CN105002249B

CN105002249B - 一种红曲霉液态发酵制备ace抑制肽的方法

Info

Publication number: CN105002249B
Application number: CN201510498869.8A
Authority: CN
Inventors: 王伟平; 胡川; 刘洋; 苏正定; 宫春杰; 张华山; 陈瑶
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2015-08-14
Filing date: 2015-08-14
Publication date: 2018-09-21
Anticipated expiration: 2035-08-14
Also published as: CN105002249A

Abstract

本发明公开了一种红曲霉液态发酵制备ACE抑制肽的方法。本发明使用人工培养基进行液态发酵生产红曲霉菌丝体，再应用混合蛋白酶复合酶解法对红曲霉菌丝体中的蛋白质进行提取，即先利用碱性蛋白酶处理，再用木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解红曲霉菌丝体中的蛋白质，并通过浓缩、真空冷冻干燥得到小分子活性多肽产品。通过对红曲多肽理化性质的测定及采用高效液相色谱法对其ACE抑制活性的研究，发现了红曲多肽具有较好的降血压功效，具有开发降血压保健食品的潜力。本发明的方法具有原料不受季节限制，操作简单、节约成本、减少环境污染、蛋白质提取率高和产品降血压活性好的优点。

Description

一种红曲霉液态发酵制备ACE抑制肽的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种红曲霉液态发酵制备ACE抑制肽的方法。

背景技术

随着社会发展和人们生产、生活水平的提高，人口平均年龄增长，饮食结构改变，盐摄入量增高，以致高血压、高血压性心脏损害患病率增加。高血压不仅是一个独立的疾病，也是脑中风、冠心病、肾功能衰竭和眼底病变的重要危险因素，高血压患者还常常伴有糖尿病等慢性疾患。有效地预防并控制高血压对人体健康具有重要意义。

降血压肽，又称为血管紧张素转化酶(Angioensin I Converting Enzyme，简称ACE)抑制肽，是从食物蛋白中分离出的一类具有显著降低血压功效的多肽短链物质。这些来源于食品的降血压肽通常由蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，其共同突出优点是只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者无降压作用，因而不会有降压过度现象发生。

红曲霉菌丝体的重量占发酵液重量的20%左右，红曲霉菌丝体中富含对人体有保健作用的有益物质，如具有降血压功能的Monacolin K，丰富的必需氨基酸、不饱合脂肪酸，35%-40%的蛋白质等物质。红曲菌丝中的这些有益物质多为不饱和脂肪酸和菌体组织蛋白质，其中的菌体组织蛋白质结构松软，容易消化吸收，尤其适合儿童，老人和病人食用，具有较高的营养保健价值。

现阶段我国的红曲生产主要以大米为原料，以固态发酵的方式进行，目前已有酶法处理固态发酵红曲霉菌渣从中回收蛋白多糖等物质的报道。然而，通过液态发酵制备纯净的红曲霉菌丝体，并使用酶解法从菌体蛋白中得到具有ACE抑制活性的多肽粉剂的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有红曲霉菌丝体再利用的技术不足，提供一种采用红曲霉菌丝体制备可溶性ACE抑制肽的方法。

使用人工培养基进行液态发酵生产红曲霉菌体，再应用混合蛋白酶复合酶解法对红曲霉菌丝体中的蛋白质进行提取，生产出安全纯净的具有ACE抑制活性的红曲多肽产品。通过对红曲多肽理化性质的测定及采用高效液相色谱法对其ACE抑制活性的研究，发现了红曲多肽具有较好的降血压功效，具有开发降血压保健食品的潜力。

本发明采用的红曲霉已于2013年3月13日保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC），中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2013082，分类命名：红色红曲霉SE1703 Monascus rubber SE1703。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

提供一种红曲霉液态发酵制备ACE抑制肽的方法，包括以下步骤：

（1）红曲霉液态发酵：使用斜面活化培养基培养红曲菌种，进行活化；取培养后的斜面种子一支，将菌体及孢子洗脱至生理盐水中制成混合液，按 10%的接种量接种到装有二级液体种子培养基，于 200rpm，30℃培养 48h~72h；将二级液体种子按 10%的接种量接种到发酵培养基中于 30℃，200rpm 培养5d，得到红曲霉菌丝体；

（2）获得菌体干粉：用去离子水清洗红曲霉菌丝体，冷冻干燥得到菌体干粉；

（3）酶解处理：称取一定量红曲菌体干粉，加入适量的水和碱性蛋白酶，调节pH至碱性，保温酶解一段时间；酶解一段时间后，对酶解液中的蛋白酶进行灭活；降温后向灭活后的红曲酶解液中加入木瓜蛋白酶，调节pH，保温酶解一段时间；酶解完成后加热一段时间，灭活木瓜蛋白酶，红曲酶解液中加入胃蛋白酶，调节pH，保温酶解一段时间；对酶解液进行抽滤，收集酶解液；

（4）后处理：对酶解液进行减压蒸发浓缩，得到红曲多肽浓缩液，对浓缩后的酶解液进行真空冷冻干燥，即得到对ACE有抑制活性的红曲多肽产品；

步骤（1）中所述的二级液体种子培养基配方为：大米粉 3%，硝酸钠 0.5%，磷酸二氢钾 0.25%，硫酸镁 0.1%，使用乳酸调节pH 5.5~6；

步骤（1）中所述的发酵培养基配方为：葡萄糖 4%，蛋白胨 2%，可溶性淀粉3%，硝酸钠 0.2%，磷酸二氢钾 0.1%，硫酸镁 0.2%，使用乳酸调节pH 5.5~6。

步骤（3）中所述的碱性蛋白酶的加入量占原料红曲菌体干粉的0.3%，加水量是红曲菌体干粉的100倍重量，即用电子天平称取蛋白酶加入其中，加碱性蛋白酶前要根据酶的最适pH调节酸碱范围，调节pH至7-8.5；调节水浴蛋白酶酶解的最适温度50℃-60℃，保温酶解2h，酶解结束后，将水浴锅的温度调至90℃，保温维持15min，除去酶解液中碱性蛋白酶的活性；温度降低至50℃以下时，向灭活了蛋白酶的红曲菌体蛋白水解液中加入原料质量0.2%的木瓜蛋白酶，保持酶解温度在50℃-60℃，调节pH在6-7左右，维持1h；调节水浴锅的温度至90℃，维持15min，灭活木瓜蛋白酶的酶活性；加入原料质量0.3%的胃蛋白酶，保持酶解温度在30℃-40℃，调节pH在3-4左右，维持1.5h。

与现有的技术相比，本发明具有以下的有益效果；

1.传统的红曲霉发酵主要以大米为主要原料进行固态发酵，使用葡萄糖和蛋白胨作为主要碳氮源，液态发酵生产红曲菌体多肽可以有效避免培养基中的大米蛋白和色素浸提过程中的有机溶剂对红曲多肽的污染，提高了红曲多肽产品的安全性。

2.本发明利用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶对红曲霉菌丝体中的蛋白质进行酶解，提取并酶解了红曲霉菌丝体中蛋白质，提高了红曲菌体蛋白的原料利用率，并且提高了蛋白质多肽的提取收率。产品总蛋白含量大于65%，ACE抑制活性IC₅₀为26.1mg/mL。

3.本发明中对红曲霉菌丝体的前处理不同于传统的高温烘干粉碎处理，高温烘干也会破坏红曲菌体蛋白的结构和活性。通过改善前处理的条件，采用新鲜红曲霉菌丝体进行清洗，过滤去除大部分水分后，低温真空冷冻干燥获得菌体干粉进行后续酶解步骤，以获得我们所需要的产品。同时，红曲霉产生的一些活性物质混合在多肽冷冻干燥的粉末中，活性得到最大限度的保留，对人体起着保健作用。

4.本发明制备的ACE抑制肽产品其ACE抑制活性IC₅₀值能够达到26.1mg/mL。将其作为功能因子添加到各类食品中，对高血压患者具有一定的降压作用。

附图说明

图1为实施例1红曲肽浓度与ACE抑制率对应图；

图2为实施例2红曲肽浓度与ACE抑制率对应图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】

使用配方为葡萄糖 6%，蛋白胨 2%，可溶性淀粉 3%，琼脂 3%的红曲霉斜面活化培养基进行菌种活化。将实验室保藏的红曲菌种SE1703接种到斜面培养基上，30℃恒温培养箱中培养进行活化。

取培养后的斜面种子一支，将菌体及孢子洗脱至100mL生理盐水中制成混合液，按10%的接种量接种到装有二级液体种子培养基100mL的 250mL 的三角瓶，于 200rpm，30℃培养 48h-72h。二级种子培养基配方为：大米粉 3%，硝酸钠 0.5%，磷酸二氢钾 0.25%，硫酸镁 0.1%，使用乳酸调节pH 5.5-6。

将培养 24h-48h 后的二级液体种子按 10%的接种量接种到发酵培养基中于 30℃，200rpm 培养5d，得到红曲霉菌丝体。发酵培养基配方为：葡萄糖 4%，蛋白胨 2%，可溶性淀粉3%，硝酸钠 0.2%，磷酸二氢钾 0.1%，硫酸镁 0.2%，使用乳酸调节pH 5.5-6。

红曲霉菌丝体使用适量去离子水清洗，冷冻干燥得到菌体干粉，电子天平称取湿重的红曲霉菌丝体100g，加入200mL体积的去离子水清洗，过滤去除滤液，菌体置于-80℃冰箱冷冻12h，调节冷冻干燥机条件为-85℃，真空度-0.01mPa，将菌体进行真空冷冻干燥得到菌体干粉。

用电子天平称取干重的红曲菌体干粉5g，加入100倍重量即500mL的去离子水，加入质量为菌体干粉原料0.3%的碱性蛋白酶，即0.015g的碱性蛋白酶，调节pH=8.5，放置于水浴锅中，调节温度为55℃，保温酶解2h。

酶解结束后，将水浴锅温度调至90℃，保温15min左右，目的是将酶解液中的蛋白酶进行灭活。

用电子天平称取占原料质量为0.2%的木瓜蛋白酶，即0.01g的木瓜蛋白酶加入到红曲菌体蛋白酶解液中，调节pH至6.3，水浴温度60℃，保温酶解1h。

木瓜蛋白酶酶解结束后，将温度升至90℃，保温15min左右。目的是灭活木瓜蛋白酶。

用电子天平称取占原料质量为0.3%的胃蛋白酶，即0.015g的胃蛋白酶加入到红曲菌体蛋白酶解液中，调节pH至3，水浴温度40℃，保温酶解1.5h。

将酶解完成后的红曲菌体蛋白酶解液进行真空抽滤。收集酶解液，用旋转蒸发仪进行酶解液的浓缩，浓缩的温度控制在50℃左右。

将浓缩后的蛋白质酶解液进行真空冷冻干燥，冷冻干燥条件为-85℃，真空度-0.01mPa，得到小分子多肽粉末产品。产品为红色或淡红色粉末状，有特殊香味。

称取定量的0.5g干粉使用国标GB50093-2010的方法测定水分含量，红曲多肽粉中的水分含量为8.7% ，使用国标GB50094-2010的方法测定灰分含量，红曲多肽粉中的灰分含量为3.4%，使用蒽酮比色法法测定可溶性总糖含量，红曲多肽粉中的可溶性总糖含量为16.3% 。

称取定量的0.5g干粉使用凯氏定氮仪进行蛋白质含量的测定。测定结果发现蛋白质含量大于69%。称取一定量的多肽干粉使用超纯水分别配置成5mg/mL, 10mg/mL, 20mg/mL, 30mg/mL的红曲多肽溶液，使用高效液相色谱法对不同浓度的红曲多肽溶液的ACE抑制活性进行测定，具体测定方法分别取不同浓度的红曲多肽溶液离心(7200 × g，15min)，取上清液进行 ACE 抑制活性测定。取 10μl上清液和40μl2.17mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于pH8.3 0.1mol/L硼酸缓冲液，其中含0.3 mol/L NaCl)于37℃保温6min，加入20μlACE(0.1U溶于1.0mL相同的缓冲溶液中)，37℃下反应30min 后，加入80μl1mol/L 的HCl溶液终止反应，至室温取 10μl反应产物进样，采用Symmetry C18色谱柱，通过HPLC 洗脱图谱定量马尿酸生成量，以马尿酸的生成量来判断样品对ACE 活性的抑制作用。测定结果为红曲多肽的IC₅₀为27.3mg/mL。

【实施例2】

使用配方为葡萄糖 6%，蛋白胨 2%，可溶性淀粉 3%，琼脂 3%的红曲霉斜面活化培养基进行菌种活化。将已经将实验室保藏的红曲菌种SE1703接种到斜面培养基上，30℃恒温培养箱中培养进行活化。

取培养后的斜面种子一支，将菌体及孢子洗脱至 100mL 生理盐水中制成混合液，按 10%的接种量接种到装有二级液体种子培养基 100mL 的 250mL 的三角瓶，于 200rpm，30℃培养 48h~72h。二级种子培养基配方为：大米粉 3%，硝酸钠 0.5%，磷酸二氢钾 0.25%，硫酸镁 0.1%，使用乳酸调节pH 5.5~6。

将培养 24h~48h 后的二级液体种子按 10%的接种量接种到发酵培养基中于 30℃，200rpm 培养5d，得到红曲霉菌丝体。发酵培养基配方为：葡萄糖 4%，蛋白胨 2%，可溶性淀粉3%，硝酸钠 0.2%，磷酸二氢钾 0.1%，硫酸镁 0.2%，使用乳酸调节pH 5.5~6。

用电子天平称取干重的红曲菌体干粉5g，加入100倍重量即500mL的去离子水，加入质量为菌体干粉原料0.3%的碱性蛋白酶，即0.015g的碱性蛋白酶，调节pH=8，放置于水浴锅中，调节温度为55℃，保温酶解2h。

用电子天平称取占原料质量为0.2%的木瓜蛋白酶，即0.01g的木瓜蛋白酶加入到红曲菌体蛋白酶解液中，调节pH至7，水浴温度60℃，保温酶解1h。

用电子天平称取占原料质量为0.3%的胃蛋白酶，即0.015g的胃蛋白酶加入到红曲菌体蛋白酶解液中，调节pH至4，水浴温度30℃，保温酶解1.5h。

将浓缩后的蛋白质酶解液进行真空冷冻干燥，冷冻干燥条件为-85℃，真空度-0.01mPa，得到小分子多肽粉末产品。

称取定量的0.5g干粉使用实施例1中的方法对红曲多肽干粉的ACE抑制活性进行测定，测定结果为红曲多肽的IC₅₀为26.1mg/mL。

Claims

1.一种红曲霉液态发酵制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)红曲霉液态发酵：使用斜面活化培养基培养红曲菌种，进行活化；取培养后的斜面种子一支，将菌体及孢子洗脱至生理盐水中制成混合液，按二级液体种子培养基体积的10％的接种量接种到装有二级液体种子培养基，于200rpm，30℃培养48h～72h；将二级液体种子按发酵培养基体积的10％的接种量接种到发酵培养基中于30℃，200rpm培养5d，得到红曲霉菌丝体；其中红曲霉采用中国典型培养物保藏中心保藏的，保藏编号为CCTCC NO:M2013082的红曲菌种；

二级液体种子培养基质量比配方为：大米粉3％，硝酸钠0.5％，磷酸二氢钾0.25％，硫酸镁0.1％，其余为去离子水，使用乳酸调节pH 5.5～6；

发酵培养基质量比配方为：葡萄糖4％，蛋白胨2％，可溶性淀粉3％，硝酸钠0.2％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.2％，其余为去离子水，使用乳酸调节pH 5.5～6；

(2)获得菌体干粉：用去离子水清洗红曲霉菌丝体，过滤去除滤液，菌体置于-80℃冰箱冷冻12h，调节冷冻干燥机条件为-85℃，真空度-0.01mPa，将菌体进行真空冷冻干燥得到菌体干粉；

(3)酶解处理：称取一定量红曲菌体干粉，加入菌体干粉100倍重量的去离子水，加入质量为菌体干粉原料0.3％的碱性蛋白酶，调节pH至7-8.5，保温酶解2h；酶解结束后，将水浴锅的温度调至90℃，保温维持15min，除去酶解液中碱性蛋白酶的活性；温度降低至50℃以下时，向灭活了蛋白酶的红曲菌体蛋白水解液中加入菌体干粉原料质量的0.2％的木瓜蛋白酶，保持酶解温度在50℃-60℃，调节pH在6-7，维持1h；调节水浴锅的温度至90℃，维持15min，灭活木瓜蛋白酶的酶活性；加入菌体干粉原料质量的0.3％的胃蛋白酶，保持酶解温度在30℃-40℃，调节pH在3-4，维持1.5h；

(4)后处理：对酶解液进行减压蒸发浓缩，得到红曲多肽浓缩液，对浓缩后的酶解液进行真空冷冻干燥，即得到对ACE有抑制活性的红曲多肽产品。