KR20150146331A - 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 배양 방법 - Google Patents

락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 배양 방법에 관한 것으로, 기존의 통상적인 방법으로 유산균 배지에서 배양 되었을 때보다, 본 발명의 아라비노오스를 탄소원으로 하는 배지에서 배양 및 수득된 락토바실러스는 균체가 가지는 대식세포 활성화 능력이 월등히 증가된다. 따라서 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물은 대식세포의 산화질소(NO) 생성능을 높은 수준으로 증가시켜 면역능력을 높여주기 때문에, 이를 이용한 면역 증강용 식품, 약학적 조성물과 정장용, 생균제, 사료용 조성물 그리고 발효제품 제조에 효과적이다.

Description

락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 배양 방법{The culturing method for increasing immune-enhancing activity in Lactobacillus spp.}
본 발명은 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 아라비노오스(arabinose)를 탄소원으로 하는 배지를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 배지에 락토바실러스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.
면역이란 인체 내에서 외부로부터 침입하는 미생물 동종의 조직 등의 다른 물질, 특이 세포가 발생하면 면역계가 관여하여 이들을 항원으로 인식하여 특이하게 반응하여 항체를 생산하는 능력을 나타냄으로서 개체의 항상성을 유지하려는 현상을 말하며, 면역 반응에 관여하는 세포는 임파구, macrophage, NK cell, 수지상세포 등이 있다. 최근 들어 인공화합물이 아닌 천연물로 치료하는 면역요법 등이 각광받으면서, 면역활성 증진 효능을 갖는 천연 유래 소재를 탐색하고자 하는 시도가 많이 이루어지고 있다.
김치와 같은 전통 발효식품에 풍부하게 존재하는 유산균은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질을 분해하여 중요한 영양성분으로 만드는 역할을 담당하며, 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균이나 크로스트리디움(Chlostridum sp.)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라, 비타민 합성, 혈중 콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다. 특히 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특성이 있어 정장작용에 많은 도움을 준다. 또한, 유산균은 대식세포의 증식을 촉진하여 대식세포(macrophage)의 장내 유해 세균에 대한 인지능력, 살균능력을 강화시키고, 면역관련 물질의 분비를 촉진하여 면역 증강효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Gabriela peridgon et al. J of food Protection 53: 404-411, 1990: Katsumasa sato et al., Microbiol Immunol., 32(7): 689-698, 1998). 또한, 유산균은 면역 조절 이상과 관련된 알레르기 및 아토피 질환에도 효과가 있어 유아에 투여 시 아토피 발생이 줄어들고(Kalliomki et al., Lancet 357:1076-1079, 2001) 아토피 습진부위 및 정도가 감소한다는 보고가 있다(Rsenfeldt et al., Dermatologic and ocular diseases 111: 389-395, 2003).
상기와 같은 유산균의 효과를 보기 위해서 종전에는 유산균 제제 또는 발효제품 내에 유산균이 다량 함유될 수 있도록 하는 기술들이 개발되었으며, 또한 이들이 위장관 내 환경에 대한 저항성을 가지고 장까지 도달하게 할 수 있는 가공 방법 등의 기술이 개발되고 있다.
이와 더불어 유산균을 자체로서 또는 이를 이용한 발효 제품들을 소비할 때에 유산균의 복용 효과를 극대화하기 위하여 유산균 자체의 기능성을 향상시키는 방법이 연구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명의 발명자들은 유산균의 기능성을 높이는 방법에 관해 연구하던 중, 아라비노오스를 탄소원으로 하는 배지에서 배양한 락토바실러스 속 균체들이 면역증강 효과가 향상된 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, (a) 아라비노오스(arabinose)를 탄소원으로 하는 배지를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 배지에 락토바실러스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 아라비노오스(arabinose)를 탄소원으로 하는 배지를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 배지에 락토바실러스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
(a) 아라비노오스(arabinose)를 탄소원으로 하는 배지를 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 배지에 락토바실러스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
(a) 단계는 아라비노오스를 탄소원으로 포함하는 배지를 제조하는 단계이다.
상기 아라비노오스(arabinose, Ara로 약기, C5H10O5)는 자일로오스(xylose)와 함께 식물계에 존재하는 대표적인 5탄당으로, 대부분 L형(L-아라비노오스)으로 존재한다. L-아라비노오스(펙티노오스라고도 함)는 식물의 고무질, 점질물, 헤미셀룰로오스나 세균 등 다당의 구성성분으로 널리 분포되어 있다. 또 소나무, 삼나무의 심재(心材)내에 유리 또는 결합 상태로 존재한다. 일반적으로 식물세포가 세포외 기질로서 합성분해되는 헤테로다당에 포함된다. 광학이성질체인 D-아라비노오스는 자연 상태에서 결핵균, 나균(癩菌)의 다당류, 알로에속(Aloe)의 배당체 이외에는 거의 찾아볼 수 없는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 아라비노오스는 모든 형태의 입체 이성질체를 포함하며, 예를 들어 하기 화학식 1의 구조를 가지는 L형(L-아라비노오스), 하기 화학식 2의 구조를 가지는 D형 (D-아라비노오스) 등이 일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 아라비노오스는 바람직하게 L형(L-아라비노오스)일 수 있다.
<화학식 1>
Figure pat00001
<화학식 2>
Figure pat00002

상기 아라비노오스는 천연으로부터 분리 정제하거나, 상업적으로 구입하여 사용하거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조할 수 있다.
예를 들어, 상기 아라비노오스는 동물의 장에서는 거의 소화되지 않는 비칼로리 당(non-caloric sugar)이며 대부분 천연에서 추출하고 있다. 아라비노오스는 식물세포벽의 구성성분인 옥수수, 밀, 호밀, 쌀과 같은 곡식의 헤미셀룰로오스, 사탕무와 사과과육의 펙틴질, 식물검질 등에 널리 분포하며, 아라비노자일란(arabinoxylan), 아라비난(arabinan), 아라비노갈락탄(abinogalactan)의 중합체 형태로 존재하는데, 상기와 같은 식물체 조직으로부터 헤미셀룰로오스를 추출 분리하여 산가수분해 또는 효소가수분해 방법으로 생산할 수 있다 (Korean J. Food Sci. Technol. Vol 35 no 5 pp 757-763 (2003)). 또한, 현재 사용되는 아라비노스의 생산방법에는 화학적·생물학적 합성법 및 효소법이 있다. 상기 화학적 합성법은 촉매를 이용한 화학반응이나 생물학적 전환 과정을 통해 기질을 가수분해화시켜 아라비노스를 얻는 방법이다. 상기 생물학적 합성법 중에 효소법은 미생물로부터 아라비노스를 생산할 수 있는 효소를 분리하여 아라비노스를 생산하게 하는 방법이다.
상기‘배지’ 또는 ‘배양 배지’는 동물세포나 식물세포 또는 미생물 등을 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체 또는 액체의 배양기질을 의미한다. 본 발명에서 배양배지는 아라비노오스를 탄소원으로 첨가하는 한 그 배지의 조성이 제한되지 않으며 당업자에게 알려진 공지의 유산균 배양배지에서 탄소원을 아라비노오스로 치환, 변경 또는 첨가한 배지 일 수 있다. 상기 공지의 유산균 배양 배지는 예를 들어 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 액체배지, APT(All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지일 수 있고, 바람직하게 MRS 액체배지에 의한 것 일 수 있다. 즉, 본 발명의 상기 배양 배지는 바람직하게 유산균 배양에 널리 쓰이는 종전의 MRS 배지에서 탄소원을 아라비노오스로 치환한 것일 수 있으며, 본 발명의 명세서에‘MRS-아라비노오스 배지’로 표기하였다.
상기 배양배지에는 배양 기질로서 유산균 생육에 필요한 탄소원과 질소원, 무기염류 및 생장소 등을 포함한다.
본 발명에서 상기 탄소원은 아라비노오스인 것을 특징으로 하며, 탄소원으로서 아라비노오스가 단독으로 또는 유산균 배양시 사용되는 공지의 탄소원과 병행하여 사용 될 수 있으나, 바람직하게 아라비노오스 단독으로 포함되는 것이 바람직하다.
질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인(Phosphorus)원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한,배양배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다
본 발명의 배지는 바람직하게 프로테오스 펩톤(proteose-peptone), 육추출물(beef extract), 효모 추출물(yeast extract), 아세트산 나트륨(sodium acetate), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate,K2HPO4), 구연산 암모늄(ammonium citrate), 황산 마그네슘(magnesium sulfate), 황산망간(manganese sulfate), 아라비노오스(arabinose) 및 정제수를 잔량으로 포함하여 이루어진다.
상기 배지에 포함되는 아라비노오즈의 양은 당업자가 목적하는 바에 따라 적절히 조절 될 수 있으며, 예를 들어 전체 배지에 대하여 0.01 %(w/v) 내지 15 %(w/v) 의 비율로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 전체 배지에 대하여 0.1 %(w/v) 내지 8 %(w/v)의 비율로 포함될 수 있고, 가장 바람직하게 전체 배지에 대하여 1 %(w/v) 내지 5 %(w/v)의 비율로 포함될 수 있다.
상기 배지의 바람직한 실시형태는 전체 배지에 대하여 프로테오스 펩톤(proteose-peptone)이 0. 1 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 육추출물(beef extract)이 0. 1 %(w/v) 내지 10 %(w/v) , 효모 추출물(yeast extract)이 0.01 %(w/v) 내지 10 %(w/v), 아세트산 나트륨(sodium acetate)이 0.01%(w/v) 내지 10 %(w/v), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80)이 0.01%(w/v) 내지 5 %(w/v), 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate,K2HPO4)가 0.01%(w/v) 내지 5 %(w/v), 구연산 암모늄(ammonium citrate)이 0.01%(w/v) 내지 5 %(w/v) , 황산 마그네슘(magnesium sulfate)이 0.001 %(w/v) 내지 1 %(w/v), 황산망간(manganese sulfate)이 0.0001 %(w/v) 내지 1 %(w/v) 및 아라비노오스(arabinose)가 0.1%(w/v) 내지 8 %(w/v)의 비율로 포함되고, 잔량의 물로 이루어지는 것 일 수 있다.
가장 바람직하게는 전체 배지에 대하여 프로테오스 펩톤(proteose-peptone)이 0.1%(w/v) 내지 5 %(w/v), 육추출물(beef extract)이 0.1 %(w/v) 내지 5 %(w/v), 효모 추출물(yeast extract)이 0.05 %(w/v) 내지 5 %(w/v), 아세트산 나트륨(sodium acetate)이 0.05 %(w/v) 내지 5 %(w/v), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80)가 0.05 %(w/v) 내지 1 %(w/v), 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate,K2HPO4)가 0.05 %(w/v) 내지 1 %(w/v), 구연산 암모늄(ammonium citrate)이 0.05 %(w/v) 내지 1 %(w/v) , 황산 마그네슘(magnesium sulfate)이 0.005 %(w/v) 내지 0.5 %(w/v), 황산망간(manganese sulfate)이 0.0005 %(w/v) 내지 0.5 %(w/v) 및 아라비노오스(arabinose)가 1 %(w/v) 내지 5 %(w/v)의 비율로 포함되고, 잔량의 물로 이루어지는 것 일 수 있다.
(b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 제조된 배지에 락토바실러스 속 균주를 배양한다.
상기 락토바실러스(Lactobacillus spp.)는 간균으로써 호모(homo) 유산발효성과 헤테로(hetero) 유산발효성을 모두 가지고 있으며, 동물 및 식물체 및 발효유제품 등 다양한 분리원에서 발견되는 통성혐기성 균종으로서, 그 종류는 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명의 락토바실러스 속 균주는 당업계에 공지된 락토바실러스 속 균주라면 그 종류가 제한되지 않으며 예를 들어, 락토바실러스 사케이(L. sakei), 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 가쎄리( L. gasseri ), 락토바실러스 파라카제이( L. paracasei ), 락토바실러스 플란타룸(L. plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼(L. ferementum), 락토바실러스 람노서스( L. rhamnosus ; L. casei subsp . rhamnosus ), 락토바실러스 루테리( L. reuteri ), 락토바실러스 델브루엑키(L. delbrueckii), 락토바실러스 존스니(L. johnsonii LJI),락토바실러스 헬베티쿠스( L. helveticus ) 및 락토바실러스 불가리쿠스(L. bulgaricus)로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 것 일 수 있다.
본 발명의 상기 락토바실러스 속 균주는 바람직하게 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 및 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 것 일 수 있다.
본 발명의 용어‘배양’이란 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서는‘발효’를 포함하는 개념이다. 본 발명에 있어서, 상기 배양은 락토바실러스 균체의 면역증강활성을 증가시키기 위한 목적으로 수행되는 것으로, 이는 면역증강과 관련된 균체 내 성분들의 생산 촉진 및 균체 내 함량을 증가시키는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 배양과정은 공지의 유산균 배양 방법에 의할 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 배양배지 또는 배양기질에 균체를 접종하고 호기적 또는 혐기적 환경에서 일정한 생육온도를 유지시켜주며 일정 시간 방치하는 방법 일 수 있으며, 회분식 배양방법, 유가식 배양방법 또는 연속식 배양방법을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 배양 온도는 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 조건은 20 내지 40℃의온도 범위 일 수 있다.
상기 배양 시간은 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 12시간에서 4일간 배양할 수 있다.
상기 (a) 및 (b) 단계를 통해 배양 및 수득된 락토바실러스는 균주의 면역증강활성이 증가되는 것이 특징이다.
면역이란 생물체 내에서 병원체와 종양 세포 등을 탐지한 다음 죽임으로써 질병으로부터 생명체를 보호하는 기작을 말한다. 면역기능은 내재면역(Innate immune)과 적응면역(adaptive immune) 기능이 있으며, 내재면역은 미생물들과 독소들이 체내로 진입하는 데 성공하였을 때 곧바로 작용하는 면역 기능으로 패턴 인식 수용체가 미생물들 사이에 널리 보존되어 있는 부분을 인지하여 외부의 미생물을 감지하는 방식으로 작용하거나, 손상된 세포들이 방출하는 경고성 신호를 같은 종류의 수용체가 이를 인지하여 미생물의 존재 사실을 감지하는 방식으로 작용한다. 적응면역은 항원의 표식을 기억하는 기능을 의미하는 면역기억(immunological memory)을 비롯한 보다 강력한 면역 반응을 말하며 항원에 특이적이며 항원제시(antigen presentation) 과정을 통한 비자기항원의 인지를 필요로 한다.
기존의 통상적인 방법으로 유산균 배지에서 배양 되었을 때보다, 본 발명의 상기 (a) 및 (b) 단계를 통해 배양 및 수득된 락토바실러스는 균체가 가지는 대식세포 활성화 능력이 증가된다. 따라서 대식세포의 NO 생성량을 증가시켜, 내재면역과 적응면역을 모두 증진시키는 효능이 증가된다.
이는 본 발명의 실시예에 잘 나타나 있다.
본 발명의 일실시예에서는 기존 MRS 배지에서 탄소원만을 치환하여 제조한 각각의 변형 배지에서 Lactobacillus sakei K040706를 배양하여, 배지에 포함된 탄소원의 종류에 따른 균체의 면역증강 활성을 평가하였다. 그 결과 본 발명의 MRS-아라비노오스 배지에서 수득 된 Lactobacillus sakei K040706 균체가 월등하게 대식세포 활성화능이 증가되었음을 확인하였다(실시예 1, 도 1 참조).
본 발명의 다른 일 실시예에서는 상기의 결과가 특정 균주에만 국한 되는 것인지 또는 유산균 일반에 적용 될 수 있는지 평가하기 위하여, 여러종류의 락토바실러스 속 균주를 MRS-아라비노오스 배지에서 배양 및 수득하여 면역증강 활성을 조사하였다. 그 결과 다른 종류의 락토바실러스 균주들에 대해서도 동일하게 균체의 대식세포 활성화능이 증가되었음을 확인하여, 락토바실러스 속의 균체 일반에 본 발명의 방법이 적용될 수 있음을 확인하였다(실시예 2, 도 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 락토바실러스 균체에서 면역증강 활성 증가에 기여한 물질을 조사하였다. 그 결과 상기 본 발명의 MRS-아라비노오스 배지에서 배양된 균체에서 테이코산 함량이 증가한 것을 확인 하였고, 이로서 본 발명의 방법이 균체 내 테이코산 생성 및 함유량 증가에 기여하였음을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 MRS-아라비노오스 배지에 포함되는 아라비노오스의 함량(또는 농도)를 달리하여, 아라비노오스의 함량에 따른 균체 기능성 변화를 조사하였다. 그 결과 1%(w/v)[10g/L와 동일] 이상 8%(w/v)[80g/L과 동일] 미만의 함량 범위에서는 기존의 유산균 MRS 배양 배지(탄소원으로 덱스트로오스 함유)에 비하여 매우 높은 수준으로 대식세포를 활성화 시킴을 확인하였다. 그러나 8%(w/v) 이상의 함량 범위에서는 오히려 대식세포 활성화능이 떨어지는 것을 확인하여, 상기와 같이 특정 아라비노오스 함량 범위가 락토바실러스 균체의 면역증강 활성에 중요하게 작용하는 것을 발견하였다(실시예 4 참조).
따라서 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.
상기 균체는 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 균체 파쇄물, 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 용어 ‘배양물’은 ‘발효물’을 포함하는 의미이며, 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다.
본 발명의 상기 조성물은 면역 증강 효과를 나타내며, 전술한 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 따라서 상기 (a) 및 (b) 단계를 통해 배양된 균체 및 배양물을 수득하기 위하여, 임의로 여과 또는 농축 등의 공정을 추가로 수행 할 수 있다.
또한 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물은 보관 등의 용이함을 위하여 여과 과정, 농축 및 정제과정, 건조과정, 동결과정, 분말화 과정이 임의로 추가될 수 있다.
본 발명의 조성물은 면역기능 저하로 기인되는 질환의 예방 및 개선에 효과 가 있으며, 상기 면역기능 저하로 기인되는 질환으로는 감기 등의 감염성 질환 및 염증성 질환, 아토피 등의 알러지 질환, 만성피로, 및 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 알려 진 면역기능 저하로 기인되는 질환은 모두 본 발명에 포함된다.
상기 면역 증강용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 함유함으로써 당업계에 공지된 방법에 따라 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으나, 바람직하게는 식품 조성물 및 약학적 조성물 및 일 수 있다.
상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강식품으로는 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물을 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 액상화 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물과 면역기능 증진효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 이에 한정되지 않지만 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물을 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물의 바람직한 함유량으로는 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 최종적으로 제조된 식품 중 0.01 내지 50 중량%이다.
또한, 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 면역기능 증진용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성 성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물을 면역기능 증진제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또한 상기 면역증강용 조성물은 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 및 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 정장용, 생균제, 사료용 조성물 일 수 있다.
상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물은 면역기능 증진 활성이 있어 주로 인간 및 동물의 건강 증진을 위한 용도, 즉, 정장용, 생균제 또는 사료용 조성물로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 조성물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하 여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등을 포함한다. 조성물 내 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체의 함량은 조성물의 용도 및 제형에 따라 달라질 수 있 다. 본 발명에 따른 정장용 또는 생균제 조성물은 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물을 약제학적 분야에서 통상적으로 사용하는 담체 및 향료와 혼합하여 정제 (tablet), 트로키(troche), 캡슐(capsule), 엘릭실(elixir), 시럽(syrup), 산제 (powder), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조 및 투여될 수 있다. 담체로는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제 등을 사용할 수 있다. 투여방식은 경구, 비경구 또는 도포법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 경구투여하는 것이 바람직하다. 또한, 투여용량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 피투여 대상의 연령, 성별, 상태 등에 따 라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 사료용 조성물은 발효사료, 배합 사료, 펠렛형태 및 사일레지(silage) 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 발효사료는 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물을 포함하고, 추가적으로 여러 가지 미생물 균 또는 효소들을 첨가함으로써 유기물을 발효시켜 제조될 수 있다. 상기 배합사료는 여러 종류의 일반 사료와 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물을 혼합 하여 제조될 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 발효사료 또는 배합사료를 펠렛기로 제형화하여 제조될 수 있다. 사일레지는 청예사료를 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물로 발효시킴으로서 제조될 수 있다.
본 발명의 상기 면역증강용 조성물은 또한, 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 발효제품을 포함한다.
발효제품의 제조방법은 통상적으로 원료의 준비, 유산균의 첨가, 발효, 완성된 제품의 회수 등의 과정으로 이루어진다.
원료의 준비 단계는 발효 대상이 되는 재료를 준비하고, 발효가 잘 이루어 지도록 발효 조건을 준비하는 단계이다. 유산균의 첨가는 발효 대상의 양에 따라 적량의 균을 첨가하는 것으로, 본 발명에서는 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체를 사용 하는 것을 특징으로 한다. 발효는 통상의 발효균의 발효조건에 따라 수행되는 것으로 바람직하게는 20 내지 40℃에서 4 내지 168시간동안 수행된다. 완성된 제품 의 회수는 발효물에서 불필요한 부산물이나 미발효된 재료를 제거하는 것에서부터 저장, 운반을 용이하게 하기 위한 모든 후처리과정 및 포장 등을 포함한다.
상기의 방법에 따라 제조하는 발효제품은 바람직하게는 음료일 수 있으며, 이 음료는 예를 들어, 상기 본 발명의 (a) 및 (b) 단계를 포함하는 방법으로 제조된 락토바실러스 균체를 배양하여 젖산 발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 다음 용기에 충전한 제품을 나타 낸다. 이 음료에는 일반적으로 유산균이 살아 있는 채로 함유되어 있으므로, 음용 후 장(腸) 안에서의 정장작용을 기대할 수 있다.
본 발명은 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 배양 방법에 관한 것으로, 기존의 통상적인 방법으로 유산균 배지에서 배양 되었을 때보다, 본 발명의 아라비노오스를 탄소원으로 하는 배지에서 배양 및 수득된 락토바실러스는 균체가 가지는 대식세포 활성화 능력이 월등히 증가된다. 따라서 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물은 대식세포의 산화질소(NO) 생성능을 높은 수준으로 증가시켜 면역능력을 높여주기 때문에, 이를 이용한 면역 증강용 식품, 약학적 조성물과 정장용, 생균제, 사료용 조성물 그리고 발효제품 제조에 효과적이다.
도 1은 탄소원을 달리한 배지에서 수거한 Lac . sakei K040706 균체의 Raw 264.7 세포에서 NO 유도활성을 나타낸다 (control: MRS broth 배양 균체).
도 2는 MRS 기본 배지 조성(탄소원으로 dextrose)에서와, 본 발명의 MRS-아라비노오즈 배지에서 회수한 여러 종의 락토바실러스 균체의 NO 생성능(마크로파아지 활성화능)을 나타낸 것이다.
도 3은 아라비노오스가 포함된 배지에서 회수한 Lac . sakei K040706 전체 균체(whole cell)와 teichoic acid를 제거한 균체를 RAW 264.7 세포에 처리하였을 때, NO 생성능(마크로파아지 활성화능)을 나타낸 것이다.
도 4는 여러 농도의 아라비노오즈가 포함된 배지들에서 배양된 Lac . sakei K040706 균체들의 Raw 264.7 세포에 대한 NO 생성능 (마크로파아지 활성화능)을 나타낸 것이다.
도 5는 배지 중 아라비노오즈의 농도를 달리하여 배양한 Lac . sakei K040706 균주를 시료로 하여 세포 독성을 평가한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
배지 조성 결정
<1-1> 탄소원(Carbon source)별 배지 제작
MRS 기본 배지 조성(하기 표1 참조)에는 탄소원으로 dextrose가 20 g/L 들어가는데, 생산성과 효능을 증가시키는 배양 조건을 위해 dextrose 이외에 arabinose, fructose, lactose, maltose, mannose, raffinose, rhamnose, ribose, sucrose, trehalose, xylose를 각각 dextrose 대신 치환하여 20 g/L 씩 넣은 배지를 만들었다. 배지를 멸균한 후, Lactobacillus sakei K040706배양액(2.8X108 CFU/mL)를 각각 1%(v/v)씩 접종하였고, 배양 후 원심분리와 동결건조로 시료를 준비하였다.
Item Contents (g)
Nitrogen Source

 Proteose Peptone No. 3 10
Beef Extract 10
Yeast Extract 5
Carbon Source Dextrose 20
Minerals and etc. Polysorbate 80 1
Ammonium Citrate 2
Sodium Acetate 5
Magnesium Sulfate 0.1
Manganese Sulfate 0.05
Dipotassium Phosphate 2
Approximate Formula* Per Liter
<1-2> 면역증강 활성이 있는 배지의 선별
Lac . sakei K040706는 MRS broth에서 30℃ 20시간 배양한 것을 사용하였고, 계대를 위해서는 MRS 사면배지를, 보존을 위해서는 glycerol 용액에 동결 보존하였다.
Lac . sakei K040706(2.8X108 CFU/mL)배양액 1%(v/v)를 상기 실시예<1-1>에서 제조된 배지에 각각 접종하여 30 ℃ 20시간 배양 후, 원심분리 하여 균체를 얻었고, 이를 동결건조 하여 시료를 준비하였다. 이 건조 균체를 50 ppm의 농도로 하여 50 ng/ml IFN-γ로 priming 된 Raw 264.7 cell에서의 NO 생성능(마크로파아지 활성화능)을 확인하였다. 대조구는 LPS 1μg/ml에 의한 NO 생성능과 비교하였다.
NO 생성능 측정은 구체적으로 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 배양액에서의 산화질소 생성은 산화질소의 산화물인 아질산의 측정을 통해 평가하였다. Griess 분석 방법을 이용하였으며 Raw 264.7 cell 세포를 96 well plate에 2 x 105 cells/mL 농도로 분주하고 24 시간 배양한 뒤, Raw 264.7 cell에 500 μg/mL으로 제조해 놓은 시료를 각각 50 μg/mL 농도로 처리한 다음, 20 시간 배양하였다. 배양 후 상등액 100 μL를 새로운 96-well plate에 옮긴 후 griess reagent (Sigma-Aldrich Co.)와 1:1로 혼합하여 넣고 shaker에서 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. standard curve는 sodium nitrite를 이용하여 측정하였다.
상기 탄소원별 배양 균체를 시료로 하여 세포의 NO 생성능을 평가한 결과는 [도 1]과 같다. LPS와 IFN-γ를 처리한 시료의 NO 생성량을 100으로 환산했을 때, MRS broth 배양 균체의 NO 생성량은 72.6%였으나, arabinose 배지에서 배양한 균체는 101.9%로 대조군(MRS broth 배양 균체)보다 높은 NO 생성능을 나타내었다. 이는 아라비노오즈 배지에서 생성된 균체가 마이크로파지 활성화 능력이 상승하였음을 나타낸다.
< 실시예 2>
MRS - 아라비노오즈 배지에서 락토바실러스 속 균들의 면역증강 활성 평가
상기 실시예 <1-2>에서 선별된 아라비노오즈를 탄소원으로 하는 변형된 MRS 배지(이하, MRS-아라비노오즈 배지로 표기)에서의 배양 방법이 다른 락토바실러스 속 균들에 대해서도 동일한 효과를 나타내는지 알아보기 위하여, 다른 락토바실러스 속 미생물들을 대상으로도 상기 실시예<1-2>의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 표 1의 MRS 기본 배지 조성(탄소원: 2%(w/v), 즉 20g/L dextrose)과 MRS 기본 배지조성에서 탄소원만 2%(w/v) arabinose[즉 20g/L]로 교체한 배지를 만들었다. 배지를 멸균한 후, Lac . sakei K040706를 비롯하여 하기 표 2에 기재된 기존에 알려진 상업화된 프로바이오틱스 2종(KCTC3594, KCTC 5033)과 상기 Lac . sakei K040706 균주와 같은 종인 Lac . sakei KCTC13416의 배양액(2.8X108 CFU/mL)을 각각 1% 접종하였고, 배양 후 원심분리와 동결건조로 시료를 준비하였다.
상기의 균체 시료를 각각 50 μg/mL 농도로 마크로파아지 세포인 Raw264.7세포에 처리하여 산화질소 생성량을 확인하였다. NO 생성량 평가는 상기 실시예 <1-2> 에 기재된 방법과 동일하다.
균 번호 균주명
K040706 Lactobacillus sakei
KCTC3594 Lactobacillus reuteri
KCTC5033 Lactobacillus rhamnosus GG
KCTC13416 Lactobacillus sakei
[도 2]에서 보는 바와 같이, Dextrose 영양원에서 배양한 균체에 의한 산화질소 생성량은 LPS대비 평균 36.6~76.3% 였으나, arabinose 영양원 배양 균체는 56.2~105.8% 증가하였다. 이는 본 발명의 MRS-아라비노오즈 배지의 교체로 20.7에서 최고 45.2%까지 마크로파아지의 활성이 증가한 것을 의미한다.
< 실시예 3>
배지 조성에 따른 균체 분획물의 조성분석
MRS broth 기준으로 대체 nitrogen source의 사용은 균체 회수율에는 영향을 미쳤으나 기능성에는 유의한 영향이 없었다(데이터 미도시). 반면 대체 carbon source의 경우는 균체 회수율은 물론 기능성에 까지 영향을 미치는 것을 확인할 수 있었다. 이에 Arabinose, Dextrose, Fructose, Trehalose 4종을 각각의 carbon source로 하는 배지에서 락토바실러스 균체를 배양하여 얻은 균체 주요 성분 함량 및 특성을 관찰하고 자하였다. 균체로서는 상기 Lac . sakei K040706를 대표로하여 본 실험에 사용하였고, 상기 4종의 배지는 실시예 <1-1>에서 제조된 것과 같다.
<3-1> 테이코산 ( Teichoic acid ) 함량
테이코산(Teichoic acid)의 함량을 측정하기 위하여, 균체를 원심분리로 모은 후, saline을 이용하여 2회 세척 후 현탁한다. 동량의 4.5% SDS(sodium dodecyl sulfate)를 95℃에서 계속 섞어주며 균체 현탁액에 첨가, 이것을 상온에서 방냉하고 다시 열수로 수차례 세척하여 SDS를 씻어낸다. Pellet을 5 ml 0.02 M Potassium phosphate buffer에 현탁하고 10,000 rpm에서 10 min 원심 분리 후 pellet 수거하고 다시 여기에 trypsin (0.02%, 1 ml) in 0.01 M potassium phosphate buffer액에 현탁시켜 37℃에서 4시간 반응한다. 원심분리(10,000 rpm에서 10 min) 후 pellet(정제 균체)을 수거하여 분석에 사용한다.
100㎕ 10% Magnesium Nitrate in ethanol에 1 mg 준비된 정제 균체를 첨가하고 이를 끓는 수욕조에서 증발시킨다. 여기에 0.3 ml 1 N-HCl을 가하고 끓는 물에서 증발시키고 얻어진 가수분해물에 3.9 ml H2O + 4 ml color reagent'를 첨가하여 37℃에서 90분간 incubation하였다가 820 nm에서 흡광도를 측정한다. (표준 물질 potassium dihydrogen phosphate)
Carbon source of medium Teichoic acid(mol/mg dried cell)
Dextrose (Control) 1.74 ± 0.12
Arabinose 3.41 ± 0.26***
Fructose 2.73 ± 0.21
Lactose 1.66 ± 0.43
***: P<0.01
Gram positive bacterial cell wall의 주요 구성 성분인 peptidoglycan(데이터 미도시) 및 teichoic acid 의 함량을 조사하였다. 이 중 특히 teichoic acid 함량은 arabinose>fructose>dextrose 순으로 높게 나타났다(표 3 참조).
<3-2> 테이코산 ( Teichoic acid ) 분리
Arabinose가 첨가된 배지에서 회수된 균체 5 g을 4% SDS 25 mL 현탁액에 녹여 30분간 끓이고 원심 분리(상온, 20,000 g, 30 min)하여 pellet을 회수하였다. pellet을 증류수로 6번 washing하여 SDS를 제거하고(원심 분리 상온, 20,000 g, 30 min), glass bead로 cell wall을 깨주었다. 원심 분리(2,500 g, 10 min)로 bead를 제거하고 원심 분리(12,000 g, 20 min)로 pellet을 얻어 증류수로 2번 washing 하였다. 5% TCA(trichlore acetic acid)를 pellet 무게 1 g당 20 mL을 넣고 4℃에서 24시간 교반하였다. 원심 분리(12,000 g, 20 min)하여 pellet을 제거하고 상등액의 5배 볼륨의 absolute ethanol을 섞어 4℃에서 16시간 침전하였다. 침전물을 회수하여(30,000 g, 15 min) 침전물을 5 mL 5% TCA에 현탁 후, 원심 분리(12,000 g, 20 min, 4℃)하여 pellet 제거하였다. 상등액에 cold ethanol 25 mL을 넣어 teichoic acid를 침전시킨 후 원심분리(30,000 g, 15 min, 4℃)하여 pellet을 회수하였고, ethanol 5 mL로 washing하고 ether 5 mL로 washing하여 소량의 증류수로 회수하여 동결건조 하였다. NO 유도활성을 측정하기위해서 본 실험방법을 통해 teichoic acid를 제거한 균체를 실험에 사용하였다. NO 유도활성 측정은 상기 실시예<1-2>에 기재된 것과 동일한 방법으로 수행되었다.
[도 3]은 MRS-아라비노오스 배지에서 배양된 균체의 whole cell과, whole cell에서 teichoic acid를 제거한 세포벽 성분의 macrophage 활성화능 관찰결과를 보여준다. teichoic acid 제거로 macrophage 활성화의 척도인 NO 유도능이 저하되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 아라비노오스(arabinose) 대체 배지에서 회수한 균체의 경우 teichoic acid의 제거로 38.6%의 현저한 활성 감소를 보였다.
상기 실시예 3의 결과를 통해, 마크로파아지 활성화의 척도인 NO 생성을 유도하는 주요 성분은 teichoic acid로 확인되었으며, 특히 해당 성분은 arabinose를 첨가한 배지에 의해 증가하였음을 확인하였다.
< 실시예 4>
아라비노오즈 농도에 따른 균체 면역증강 활성 평가
<4-1> 농도에 따른 면역증강 활성 변화
dextrose 와 Arabinose를 각각 1%(w/v), 2 %(w/v), 4 %(w/v), 8 %(w/v) 함량으로 하여[각각 10g/L, 20g/L, 40g/L, 80g/L을 나타냄], 농도별로 배지를 조제하였다(이때 나머지 조성은 탄소원을 제외하고 표 1에 기재된 것과 같다). 균체로서는 상기 Lac . sakei K040706를 대표로하여 본 실험에 사용하였다.
상기에서 제조된 배지를 멸균한 후, Lac . sakei K040706균주를 각각 1%씩 접종하였고, 30℃ 20시간 배양 후 원심분리 및 동결건조로 시료를 얻었다. 상기의 균체 시료를 각각 50 μg/mL 농도로 마크로파아지 세포인 Raw264.7세포에 처리하여 산화질소 생성량을 확인하였다. NO 생성량 평가는 상기 실시예 <1-2> 에 기재된 방법과 동일하다.
각각의 배지에서 배양한 균체를 시료로 하여 NO 생성능을 확인한 결과,[도 4]에서 보는 바와 같이 arabinose 첨가 배지 배양 균체가 dextrose 첨가배지 배양 균체에 비해 평균 18.5~20.7% NO 생성이 증가하였다. 그러나, arabinose를 8%(w/v) 첨가한 배지 배양 균체의 경우, 1%(w/v), 2%(w/v), 4%(w/v)를 첨가한 배지에 비해 NO 생성량이 현저하게 저하된 것을 확인할 수 있었다.
<4-2> 농도에 따른 세포 독성
세포 생존율은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (Sigma-Aldrich Co.) 측정으로 분석하였다. Raw 264.7 cell 세포를 96 well plate에 2 x 105 cells/mL 농도로 분주하고 24 시간 배양한 뒤 500 μg/mL으로 제조해 놓은 시료(상기 실시예 4-1에서 수득한 균체 시료)를 각각 50 μg/mL 농도별로 처리한 다음, 20 시간 배양하였다. well 의 media를 모두 제거한 뒤 5 mg/mL 농도의 MTT 시약을 serum free DMEM과 혼합하여 최종농도를 500 μg/mL로 제조한 뒤 well 당 200 μL씩 분주하고 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 상등액을 제거하고 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 첨가하여 세포를 용해시킨 후 MTT 환원에 의해 생성된 포르마잔을 microplate reader (infinite M200 Pro, Tecan, Japan)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
배지 중 arabinose의 농도를 달리하여 배양한 균주를 시료로 하여 세포 독성을 평가한 결과는 [도 5]와 같다. 모든 농도의 균체처리구가 85% 이상의 세포 생존률을 보여 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 배양 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 아라비노오스(arabinose)를 탄소원으로 하는 배지를 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 배지에 락토바실러스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.
기존의 통상적인 방법으로 유산균 배지에서 배양 되었을 때보다, 본 발명의 아라비노오스를 탄소원으로 하는 배지에서 배양 및 수득된 락토바실러스는 균체가 가지는 대식세포 활성화 능력이 월등히 증가된다. 따라서 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물은 대식세포의 산화질소(NO) 생성능을 높은 수준으로 증가시켜 면역능력을 높여주기 때문에, 이를 이용한 면역 증강용 식품, 약학적 조성물과 정장용, 생균제, 사료용 조성물 그리고 발효제품 제조에 효과적이므로 산업상 이용가능성이 크다.

Claims (7)

  1. (a) 아라비노오스(arabinose)를 탄소원으로 하는 배지를 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 배지에 락토바실러스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 락토바실러스 속 균주의 면역증강 활성을 증가시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배지는 MRS-아라비노오스 배지 인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 아라비노오스는 전체 배지의 중량 대비 0.1 %(w/v) 내지 8 %(w/v)의 비율로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 MRS-아라비노오스 배지는 프로테오스 펩톤(proteose-peptone), 육추출물(beef extract), 효모 추출물(yeast extract), 아세트산 나트륨(sodium acetate), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate,K2HPO4), 구연산 암모늄(ammonium citrate), 황산 마그네슘(magnesium sulfate), 황산망간(manganese sulfate) 및 아라비노오스(arabinose) 를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역증강 활성은 테이코산(teichoic acid)의 함량 증가에 기인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 가쎄리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus ferementum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus ; Lactobacillus casei subsp . rhamnosus), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 존스니(Lactobacillus johnsonii LJI), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 및 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항의 방법에 의해 제조된 균체 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 조성물.
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