CN107114758A - 一种发酵虫草菌丝体粉及其制备方法 - Google Patents

一种发酵虫草菌丝体粉及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种发酵虫草菌丝体粉及其制备方法，包括如下步骤：蝙蝠蛾拟青霉菌种接种恒温培养、种子罐培养、发酵罐培养、超低温真空浓缩、冷冻干燥、粉碎。本发明所述方法制得的虫草菌丝体粉较专利申请号为201310124056.3生产的虫草菌丝体粉，产品中钙含量提高15～20％；镁含量提高5～8％；铁含量提高5～7％；锌含量提高6～9％；虫草酸含量提高5～8％；虫草素含量提高6～10％；SOD酶活力提高4～7％。本发明还公开了以该虫草菌丝体粉为活性成分在制备提高机体免疫功能制剂中的应用。

Description

一种发酵虫草菌丝体粉及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种发酵虫草菌丝体粉、其制备方法及其在制备增强免疫功能制剂中的应用。
背景技术
冬虫夏草是我国传统名贵的强壮滋补药材，由于天然虫草有其严格的寄生性及特殊的生长环境，加之近年来生态环境的严重破坏，天然虫草资源锐减，价格猛涨。随着人民生活水平的不断提高，对虫草的需求量正日益增大，因此，人工培养虫草菌丝体替代天然虫草成为当务之急。现代科学研究表明，虫草菌丝体中富含虫草酸、虫草素、SOD酶、虫草多糖等功效成分，其含量基本与天然冬虫夏草相同，虫草菌丝体同样具有提高人体免疫力、抗疲劳、预防心脑血管疾病及抗肿瘤等多种促进人体健康的功能，产品保健功效显著，是天然冬虫夏草理想的替代品，有广阔的发展前景。
钙元素是人体中含量最多的无机盐，占人体体重的2％，具有多种重要的生理功能，享有“生命元素”之称。镁是人体必需的重要元素之一，体内镁的总量约为21-28g。镁元素在调节免疫系统方面起重要作用：参与免疫球蛋白的合成、参与激活补体、调节吞噬细胞的吞噬功能、调节T淋巴细胞的成熟和功能，低镁可致血免疫球蛋白降低。铁是人体含量最多的必需微量元素，人体总含量为3-5克。在人体所必需的十多种微量元素中，铁无论在重要性上还是在数量上都居首位，堪称“微量元素中的老大”。锌是人体不可缺少的微量元素之一，人体内含锌量约为2-3g。锌元素参与体内多种生理活动，具有重要的生理功能：其能直接作用于脾脏、扁桃体及胸腺等免疫器官，并作用于多种免疫物质与免疫细胞，促进生长，提高机体免疫力；维持机体的正常生长发育；维持正常的味觉功能及食欲；促进正常的性发育等。
虫草酸、虫草素、SOD酶是虫草菌丝体本身含有的特征性功效成分。国内外目前关于富含钙、镁、铁、锌的虫草菌丝体产品及其制备方法几乎没有。本发明在专利申请号为201310124056.3的“一种虫草菌丝体及制备方法”的基础上进行了研究、改进，在未增加工艺复杂性、投入成本更低的情况下，得到了钙、镁、铁、锌、虫草酸、虫草素、SOD酶含量更高的虫草菌丝体粉，产品的保健功能更强。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的发酵虫草菌丝体粉及其制备方法，所述产品较现有技术生产出的虫草菌丝体粉含有更高的钙、镁、铁、锌等元素，并且虫草酸、虫草素、SOD酶等特征性功效成分含量更高，且不增加工艺的复杂性，投入成本更低；
本发明的另一目的在于提供一种在制备增强免疫功能制剂中具有更好的增强机体免疫效果的虫草菌丝体粉。
为达到上述目的，本发明采用下列技术方案实现。
菌种接种恒温培养的培养基配方组成及重量比为：麦芽糖1％-3％，鸡蛋蛋白粉2％-8％，KH2PO4 0.1％-0.5％，硫酸镁0.1％-3％，水余量。
为进一步实现本发明的目的，其配方组成及重量比为：麦芽糖1.5％-2.5％，鸡蛋蛋白粉4％-6％，KH2PO4 0.2％-0.4％，硫酸镁0.5％-2.5％，水余量；更优选的配方组成及重量比为：麦芽糖2％，鸡蛋蛋白粉5％，KH2PO4 0.3％，硫酸镁0.2％，水余量。
种子罐发酵培养的培养基配方组成及重量比为：马铃薯粉15％-30％，葡萄糖1％-4％，乳清浓缩蛋白2％-5％，KH2PO4 0.1％-0.5％，硫酸镁0.1％-3％，水余量。
为进一步实现本发明的目的，其配方组成及重量比为：马铃薯粉20％-25％，葡萄糖2％-3％，乳清浓缩蛋白3％-4％，KH2PO4 0.2％-0.4％，硫酸镁0.5％-2.5％，水余量；更优选的配方组成及重量比为：马铃薯粉20％，葡萄糖3％，乳清浓缩蛋白4％，KH2PO4 0.2％，硫酸镁0.1％，水余量。
发酵罐培养的培养基配方组成及重量比为：大豆分离蛋白4％-10％，脱脂奶粉4％-10％，酶解骨粉8％-12％，葡萄糖1％-3％，水余量；所述酶解骨粉的制备方法为：①蒸煮：将动物鲜骨经挑选、清洗等工序，装入蒸煮罐内，蒸煮3次，每次2小时；②研磨：将蒸煮后的净骨，经粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料与添加的水的重量比为1∶1；③生化酶解：将研磨后的骨浆打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶重量比1︰2的复合蛋白酶，复合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加柠檬酸调PH值至5.5，45℃搅拌1h；酶解液加碱中和，灭活，供下道工序使用，喷粉前骨浆在灭菌缸中停留不得超过1小时；④干燥喷粉：当进口温度达到180℃时，打开蓄水罐阀门，当进口温度达到225℃、出口温度达到105℃时，稳定10分钟后关闭水阀门，打开灭菌缸排液阀门，开始喷粉，得酶解骨粉。
为进一步实现本发明的目的，其配方组成及重量比为：大豆分离蛋白5％-8％，脱脂奶粉5％-8％，酶解骨粉9％-11％，葡萄糖2％-3％，水余量；更优选的配方组成及重量比为：大豆分离蛋白5％，脱脂奶粉5％，酶解骨粉10％，葡萄糖3％，水余量。
本发明采用蝙蝠蛾拟青霉为菌种，通过菌种接种恒温培养、种子罐培养、发酵罐培养、超低温真空浓缩、冷冻干燥、粉碎等工艺制备而成。
具体步骤为：
步骤一：菌种接种恒温培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：麦芽糖1％-3％，鸡蛋蛋白粉2％-8％，KH2PO40.1％-0.5％，硫酸镁0.1％-3％，水余量。将配制好的培养基分装入锥形瓶中，封口后在120-130℃条件下灭菌18-30分钟，取出培养基，自然冷却至20-30℃，在无菌条件下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种，15-30℃恒温培养5-10天。
步骤二：种子罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：马铃薯粉15％-30％，葡萄糖1％-4％，乳清浓缩蛋白2％-5％，KH2PO4 0.1％-0.5％，硫酸镁0.1％-3％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤一培养好的菌种，接种量6.5％-8.0％，温度15-30℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养时间72小时。
步骤三：发酵罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：大豆分离蛋白4％-10％，脱脂奶粉4％-10％，酶解骨粉8％-12％，葡萄糖1％-3％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤二培养好的菌种，接种量3.0％-3.5％，温度15-30℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养至培养基还原糖小于0.1％时，放罐收获。
步骤四：超低温真空浓缩
将培养好的虫草菌丝体放入超低温真空浓缩设备，设定工作真空度为-0.08MPa，蒸发温度为30℃，浓缩至产品比重达到1.2-1.3g/cm3,结束浓缩。
步骤五：冷冻干燥
将浓缩后的虫草菌丝体以-0.6℃/分钟的降温速度快速冷冻到-30℃，维持2小时后，放入干燥室进行干燥。加热板升温至45℃后，保持9小时，再降温至35℃，保持5小时，全过程保持最高真空度。所得产物水分≤5％。
冷冻干燥后产品，用万能粉碎机进行粉碎，得到粉末状虫草菌丝体。
本发明所述的菌种接种恒温培养的培养基，其氮源采用鸡蛋蛋白粉，鸡蛋蛋白粉属动物源蛋白质，含有90％以上的优质蛋白质，氨基酸种类齐全且含量丰富，营养价值高。经过筛选对比试验后发现，以鸡蛋蛋白粉做为氮源，可明显的促进接种恒温培养阶段的虫草菌丝体的生长，是此阶段的最佳氮源。矿物质钾、磷、镁对虫草发酵具有重要影响，因此在培养基中加入适量的KH2PO4和硫酸镁，以促进虫草菌丝体的生长。
本发明所述的种子罐培养基，其氮源采用乳清浓缩蛋白，乳清浓缩蛋白来源于牛乳，含有80％以上的优质蛋白质，氨基酸种类齐全且含量丰富，营养价值高。经过筛选对比试验后发现，以乳清浓缩蛋白做为氮源，可明显的促进种子罐培养阶段的虫草菌丝体的生长，是此阶段的最佳氮源。矿物质钾、磷、镁对虫草发酵具有重要影响，因此在培养基中加入适量的KH2PO4和硫酸镁，以促进虫草菌丝体的生长。
本发明所述的发酵罐培养基，以大豆分离蛋白、脱脂奶粉为氮源，大豆分离蛋白含有90％以上的优质蛋白质，属于植物性蛋白，脱脂奶粉含有34％的优质蛋白质，属于动物性蛋白，两者复配使用，可实现氨基酸的互补，弥补两种蛋白质中限制性氨基酸的不足，显著提高营养价值。经过筛选对比试验后发现，以大豆分离蛋白和脱脂奶粉做为氮源，可明显的促进发酵罐培养阶段的虫草菌丝体的生长，是此阶段的最佳氮源。酶解骨粉来源于天然牛骨，富含钙、镁、铁、锌等多种矿物元素，是纯天然的矿物质集合体，与无机矿物质相比，安全性高，生物利用率高，营养价值高，并可以明显促进虫草菌丝体的生长。
虫草酸是虫草菌丝体的主要活性成分之一，其属于弱酸，对温度敏感，遇热易挥发；虫草素是虫草菌丝体的主要活性成分之一，属于腺苷类似物，其热稳定性也较差；SOD酶是虫草菌丝体的主要活性成分之一，属于生物酶类，遇高温容易变性从而失去生物活性。本发明所述的超低温真空浓缩和冷冻干燥工艺，是在较低的加工温度条件下，实现了虫草菌丝体的浓缩和干燥过程，与现有技术相比，更好的保留了虫草菌丝体中的对热敏感的活性物质。
发明人通过大量的实验研究，发现虫草菌丝体对矿物质元素富集能力高。本发明采用特定的培养基及制备方法，生产出富含钙、镁、铁、锌的虫草菌丝体，同时明显提高了虫草菌丝体中虫草酸、虫草素、SOD酶等活性成分的含量。药理实验和临床实验数据表明，虫草菌丝体具有显著的免疫调节的功能；钙、镁、锌、铁元素均是人体必需的矿物元素，与人体免疫系统关系密切，具有提高机体免疫力的功效。两者相辅相成，协同增效，可以明显增加产品此方面的保健功效。
发明人在研究虫草菌丝体粉的制备工艺时，意外发现选择步骤二种子罐培养过程中接入步骤一培养好的菌种的接种量为6.5％-8.0％，步骤三发酵罐培养过程中选择本发明特定工艺制备的酶解骨粉配制培养基，而仅接入步骤二培养好的菌种3.0％-3.5％，不改变其他步骤工艺参数的情况下，所制得的虫草菌丝体粉的产量几乎没有变化，但产品中钙含量、镁含量、铁、锌、虫草酸、虫草素、SOD酶活力均有不同程度的提升。经检测，本发明所述的虫草菌丝体粉，较申请号为201310124056.3生产的虫草菌丝体粉，产品中钙含量提高15～20％；镁含量提高5～8％；铁含量提高5～7％；锌含量提高6～9％；虫草酸含量提高5～8％；虫草素含量提高6～10％；SOD酶活力提高4～7％。
经功能试验证明，本发明所述的虫草菌丝体粉，较现有技术生产的虫草菌丝体粉具有更加显著的增强机体免疫的效果。
本发明所述的虫草菌丝体粉可与任何一种或一种以上药剂学上辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、木糖醇、葡萄糖、甘露醇等混合制成的各种剂型，例如，可制成片剂、缓释片、粉剂、滴丸、颗粒剂、胶囊剂、微粒剂。优选剂型为胶囊剂或粉剂。
试验例：
下面通过临床试验数据，进一步说明本发明的有益效果：
1材料和方法：参照《保健食品检验与评价技术规范》中增强免疫力功能检验方法与操作规程进行。
1.1试验动物与造模
昆明种SPF级小鼠，雌性，由重庆市实验动物中心提供，体质量为16～18g，放入动物房适应3d后，体质量为18～22g开始造模，腹腔内注射100mg/kg环磷酰胺，1次/d，连续3天。
1.2分组与给药剂量
每个实验分为四组，即实验A组、实验B组、实验C组、空白对照组，每组10只。实验A组为服用本发明实施例1制得的虫草菌丝体粉，实验B组为服用专利申请号为201310124056.3中的实施例1制得的虫草菌丝体粉(其步骤三中酶解骨粉采用以下方法制备：①蒸煮：将动物鲜骨经挑选、清洗等工序，装入蒸煮罐内，蒸煮3次，每次2小时；②研磨：将蒸煮后的净骨，经粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料与添加的水的重量比为1∶1；③生化酶解：将研磨后的骨浆打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶重量比1︰2的复合蛋白酶，复合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加柠檬酸调PH值至5.5，45℃搅拌1h；酶解液加碱中和，灭活，供下道工序使用，喷粉前骨浆在灭菌缸中停留不得超过1小时；④干燥喷粉：当进口温度达到180℃时，打开蓄水罐阀门，当进口温度达到225℃、出口温度达到105℃时，稳定10分钟后关闭水阀门，打开灭菌缸排液阀门，开始喷粉，得酶解骨粉)，实验C组为服用从江西中科生物有限公司购得的虫草菌丝体粉，按照成人一天推荐量2g/60kg计算，相当于0.03g/日/kg体重，实验量设人体推荐量的10倍，即每日0.3g/kgBW。受试物以无菌水配制，每日一次经口给予，连续灌胃30天后测各项指标。空白对照组给予同剂量的生理盐水。
1.3试验方法
1.3.1体重、脏器/体质量比值各组小鼠按规定给药剂量给药，连续灌胃30d后称量，颈椎脱臼处死，解剖动物，取出胸腺和脾脏，用滤纸吸干血迹后称量，计算脏器和体质量之间的比值。
1.3.2脾淋巴细胞转化实验采用同位素掺入法。各组小鼠按规定给药剂量给药，连续灌胃30d后制作各组小鼠脾细胞，做为反应细胞。刺激细胞的制作：无菌制作C57BL/6小鼠脾细胞悬液，用浓度为25mg/L的丝裂霉素C在37摄氏度下处理30min后，离心去上清，再洗2遍后，用含10％小牛血清的RPMI1640恢复到5*109/L,并加入到96孔板中。细胞培养6d后，每孔加3H-TdR使终浓度为18.5*104Bq/孔继续培养6h。收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液闪仪计数每分钟脉冲数。
1.3.3迟发型变态反应实验采用耳肿胀法。各组小鼠按规定给药剂量给药，连续灌胃30d后，于第1、第5天每只小鼠后肢皮内注射7％DNFB丙酮溶液0.02mL进行致敏，于第1次致敏的第8天，用1％DNFB丙酮溶液0.02mL涂布于右耳进行攻击，左耳涂布生理盐水作为对照。次日处死动物，用直径8mm的打孔器分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，称重并计算左右耳重量的差值进行单因素方差分析。
1.3.4抗体生产细胞检测采用Jerne改良玻片法。各组小鼠按规定给药剂量给药，连续灌胃30d后用SRBC致敏，5d后颈椎脱臼处死，取出肝脏制成细胞悬液，在5mlRPMI1640培养液中技术细胞，并将细胞浓度调整为5*106个/ml。将表层培养基加热溶解后，放50℃水浴保温，与等量pH7.2-7.4、2倍浓度的Hank's液视合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加50μl10％SRBC，20μl脾细胞悬液，迅速混匀，倾倒于己刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上.放入二氧化碳培养箱中孵育1-1.5h然后用SA缓冲液稀释的补体加入到玻片架凹槽内，继续温育1-1.5h后，计数溶血空斑数。
1.3.5血清溶血素测定采用测定半数溶血值法。各组小鼠按规定给药剂量给药，连续灌胃30d后用SRBC致敏，5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液稀释。将稀释后的血清1ml置试管内.依次加入10％SRBC0.5ml,补体1ml。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温巧20min后.冰浴终止反应，2000r/min离心10min，取上情液1ml加都氏试剂3ml，同时取10％SRBC0.25ml加都氏试剂至4mL，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值，即为血清半数溶血值(血清HC50)。
1.3.6碳廓清实验各组小鼠按规定给药剂量给药，连续灌胃30d后后小鼠的尾静脉按每10g体质量0.1ml注入浓度为25％墨汁，注射墨汁间隔2、10min，分别从小鼠内毗静脉丛取血20μL，加入到2ml的Na2CO3(w＝0.1％)溶液中。以Na2CO3溶液作空白对照，用722可见分光光度计在600nm下测定吸光度。然后将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称量，算出吞噬指数α。
1.3.7巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验各组小鼠按规定给药剂量给药，连续灌胃30d后，向每只小鼠腹腔注射20％的鸡红细胞悬液lml，30min后，颈椎脱臼处死动物，解剖小鼠腹腔，注入2ml生理盐水，吸取腹腔液制作涂片，用吉姆萨工作液染色15～30min，再用蒸馏水漂洗、晾干，显微镜下计数，计算吞噬指数和吞噬百分率。
1.3.8NK细胞活性测定用MTT法：取处于对数生长期的Yac-1细胞为靶细胞。各组小鼠脾淋巴细胞置培养瓶中贴壁2h去除贴壁的巨噬细胞后为效应细胞，按下式计算杀伤率：
杀伤率(％)＝1-(OD(E+T)-ODE)/ODT
OD(E+T)：指NK+靶细胞孔OD值。ODE：指同一组效应细胞对照孔OD值。ODT：指相应靶细胞对照孔OD值。
2实验结果
2.1对小鼠体质量，脾脏、胸腺指数影响：与空白对照组比较，各实验组小鼠体重增加差异不显著(P＞0.05)；脾脏/体质量与胸腺/体质量中，实验B组、实验C组可显著提高小鼠脾脏或胸腺指数(P＜0.05)，实验A组即本发明组可极其显著提高小鼠脾脏或胸腺指数(P＜0.01)。具体实验数据见表1。
表1对小鼠体质量及脾脏、胸腺质量的影响
注：*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01
2.2对小鼠脾淋巴细胞转化影响：与空白对照组比较，实验B组、实验C组可显著抑制ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖(P＜0.05)，实验A组，即本发明组，可极其显著抑制ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖(P＜0.01)。具体实验数据见表2。
表2对小鼠脾淋巴细胞转化影响
注：*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01
2.3对小鼠迟发型变态反应影响：与空白对照组比较，各实验组小鼠右耳经1％DNFB丙酮溶液攻击后明显肿胀，重量高于左耳，其中实验B组、实验C组左右耳重量的差值明显高于对照组(P＜0.05)，实验A组左右耳重量的差值极其显著高于对照组。具体实验数据见表3。
表3对小鼠迟发型变态反应影响
注：*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01
2.4对小鼠抗体生成细胞影响：与空白对照组比较，实验B组、实验C组小鼠脾抗体形成细胞明显增强(P＜0.05)，实验A组脾抗体形成细胞增强极其显著(P＜0.01)。具体实验数据见表4。
表4对小鼠抗体生成细胞影响
注：*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01
2.5对小鼠血清溶血素影响：与空白对照组比较，各实验均能升高血清HC50，实验A组、实验B组、实验C组均具有显著性(P＜0.05)。具体实验数据见表5。
表5对小鼠血清溶血素影响
注：*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01
2.6对小鼠碳廓清及巨噬细胞吞噬功能影响：与空白对照组比较，实验B组、实验C组可以明显提高小鼠的碳廓清能力(P＜0.05)、能明显提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力(P＜0.05)；实验A组可以极其明显提高小鼠的碳廓清能力(P＜0.01)、能极其明显提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力(P＜0.01)。具体实验数据见表6。
表6对小鼠碳廓清及巨噬细胞吞噬功能影响
注：*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01
2.7对小鼠NK细胞活性影响：与空白对照组比较，实验B组、实验C组能显著提高小鼠NK细胞活性(P＜0.05)，实验A组能极其显著提高小鼠NK细胞活性(P＜0.01)。具体实验数据见表7。
表7对小鼠NK细胞活性影响
注：*与空白对照组比较，P＜0.05；**与空白对照组比较，P＜0.01
3结论
本实验结果表明，本发明技术方案制得的虫草菌丝体粉对细胞免疫、体液免疫、巨噬细胞吞噬功能和NK细胞活性均有极强的促进作用，提示本发明虫草菌丝体粉具有较现有技术更加显著的增强免疫力的功能。发明人对本发明其他的几个实施例也分别进行了上述功效试验，均得到了相似的实验结果，证明本发明技术方案制得的虫草菌丝体粉较现有技术生产的虫草菌丝体粉具有更加显著的增强机体免疫功能的效果。
具体实施方式
实施例1
步骤一：菌种接种恒温培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：麦芽糖2％，鸡蛋蛋白粉5％，KH2PO4 0.3％，硫酸镁0.2％，水余量。将配制好的培养基分装入锥形瓶中，封口后在120℃条件下灭菌20分钟，取出培养基，自然冷却至25℃，在无菌条件下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种，27℃恒温培养8天。
步骤二：种子罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：马铃薯粉20％，葡萄糖3％，乳清浓缩蛋白4％，KH2PO40.2％，硫酸镁0.1％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤一培养好的菌种，接种量8.0％，温度18℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养时间72小时。
步骤三：发酵罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：大豆分离蛋白5％，脱脂奶粉5％，酶解骨粉10％，葡萄糖3％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤二培养好的菌种，接种量3.5％，温度25℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养至培养基还原糖小于0.1％时，放罐收获。
其中酶解骨粉的制备方法为：①蒸煮：将动物鲜骨经挑选、清洗等工序，装入蒸煮罐内，蒸煮3次，每次2小时；②研磨：将蒸煮后的净骨，经粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料与添加的水的重量比为1∶1；③生化酶解：将研磨后的骨浆打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶重量比1︰2的复合蛋白酶，复合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加柠檬酸调PH值至5.5，45℃搅拌1h；酶解液加碱中和，灭活，供下道工序使用，喷粉前骨浆在灭菌缸中停留不得超过1小时；④干燥喷粉：当进口温度达到180℃时，打开蓄水罐阀门，当进口温度达到225℃、出口温度达到105℃时，稳定10分钟后关闭水阀门，打开灭菌缸排液阀门，开始喷粉，得酶解骨粉。
步骤四：超低温真空浓缩
将培养好的虫草菌丝体放入超低温真空浓缩设备，设定工作真空度为-0.08MPa，蒸发温度为30℃，浓缩至产品比重达到1.21g/cm3,结束浓缩。
步骤五：冷冻干燥
将浓缩后的虫草菌丝体以-0.6℃/分钟的降温速度快速冷冻到-30℃，维持2小时后，放入干燥室进行干燥。加热板升温至45℃后，保持9小时，再降温至35℃，保持5小时，全过程保持最高真空度。所得产物水分≤5％，实测值为3.5％。
冷冻干燥后产品，用万能粉碎机进行粉碎，得到粉末状虫草菌丝体。
实施例2
步骤一：菌种接种恒温培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：麦芽糖1.5％，鸡蛋蛋白粉4％，KH2PO40.2％，硫酸镁0.5％，水余量。将配制好的培养基分装入锥形瓶中，封口后在128℃条件下灭菌25分钟，取出培养基，自然冷却至27℃，在无菌条件下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种，30℃恒温培养6天。
步骤二：种子罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：马铃薯粉25％，葡萄糖2％，乳清浓缩蛋白3％，KH2PO40.4％，硫酸镁0.6％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤一培养好的菌种，接种量7.0％，温度20℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养时间72小时。
步骤三：发酵罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：大豆分离蛋白6％，脱脂奶粉8％，酶解骨粉9％，葡萄糖2％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤二培养好的菌种，接种量3.50％，温度22℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养至培养基还原糖小于0.1％时，放罐收获。
其中酶解骨粉的制备方法为：①蒸煮：将动物鲜骨经挑选、清洗等工序，装入蒸煮罐内，蒸煮3次，每次2小时；②研磨：将蒸煮后的净骨，经粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料与添加的水的重量比为1∶1；③生化酶解：将研磨后的骨浆打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶重量比1︰2的复合蛋白酶，复合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加柠檬酸调PH值至5.5，45℃搅拌1h；酶解液加碱中和，灭活，供下道工序使用，喷粉前骨浆在灭菌缸中停留不得超过1小时；④干燥喷粉：当进口温度达到180℃时，打开蓄水罐阀门，当进口温度达到225℃、出口温度达到105℃时，稳定10分钟后关闭水阀门，打开灭菌缸排液阀门，开始喷粉，得酶解骨粉。
步骤四：超低温真空浓缩
将培养好的虫草菌丝体放入超低温真空浓缩设备，设定工作真空度为-0.08MPa，蒸发温度为30℃，浓缩至产品比重达到1.28g/cm3,结束浓缩。
步骤五：冷冻干燥
将浓缩后的虫草菌丝体以-0.6℃/分钟的降温速度快速冷冻到-30℃，维持2小时后，放入干燥室进行干燥。加热板升温至45℃后，保持9小时，再降温至35℃，保持5小时，全过程保持最高真空度。所得产物水分≤5％，实测值为3.8％。
冷冻干燥后产品，用万能粉碎机进行粉碎，得到粉末状虫草菌丝体。
实施例3
步骤一：菌种接种恒温培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：麦芽糖3％，鸡蛋蛋白粉7％，KH2PO4 0.4％，硫酸镁1％，水余量。将配制好的培养基分装入锥形瓶中，封口后在120℃条件下灭菌18分钟，取出培养基，自然冷却至21℃，在无菌条件下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种，19℃恒温培养10天。
步骤二：种子罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：马铃薯粉15％，葡萄糖4％，乳清浓缩蛋白2％，KH2PO40.5％，硫酸镁0.9％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤一培养好的菌种，接种量6.8％，温度22℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养时间72小时。
步骤三：发酵罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：大豆分离蛋白8％，脱脂奶粉4％，酶解骨粉8％，葡萄糖1％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤二培养好的菌种，接种量3.0％，温度26℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养至培养基还原糖小于0.1％时，放罐收获。
其中酶解骨粉的制备方法为：①蒸煮：将动物鲜骨经挑选、清洗等工序，装入蒸煮罐内，蒸煮3次，每次2小时；②研磨：将蒸煮后的净骨，经粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料与添加的水的重量比为1∶1；③生化酶解：将研磨后的骨浆打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶重量比1︰2的复合蛋白酶，复合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加柠檬酸调PH值至5.5，45℃搅拌1h；酶解液加碱中和，灭活，供下道工序使用，喷粉前骨浆在灭菌缸中停留不得超过1小时；④干燥喷粉：当进口温度达到180℃时，打开蓄水罐阀门，当进口温度达到225℃、出口温度达到105℃时，稳定10分钟后关闭水阀门，打开灭菌缸排液阀门，开始喷粉，得酶解骨粉。
步骤四：超低温真空浓缩
将培养好的虫草菌丝体放入超低温真空浓缩设备，设定工作真空度为-0.08MPa，蒸发温度为30℃，浓缩至产品比重达到1.25g/cm3,结束浓缩。
步骤五：冷冻干燥
将浓缩后的虫草菌丝体以-0.6℃/分钟的降温速度快速冷冻到-30℃，维持2小时后，放入干燥室进行干燥。加热板升温至45℃后，保持9小时，再降温至35℃，保持5小时，全过程保持最高真空度。所得产物水分≤5％，实测值为4.0％。
冷冻干燥后产品，用万能粉碎机进行粉碎，得到粉末状虫草菌丝体。
实施例4
步骤一：菌种接种恒温培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：麦芽糖1.8％，鸡蛋蛋白粉4.5％，KH2PO40.4％，硫酸镁1.1％，水余量。将配制好的培养基分装入锥形瓶中，封口后在129℃条件下灭菌26分钟，取出培养基，自然冷却至23℃，在无菌条件下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种，17℃恒温培养9天。
步骤二：种子罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：马铃薯粉24％，葡萄糖2.2％，乳清浓缩蛋白4.8％，KH2PO4 0.2％，硫酸镁1.6％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤一培养好的菌种，接种量6.5％，温度29℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养时间72小时。
步骤三：发酵罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：大豆分离蛋白9％，脱脂奶粉4％，酶解骨粉8％，葡萄糖2.6％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤二培养好的菌种，接种量3.5％，温度23℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养至培养基还原糖小于0.1％时，放罐收获。
其中酶解骨粉的制备方法为：①蒸煮：将动物鲜骨经挑选、清洗等工序，装入蒸煮罐内，蒸煮3次，每次2小时；②研磨：将蒸煮后的净骨，经粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料与添加的水的重量比为1∶1；③生化酶解：将研磨后的骨浆打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶重量比1︰2的复合蛋白酶，复合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加柠檬酸调PH值至5.5，45℃搅拌1h；酶解液加碱中和，灭活，供下道工序使用，喷粉前骨浆在灭菌缸中停留不得超过1小时；④干燥喷粉：当进口温度达到180℃时，打开蓄水罐阀门，当进口温度达到225℃、出口温度达到105℃时，稳定10分钟后关闭水阀门，打开灭菌缸排液阀门，开始喷粉，得酶解骨粉。
步骤四：超低温真空浓缩
将培养好的虫草菌丝体放入超低温真空浓缩设备，设定工作真空度为-0.08MPa，蒸发温度为30℃，浓缩至产品比重达到1.28g/cm3,结束浓缩。
步骤五：冷冻干燥
将浓缩后的虫草菌丝体以-0.6℃/分钟的降温速度快速冷冻到-30℃，维持2小时后，放入干燥室进行干燥。加热板升温至45℃后，保持9小时，再降温至35℃，保持5小时，全过程保持最高真空度。所得产物水分≤5％，实测值为2.9％。
冷冻干燥后产品，用万能粉碎机进行粉碎，得到粉末状虫草菌丝体。
实施例5
步骤一：菌种接种恒温培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：麦芽糖2.5％，鸡蛋蛋白粉2％，KH2PO40.1％，硫酸镁1.2％，水余量。将配制好的培养基分装入锥形瓶中，封口后在130℃条件下灭菌19分钟，取出培养基，自然冷却至21℃，在无菌条件下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种，30℃恒温培养5天。
步骤二：种子罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：马铃薯粉15％，葡萄糖3.4％，乳清浓缩蛋白4.1％，KH2PO4 0.4％，硫酸镁0.7％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤一培养好的菌种，接种量8.0％，温度19℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养时间72小时。
步骤三：发酵罐培养：
配制培养基：其配方组成及重量比为：大豆分离蛋白10％，脱脂奶粉4％，酶解骨粉12％，葡萄糖1.5％，水余量。配制好的培养基进行高温高压灭菌，灭菌条件为：灭菌压力0.1MPa；灭菌温度121℃；灭菌时间30分钟。灭菌后接入步骤二培养好的菌种，接种量3.2％，温度16℃，通气1∶0.5，搅拌速度200转/分钟，培养至培养基还原糖小于0.1％时，放罐收获。
其中酶解骨粉的制备方法为：①蒸煮：将动物鲜骨经挑选、清洗等工序，装入蒸煮罐内，蒸煮3次，每次2小时；②研磨：将蒸煮后的净骨，经粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料与添加的水的重量比为1∶1；③生化酶解：将研磨后的骨浆打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶重量比1︰2的复合蛋白酶，复合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加柠檬酸调PH值至5.5，45℃搅拌1h；酶解液加碱中和，灭活，供下道工序使用，喷粉前骨浆在灭菌缸中停留不得超过1小时；④干燥喷粉：当进口温度达到180℃时，打开蓄水罐阀门，当进口温度达到225℃、出口温度达到105℃时，稳定10分钟后关闭水阀门，打开灭菌缸排液阀门，开始喷粉，得酶解骨粉。
步骤四：超低温真空浓缩
将培养好的虫草菌丝体放入超低温真空浓缩设备，设定工作真空度为-0.08MPa，蒸发温度为30℃，浓缩至产品比重达到1.23g/cm3,结束浓缩。
步骤五：冷冻干燥
将浓缩后的虫草菌丝体以-0.6℃/分钟的降温速度快速冷冻到-30℃，维持2小时后，放入干燥室进行干燥。加热板升温至45℃后，保持9小时，再降温至35℃，保持5小时，全过程保持最高真空度。所得产物水分≤5％，实测值为3.0％。
冷冻干燥后产品，用万能粉碎机进行粉碎，得到粉末状虫草菌丝体。

Claims (10)

1.一种发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，所述的虫草菌丝体粉采用以下方法制备：
(1)菌种接种恒温培养
配制培养基，将配制好的培养基分装入锥形瓶中，封口后在120-130℃条件下灭菌18-30min，冷却至20-30℃，在无菌条件下接入蝙蝠蛾拟青霉菌种，15-30℃恒温培养5-10天；所述的菌种接种恒温培养的培养基组分重量比为：麦芽糖1％-3％，鸡蛋蛋白粉2％-8％，KH2PO4 0.1％-0.5％，硫酸镁0.1％-3％，水余量；
(2)种子罐培养
配制培养基，在压力0.1MPa，温度121℃条件下灭菌30min，灭菌后接入步骤(1)中培养好的菌种，接种量6.5％-8.0％，温度15-30℃，通气1∶0.5，搅拌速度200r/min，培养72h；所述的种子罐培养的培养基组成及重量比为：马铃薯粉15％-30％，葡萄糖1％-4％，乳清浓缩蛋白2％-5％，KH2PO4 0.1％-0.5％，硫酸镁0.1％-3％，水余量；
(3)发酵罐培养
配制培养基，压力0.1MPa，温度121℃条件下灭菌时间30min，灭菌后接入步骤(2)培养好的菌种，接种量3.0％-3.5％，温度15-30℃，通气1∶0.5，搅拌速度200r/min，培养至培养基还原糖小于0.1％时，放罐收获；所述的发酵罐培养的培养基组分重量比为：大豆分离蛋白4％-10％，脱脂奶粉4％-10％，酶解骨粉8％-12％，葡萄糖1％-3％，水余量；所述酶解骨粉的制备方法为：①蒸煮：将动物鲜骨经挑选、清洗等工序，装入蒸煮罐内，蒸煮3次，每次2小时；②研磨：将蒸煮后的净骨，经粗碎、精碎、粗磨、研磨至260目以下，骨料与添加的水的重量比为1∶1；③生化酶解：将研磨后的骨浆打入生化缸，加入木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶重量比1︰2的复合蛋白酶，复合蛋白酶占骨料重量比0.10％，加柠檬酸调PH值至5.5，45℃搅拌1h；酶解液加碱中和，灭活，供下道工序使用，喷粉前骨浆在灭菌缸中停留不得超过1小时；④干燥喷粉：当进口温度达到180℃时，打开蓄水罐阀门，当进口温度达到225℃、出口温度达到105℃时，稳定10分钟后关闭水阀门，打开灭菌缸排液阀门，开始喷粉，得酶解骨粉；
(4)真空浓缩
-0.08MPa，30℃真空浓缩，浓缩至产品比重为1.20-1.30g/cm3；
(5)冷冻干燥
将浓缩后的虫草菌丝体以-0.6℃/min的降温速度快速冷冻到-30℃，维持2小时后，放入干燥室进行干燥，加热板升温至45℃后，保持9小时，再降温至35℃，保持5小时，即得。
2.根据权利要求1所述的发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，在制备该虫草菌丝体粉的步骤(1)中所述的菌种接种恒温培养的培养基组分重量比为：麦芽糖1.5％-2.5％，鸡蛋蛋白粉4％-6％，KH2PO4 0.2％-0.4％，硫酸镁0.5％-2.5％，水余量；优选的，其配方组分重量比为：麦芽糖2％，鸡蛋蛋白粉5％，KH2PO4 0.3％，硫酸镁0.2％，水余量。
3.根据权利要求1所述的发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，在制备该虫草菌丝体粉的步骤(2)中所述的种子罐培养的培养基组成及重量比为：马铃薯粉20％-25％，葡萄糖2％-3％，乳清浓缩蛋白3％-4％，KH2PO4 0.2％-0.4％，硫酸镁0.5％-2.5％；水余量；优选的，其配方组分重量比为：马铃薯粉20％，葡萄糖3％，乳清浓缩蛋白4％，KH2PO4 0.2％，硫酸镁0.1％，水余量。
4.根据权利要求1所述的发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，在制备该虫草菌丝体粉的步骤(3)中所述的发酵罐培养的培养基组分重量比为：大豆分离蛋白5％-8％，脱脂奶粉5％-8％，酶解骨粉9％-11％，葡萄糖2％-3％，水余量；优选的，其配方组分重量比为：大豆分离蛋白5％，脱脂奶粉5％，酶解骨粉10％，葡萄糖3％，水余量。
5.根据权利要求1所述的发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，在制备该虫草菌丝体粉的步骤(1)中所述的菌种接种恒温培养的培养基组分重量比为：麦芽糖2％，鸡蛋蛋白粉5％，KH2PO4 0.3％，硫酸镁0.2％，水余量。
6.根据权利要求1所述的发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，在制备该虫草菌丝体粉的步骤(2)中所述的种子罐培养的培养基组成及重量比为：马铃薯粉20％，葡萄糖3％，乳清浓缩蛋白4％，KH2PO4 0.2％，硫酸镁0.1％，水余量。
7.根据权利要求1所述的发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，在制备该虫草菌丝体粉的步骤(3)中所述的发酵罐培养的培养基组分重量比为：大豆分离蛋白5％，脱脂奶粉5％，酶解骨粉10％，葡萄糖3％，水余量。
8.根据权利要求1-7任一权利要求所述的发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，在制备该虫草菌丝体粉的步骤(2)中所述的接种量为7.0％～7.5％。
9.根据权利要求1-7任一权利要求所述的发酵虫草菌丝体粉，其特征在于，在制备该虫草菌丝体粉的步骤(3)中所述的接种量为3.2％。
10.权利要求1所述的发酵虫草菌丝体粉在制备提高机体免疫功能制剂中的应用。
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