的碱性电解水中超声辅助浸提，提取温度为90℃，超声功率为300W，提取时间为120min，料液比为1:35g/mL；然后将浸提液5500r/min离心12min，取上清液利用旋转蒸发仪在45～50℃真空条件下浓缩；用4倍体积无水乙醇4℃沉淀8～10小时，收集沉淀，冷冻干燥，置于干燥、避光处保存；
(2)将步骤(1)得到的冻干产物溶解配制成羊肚菌多糖溶液，按多糖溶液:Sevag试剂＝1:1的体积比加入Sevag试剂(氯仿:正丁醇＝4:1，v/v)震荡30min，离心去除蛋白和有机试剂，重复3次；将上清液利用旋转蒸发仪在45～50℃真空条件下浓缩，70℃真空干燥箱干燥后，粉碎得羊肚菌多糖。
结果测定
1、对实施例1制备的羊肚菌多糖(MCP)进行多糖含量测定
采用苯酚-硫酸显色法测定提取的羊肚菌多糖中总糖含量，结果显示：羊肚菌多糖中多糖含量为79％，且多糖溶解性增加、黏度降低。
2、羊肚菌多糖平均分子量测定
将实施例1制备的羊肚菌多糖溶于去离子水配制成浓度50mg/mL的溶液，离心(8000r/min，10min)后取上清10mL上样于纤维素DEAE-52离子层析柱(2.6×40cm)，先用蒸馏水进行洗脱，然后以0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，每隔90s收集一管，每管收集6mL；根据洗脱曲线收集不同的洗脱峰组分，用去离子水透析(截留量3000Da)，然后冷冻干燥；再将冷冻干燥后的产物溶于蒸馏水中配置成10mg/mL的多糖溶液，取2mL上样于Sephadex G-100凝胶层析柱(2.6×50cm)中，用蒸馏水洗脱，洗脱液流速为0.5mL/min；用自动部分收集器收集，每管收集4mL；根据洗脱曲线中显现的洗脱峰分别收集洗脱液，经透析(截留量3000Da)后冷冻干燥，储存备用。
采用高效液相排阻色谱法(HPSEC)检测羊肚菌多糖的平均分子量，测定结果表明：羊肚菌多糖经纤维素DEAE-52洗脱获得了三个组分，分别为MCP-1、MCP-2和MCP-3，这三个组分经Sephadex G-100凝胶层析柱纯化，得到了六个组分，分别为MCP-1a、MCP-1b、MCP-2a、MCP-2b、MCP-3a和MCP-3b。
通过GC-MS对其分子量进行分析，MCP的数均分子量为1300～1800kDa，MCP-1b、MCP-2a和MCP-3b的数均分子量分别为20～30kDa、600～650kDa、1000～1100kDa。
3、羊肚菌多糖中单糖组成测定
称取2mg样品用2mol/L三氟乙酸(TFA)水解,除去TFA后，将残留物溶解在蒸馏水中，并在室温下用硼氢化钠还原3h，用乙酸中和过量的硼氢化钠，至溶液不再产生气泡为止。减压蒸发至干燥后，将残余物用乙酸酐在100℃乙酰化1小时。使用TR-5MS色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)对所得醋酸醛二醇进行GC-MS分析测定实施例1制备的羊肚菌多糖中单糖组成。
结果显示：MCP主要由摩尔比为(60.05～61.10):(49.22～50.94):(30.31～30.34):(0.99～1.00):(1.22～1.24):(0.32～0.36):(3.11～3.14)的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖组成。
实施例2
实施例1制备的羊肚菌多糖在改善慢性应激抑郁症中的应用
动物实验：从西安交通大学医学院实验动物中心购买6周龄雄性ICR小鼠，12h/12h明暗周期适应性喂养3-5天。小鼠慢性应激抑郁模型参照国家人类疾病动物模型资源库推荐方法，给予慢性不可预见性的温和刺激并配合孤养。选择7种应激因子按随机方法在28天内应用，包括12h昼夜颠倒、禁食禁水24h、禁水24h、禁食24h、束缚2-4h、倾笼、4℃冷水游泳3-5min。每天随机给予一种刺激，使小鼠不能预料刺激的发生，以避免产生适应，平均每种刺激给予3次。
将小鼠随机分为五组：对照组、模型组(CUMS组)、路优泰组(100mg/kg)、MCPL低剂量组(200mg/kg)、MCPH高剂量组(600mg/kg)，n＝10/组。除了对照组外，其余各组小鼠均按小鼠慢性应激抑郁模型SOP进行造模；从造模第一天开始灌胃给药，一天一次，连续28天，对照组和模型组给予等体积的生理盐水。第28天结束时，牺牲小鼠，取血液和海马组织待测。
所测指标按以下顺序进行：
(1)体重变化的测定：每天称取各组小鼠的体重，监测小鼠在干预期间的体重变化；
(2)糖水偏爱率的测定：在前24h每笼放入两瓶1％(w/v)的蔗糖溶液，紧接着24h将其中的一瓶换成纯水，适应结束后，禁食禁水24h，之后12h的基线测试开始进训练后禁食动物，将1％(w/v)蔗糖和水各一瓶放入每个笼子中24小时。记录小鼠的总液体消耗，糖水消耗和纯水消耗；糖水偏好指数的计算公式如下：
糖水偏好指数％＝糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100％
(3)悬尾不动时间的测定：将小鼠尾端固定在一根水平木棍上，使小鼠呈倒挂状态，其头部离水平面5～6cm，当小鼠四肢不再剧烈挣扎即视为静止不动，记录每只小鼠在5min内累计不动时间；
(4)强迫游泳不动时间的测定：采用透明圆柱形玻璃筒,水深10cm，水温23～25℃，观察6min，记录后4min内保持不动状态时间；
(5)细胞因子的测定：酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒操作方法，检测小鼠血清和海马中的细胞因子水平：TNF-α、IL-1β；
(6)海马组织5-HT的测定：取小鼠海马组织10mg加入100μL PBS(pH7.4)匀浆，在4℃下3000rpm离心20min，收集上清液用ELISA试剂盒(中国上海江莱)测定5-HT水平；在450nm波长下测量每个样品的吸光度(OD值)。
测定结果如下：
1、从图1中B可知，随试验天数增加，对照组小鼠体重平稳增长；与对照组小鼠相比，模型组小鼠体重增加缓慢；与模型组相比，各个处理组小鼠体重增长速率显著增加，体重增长速率：路优泰组＞MCPH组＞MCPL组(图1B)；说明，MCP能够有效的缓解慢性应激抑郁小鼠的症状。
2、行为学实验结果显示，从图1中C可知，与对照组比较，模型组小鼠的糖水偏好率显著降低；与模型组比较，各处理组小鼠的糖水偏好率均显著升高，糖水偏好率结果显示：MCP组能够有效的缓解慢性应激抑郁小鼠的症状，并且能够达到与市售路优泰相当的水平。
从图1中D、E可知，模型组中FST和TST小鼠的不动时间显著高于对照组小鼠，与模型组的不活动时间相比，MCP组小鼠的不活动时间显著降低。
3、炎症细胞因子水平检测结果显示，如图2所示；模型组IL-1β和TNF-α水平显著高于对照组；MCP给药显著降低了模型组中的IL-1β和TNF-α水平，并且MCP高剂量组的降低效果更加突出；如图3所示小鼠接受慢性应激刺激后，模型组海马体中的5-HT水平明显低于对照组小鼠；相比之下，MCP给药逆转了由慢性应激刺激引起的海马5-HT下降，尤其是高剂量组，几乎达到了与对照组相当的水平。
上述结果表明，MCP应用于慢性应激抑郁的治疗，能够有效的改善慢性应激刺激引起的抑郁样表型，具有较好的市场应用价值。
Claims (10)
1.一种制备具有抗抑郁活性的羊肚菌多糖方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)取粉碎过筛后的羊肚菌溶于碱性电解水中，在80～90℃，超声辅助浸提60～180min，得浸提液；然后将浸提液离心，取上清液旋转浓缩，浓缩液再用无水乙醇进行醇沉，收集沉淀、冷冻干燥，得冻干粉；
(2)将步骤(1)得到的冻干粉溶解配制成羊肚菌多糖溶液，按多糖溶液:Sevag试剂＝1:1的体积比加入Sevag试剂，振荡萃取、离心，吸取上清，重复萃取2～3次，最后一次离心后，取上清液旋转浓缩，干燥后粉碎，即得羊肚菌多糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述碱性电解水的pH为10～12。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述羊肚菌与碱性电解水的料液比为1:(30～40)g/mL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述超声功率为300～350W。
5.由权利要求1～4任一所述的方法制备得到的羊肚菌多糖。
6.根据权利要求5所述的羊肚菌多糖，其特征在于，所述羊肚菌多糖中多糖含量为75～79％；羊肚菌多糖的数均分子量为1300～1800kDa。
7.根据权利要求5或6所述的羊肚菌多糖，其特征在于，所述羊肚菌多糖包含摩尔比为(60.05～61.10):(49.22～50.94):(30.31～30.34):(0.99～1.00):(1.22～1.24):(0.32～0.36):(3.11～3.14)的葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖。
8.由权利要求5～7任一所述的羊肚菌多糖在制备用于预防和/或改善抗抑郁症的药物中的应用。
9.一种抗抑郁症的药物，其特征在于，所述药物包括采用权利要求5～7任一所述的羊肚菌多糖作为抗抑郁药物的活性成分。
10.一种用于缓解动物抑郁症状的饲料，其特征在于，所述饲料包含权利要求5～7任一所述的羊肚菌多糖。
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| CN116003642B (zh) * | 2022-07-27 | 2024-04-12 | 西南大学 | 一种碱性电解水提取羊肚菌多糖的方法及所得羊肚菌多糖 |
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