KR20160143100A - 바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조방법 - Google Patents

바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 모리 균주를 이용한 고상 배양물의 제조방법을 통해 1-데옥시노지리마이신을 함유하는 고상 배양물을 고효율 저비용으로 대량 생산할 수 있으며, 본 발명의 고상 배양물은 비만, 당뇨, 지질 관련 대사성 질환 또는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조방법{METHOD FOR PREPARING SOLID CULTURE USING BACILLUS SUBTILIS MORI}
본 발명은 바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 바실러스 서브틸리스 모리를 이용하여 1-데옥시노지리마이신을 다량 함유하는 고상 배양물을 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 고상 배양물에 관한 것이다.
1-데옥시노지리마이신(1-deoxynojirimycin, DNJ)은 6탄당 단환(monocycle) 구조를 갖는 피페리딘 계열의 대표적인 물질로서(Asano et al., Tetrahedron 11: 1645-1680, 2000), 당 분자 내에 수 개의 수산기를 포함하고 산소가 질소로 치환 되어 있는 구조적 특징을 갖는 알카로이드 물질이다. 이 물질은 포유동물의 소화기 내에서 전분, 올리고당 및 말토스를 분해하여 이들을 혈액으로 흡수시키는 α-글루코시다제(α-glucosidase)의 활성을 억제하여 식후에 혈당이 급격하게 상승하는 것을 방지한다. 특히, 1-데옥시노지리마이신은 포유동물의 소장에 존재하는 α-글루코시다제에 대한 저해능이 우수하여 소장에서 혈액으로의 포도당 유입을 억제함으로써 오래전부터 식후 고혈당증을 유발하는 인슐린 비의존형 당뇨병의 치료제로 주목받아 왔다. 또한, 1-데옥시노지리마이신의 항바이러스, 항암 및 암전이 억제효과가 밝혀지면서 이를 이용한 다양한 의약품들의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
1-데옥시노지리마이신을 생산하는 방법으로서 식물에서 추출하는 방법이 가장 활발하게 연구되어 왔으나, 상기 방법은 추출되는 1-데옥시노지리마이신의 생산량 부족, 복잡한 정제과정 등의 문제점으로 인해 경제성이 떨어지며 산업적으로 이용하기 어렵다.
이에, 경제적인 측면에서 미생물 발효를 이용한 생산 방법이 가장 주목 받고 있다(Murao and Miyata, Agric . Biol . Chem, 44, 291-221, 1980; Ezure 등, Agric. Biol Chem, 19, 2159~2165, 1985; Hardick 등, Tetrahedron, 30, 6285~6296, 1992). 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 미생물로 알려진 것으로는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리큐파시엔스(Bacillus amyloliquifaciens), 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa), 바실러스 서브틸리스 바 나이거(Bacillus subtilis var niger), 스트렙토마이세스 라벤둘레(Streptomyces lavendulae), 스트렙토마이세스 서브루틸러스(Streptomyces subrutilus) 등이 있다. 하지만, 미생물 생산방법은 추출되는 1-데옥시노지리마이신의 생산량이 상업화하기에 부족한 문제를 가지고 있다.
본 발명자들은 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 신규 미생물을 동정하였고, 이를 바실러스 서브틸리스 모리로 명명하여 2002년 12월 02일 자로 한국미생물보존센터에 기탁한바 있다(대한민국 특허 제0477039호 참고). 상기 바실러스 서브틸리스 모리는 혈당 강하 및 항바이러스 효과를 나타낸다. 하지만 상기 문헌은 1-데옥시노지리마이신의 생성을 극대화할 수 있는 최적의 배양조건에 대해서는 개시하고 있지 않다.
이에 본 발명자들은, 바실러스 서브틸리스 모리로부터 다량의 1-데옥시노지리마이신을 생산할 수 있는 방법에 대해 연구하던 중, 바실러스 서브틸리스 모리를 대두피 및 옥수수 전분을 포함하는 고상 배지에서 배양하여 수득한 고상 배양물이 사료첨가제, 건강기능식품, 의약품 등에 사용될 수 있는 우수한 효과를 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허 제0477039호
Asano et al, Tetrahedron 11: 1645-1680, 2000 Murao and Miyata, Agric. Biol. Chem, 44, 291-221, 1980 Ezure 등, Agric. Biol Chem, 19, 2159~2165, 1985 Hardick 등, Tetrahedron, 30, 6285~6296, 1992
따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 서브틸리스 모리를 이용하여 1-데옥시노지리마이신을 다량으로 함유하는 고상 배양물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법에 따라 제조된 고상 배양물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 바실러스 서브틸리스 모리 균주(KCCM-10450)를 액상 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 얻어진 액상 배양물을 30 내지 60 중량%의 대두피 및 0 내지 10 중량%의 옥수수 전분을 포함하는 고상 배지에 접종하여 고상 배양하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 얻어진 고상 배양물을 건조 및 분쇄하는 단계를 포함하는, 바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조방법을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 바실러스 서브틸리스 모리의 고상 배양물을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 고상 배양물은 고농도의 1-데옥시노지리마이신을 함유하는바, 비만, 당뇨, 지질 관련 대사성 질환 또는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 고상 배양물은 주원료로서 저렴한 대두피를 사용함으로써 공정이 간편하며 제조원가가 저렴하다.
도 1은 본 발명의 일 실시양태에 따른 바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조공정을 나타낸 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시양태에 따른 바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조공정을 나타낸 단계별 사진이다.
도 3은 실시예 4의 고상 배양물 내에 존재하는 데옥시노지리마이신 함량을 HPLC에 의해 분석한 크로마토그램이다.
도 4는 고상 배양물의 처리 농도별 소 바이러스성 설사병 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 고상 배양물의 소 유행열 바이러스 및 모기매개성 아이노 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 비교한 그래프이다.
이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 1) 바실러스 서브틸리스 모리 균주를 액상 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)에서 얻어진 액상 배양물을 30 내지 60 중량%의 대두피 및 0 내지 10 중량%의 옥수수 전분을 포함하는 고상 배지에 접종하여 고상 배양하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)에서 얻어진 고상 배양물을 건조 및 분쇄하는 단계를 포함하는, 바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 고상 배양물의 제조방법을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 고상 배양물은 대한민국 특허 제0477039호에 개시된 바실러스 서브틸리스 모리를 이용하여 제조된다. 바실러스 서브틸리스 모리는 돼지 소장의 α-글루코시다아제(α-glucosidase)로부터 분리 및 동정한 바실러스 속의 균주로서, 벨벳형태의 그람양성 간균이며 운동성이 있고 포자 형성능이 있다. 또한, 바실러스 서브틸리스 모리는 혈당강하 및 항바이러스 활성을 갖는 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 것으로 알려져 있으며, 2002년 12월 02일 자로 한국미생물보존센터에 기탁되어 있다(기탁번호: KCCM-10450).
<단계 1> 액상 배양 단계
본 발명에 따른 제조방법의 단계 1은 바실러스 서브틸리스 모리(Bacillus subtilis MORI) 균주를 액상 배양(종균 배양)하는 단계이다. 상기 액상 배양에 앞서, 바실러스 서브틸리스 모리 균주는 한천 배지에서 순수 배양될 수 있다. 상기 액상 배양은 상이한 액상 배지에서 수행될 수 있으며, 1차 액상 배양 및 2차 액상 배양으로 총 2회에 걸쳐 수행될 수 있다.
상기 바실러스 서브틸리스 모리 균주를 배양하기 위한 액상 배지로는 바실러스균을 배양하는데 통상적으로 사용되는 배지라면 어느 것이든 사용가능하며, 배지 총 중량을 기준으로 0 내지 7 중량%의 포도당, 0 내지 5 중량%의 효모추출물, 0 내지 5 중량%의 옥수수 액침(CSL; Corn Steep Liquor), 0 내지 0.5 중량%의 제이인산칼륨, 0 내지 0.2 중량%의 황산마그네슘 및 0 내지 0.2 중량%의 황산아연을 포함할 수 있다.
상기 액상 배지의 성분 중 하나인 포도당은 탄소공급원으로서 사용되며, 글리세롤, 아도니톨, N-아세틸-D-글루코사민, 당밀, 프럭토올리고당, 전분, 그 가수분해물 등으로 대체될 수 있다. 또한, 상기 액상 배지의 성분 중 하나인 효모추출물 또는 옥수수액침은 질소공급원으로서 사용되며, 카제인, 카시톤, 소이톤, 육즙추출물, 펩톤, 폴리펩톤, 트립톤, 맥아추출물 등으로 대체될 수 있다. 상기 액상 배지의 성분 중 제이인산칼륨, 황산마그네슘 및 황산아연은 미네랄 공급원으로서 사용되며, 이는 염화망간, 염화구리, 염화코발트, 염화니켈, 염화몰리브덴산, 염화철, 염화아연 등으로 대체될 수 있다. 이외에도 액상 배지는 성장요소로서 모든 비타민 B 복합체, 비타민 C, 비오틴, 폴산, 콜린, 이노시톨, 비타민 L, 비타민 P 등의 수용성 비타민 및 비타민 A, D, E, F, K, U 등의 지용성 비타민을 추가로 포함할 수 있다. 시판중인 액상 배지의 예로는 TSB 배지(BD사), Nutrient 배지(BD사) 및 YM 배지(BD사) 등이 있으며, 바람직하게는 TSB 배지가 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 바실러스 서브틸리스 모리 균주는 TSB 배지에 105 내지 109 cfu/㎖의 농도로 접종된 후, 30 내지 40℃의 온도에서 1 내지 5일간, 바람직하게는 37℃의 온도에서 1일간 플라스크 또는 발효조에서 배양될 수 있다.
<단계 2> 고상 배양 단계
본 발명에 따른 제조방법의 단계 2는 상기 단계 1)에서 얻어진 액상 배양물을 고상 배지에 접종하여 고상 배양하는 단계이다. 본원에서, '고상 배양'이란 일반적인 액체 상태가 아닌 곡물, 톱밥, 솜, 볏짚 등 물에는 녹지 않는 고상의 재료를 이용하여 종균 및 미생물을 효율적으로 발효하는 배양법을 지칭한다. 상기 방법은 수분활성도가 낮기 때문에 세균에 의한 오염도가 적다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 모리 균주를 고상 배양하기 위한 배지는 배지 총 중량을 기준으로 30 내지 60 중량%의 대두피 및 0 내지 10 중량%의 옥수수 전분을 포함할 수 있다. 상기 대두피는 배지 총 중량을 기준으로 바람직하게는 35 내지 50 중량%, 더욱 바람직하게는 35 내지 40 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 또한, 상기 옥수수 전분은 배지 총 중량을 기준으로 바람직하게는 0 내지 5 중량%, 더욱 바람직하게는 1.6 내지 4.0 중량%, 가장 바람직하게는 2.4 중량%의 양으로 포함될 수 있다.
상기 고상 배지는 30 내지 70 중량%의 최종 수분 농도를 가질 수 있다. 상기 수분 농도 범위 내에서 균주의 증식 및 효소생산이 원활하고, 공기공급 저하 및 오염균 증식의 가능성을 최소화할 수 있다.
고상 배양을 위한 종균은 수분량을 가감하여 1 내지 60 중량%의 양으로 접종될 수 있으며, 바람직하게는 2 중량%로 접종될 수 있다.
상기 고상 배양 단계를 통해 공정 시간을 단축할 수 있으며, 고농도의 1-데옥시노지리마이신의 효율적인 생산이 가능하다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 단계 2의 고상 배양은 상기 단계 1에서 수득한 바실러스 서브틸리스 모리 균주의 액상 배양물 50 mL을 188 g의 대두피, 12 g의 옥수수 전분 및 250 mL의 물로 구성된 배지에 접종한 후, 30 내지 40℃의 온도에서 3 내지 7일간, 바람직하게는 37℃의 온도에서 5일간 고상 배양함으로써 수행될 수 있다.
<단계 3> 건조 및 분쇄단계
본 발명에 따른 제조방법의 단계 3은 상기 단계에서 얻어진 고상 배양물을 건조 및 분쇄하는 단계이다.
상기에서 제조된 고상 배양물은 통상적인 건조 방식인 동결 건조, 열풍 건조, 진공 건조 및 분무 건조 등의 방법으로 건조될 수 있으며, 바람직하게는 열풍 건조를 통해 건조될 수 있다. 상기 건조 과정을 통해 원하는 바실러스 서브틸리스 모리의 고상 배양물이 수득될 수 있으며, 이후, 수득된 고상 배양물은 다양한 입자 크기로 분쇄되어 분말화될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 제조방법에 따라 제조된 바실러스 서브틸리스 모리의 고상 배양물을 제공한다.
상기 고상 배양물은 1-데옥시노지리마이신을 고농도로 함유하고 있어, 각종 사료첨가제, 식품조성물 또는 비만, 당뇨, 지질 관련 대사성 질환 또는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서 이용될 수 있다.
상기 사료첨가제는 가축의 질병 예방, 산란율 증대, 사료 효율 개선, 산자 활력 증대, 발정 재귀율 개선, MSY(모돈 한 마리당 1년간 생산된 돼지 중 출하체중이 될 때까지 생존하여 판매된 마릿수) 개선 및 가축 성장 촉진 등을 통해 가축 생산성을 증진시킬 수 있으며, 양계, 양돈 및 축우용으로 적용가능하다.
본 발명에 따른 고상 배양물은 자체로도 바실러스 균 생균수 및 항바이러스 효능 물질이 함유되어 있어 상기 사료첨가제에 5 내지 100 중량%, 바람직하게는 10 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 또한, 상기 고상 배양물은 강피류 미강, 탈지박, 배아박, 주정박, 엿박 등 사료첨가제에 통상적으로 사용되는 부형제와 혼합하여 사용될 수 있으며, 보조 사료 생균제 등 기존 사료첨가제 제품에 하나의 원료로서 혼합될 수 있다.
상기 사료첨가제는 사료의 총 중량을 기준으로 0.1 내지 0.3중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량%의 양으로 사료와 혼합되어 양계, 양돈 및 축우에 급여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 고상 배양물은 식품조성물로 이용될 수 있다. 상기 식품조성물은 비만 개선, 혈당 저하를 통한 당뇨병 질환의 예방, 병원성 바이러스의 감염 억제 또는 암 또는 암전이 억제를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가되어 기능성 식품 또는 건강보조식품으로 제공될 수 있으며, 이러한 경우 상기 식품조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 혼합하여 사용될 수 있다. 유효성분인 고상 배양물의 혼합량은 그의 사용목적, 즉 예방, 건강증진 또는 치료적 처치에 따라 적절하게 결정될 수 있으며, 5 내지 95 중량%, 바람직하게는 10 중량%의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 식품조성물이 적용될 수 있는 식품의 종류에 특별한 제한은 없으며, 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 아이스크림류를 포함하는 낙농 제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 예로 들 수 있고, 통상적인 의미에서의 기능성 식품 및 건강보조식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품조성물은 유효성분으로서 고상 배양물을 지시된 비율로 함유하는 것 이외에는 여러 가지 영양제, 탄수화물, 비타민, 미네랄, 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 필요에 따라 선택적으로 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 두 가지 이상의 성분이 혼합되어 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 고상 배양물은 비만, 당뇨, 지질 관련 대사성 질환 또는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물로 이용될 수 있다. 상기 지질 관련 대사성 질환은 지방간, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 심혈관 질환, 동맥경화증 또는 지질 관련 대사 증후군일 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 담체, 부형제 및/또는 희석제를 포함할 수 있으며, 이러한 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 유효성분인 고상 배양물의 혼합량은 그의 사용목적, 즉 예방, 건강증진 또는 치료적 처치에 따라 적절하게 결정될 수 있으며, 5 내지 95 중량%, 바람직하게는 10 중량%의 양으로 포함될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 칼슘카보네이트, 전분, 수크로오스, 락토스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 사용될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 상기 좌제로는 위텝솔(witepsol), 마이크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
이하, 실시예 및 비교예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.　하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로써, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 대두피 함유 고상 배지를 이용한 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물 제조
바실러스 서브틸리스 모리 균주를 YM 한천 배지(BD, 미국)에서 37℃에서 1일간 배양하였다. 그 후, YM 한천 배지에서 자란 콜로니를 100 mL의 TSB 배지(tryptic soy broth; BD, 미국)에 107 cfu/mL의 농도로 접종하여 37℃에서 1일간 액상 배양하였다. 한편, 대두피 200 g을 250 ml의 물에 용해시켜 배지 용액을 만든 후, 이를 121℃에서 15분간 멸균하고 40℃ 이하로 냉각시켜 고상 배양을 위한 배지를 제조하였다. 상기 고상 배지에 TSB 배양액 50 mL를 접종한 후 37℃에서 5일간 고상 배양하였다. 이후, 상기 고상 배양물을 60℃에서 1일간 열풍건조한 후 분쇄하여 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물을 제조하였다.
실시예 2: 대두피 및 옥수수 전분(0.8 중량%) 함유 고상 배지를 이용한 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물 제조
상기 실시예 1에서 대두피 200 g 대신 대두피 196 g과 옥수수 전분 4 g을 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양물을 제조하였다.
실시예 3: 대두피 및 옥수수 전분(1.6 중량%) 함유 고상 배지를 이용한 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물 제조
상기 실시예 1에서 대두피 200 g 대신 대두피 192 g과 옥수수 전분 8 g을 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양물을 제조하였다.
실시예 4: 대두피 및 옥수수 전분(2.4 중량%) 함유 고상 배지를 이용한 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물 제조
상기 실시예 1에서 대두피 200 g 대신 대두피 188 g과 옥수수 전분 12 g을 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양물을 제조하였다.
실시예 5: 대두피 및 옥수수 전분(3.2 중량%) 함유 고상 배지를 이용한 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물 제조
상기 실시예 1에서 대두피 200 g 대신 대두피 184 g과 옥수수 전분 16 g을 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양물을 제조하였다.
실시예 6: 대두피 및 옥수수 전분(4.0 중량%) 함유 고상 배지를 이용한 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물 제조
상기 실시예 1에서 대두피 200 g 대신 대두피 180 g과 옥수수 전분 20 g을 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양물을 제조하였다.
비교예 1: 대두피 및 탈지 대두분 함유 고상 배지를 이용한 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물 제조
상기 실시예 1에서 대두피 200 g 대신 대두피 196 g과 탈지 대두분 4 g을 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양물을 제조하였다.
비교예 2: 대두피 및 진피 함유 고상 배지를 이용한 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물 제조
상기 실시예 1에서 대두피 200 g 대신 대두피 196 g과 진피(귤껍질) 4 g을 첨가한 것을 제외하고는 동일한 방식으로 배양물을 제조하였다.
시험예 1: 고상 배지 성분에 따른 배양물의 알파글루코시다아제 저해능 분석
실시예 1, 2 및 비교예 1, 2의 배양물을 0.1 M 인산칼륨버퍼(pH 6.8)를 이용하여 100배 내지 50,000,000배로 희석한 후, 문헌(조용석 등, 한국미생물생명공학회, 37(11), 1401~1407, 2008)에 기재된 방법을 참조하여 알파글루코시다아제(α-glucosidase) 저해능 시험을 실시하였다. 상기 저해능은 GIU(α-glucosidase inhibitory unit)/㎖로 나타내었고, 50% 저해 농도를 IC50으로 나타내었다. 상기 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
배양물 배양조건 배지성분 GIU/㎖ IC50 (㎍/㎖)
실시예 1 액상 및 고상 배양 대두피 118,162 8.4
실시예 2 대두피 및 옥수수전분 145,783 6.9
비교예 1 대두피 및 탈지대두분 69,285 14.4
비교예 2 대두피 및
진피		 89,444 11.2
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 대두피만이 함유된 고상 배지에서 배양된 실시예 1의 배양물, 및 대두피와 옥수수 전분이 함유된 고상 배지에서 배양된 실시예 2의 배양물이 대두피와 탈지대두분이 함유된 고상 배지에서 배양된 비교예 1의 배양물 및 대두피와 진피가 함유된 고상 배지에서 배양된 비교예 2의 배양물에 비해 상대적으로 우수한 알파글루코시다아제 저해능을 나타내었다.
시험예 2: 고상 배지 내 옥수수 전분의 함량에 따른 배양물의 알파글루코시다아제 저해능 분석
실시예 1 내지 6의 배양물을 0.1 M 인산칼륨버퍼(pH 6.8)를 이용하여 100배 내지 50,000,000배로 희석한 후, 시험예 1과 동일한 방법으로 알파글루코시다아제 저해능 시험을 실시하였다. 또한, 배양물 내의 1-데옥시노지리마이신(DNJ)의 함량을 형광검출기를 장착한 HPLC를 이용하여 분석하였다((Kim 등. Chromatography, 1002: 93-99, 2003; 조용석 등, 한국미생물생명공학회, 37(11), 1401~1407, 2008). 상기 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
배양물 배지성분 GIU/㎖ IC50 (㎍/㎖) DNJ (g/kg)
실시예 1 대두피 118,162 8.4 1.7
실시예 2 대두피 및 옥수수전분(0.8 중량%)
 145,783 6.9 2.1
실시예 3 대두피 및
옥수수전분(1.6 중량%)		 165,829 6.0 2.4
실시예 4 대두피 및
옥수수전분(2.4 중량%)		 217,127 4.7 3.0
실시예 5 대두피 및
옥수수전분(3.2 중량%)		 195,120 5.1 2.7
실시예 6 대두피 및
옥수수전분(4.0 중량%)		 175,200 5.7 2.5
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 대두피만이 함유된 고상 배지에 비해 대두피와 옥수수 전분이 함유된 고상 배지에서 배양된 바실러스 서브틸리스 모리의 배양물이 우수한 알파글루코시다아제 저해능을 나타내었다.
옥수수 전분 2.4 중량%까지는 옥수수 전분의 함량이 증가할수록 알파글루코시다아제 저해능이 증가하였으나, 2.4 중량%를 초과하는 경우에는 옥수수 전분의 함량이 증가할수록 오히려 알파글루코시다아제 저해능이 감소하는 추세를 나타내었다.
특히, 대두피와 2.4 중량% 옥수수 전분이 함유된 고상 배지에서 배양된 실시예 4의 배양물이 가장 높은 알파글루코시다아제 저해능을 나타내었는데, 상기 실시예 4의 배양물은 대두분만이 함유된 고상 배지에서 배양된 실시예 1의 배양물보다 알파글루코시다아제 저해능이 1.8배 높았고, DNJ의 농도도 가장 높은 것으로 나타났다.
실시예 4의 배양물을 3회 이상 반복적으로 제조하여 HPLC로 분석한 결과, 배양물 내에 평균 3.8 g/kg의 DNJ가 존재하는 것으로 확인되었다(도 3).
시험예 3: 바실러스 서브틸리스 모리 고상 배양물의 항비만 및 항당뇨 효과 검증
상기 실시예 4에서 제조된 고상 배양물의 비만 및 당뇨 개선 효과를 검증하기 위하여 고지방식이 랫트 시험을 실시하였다.
3주령 수컷 SD(Sprague-Dawley) 랫트 24마리를 코아텍(한국)으로부터 입수하여 폴리프로필렌 우리에서 22±2℃ 온도 조건 하에 12시간 주야 주기로 1주 동안 순화시켰다. 이후, 상기 랫트를 정상사료(퓨리나, 한국) 섭취 군과 고지방사료(Reseach Diet Inc., 미국) 섭취군으로 나누어, 12주 동안 사료를 섭취하게 하였다.
12주 후, 랫트를 다시 6마리씩 4개군(정상군(Group Ⅰ: Normal group), 고지방식이 대조군(Group Ⅱ: HF control), 고지방식이+ 250 mg/kg(쥐체중)의 고상 배양물 섭취군(Group Ⅲ: HF+250SSF), 고지방식이+ 500 mg/kg(쥐체중)의 고상 배양물 섭취군(Group Ⅳ: HF+500SSF))으로 나누어, 8주 동안 매일 1회 경구로 사료를 섭취하게 하였다. 체중은 8주간 투여 시작일과 종료일에 측정하였고, 사료 섭취량은 일정간격으로 측정하였다.
투여 종료시에 랫트을 밤새 절식시킨 후, 채혈하여 공복혈당, 인슐린, 혈중 중성지방, 총콜레스테롤 및 유리지방산 수치를 측정하였다. 공복혈당은 Trender(1969) 방법으로 측정하였고(Trender P. (1969): Colourimetric determination of glucose. Ann Clin Biochem., 6: 24-27), 혈장 인슐린은 ELISA 법으로 측정하였으며, 혈중 중성지방, 총콜레스테롤, 유리지방산 등은 표준시험법(머크사)으로 측정하였다. 또한, 랫트를 400 mg/kg 크로랄 하이드레이트(chloral hydrate)로 마취한 후, 지방 패드, 간 및 피하지방 조직을 적출하여 무게를 측정하였다. 상기 측정 결과들을 평균±표준편차로 나타내었고, 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA)을 통해 유의적 차이를 비교 분석하였다. 상기 결과를 하기 표 3 및 4에 나타내었다.
항목 정상군 고지방식이 대조군 고지방식이+250 mg/kg의 고상 배양물 섭취군 고지방식이+500 mg/kg의 고상 배양물 섭취군
초기 체중(g) 327±20 510±28 520±30 521±35
종료 체중(g) 358±22 581±32a 565±35b 546±31d
사료섭취량
(g/day)		 58±9 74±12a 67±9b 56±10d
인슐린(mg/dL) 1.5±0.0 2.6±0.7a 1.9±0.6b 1.5±0.1c
공복혈당
(mg/dL)		 83±6 295±19a 215±11b 160±8c
전체지방체
(%, 체중)		 2.2±0.1 11.2±0.3a 9.3±0.2b 7.4±0.2c
부고환지방
(%, 체중)		 0.9±0.1 1.3±0.1a 1.2±0.1b 0.9±0.1c
장간막지방
(%, 체중)		 0.3±0.1 1.4±0.1a 1.1±0.1b 0.7±0.1c
복막뒤지방
(%, 체중)		 0.5±0.1 5.2±0.2a 3.9±1.0b 2.5±1.2c
각 행의 서로 다른 알파벳은 유의적 차이를 나타낸다(P<0.05).
a, 정상군과 고지방식이 대조군 비교(P<0.05)
b, 고지방식이군 및 고지방식이+250 mg/kg의 대두분 고상 배양물 섭취군 비교(P<0.05)
c, 고지방식이군 및 고지방식이+500 mg/kg의 대두분 고상 배양물 섭취군(P<0.05)
d, 고지방식이군 및 고지방식이+500 mg/kg의 대두분 고상 배양물 섭취군(P<0.01)
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 고지방식이 대조군과 비교하여 250 mg/kg 또는 500 mg/kg의 고상 배양물 섭취군은 종료 체중, 사료 섭취량, 공복혈당, 인슐린, 공복혈당, 전체 지방체 무게, 부고환 지방 무게, 장간막 지방 무게 및 복막 뒤 지방 무게를 비롯한 모든 항목에서 수치가 감소하였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 모리의 고상 배양물이 우수한 항비만 및 항당뇨 효과를 가짐을 보여준다.
처리군 총 콜레스테롤(mmol/L) 유리지방산(mmol/L) 중성지방(mmol/L)
정상대조군 0.5±0.1 0.3±0.1 0.6±0.1
고지방식이 대조군 1.4±0.5a 0.6±0.1a 2.0±0.2a
고지방식이+250 mg/kg의 대두분 고상 배양물 섭취군 1.0±0.1b 0.5±0.1b 0.9±0.1b
고지방식이+500 mg/kg의 대두분 고상 배양물 섭취군 0.7±0.1c 0.3±0.1c 0.7±0.1c
각 열의 서로 다른 알파벳은 유의적 차이를 나타낸다(P<0.05).
a, 정상군과 고지방식이 대조군 비교
b, 고지방식이군 및 고지방식이+250 mg/kg의 고상 배양물 섭취군 비교(P<0.05)
c, 고지방식이군 및 고지방식이+500 mg/kg의 고상 배양물 섭취군 비교(P<0.05)
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 고지방식이 대조군은 고지방식이로 인해 정상대조군에 비해 총콜레스테롤, 유리지방산 및 중성지방의 수치가 증가하였다. 그러나, 본 발명의 고상 배양물 섭취군의 경우, 총콜레스테롤, 유리지방산 및 중성지방의 수치가 감소된 것으로 나타났다. 특히, 500 mg/kg의 고상 배양물 섭취군의 경우, 총콜레스테롤, 유리지방산 및 중성지방이 정상대조군과 비슷한 수치로 회복된 것으로 나타났다. 상기 결과는 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 모리의 고상 배양물이 우수한 지질 대사 개선 효과를 가짐을 보여준다.
시험예 4: 바실러스 서브틸리스 모리 고상 배양물의 항바이러스 효과 검증
상기 실시예 4에서 제조된 고상 배양물에 대한 항바이러스 효과를 검증하기 위하여, 소 바이러스성 설사병 바이러스(bovine viral diarrhea virus, BVDV)로 감염된 MDCK 숙주세포(Sigma, 미국)를 alpha-MEM 배지(Gibco BRL, 미국)에서 배양한 후, 상기 배양액에 실시예 4에서 제조된 고상 배양물을 0, 0.25, 0.5, 1, 2.5 및 5 ㎎/㎖의 농도로 각각 처리하여 5일간 37℃로 처리하였다. 그 후, 고상 배양물의 농도에 따른 바이러스 수(viral titer, log)를 플라크 감소 분석법(plaque reduction assay; Durantel 등. Journal of Virology. 75:8987-8998, 2001)에 의해 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 고상 배양물의 처리 농도가 증가할수록 BVDV의 수가 감소하는 것으로 나타났고, 특히 5 ㎎/㎖ 농도에서 바이러스가 완전히 박멸된 것으로 나타났다.
또한, 소 유행열 바이러스(bovine ephemeral fever virus, BEFV) 및 모기매개성 아이노 바이러스(mosquito borne aino virus, MBAV)로 감염된 각각의 Vero 세포(ATCC C-1586)를 alpha-MEM 배지(Gibco BRL, 미국)에서 배양한 후, 상기 배양액에 상기 실시예 4에서 제조된 고상 배양물을 0.5 ㎎/㎖의 농도로 처리하여 5일간 37℃로 처리하였다. 그 후, 무처리 대조군과 고상 배양물을 처리한 숙주세포 배양액의 바이러스 수(viral titer, log)를 측정하였다(Tzipori. Br. Vet. J. 131:720-786, 1975).
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 실시예 4의 고상 배양물을 처리한 군은 소 유행열 바이러스의 수가 2.5로서 무처리 대조군의 바이러스 수인 5.5에 비해 크게 감소하였다. 또한, 고상 배양물을 처리한 군은 아이노 바이러스의 수가 3으로서 무처리 대조군의 바이러스 수인 5.5에 비해 크게 감소하였다. 상기 결과는 본 발명에 따른 고상 배양물이 우수한 항바이러스 효과를 가짐을 보여준다.
시험예 5: 바실러스 서브틸리스 모리 고상 배양물의 이유자돈 사양 효과 시험
상기 실시예 4에서 제조된 고상 배양물에 대한 이유자돈의 사양 효과를 알아보기 위하여, 보조 사료첨가제용 생균제인 모리맥스(바이오토피아, 한국)에 고상 배양물을 10% 중량비로 혼합하여 사료첨가제를 제조하였다. 상기 사료첨가제를 자돈 배합사료에 톤당 3 kg씩 혼합한 후, 80마리의 이유자돈에게 48일간 급여하였다. 또한, 80마리의 대조군의 경우 사료첨가제 없이 배합사료만 급여하였다. 그 후, 이유자돈의 초기체중, 종료체중, 치사율, 설사발병률, 일당증체, 일당사료섭취량 및 사료효율을 측정하여 하기 표 5에 나타내었다.
항목 대조군(80두) 시험군(80두) p-값
초기 체중(kg) 5.55b 5.12a 0.0005
종료 체중(kg) 18.44 21.40 0.0037
치사율(%) 2.5 0.0 분석안됨
설사발병률(%) 8.75 5.00 분석안됨
일당증체(kg) 0.269 0.339 0.0752
일당사료섭취량(kg) 0.517 0.540 0.0623
사료효율(증체/섭취량) 1.924a 1.593b 0.0251
Student's t-test 통계분석에 의해서 각 행의 서로 다른 알파벳은 유의적 차이를 나타낸다(P<0.05).
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 고상 배양물을 함유하는 사료첨가제를 급여한 실험군은 종료체중, 치사율, 설사발병률, 일당증체, 일당사료섭취량 및 사료효율 등 모든 측면에서 대조군에 비해 우수한 결과를 나타내었다. 특히, 시험 종료 체중의 경우, 대조군은 18.44 kg인 반면, 시험군은 21.40 kg으로서 체중이 확연히 증가함을 알 수 있었다. 상기 결과는 본 발명에 따른 고상 배양물이 이유자돈의 사양에 있어 우수한 효과를 가짐을 보여준다.
시험예 6: 바실러스 서브틸리스 모리 고상 배양물의 임신모돈 사양 효과 시험
상기 실시예 4에서 제조된 고상 배양물에 대한 임신모돈의 사양 효과를 알아보기 위하여, 보조 사료첨가제용 생균제인 모리맥스(바이오토피아, 한국)에 실시예 4의 고상 배양물을 10% 중량비로 혼합하여 사료첨가제를 제조하였다. 상기 사료첨가제를 임신모돈 배합사료에 임신중인 모돈의 경우 톤당 2 kg을, 분만 후의 모돈의 경우 톤당 3 kg을 혼합하여 34마리의 임신모돈에게 107일간 급여하였다. 또한, 34마리의 대조군의 경우 사료첨가제 없이 배합사료만 급여하였다. 그 후, 임신모돈의 산자수, 활력 자돈수, 폐사율, 산자 체중, 이유일, 이유자돈수, 이유시 자돈 체중, 발정재귀 두수, 발정재귀 빈도일, 발정재귀일 및 공태일수를 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.
항 목 대조군(34두) 시험군(34두) P-값
모돈당 산자수(두수) 9.20 9.80 0.464
모돈당 활력 자돈수(두수) 8.00 9.00 0.145
폐사율(%) 12.50 6.49 0.174
산자 체중(kg) 1.22b 1.41a 0.006
이유일 24.70a 23.10b 0.003
폐사율(%) 15.90b 8.80a 0.145
모돈당 이유자돈수(두수) 6.82a 8.24b 0.712
이유시 자돈 체중(kg) 6.20 6.40 0.519
발정재귀 두수 31 33 분석안됨
발정재귀 빈도일(day) 8.5 7.4 0.079
발정재귀일(day) 32.8b 30.2a 0.002
공태일수(day) 34.2a 30.9b 0.017
Student's t-test 통계분석에 의해서 각 행의 서로 다른 알파벳은 유의적 차이를 나타낸다(P<0.05).
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 고상 배양물을 함유하는 사료첨가제를 급여한 시험군은 모돈당 산자수, 모돈당 활력 자돈수, 폐사율, 산자 체중, 이유일, 모돈당 이유자돈수, 이유시 자돈 체중, 발정재귀 두수, 발정재귀 빈도일, 발정재귀일, 공태일수 등 모든 측면에서 대조군에 비해 우수한 것으로 나타났다. 특히, 폐사율의 경우, 대조군은 12.50%인 반면, 시험군은 6.49%로서 절반 정도로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 본 발명에 따른 고상 배양물이 산자모돈의 사양에 있어 우수한 효과를 가짐을 보여준다.
제조예 1: 대두피를 포함하는 멸균 고상 배지를 이용한 고상 배양물의 제조
바실러스 서브틸리스 모리 균주를 YM 한천 배지(BD, 미국)에서 37℃에서 1일간 배양하였다. 그후, YM 한천 배지에서 자란 콜로니를 1 L의 TSB 배지(BD, 미국)에 접종하여 37℃에서 1일간 1차 액상 배양하였다. 수득한 TSB 액상 배양액 1 L를 1%(w/v) 포도당, 0.5%(w/v) 효모추출물, 3%(w/v) 대두분 및 0.1%(w/v) 제이인산칼륨으로 구성된 100 L 액상 배지와 혼합하여 200 L 발효조에서 37℃에서 20시간 동안 2차 액상 배양하였다. 한편, 대두피 400 kg과 4.8%(w/v) 옥수수 전분액 500 L를 혼합하여 121℃에서 2시간 동안 멸균한 후, 40℃ 이하로 냉각시켜 고상 배양을 위한 배지를 제조하였다. 상기 고상 배지에 2차 액상 배양액 100 L를 혼합하여 1.5 톤 용량 회전식 고체 배양기(보성엔지니어링, 한국)에서 5일간 1일 2회 교반하면서 고상 배양하고, 60℃에서 1일간 열풍건조한 후 분쇄하여 고상 배양물을 제조하였다.
제조예 2: 대두피를 포함하는 살균 고상 배지를 이용한 고상 배양물의 제조
상기 제조예 1에서 121℃에서 2시간 동안 멸균하는 대신 103℃에서 6시간 동안 살균하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 고상 배양물을 제조하였다.
제조예 3: 탈지 대두분을 포함하는 액상 배지를 이용한 고상 배양물의 제조
바실러스 서브틸리스 모리 균주를 YM 한천 배지(BD, 미국)에서 37℃에서 1일간 배양하였다. 그후, YM 한천 배지에서 자란 콜로니를 1 L의 TSB 배지(BD, 미국)에 접종하여 37℃에서 1일간 1차 액상 배양하였다. 수득한 TSB 액상 배양액 1 L를 2%(w/v) 탈지 대두분이 포함된 50 L 액상 배지와 혼합하여 100 L 발효조에서 37℃에서 20시간 동안 2차 액상 배양하였다. 한편, 대두피 400 kg과 24 kg의 옥수수전분이 용해되어 있는 전분액 550 L를 혼합하여 103℃에서 6시간 동안 살균한 후, 40℃ 이하로 냉각시켜 고상 배양을 위한 배지를 제조하였다. 상기 고상 배지에 2차 액상 배양액 50 L를 혼합하여 1.5 톤 용량 회전식 고체 배양기(보성엔지니어링, 한국)에서 5일간 1일 2회 교반하면서 고상 배양하고, 60℃에서 1일간 열풍건조한 후 분쇄하여 고상 배양물을 제조하였다.
제조예 4: 접종량을 증가시킨 고상 배양물의 제조
바실러스 서브틸리스 모리 균주를 YM 한천 배지(BD, 미국)에서 37℃에서 1일간 배양하였다. 그후, YM 한천 배지에서 자란 콜로니를 1 L의 TSB 배지(BD, 미국)에 접종하여 37℃에서 1일간 1차 액상 배양하였다. 수득한 TSB 액상 배양액 1 L를 2%(w/v) 탈지 대두분이 포함된 400 L 액상 배지와 혼합하여 1000 L 발효조에서 37℃에서 20시간 동안 2차 액상 배양하였다.
한편, 대두피 400 kg과 24 kg 옥수수전분이 함유된 옥수수전분액 200 L를 혼합하여 121℃에서 2시간 동안 살균한 후, 40℃ 이하로 냉각시켜 고상 배양을 위한 배지를 제조하였다. 상기 고상 배지에 2차 액상 배양액 400 L를 혼합하여 1.5 톤 용량 회전식 고체 배양기(보성엔지니어링, 한국)에서 5일간 1일 2회 교반하면서 고상 배양하고, 60℃에서 1일간 열풍건조한 후 분쇄하여 고상 배양물을 제조하였다.
제조예 5: 고상 배양물 및 부형제를 함유하는 사료첨가제의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 고상 배양물 10 중량%에 부형제로서 90 중량%의 미강을 사용한 후 혼합하여 사료첨가제를 제조하였다.
제조예 6: 고상 배양물 및 기존 사료첨가제를 함유하는 사료첨가제의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 고상 배양물 10 중량%에 기존 사료첨가제로서 90 중량%의 모리맥스(바이오토피아, 한국)를 혼합하여 사료첨가제를 제조하였다.
제조예 7: 고상 배양물을 함유하는 식품용 분말 및 캡슐제의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 고상 배양물 10 중량%에 90 중량%의 옥수수 전분을 혼합하여 식품용 분말을 제조하였다.
한편, 상기 식품용 분말을 95% 주정과 혼합 및 건조한 후, 30 메쉬 표준망 체를 통과시켜 수득하였다. 이후, 1.5 중량%의 스테아르산마그네슘과 혼합한 다음, 상기 혼합물을 0호 캡슐 충진기(춘천바이오산업진흥원)를 이용하여 캡슐에 충진하였다.
제조예 8: 고상 배양물을 함유하는 의약품용 분말 및 캡슐제의 제조
상기 제조예 1에서 제조된 고상 배양물 10 중량%에 90 중량%의 미세결정셀룰로오스(아비셀)를 혼합하여 의약품용 분말을 제조하였다.
한편, 상기 의약품용 분말을 95% 주정과 혼합 및 건조한 후, 30 메쉬 표준망 체를 통과시켜 수득하였다. 이후, 2 중량%의 스테아르산마그네슘과 혼합한 다음, 상기 혼합물을 0호 캡슐 충진기(춘천바이오산업진흥원)를 이용하여 캡슐에 충진하였다.

Claims (11)

1) 바실러스 서브틸리스 모리 균주(KCCM-10450)를 액상 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 얻어진 액상 배양물을 30 내지 60 중량%의 대두피 및 0 내지 10 중량%의 옥수수 전분을 포함하는 고상 배지에 접종하여 고상 배양하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 얻어진 고상 배양물을 건조 및 분쇄하는 단계
를 포함하는, 바실러스 서브틸리스 모리를 이용한 고상 배양물의 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 1)의 액상 배양이 30 내지 40℃의 온도에서 1 내지 5일간 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 1)의 액상 배양이 배지 총 중량을 기준으로 0 내지 7 중량%의 포도당, 0 내지 5 중량%의 효모추출물, 0 내지 5 중량%의 옥수수액침, 0 내지 0.5 중량%의 제이인산칼륨, 0 내지 0.2 중량%의 황산마그네슘 및 0 내지 0.2 중량%의 황산아연을 포함하는 액상 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 1)의 액상 배양이 상이한 액상 배지에서 수행되는 1차 액상 배양 및 2차 액상 배양으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 2)의 고상 배지가 35 내지 50 중량%의 대두피 및 0 내지 5 중량%의 옥수수 전분을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 2)의 고상 배지가 30 내지 70 중량%의 최종 수분 농도를 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단계 2)의 고상 배양이 30 내지 40℃의 온도에서 3 내지 7일간 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 제조방법에 따라 제조된, 바실러스 서브틸리스 모리의 고상 배양물.
제 8 항의 고상 배양물을 포함하는, 사료첨가제 또는 식품조성물.
제 8 항의 고상 배양물을 포함하는, 비만, 당뇨, 지질 관련 대사성 질환 또는 바이러스성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 지질 관련 대사성 질환이 지방간, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 심혈관 질환, 동맥경화증 또는 지질 관련 대사 증후군인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020231127A1 (ko) * 2019-05-14 2020-11-19 한국식품연구원 간 기능 개선 활성을 갖는 균주 및 이의 용도
KR20210062830A (ko) * 2019-11-22 2021-06-01 이재훈 진피 및 바실러스 서틸리스 fb001 균주의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 반추동물의 설사병 예방 또는 개선용 조성물
WO2021167356A1 (ko) * 2020-02-18 2021-08-26 주식회사 피코엔텍 글루타치온과 알데히드탈수소효소를 함유하는 숙취해소제

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100477039B1 (ko) 2003-02-07 2005-03-17 (주)바이오토피아 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 신규한 미생물 및 이를 함유하는 조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100477039B1 (ko) 2003-02-07 2005-03-17 (주)바이오토피아 1-데옥시노지리마이신을 생산하는 신규한 미생물 및 이를 함유하는 조성물

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Asano et al, Tetrahedron 11: 1645-1680, 2000
Ezure 등, Agric. Biol Chem, 19, 2159~2165, 1985
Hardick 등, Tetrahedron, 30, 6285~6296, 1992
Murao and Miyata, Agric. Biol. Chem, 44, 291-221, 1980

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020231127A1 (ko) * 2019-05-14 2020-11-19 한국식품연구원 간 기능 개선 활성을 갖는 균주 및 이의 용도
CN113939198A (zh) * 2019-05-14 2022-01-14 韩国食品研究院 具有改善肝功能活性的菌株及其用途
EP3970511A4 (en) * 2019-05-14 2023-01-11 Korea Food Research Institute STRAIN WITH ACTIVITY TO IMPROVE LIVER FUNCTION AND UTILIZATION THEREOF
KR20210062830A (ko) * 2019-11-22 2021-06-01 이재훈 진피 및 바실러스 서틸리스 fb001 균주의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 반추동물의 설사병 예방 또는 개선용 조성물
WO2021167356A1 (ko) * 2020-02-18 2021-08-26 주식회사 피코엔텍 글루타치온과 알데히드탈수소효소를 함유하는 숙취해소제

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