JP4587441B2

JP4587441B2 - 新規な糖尿病治療剤および食品

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Publication number: JP4587441B2
Application number: JP2004035825A
Authority: JP
Inventors: 謙一松永
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 2004-02-12
Filing date: 2004-02-12
Publication date: 2010-11-24
Anticipated expiration: 2024-02-12
Also published as: JP2005225801A; US20050180990A1

Description

本発明は、動物やヒトにおける糖尿病の治療のための糖尿病治療剤および食品に関する。本発明の糖尿病治療剤および食品は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。

糖尿病は、インスリンの作用不足によって高血糖が持続し、さまざまな代謝異常をきたす疾患群のことをいう。近年、糖尿病患者は増加の一途をたどっており、日本国内の患者数は約７４０万人、その予備軍を含めると約１６００万人と推定されている。

糖尿病は、１型糖尿病（インスリン依存型糖尿病）と２型糖尿病（ＮＩＤＤＭ。インスリン非依存型糖尿病）に大別されるが、日本ではその大部分が２型糖尿病を占め、その治療と合併症防止（例えば、糖尿病神経障害、糖尿病網膜症、糖尿病腎症などの防止）が今や重要課題となっている。

糖尿病治療には、一般に食事療法と運動療法が行われるが、良好な血糖管理が得られない場合、経口糖尿病薬剤投与またはインスリン注射が行われる。経口糖尿病薬剤には、（i）膵β細胞に作用してインスリン分泌を促進する薬剤（例えば、スルホニル尿素剤、速効性インスリン分泌促進剤など）、（ii）腸管に作用して糖質の腸管吸収を遅延させる薬剤（例えば、αグルコシダーゼ阻害剤など）、（iii）肝臓・筋肉、脂肪細胞などに作用してインスリン抵抗性を改善させる薬剤（インスリン抵抗性改善薬など）の３種類があり、病態や症状に応じて使用されている。しかしこれら薬剤は、場合によっては低血糖や薬剤感受性低下、臓器障害などを引き起すとされている。そのため新しいタイプの治療用薬剤や予防剤、機能性食品の開発が要望されている。

ところで、きのこ類は多用な生物活性を有することから、古くから日本人の健康に寄与してきた。例えばマツタケ〔Tricholoma matsutake（S. Ito & Imai）Sing.〕については、特公昭５７−１２３０号公報（特許文献１）に、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水または希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、およびエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示され、特許第２７６７５２１号明細書（特許文献２）には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。

さらに、本発明者らにより、マツタケ熱水抽出液、マツタケアルカリ溶液抽出液、あるいはこれら抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分が免疫増強活性を有することが見出されている（国際公開第０１／４９３０８号パンフレット（特許文献３））。本発明者らはまた、マツタケの特定の菌糸体由来の部分精製画分にストレス負荷回復促進作用があることも見出した（特願２００２−１０６６３２号明細書）。

特公昭５７−１２３０号公報特許第２７６７５２１号明細書国際公開第０１／４９３０８号パンフレット

上述のようにマツタケには抗腫瘍活性、免疫増強活性、ストレス負荷回復促進作用などの種々の生理活性が含まれることが見出されている。しかしながら、本発明者の知る限りにおいて、マツタケ、あるいは該マツタケが属するキシメジ属に属する担子菌類が、糖尿病に対して優れた治療効果を有するということについては、これまで報告がされていない。

本発明者は、２型糖尿病のモデルとして病態解析や薬剤評価に用いられている新生児期ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理ラット（ｎＳＴＺラット）を用いて研究を重ねた結果、マツタケ、あるいは該マツタケが属するキシメジ属に属する担子菌類が、このｎＳＴＺラットに対し優れたインスリン分泌促進作用、血糖値上昇抑制効果等を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の課題は、マツタケ等のキシメジ属に属する担子菌類を利用した糖尿病治療剤および食品を提供することにある。

本発明は、マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、糖尿病治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、上記糖尿病治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭＢＰ−７３０４株である、上記糖尿病治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、上記糖尿病治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液である、上記糖尿病治療剤および食品に関する。

また本発明は、第２型糖尿病治療のための、上記糖尿病治療剤および食品に関する。

本発明により、安全で、安定的に大量供給が可能な、糖尿病治療、糖尿病合併症防止（例えば、糖尿病神経障害、糖尿病網膜症、糖尿病腎症などの防止）のための薬剤および食品が提供される。

本発明の糖尿病治療剤および食品に用いられるマツタケ〔Tricholoma matsutake（S. Ito & Imai）Sing.〕は、菌糸体、培養物（Broth）、子実体のいずれの形態のものも用いることができ、生でも乾燥したものでもよい。本発明では子実体は胞子も含むものとする。これら菌糸体、培養物（Broth）、子実体の各抽出物も用いることができる。

本発明では特にマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株が好ましく用いられる。

マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、本出願人によって新規菌株として従前に出願され（国際公開第０２／３０４４０号パンフレット）、独立行政法人産業技術総合研究所（（旧）工業技術院生命工学研究所）に平成１２年９月１４日に寄託されている。このマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、京都府亀岡市で採取したマツタケＣＭ６２７１株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養することにより菌糸体継代株を得たものであり、呉羽化学工業（株）生物医学研究所で維持している。

マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の子実体の形態は、「原色日本新菌類図鑑（１）」（今関六也・本郷次雄編、保育社、昭和３２年発行）プレート（plate）９頁および２６頁に記載のマツタケ子実体に合致するものであった。

マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の継代は、エビオス寒天斜面培地で実施することができる。マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体をエビオス寒天平板培地に接種すると、白色の菌糸が放射状に密に生育し、大きなコロニーを形成する。走査型電子顕微鏡で観察すると、太さ１〜２μｍの枝状の菌糸体が無数に存在し、菌糸体側部に数μｍ程度の突起物が時々みられる。該菌株の菌糸体を大量培養する場合は、液体培地に接種し、静置培養、振盪培養、タンク培養等により行うことができる。

なお、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、もっぱら菌糸体の形状で継代維持または培養することが可能であるが、子実体の形状となることもある。

マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌学的性質は以下のとおりである。
（１）麦芽エキス寒天培地における培養的・形態的性質
白色の菌糸が放射状に密に生育してコロニーを形成する。接種３０日目のコロニー径は約４ｃｍである。

（２）ツアペック寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、およびフェノールオキシダーゼ反応検定用培地における培養的・形態的性質
上記いずれの培地においても、接種後１ヶ月経過しても菌糸の発育はほとんどみられない。

（３）ＹｐＳｓ寒天培地における培養的・形態的性質
白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約５ｍｍである。

（４）グルコース・ドライイースト寒天培地における培養的・形態的性質
白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約２ｍｍである。

（５）最適生育温度および生育範囲
滅菌処理した液体培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス、ｐＨ７．０）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、５〜３５℃の種々の温度でそれぞれ培養し、２８日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定した。その結果、菌体質量は５〜１５℃の範囲で直線的に増加し、１５〜２５℃の範囲で緩やかに増加した。２７．５℃以上ではほとんど増殖しなかった。最適生育温度は１５〜２５℃である。

（６）最適生育ｐＨおよび生育範囲
液体培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス）のｐＨを１モル／Ｌ塩酸または１モル／Ｌ水酸化カリウムで調整し、ｐＨ３．０〜８．０の種々の培地を調製して菌体の生育ｐＨを調べた。すなわち各培地をフィルター滅菌し、培地１０ｍＬを滅菌済１００ｍＬ容三角フラスコに分注した。マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種後、２２℃で培養し、フラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定した。その結果、菌体の生育限界はｐＨ３．０〜７．０、最適生育ｐＨは４．０〜６．０であった。

（７）対峙培養による帯線形成の有無
エビオス寒天平板培地に、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株のブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）と、公知の１３種類のマツタケ株（例えば、ＩＦＯ６９１５株；（財）発酵研究所）の各ブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）とを、約２ｃｍ間隔に対峙して植菌し、２２℃で３週間培養した後、両コロニー境界部に帯線が生じるか否かを判定した。

その結果、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、公知のマツタケ株（１３種類）のいずれの株に対しても明確な帯線を形成しなかった。なお、マツタケでは異株間対峙培養で帯線は生じないとされており、公知のマツタケ株（１３種類）間についても、明確な帯線を形成した組み合わせはなかった。

（８）栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地（「太田培地」。Ohtaら、"Trans. Mycol. Soc. Jpn.", 31, 323-334, 1990)１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、２２℃で培養し、４２日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定したところ、菌体４４１ｍｇが得られた。

上記菌根菌用合成培地中の炭素（Ｃ）源であるグルコースの代わりに、２８種類の糖質関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。その結果、菌体質量が多かった糖質関連物質から菌体質量が少なかった糖質関連物質を順に示せば、以下のとおりである。

小麦デンプン＞トウモロコシデンプン＞デキストリン＞メチルβグルコシド＞セロビオース＞マンノース＞フラクトース＞アラビノース＞ソルビトール＞グルコース＞ラクトース＞グリコーゲン＞マンニトール＞リボース＞マルトース＞トレハロース＞ガラクトース＞ラフィノース＞メリビオース＞Ｎ−アセチルグルコサミン。

なお、セルロース、ダルチトール、シュークロース、キシロース、メチルαグルコシド、イヌリン、イノシトール、およびソルボースでは、菌の発育はほとんどみられなかった。

次に、上記菌根菌用合成培地中の窒素（Ｎ）源である酒石酸アンモニウムの代わりに、１５種類の窒素関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。

その結果、菌体質量が多かった窒素関連物質から菌体質量が少なかった窒素関連物質を順に示せば、以下のとおりである。

コーンスティープリカー＞大豆ペプトン＞ミルクペプトン＞硝酸アンモニウム＞硫酸アンモニウム＞酒石酸アンモニウム＞炭酸アンモニウム＞アスパラギン＞リン酸アンモニウム＞塩化アンモニウム＞硝酸ナトリウム＞肉エキス＞酵母エキス＞カザミノ酸＞クロレラ＞トリプトーン＞硝酸カリウム。

さらに、上記合成培地中のミネラルおよびビタミン類のうち、特定の１成分を除去した培地に、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。

その結果、塩化カルシウム・二水和物、硫酸マンガン（II）・五水和物、硫酸亜鉛・七水和物、硫酸コバルト・七水和物、硫酸銅・五水和物、硫酸ニッケル・六水和物、塩酸アミン、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、塩酸ピリドキシン、塩化カーチニン、アデニン硫酸・二水和物、または塩酸コリンのいずれか１つを培地から除いても、菌体質量にほとんど影響がなかった。

一方、硫酸マグネシウム・七水和物、塩化鉄（II）、またはリン酸二水素カリウムのいずれか１つを培地から除くと、菌体質量は顕著に減少した。すなわち、マグネシウム、鉄、リン、およびカリウムは、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の増殖に必須と考えられる。

（９）ＤＮＡ塩基組成（ＧＣ含量）
ＧＣ含量は４９．９％である。

（１０）ＲＡＰＤ法により生成するＤＮＡパターン
６種類の異なるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction)用プライマー（１０ｍｅｒ）をそれぞれ単独で用いるＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法により生成するＤＮＡパターンについて、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株と、公知の４４種類のマツタケ株（例えば、ＩＦＯ６９１５株；（財）発酵研究所）とを比較したところ、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、公知のマツタケ株（４４種類）のいずれとも異なるＤＮＡパターンを示した。

本発明の糖尿病治療剤および食品は、有効成分として、（i）マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体）の生のものをそのまま、あるいはこれを乾燥粉末としたもの、（ii）マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の熱水抽出液（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体の、熱水抽出液）、（iii）マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株のアルカリ溶液抽出液（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体の、アルカリ溶液抽出液）などを含む態様が好ましく例示されるが、これら例示に限定されるものではない。

本発明では上記（i）の態様が好ましい。

本発明の糖尿病治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物から適当な除去手段（例えば、濾過）により培地を除去しただけの状態で使用することもできるし、あるいは、培地を除去した後の菌糸体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

本発明の糖尿病治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の培養物（Broth）としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物の状態で使用することもできるし、あるいは、前記混合物から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した培養物（Broth）乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記培養物（Broth）乾燥物を粉砕した培養物（Broth）乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

上記培養工程は、特に限定されるものでなく、一般にマツタケ菌を培養する方法を任意に用いることができるが、例えば、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株（「マツタケ菌I」）を固形培地または液体培地で培養または保存してマツタケ菌IIを得る工程、前記マツタケ菌IIを静置液体培養してマツタケ菌IIIを得る工程、前記マツタケ菌IIIを振盪培養してマツタケ菌IVを得る工程、前記マツタケ菌IVを１００Ｌ未満の小型培養装置を用いて、培養液中に通気を行わない攪拌培養してマツタケ菌Vを得る工程、前記マツタケ菌Vを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部攪拌培養してマツタケ菌VIを得る工程、前記マツタケ菌VIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部攪拌培養してマツタケ菌VIIを得る工程、および前記マツタケ菌VIIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養してマツタケ菌VIIIを得る工程、からなる培養方法（特願２００２−３１１８４０号明細書）が、マツタケ菌の生理活性を損うことなく大量生産できるという点から好適に用いられる。

〈マツタケ菌Iを培養または保存してマツタケ菌IIを得る工程〉
用いる培地としては、一般にマツタケ菌を培養する栄養源基質を有する培地であれば特に制限なく使用することができる。例えば、太田培地（Ohtaら、"Trans. Mycol. Soc. Jpn.", 31, 323-334, 1990）、ＭＭＮ培地（Marx, D. H., "Phytopathology", 59:153-163, 1969）、浜田培地（浜田、"マツタケ", 97-100, 1964）等が挙げられるが、これら例示に限定されるものでない。

固形培地用の固形化剤としては、カラギーナン、マンナン、ペクチン、寒天、カードラン、デンプン、アルギン酸等が好適例として挙げられる。これらのうち寒天が好ましい。

使用可能な培地の栄養源基質には、炭素源、窒素源、無機元素源などが挙げられる。

上記炭素源としては、米デンプン、小麦粉デンプン、バレイショデンプン、サツマイモデンプン等のデンプン類；デキストリン、アミロペクシン等の多糖類；マルトース、シュクロース等の少糖類；フラクトース、グルコース等の単糖類などが挙げられる。さらに麦芽エキスを挙げることができる。マツタケ菌の生長速度から、グルコースなどの単糖類が好ましい時期と、デンプン類が好ましい時期とがあるので、時期に応じた炭素源を選択し、必要に応じて組合せて使用する。

上記窒素源としては、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティーブリカー、大豆粉、大豆ペプトンなどの天然由来物質や、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素などが挙げられる。これらは単独で、あるいは組合せて用いることができる。一般に生長速度を考慮すると、天然由来物質、特に酵母エキスが好ましい。

上記無機元素源は、リン酸および微量元素を供給するために使用される。例を挙げると、リン酸塩のほか、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、銅、鉄などの金属イオンの無機塩（例えば、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、等）があり、必要量を培地中に溶解する。

また、培地にビタミンＢ_１などのビタミン類、アミノ酸類を添加することもできる。

さらに、使用するマツタケ菌の性質に応じて、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質などを添加することができる。植物抽出物としては、果菜類、根菜類、葉菜類などの抽出物が例示される。有機酸としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸などが例示される。核酸関連物質としては、市販の核酸、核酸抽出物、酵母、酵母エキスなどが例示される。

固形培地を調製する場合、炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２０〜３０ｇ／Ｌである。

窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌである。さらに他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。また、調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．０、特に好ましくは５．０〜５．５とする。

〈静置液体培養〉
次に、マツタケ菌II（マツタケ菌Iを固形培地または液体培地で培養または保存したマツタケ菌）を静置液体培養してマツタケ菌IIIを製造する方法について記載する。

通常、１００ｍＬ〜２Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。

この静置液体培養は、液体培地にマツタケ菌IIを接種することにより開始する。
接種したマツタケ菌IIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌IIを含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍となる量の液体培地を使用する。

接種したマツタケ菌IIを含有する培養液中のマツタケ菌IIの乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌IIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌IIを含有する培養液を接種する。

該静置液体培養での培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃であり、培養期間は３０〜４００日間が好ましく、より好ましくは１２０〜２４０日間である。培養期間が３０日未満、あるいは４００日超では、大量培養に適した生育能を有するマツタケ菌IIIを得ることが困難となる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）を初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加率」）が、２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点から好ましい。

静置液体培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

静置液体培養に用いる栄養源基質として、マツタケ菌Iを培養する固形培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ_１などのビタミン類、アミノ酸類等を使用することができる。

炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。

リン酸塩を使用する場合は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌになるようにする。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。

調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。

マツタケ菌IIIを含有する静置液体培養による培養液の一部若しくは全部を、マツタケ菌IIを含有する培養液（若しくは培養物）と同様に静置液体培養の接種源として、再度、静置液体培養工程で使用することもできる。

〈振盪培養〉
次いで、マツタケ菌III（マツタケ菌IIを静置液体培養して得られたマツタケ菌）を振盪培養して、マツタケ菌IVを製造する方法について記載する。

通常、３００ｍＬ〜５Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。

この振盪培養は、液体培地にマツタケ菌IIIを接種することにより開始する。
接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。

なお、接種時拡大倍率に見合う培養液の量を確保するために、静置液体培養を複数の培養装置を用いて製造することもできる。

接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液中のマツタケ菌IIIの乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌IIIを含有する培養液を接種する。

振盪培養では、培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃であり、培養期間は７〜５０日間が好ましく、より好ましくは１４〜２８日間である。

振盪培養に要する動力として、通常、三角フラスコ内の培養液単位体積あたりの攪拌所要動力０．０５〜０．４ｋＷ／ｍ^３を用いる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加倍率」）が２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点で好ましい。

振盪培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

振盪培養に用いられる栄養源基質として、マツタケ菌IIを培養する液体培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ_１などのビタミン類、アミノ酸類を使用することができる。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌになるようにする。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。

〈攪拌培養〉
次に、攪拌培養により、マツタケ菌V、マツタケ菌VI、マツタケ菌VII、マツタケ菌VIIIを製造する方法について記載する。

この攪拌培養は、液体培地にマツタケ菌（IV〜VII）を接種することにより開始する。以下の説明において、マツタケ菌IVは、マツタケ菌IIIを振盪培養して得られるマツタケ菌をいい；マツタケ菌Vは、マツタケ菌IVを１００Ｌ未満の小型培養装置を用いて培養液中に通気を行わない撹拌培養を行って得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIは、マツタケ菌Vを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIIは、マツタケ菌VIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIIIは、マツタケ菌VIIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいう。

攪拌培養で用いる液体培地は、次のようにして調製することができる。
栄養源基質は、振盪培養で使用する、炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ_１などのビタミン類、アミノ酸類と同じものを使用することができる。

炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。デンプン類を好ましく使用できる。

攪拌を行う培養液中の浸透圧に影響するグルコースなどの単糖類を併用する場合、その使用量は、好ましくは０．１〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜４０ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．７〜２０ｇ／Ｌである。

窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが唖好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜、添加することができる。

攪拌培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

攪拌培養の培養温度は、１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃とする。

接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。

接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液中のマツタケ菌（IV〜VII）の乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０１〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液を接種する。

攪拌培養で得られるマツタケ菌（V〜VII）を、さらに攪拌培養の母菌として用いる場合の培養日数は、３〜２０日間が好ましく、特には５〜１４日間である。

これらの培養日数後に、マツタケ菌（V〜VII）の乾燥菌糸体含有量が、好ましくは０．５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜８ｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｇ／Ｌになっている培養液は、攪拌培養に適した生育能を有するマツタケ菌（V〜VII）を含有している。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加率」）が２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点で好ましい。

他方、攪拌培養で得られるマツタケ菌（V〜VIII）を、マツタケ菌糸体として分離する場合の培養日数は５〜３０日間であり、好ましくは７〜２０日間、特に好ましくは１０〜１５日間である。

これらの培養日数から、炭素源の資化速度が著しく低下した時を培養終了とするのが好ましいが、適宜、製造サイクル、製造コスト等の製造形態に合せて決定することができる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加倍率」）が３５〜１００倍となるように培養することが、工業的な生産の点で好ましい。

マツタケ菌IVを含有する振盪培養で製造した培養液を、１００Ｌ以上の中型、および大型培養槽などの培養装置による攪拌培養工程で使用することもできる。

攪拌培養に使用する培養装置は、通気攪拌ができ、無菌性が確保できれば特に制限なく使用することが可能で、必要に応じて通気することができ、または通気装置を装着できるものを使用する。したがって、通常の、小型、中型および大型の培養槽、またはジャーファーメンターを使用することができる。

１００Ｌ未満のジャーファーメンターまたは小型培養槽を用いて、マツタケ菌IVの培養を行いマツタケ菌Vを製造する場合、液体培地中に通気せずに、攪拌培養を行うのが好ましい。１００Ｌ未満のジャーファーメンターまたは小型培養槽で通気を行って培養すると、菌糸が凝集し、成長点が欠失して母菌としての生育能が損われる場合があるからである。

また、１００Ｌ以上の中型、および大型培養槽などの培養装置により工業スケールで深部攪拌培養を行う場合、必要に応じて通気を行う。この場合の通気量は０．０５〜１．０ｖｖｍ、特には０．２〜０．５ｖｖｍとするのが好ましい。

攪拌培養における攪拌は、培養初期では培養液単位体積あたりの所要攪拌動力で制御する。通常、０．０１〜２ｋＷ／ｍ^３、好ましくは０．０５〜１ｋＷ／ｍ^３の範囲で攪拌を行うことにより、マツタケ菌糸体が良好に生育する。培養初期を過ぎれば菌が生育を始め、酸素供給量が不足し、さらに、生育した菌糸体の分散が不十分になるので、適宜、攪拌の強度を大きくすることが必要になる。当該深部攪拌では、培養初期には低通気、低撹拌速度で培養し、培養後期には高通気、高攪拌速度で培養するのが好ましい。

深部攪拌培養から得られたマツタケ菌糸体の分離・回収は、常法によって行うことができる。例えば、フィルタープレスなどによる濾過、遠心分離などである。

得られた菌糸体は、例えば蒸留水により充分に洗浄してから、次の熱水抽出工程を実施するのが好ましい。また抽出効率が向上するように、破砕物または粉体の状態に加工するのが好ましい。

本発明の糖尿病治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の子実体としては、例えば、子実体をそのままで、または子実体を破砕した状態で使用することもできるし、あるいは、子実体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した子実体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには、前記子実体乾燥物を粉砕した子実体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

本発明の糖尿病治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の熱水抽出液は、例えば培養により得られるマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体（すなわち培養菌糸体）、培養物（Broth）、または子実体を熱水で抽出することにより得ることができる。

熱水抽出に用いる熱水の温度は、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株に含有される糖尿病治療作用を示す成分が、熱水抽出液中に充分に抽出される温度である限り特に限定されるものではないが、６０〜１００℃程度が好ましく、８０〜９８℃程度がより好ましい。

菌糸体または子実体を熱水抽出に用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物または粉体の状態に加工することが好ましい。

また抽出の際には、抽出効率が向上するように、攪拌または振盪しながら実施するのが好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常１〜６時間程度であり、２〜３時間程度が好ましい。

得られた熱水抽出液は、不要物が混在する状態で、そのまま、本発明の糖尿病治療剤の有効成分として用いることもできるし、あるいは不溶物を除去してから、さらにはそこから抽出液中の低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、本発明の糖尿病治療剤の有効成分として用いることもできる。

本発明の糖尿病治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株のアルカリ抽出液は、例えば、上述したマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の熱水抽出液の製造方法において、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、上記熱水抽出液の製造方法に準じた方法により得ることができる。

アルカリ溶液抽出に用いるアルカリ溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。アルカリ溶液のｐＨは８〜１３が好ましく、９〜１２がより好ましい。アルカリ溶液抽出は０〜３０℃程度で実施するのが好ましく、０〜２５℃程度がより好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体残渣の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、アルカリ溶液のｐＨ若しくは温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常３０分間〜５時間程度であり、１〜３時間程度が好ましい。得られたアルカリ溶液抽出液は、そのまま、あるいは所望により中和処理を実施してから、本発明の糖尿病治療剤および食品に用いる。

本発明の糖尿病治療剤および食品は、有効成分であるマツタケ、特にはマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株、あるいはその抽出物を、単独で、あるいは所望により薬剤学的に許容し得る担体とともに、ヒトや動物に投与することができる。

本発明において「糖尿病治療」とは、動物やヒトなどにおいて、糖尿病発症（病的状態）の治療を意味するが、いわゆる糖尿病予備軍といわれるような、いわば糖尿病の前段階状態が進行して糖尿病の発症を遅延・抑制せしめる効果も含む。また糖尿病合併症の防止効果も含む。したがって、本発明の糖尿病治療剤および食品の投与・摂取時期は、特に限定されるものではないが、日常的に継続投与・摂取するのが好ましい。

本発明における糖尿病治療効果は、糖尿病のタイプを問うものではなく、１型糖尿病、２型糖尿病など、いずれのタイプの糖尿病に対して奏効し得るが、特には２型糖尿病の治療効果に優れる。

本発明の糖尿病治療剤および食品の投与・摂取剤型としては特に限定されるものでなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、座剤、局所投与のクリーム、点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。

経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、または合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法により製造することができる。

非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内など）等が例示される。なかでも注射剤が最も好適に用いられる。

例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、または乳化剤などを任意に用いることができる。

また、本発明の糖尿病治療剤および食品は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の糖尿病治療剤および食品をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植することができる。

本発明の糖尿病治療剤および食品は、これに限定されるものではないが、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株あるいはその抽出物等の有効成分を０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％の量で含有することができる。

本発明の糖尿病治療剤および食品を用いる場合の投与・摂取量は、被投与者の年齢、性別、体重、または投与・摂取方法などに応じて適宜決定することができ、経口的にまた非経口的に投与・摂取することが可能である。

また、投与・摂取形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株あるいはその抽出物等の有効成分を、添加剤（食品添加剤など）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、またはうがい剤等に添加することができる。

なお、上記において、特定保健用食品は、その食品が持つ健康機能の表示が認められる食品（食品ごとに厚生労働省の許可を必要とする）をいい、栄養機能食品は栄養成分の機能を明記できる食品（厚生労働省が作成した規格基準を満たす必要あり）をいい、いわゆる健康食品とは上記保健機能食品以外の食品一般を広く意味するもので、健康補助食品等を含むものである。

次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によってなんら限定されるものでない。

I．被検物質
マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥物粉末（以下「ＣＭ６２７１」とも記す）の調製
マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株菌糸体を、滅菌処理した培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス、ｐＨ６．０）３．５ｔの入った７ｔ容培養タンクに接種し、２５℃で攪拌しながら４週間培養を行った。得られた培養物を濾布濾過し、菌糸体を分離した後、蒸留水で充分に洗浄した。

得られた菌糸体の一部（約１ｋｇ）を−６０℃に凍結した後、凍結乾燥機（MINIFAST MOD. DO. 5；Edwards社）を用いて凍結乾燥することにより、乾燥菌糸体１１０ｇを得た。

この乾燥菌糸体を、ホモブレンダー（Wonder Blender社）を用いて粉砕することにより、乾燥物粉末（ＣＭ６２７１）１００ｇを得た。これをシリカゲル入りの容器に密封し、１８℃で保存した。

II．試薬
糖尿病モデル作成に用いる試薬としてのストレプトゾシン（ＳＴＺ）は、シグマ・ケミカル社（Sigma Chemicals Co.，米国）から購入した。

該ＳＴＺを少量の生理食塩水に混ぜた後、ｐＨ４．５の０．０５モル／Ｌクエン酸緩衝液（５μＬ／ＳＴＺ１００ｍｇ）を加えて溶解し、生理食塩水を加えてＳＴＺ溶液（濃度０．８質量％）を用時調製した。糖尿病モデル作成（下記III．参照）では、該ＳＴＺ溶液調製後、５分間以内にラットに投与した。

III．糖尿病モデル作成
日本クレア（株）から妊娠Wistarラットを購入し、呉羽化学工業（株）生物医学研究所で個別飼育した。すなわち、出産後４８時間以内の新生児期ラットに、上記で調製したＳＴＺ溶液を８０ｍｇ／ｋｇ皮下注射して糖尿病モデルラットを作成した（以下、当該ラットを「ｎＳＴＺラット」と記すこともある）。対照（コントロール）ラットには、ＳＴＺ溶液の代わりに、クエン酸緩衝液を等量皮下注射した。

ｎＳＴＺラットは従来より、２型糖尿病モデルとして病態解析や薬剤評価に用いられている。すなわち、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Streptomyces achromogenes）由来の抗生物質ＳＴＺを新生児期ラットに投与すると、生後３〜４日間にかけて一過性の糖尿病状態になるが、新生児期の膵β細胞がＳＴＺに抵抗性なためその一部は再生し、生後３〜４週目には血糖値は正常近くに回復する。その後、膵β細胞からのグルコース刺激に対する選択的なインスリン分泌不全が認められるようになり、血糖値は徐々に上昇し、生後８週目頃には軽度の空腹時高血糖と明らかな耐糖能の低下を示す。

IV．飼育と群分け
上記処置後のｎＳＴＺラット、対照（コントロール）ラットを親の元に戻して、母乳栄養下で４週間飼育した。

４週目の離乳時に雄ラットを分別し、これら雄ラットに市販の固形飼料ＣＥ−２と水道水を自由に与えて飼育した。

８週齢から１週間、基本食を与えて飼育した。基本食は、下記表１に示す組成（「基本食組成」欄に記載）の飼料である。

〈実験食（ＣＭ６２７１添加飼料）摂取期間〉
続いて９週齢のｎＳＴＺラットと対照（コントロール）ラットを、それぞれ２群ずつに分け、基本食で飼育を続ける群（＝基本食摂取群）と、ＣＭ６２７１添加飼料（実験食）で飼育を続ける群（＝実験食摂取群）とに分け、それぞれ８週間飼育した。ＣＭ６２７１添加飼料（実験食）は、下記表１に示す組成（「実験食組成」）欄に記載）の飼料で、基本食のセルロース成分の代わりにＣＭ６２７１を添加したものである。

表１中、「無機物質」^（＊１）は、炭酸カルシウム３９．２９質量％、リン酸水素カルシウム二水和物０．４３質量％、リン酸二水素カリウム３４．３１質量％、塩化ナトリウム２５．０６質量％、硫酸マグネシウム七水和物９．９８質量％、クエン酸鉄ｎ水和物０．６２３質量％、硫酸銅五水和物０．１５６質量％、硫酸マンガン一水和物０．１２１質量％、塩化亜鉛０．０２質量％、沃化カリウム０．０００５質量％、七モリブデン酸六アンモニウム四水和物０．００２５質量％からなる組成（水分を除く）である。「ビタミン類」^（＊２）含有量（１００飼料あたり）は、塩酸チアミン０．５ｍｇ、リボフラビン０．５ｍｇ、ニコチン酸２．５ｍｇ、パントテン酸カルシウム２．０ｍｇ、塩酸ピリドキシン０．２５ｍｇ、ビタミンＫ０．０５ｍｇ、ビオチン０．０１ｍｇ、葉酸０．０２ｍｇ、ビタミンＢ１２０．００２ｍｇ、イノシトール１０．０ｍｇ、アスコルビン酸５．０ｍｇ、α−トコフェロール１０．０ｍｇ、ビタミンＡ４００１．Ｕ．、ビタミンＤ２００１．Ｕ．である。これら無機物質およびビタミン類の選択と添加量は、「Harpar AE,Amino acide balannce and imbalance I. Dietary level of protein and acid imbalance.J.Nutrition 68:405-418,1959」記載内容に準拠した。

ラットの群分けは、血糖値および体重の群平均がなるべく等しくなるように、１群６匹の２群に分け、各群において動物番号を付けた。余剰動物は群分け終了後試験系より除外した。

本実験で用いたラットは以下の４群（各群ともｎ＝６）である。

（1）対照（コントロール）ラットで、基本食を摂取した群（＝「対象・基本食群」）
（2）対照（コントロール）ラットで、実験食摂取群（＝「対象・実験食群」）
（3）ｎＳＴＺラットで、基本食摂取群（＝「ｎＳＴＺ・基本食群」）
（4）ｎＳＴＺラットで、実験食摂取群（＝「ｎＳＴＺ・実験食群」）。

なお、飼料はオートクレーブ滅菌したものを、飲料水はオートクレーブで処理した水道水をそれぞれ自由摂取させた。

また、ラットは、温度２２±１℃、相対湿度５５±１０％、換気回数１０〜２０回／時、照明時間６〜１８時間に設定したバリアシステムの飼育室にて、金属製ケージ（Ｗ１５×Ｄ３０×Ｈ１７ｃｍ）中で個別飼育した。飼育期間中の温度は２１．５〜２２．５℃、相対湿度は４８〜７１％で推移した。

各ラットの背側尾根部に油性マーカーで個体番号を記入することにより個体を識別した。ケージには投与区分および動物番号を記したカラーラベルを付けて識別した。

V．実験および評価
上記各群のラットを用いて以下の実験および評価を行った。

なお各データ統計学的処理は、スチューデント・ティー・テスト（Student t-test）を用い、有意水準は５％未満（ｐ＜０．０５）とした。

［一般状態観察、体重測定、飼料摂取量、および飲水量］
一般状態は、１日１回観察し、体重を投与開始日および最終投与日を含み週１回測定した。実験食摂取期間の体重、飼料摂取量、および飲水量は毎週２回測定した。

実験食摂取期間中のラットの体重、体重増加量、飼料摂取量、および飲水量の結果を表２および図１−１、図１−２に示す。なお表２中の数字は平均±ＳＤ（標準偏差）を示す。「摂餌量」^（＊）、「飲水量」^（＊）は、それぞれ、１７週齢時、３日間測定の平均値である。

表２および図１−１、図１−２の結果から明らかなように、基本食群と実験食群との間で体重増加量、飼料摂取量、および飲水量に大きな違いはなく、有意差はなかった。

［空腹時血糖値の測定試験］
実験食投与の直前（９週齢）、投与後３週目および６週目にラットを５時間絶食させた後、無麻酔下で尾静脈よりヘパリン含有ヘマトクリット毛細管を用いて採血した。次いで、ヘマトクリット遠心機で分離し、血漿中のグルコース濃度（血糖値）を測定した。

各群のグルコース濃度（血糖値）を表３および図２に示す。なお表３中の数字は平均±ＳＤを示す。

表３および図２の結果から明らかなように、対照・基本食群と対照・実験食群との間に血糖値の有意な変化は観察されず、ＳＴＺ非処置動物の血糖値に対する実験食の影響は少ないと考えられた。

一方、ｎＳＴＺ処置動物においては、実験前の血糖値は両群とも非処置動物に比べ高かった。ｎＳＴＺ・基本食群では、実験開始３週および６週後でも血糖は高値を維持したが、ｎＳＴＺ・実験食群では血糖値は低下し、両群間に有意差がみられた。すなわち実験食（ＣＭ６２７１添加食）はｎＳＴＺ処置動物の血糖値を抑制することが示唆された。

［耐糖能試験］
実験食投与後４週目（＝１３週齢）にラットを２０時間絶食させた後、無麻酔下で１ｇ／ｋｇのグルコースを経口投与した。グルコース投与前、および投与６０分後、１２０分間後に、ヘパリン含有ヘマトクリット毛細管を用いて尾静脈より採血した。ヘマトクリット遠心機で分離し、血漿中のグルコース濃度を測定した。結果を表４および図３に示す。なお表４中の数字は平均±ＳＤを示す。

表４および図３に示す結果から明らかなように、グルコース負荷により、対照・基本食群の血糖値は３０分後にピークに達し、その後緩やかに低下した。対照・実験食群でも同様の傾向を示した。

一方、ｎＳＴＺ・基本食群では、グルコース負荷により、３０分後の値は対照・基本食群に比べ有意に高く、１２０分後でも有意差が認められた。またｎＳＴＺ・実験食群では、グルコース負荷後の血糖値は３０分および１２０分後ともにｎＳＴＺ・基本食群に比べて有意に低かった。

［実験食負荷後の血糖値およびインスリン値の測定試験］
実験終了前に、ラットを２０時間絶食させた後、２ｇ／ｋｇの糖質に相当するそれぞれの実験食を３０分間摂取させ、実験終了まで再び絶食させた。実験食摂取前および摂取後３０分間、６０分間、１２０分間の時、ヘパリン含有ヘマトクリット毛細管を用いて尾静脈より採血した。ヘマトクリット遠心機で分離し、血漿中のグルコース濃度およびインスリン濃度を測定した。

なお血糖グルコースは、グルコースオキシダーゼ法（「ＴＯＡグルコース分析計ＧＬＵ−１２」、東亜電波工業（株）製）、血漿インスリンは、酵素免疫測定法（グラザイムInsulin-EIA Test；和光純薬）を用いて測定した。

実験結果を表５および図４に示す。なお表５中の数字は平均±ＳＤを示す。

表５および図４に示す結果から明らかなように、対照・基本食群の血糖値は、実験食負荷６０分後にピークに達し、その後緩やかに低下した。対照・実験食群でも同様の傾向を示した。

一方、ｎＳＴＺ・基本食群では、負荷６０分後の値は対照・基本食群に比べ有意に高く、１２０分後でも有意差が認められた。またｎＳＴＺ・実験食群では、負荷後の血糖値は、ｎＳＴＺ・基本食群に比べて有意に低かった。

血漿インスリン値の結果について表６および図５に示す。なお表６中の数字は平均±ＳＤを示す。

表６および図５の結果から明らかなように、対照・基本食群の血漿インスリン値は、負荷３０分後にピークに達し、その後緩やかに低下した。対照・実験食群でも同様の傾向を示した。

一方、ｎＳＴＺ・基本食群では、負荷３０分後の値は対照・基本食群に比べ有意に低く、６０分後でも有意差が認められた。またｎＳＴＺ・実験食群では、負荷後３０分および１２０分後のインスリン値は、ｎＳＴＺ・基本食群に比べて有意に高かった。

以上の成績から、ｎＳＴＺラットにおいて、膵β細胞の機能異常は、マツタケ菌糸体製剤ＣＭ６２７１の投与により改善された結果インスリンの分泌反応が回復し、血糖値の改善をもたらしたと推察される。

VI．まとめ
上記実験結果から明らかなように、実験群では、対照群に比し、空腹時高血糖の低下、グルコース負荷時の耐糖能の改善、食後の血糖の上昇抑制、およびインスリン分泌量の増加が認められた。一方、体重増加量、飼料摂取量および飲水量は両群間で有意差はなかった。これによりＣＭ６２７１添加飼料はｎＳＴＺラットの症状を改善することが示唆され

実施例における実験食摂取期間の体重変化を示すグラフである。実施例における実験食摂取期間の摂餌量と飲水量を示すグラフである。実施例における空腹時血糖値の測定結果を示すグラフである。実施例におけるグルコース負荷後の血糖値の測定結果を示すグラフである。実施例における実験食負荷後の血糖値の測定結果を示すグラフである。実施例における実験食負荷後のインスリン値の測定結果を示すグラフである。

Claims

マツタケ（Tricholoma matsutake）ＦＥＲＭＢＰ−７３０４株またはその抽出物を含む、２型糖尿病治療剤。
マツタケ（T. matsutake）ＦＥＲＭＢＰ−７３０４株が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項１記載の２型糖尿病治療剤。
マツタケ（T. matsutake）ＦＥＲＭＢＰ−７３０４株が菌糸体の乾燥粉末である、請求項１または２記載の２型糖尿病治療剤。
マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の抽出物が菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の２型糖尿病治療剤。