KR102546934B1

KR102546934B1 - 락토바실러스 람노서스 kcc-51 균주 및 이를 포함하는 조성물

Info

Publication number: KR102546934B1
Application number: KR1020210043477A
Authority: KR
Inventors: 최기춘; 사운드라젠 일라베닐; 박형수
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-04-02
Filing date: 2021-04-02
Publication date: 2023-06-23
Also published as: KR20220138495A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 이용한 사일리지 및 헤일리지에 관한 것으로, 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주와, 상기 균주, 상기 균주의 배양액, 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물과, 상기 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제와, 상기 균주를 포함하는 사료용 조성물과, 트리티케일에 상기 균주를 배합하여 발효시키는 사일리지 제조 방법과, 상기 방법으로 제조된 사일리지를 제공한다.

Description

락토바실러스 람노서스 KCC-51 균주 및 이를 포함하는 조성물{LACTOBACILLUS RHAMNOSUS KCC-51 STRAIN AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME}

본 발명은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(수탁번호: KACC 92336P) 균주 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

엔실링(ensiling)은 수십 년 동안 마초를 보존하기 위해 사용된 혐기성 조건의 발효 공정이고, 자발적인 젖산 생산이 가능하여 식물 재료를 보존하는데 사용된 필수 공정이다. 이 방법은 반추 동물에게 일관성이 있는 사료 공급을 제공할 수 있어 전 세계적으로 큰 주목을 받은바 있다.

그러나, 식물의 호기성 산화, 식물에 부정적인 영향을 주는 미생물 역학, 단백질 분해 활동, 원치 않는 발효, 및 아미노산 탈아미노화 및 탈카르복실화 등이 발생하여, 마초 보존에 부정적인 영향을 미치고 에너지 및 영양소 손실을 높이며 항 영양 화합물을 축적하는 경우가 있다.

따라서, 사일리지 및 사료 산업의 주요 목표는 식물 사일리지의 영양 성분, 호기성 안정성, 및 흡광도 효율성을 개선하는 것이다. 일반적으로 유산균은 사일리지 발효의 신속한 유도를 통해 밀봉된 상태에서 마초 보존에 중요한 역할을 한다. 그러나, 사료 산업에서 공장의 토착 유산균은 현 산업 요구 사항을 충족하기에 충분하지 않다.

따라서 영양분이 보존된 양질의 사일리지, 특히 유산균을 만들기 위해서는 별도의 접종액이 필요하다.

한국공개특허공보 제10-2016-0002751호 한국등록특허공보 제10-1627806호 한국공개특허공보 제10-2018-0021777호

본 발명은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주, 이를 포함하는 조성물, 및 이를 이용한 사일리지 및 헤일리지를 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 제공한다.

본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 16S rRNA를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주, 상기 균주의 배양액, 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 균주는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공한다.

본 발명은 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 포함하는 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 트리티케일에 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 배합하는 배합 단계; 및 상기 배합 단계의 결과물을 밀봉하여 발효시키는 발효 단계를 포함하여 사일리지를 제조하는 사일리지 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 사일리지는 저 수분 사일리지일 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에 있어서, 상기 저 수분 사일리지는 상기 트리티케일 중량의 40% 내지 50% 수분 함량인 상기 트리티케일을 포함할 수 있다.

본 발명은 사일리지 제조 방법을 이용하여 제조된 사일리지를 제공한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주는 우수한 항균 활성과 위액, 십이지장액, 및 장액에서 생존력을 가진다. 본 발명의 KCC-51 균주를 포함하는 조성물은 우수한 프로바이오틱스 효과를 가지므로, 사료, 사일리지, 및 헤일리지 등 다양한 형태로 활용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주의 동결 건조된 ECS의 농도 및 시간에 따른 항균 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2a 내지 도 2d는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주의 프로바이오틱 특성을 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주, 상기 균주 또는 그 배양액 등을 포함하는 항균용 조성물, 상기 균주 또는 그 배양액 등을 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제, 상기 균주 또는 그 배양액 등을 포함하는 사료용 조성물, 상기 균주 또는 상기 조성물 등을 트리티케일에 첨가하는 사일리지 제조 방법, 및 상기 사일리지 제조 방법을 이용하여 제조된 사일리지임을 특징으로 한다.

본 발명은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 제공할 수 있다. 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 16S rRNA를 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주, 상기 균주의 배양액, 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공할 수 있다.

본 명세서에서 “배양액”은 균주를 배지에 접종하고 일정시간 배양하여 얻은 결과물로서, 본 발명에 따른 균주를 적합한 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액을 초음파 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액, 상기 배양액, 여액, 및 파쇄액 등을 농축한 농축한 농축액 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항균용 조성물은 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 대해 항균 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명은 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제를 제공할 수 있다.

본 발명은 사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 포함하는 사료용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 트리티케일에 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 배합하는 배합 단계; 및 상기 배합 단계의 결과물을 밀봉하여 발효시키는 발효 단계를 포함하여 사일리지를 제조하는 사일리지 제조 방법을 제공할 수 있다.

본 발명은 상기 사일리지 제조 방법을 이용하여 제조된 사일리지를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 “사일리지”는 식물 생산이 어려운 한겨울과 같은 시기에 소 등 반추동물에게 신선한 식물사료(조사료)를 공급하기 위한 저장기술 및 상기 저장기술로 제조된 식물사료를 의미한다. 바싹 마른 건초와 달리, 가축이 먹기 좋게 적당한 수분이 있는 상태로 작물을 저장하는 것이 바로 사일리지이다. 사일리지는 또 다른 이름으로 엔실리지(ensilage), 매초, 또는 담근 먹이라고도 부른다. 논에 비닐로 포장하여 만들어진 곤포 사일리지가 가장 일반적이지만, 이 외에도 사일리지를 수직으로 쌓는 탑형 및 땅에 구덩이를 파고 사일리지를 발효시키는 트렌치형 등 다양한 방식으로 사일리지를 저장할 수 있다. 사일리지는 발효시킨 조사료를 쓰기 때문에 단백질, 비타민, 및 카로틴 등의 함량이 높아, 가축 먹이로 알맞을 뿐만 아니라, 저장기간 동안 영양소 손실이 적고, 저장하는데 날씨의 영향을 크게 받지 않는 장점이 있다.

또한, 사일리지는 수분 함량이 다소 많은 생초류, 근채류, 엽체류, 또는 농가부산물 등을 대상으로 제조될 수 있으며, 일례로, 옥수수, 청예대두, 완두, 목초류, 야초류, 고구마줄기, 무 잎, 배추 잎, 감자, 고구마, 기타 근채류, 전분박, 양조박, 가축배설물, 밀, 호밀, 보리, 총체맥류, 이탈리안 라이그라스, 및 트리티케일 등 다양한 재료로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시 예에 있어서, 사일리지는 트리티케일로 제조될 수 있다.

본 명세서 내에서 “트리티케일”은 밀을 모본으로 하고 호밀을 부본으로 하여 교잡한 다음 염색체를 배가시켜 만든 1년생 초본식물이다. 이름도 밀의 학명인 트리티컴과 호밀의 학명인 씨케일을 합성하여 트리티케일이라 불리며, 과거에는 호밀과 한국어 밀을 합쳐 라이밀이라고 불리기도 했다. 트리티케일은 추운 지역이나 척박한 토양환경에서도 잘 적응하여 높은 수량을 내는 위해 밀의 높은 수량성과 호밀의 악조건의 견디는 능력을 조합한 작물이다. 따라서 밀이나 보리가 재배되기 어려운 추운 지역이나 열악한 환경에서도 재배가 가능하다. 뿐만 아니라, 트리티케일은 높은 수준의 밀 단백질과 호밀 라이신을 함유하고 있기 때문에 식용으로도 적합한 곡물이다.

또한, 사일리지는 수분 함량에 따라 세분화될 수 있다. 예를 들어, 고 수분 사일리지(일반적인 사일리지)는 수분 함량이 재료 중량의 약 60% 내지 약 70%인 사일리지를 의미하고, 저 수분 사일리지(헤일리지; Haylage)는 재료의 수분 함량이 재료 중량의 약 30% 내지 약 60%인 사일리지를 의미한다.

본 발명의 사일리지는 저 수분 사일리지인 것을 제공할 수 있다.

본 명세서 내에서 “저 수분 사일리지”는 헤일리지(Haylage)라고도 불리고, 건초 또는 사일리지의 중간 개념으로 건초보다는 수분 함량이 높고 사일리지보다는 낮은 사일리지를 의미하며, 일반적으로 저 수분 사일리지는 사일리지 재료 중량의 약 30% 내지 약 60% 수분 함량인 상기 사일리지 재료로 제조된 사일리지를 의미한다. 예를 들어, 저 수분 사일리지는 사일리지 재료 중량의 약 35% 내지 약 55% 수분 함량인 상기 사일리지 재료로 제조될 수 있다. 본 발명의 일 실시 예에 있어서, 저 수분 사일리지는 사일리지 재료 중량의 약 40% 내지 약 50% 수분 함량인 상기 사일리지 재료로 제조될 수 있다.

이하, 실시 예 및 실험 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시 예 1] 유산균 박테리아의 분리

트리티케일(Triticale) 샘플은 2018년 한국 전북 장수에서 동일한 땅의 여러 장소에서 수집되었고, 무균 증류수로 10배 연속 희석하는 효과적인 유산균(LAB; Lactic Acid Bacteria) 분리 방법을 진행하기 위해 실험실로 옮겼다. MRS(Man Rogosa and Sharpe) 고체 배지(agar)를 사용하여 유산균 콜로니를 분리하고, BCP(Bromo Cresol Purple) 고체 배지에서 정체를 확인했다. 또한, 16S rRNA 서열과 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 블라스트 툴을 사용하여 게놈 수준에서 유산균의 종을 확정하였다.

16S rRNA 서열 및 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 분석 결과, KCC-51은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주로 나타났다. 상기 균주의 서열은 NCBI 데이터베이스(GenBank Accession Numbers MW015793)에 기탁되었다. 또한, 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주를 국립농업과학원 미생물은행(KACC; Korean Agricultural Culture Collection)에 기탁하여 수탁번호 KACC 92336P를 부여받았다. 모든 유산균 콜로니는 각각 단기 및 장기 보관을 위해 MRS 고체 배지 플랫과 20% 글리세롤 용액에서 보존되었다.

[실시 예 2] 배양액 생성

락토바실러스(Lactobacillus. sp) 종을 MRS 액체 배지(CONDA, Madrid, Spain)에 접종하고, 32℃에서 24시간 동안 배양했다. 다음 1 ㎖ 배양액을 추출하여 10분 동안 4000g 조건으로 원심분리하고 상청액을 버렸다. 펠렛은 PBS(Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4)로 3번 세척하였다. 박테리아 콜로니는 퀀텀(QUANTOM^TM) 생존 세포 염색법(Logos biosystem, 경기도, 대한민국)을 사용하여 계수하였다. 간단히 말해서, 펠렛은 퀀텀(QUANTOM^TM) 생존 세포 희석 완충액으로 희석되었고, 희석된 세균 배양액 10㎕를 2㎕ 퀀텀(QUANTOM^TM) 생존 세포 염색 염료와 혼합한 후 어두운 곳에서 37℃ 조건에서 30분 동안 배양하였다. 다음으로, 8㎕ 퀀텀(QUANTOM^TM) 세포 로딩 버퍼를 사용하고 기포를 생성하지 않도록 부드럽게 혼합하였다. 그 후, 6㎕의 샘플을 퀀텀(QUANTOM^TM) M50 세포 계수 슬라이드에 로드하고 퀀텀(QUANTOM^TM) 원심분리기에서 300g 조건에서 10분 동안 원심분리하였다. 박테리아 콜로니는 대부분의 박테리아 세포에 대해 광도 수준이 9로 설정된 퀀텀(QUANTOM^TM)으로 계수되었다. 사일리지 생산에 쓰일 박테리아를 수확하기 위해, 배양액을 원심분리하고 PBS로 세척한 후 멸균 증류수(최종농도 1*104/㎖)에 희석하였다.

[실시 예 3] 트리티케일(triticale) 사일리지 생산

2019년 한국 전북 장수에서 출수기에 조선 품종 트리티케일을 수확하고 고 수분 사일리지를 제조하는 경우 8시간 내지 10시간, 저 수분 사일리지를 제조하는 경우 24시간 내지 36시간 동안 방치하였다. 각 단계에서 나온 300g의 트리티케일을 마초 절단기로 이론상 1.5cm 내지 2.5cm로 잘게 절단했다. 각각의 샘플들은 28cm*36cm 크기의 사일리지 백(Aostar Co.,Ltd., Seoul, Korea)에 포장되었다.

실험은 각 수분 정도(고 수분 및 저 수분)에서 2개의 그룹으로 무작위 구분하여 5개의 복제품을 대상으로 했다. 실험 그룹은 그룹 I을 대조군(비접종, 3㎖ 물), 그룹 II를 제1 실험군인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)*104 CFU/㎖(1㎖ 접종액 및 2㎖ 물)로 구성하였다. 진공포장기(Food saver V48802, MK Corporation, Seoul, Korea)를 사용하여 모든 사일리지 백에 포함된 공기를 제거하였다.

[실험 예 1] KCC-51 균주의 특징

앞서 [실시 예 1]에 개시된 균주(KCC-51)를 조사한 특징은 다음 하기 표 1과 같다.

[표 1]

상기 표 1을 참조하면, 유력한 락토바실러스 균주는 트리티케일 마초 샘플에서 항균 활성을 기반으로 분리 및 선택되었으며, 이 균주가 그람 양성, 막대 모양, 및 비운동성 특성을 가진 카탈라아제에 음성인 물리 화학적 특성임을 확인했다.

[실험 예 2] 탄수화물 발효 테스트

탄수화물 발효 실험은 상기 [실시 예 1]의 균주를 대상으로 API-CH50(France, Marcy-I`Etoile)을 사용하여 진행되었다. 상기 개시된 탄수화물 발효 실험의 결과는 하기 표 2에 기재하였다.

[표 2]

상기 표 2를 참조하면, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주는 다양한 탄수화물 기질을 발효하였다. 특히, 디-칼락토스(D-Galactose), 디-글루코스(D-Glucose), 디-프럭토스(D-Fructose), 디-만노스(D-Mannose), 엘-소보스(L-Sorbose), 디-만니톨(D-Mannitol), 디-소비톨(D-Sorbitol), 메틸-알파-디-글루코시드(Methyl-alpha-D-glucoside), 아미그달린(Amygdalin), 알부틴(Arbutin), 에스쿨린 페릭 시트레이트(Esculin ferric citrate), 디-셀로비오스(D-Cellobiose), 디-락토스(D-Lactose), 디-트레할로스(D-Trehalose), 디-멜레치토스(D-Melezitose), 디-투라노스(D-Turanose), 디-타가토스(D-Tagatose), 및 포타슘 2 세토글루코네이트(Potassium 2-cetoGluconate)에 강한 발효능을 갖는 것을 확인하였다.

[실험 예 3] 세포 외 효소 분비 실험

세포 외 효소 분비 실험은 상기 [실시 예 1]의 균주를 대상으로 API-ZYM(France, Marcy-I`Etoile)을 사용하여 진행되었다. 상기 개시된 세포 외 효소 분비 실험의 결과는 하기 표 2에 기재하였다.

[표 3]

상기 표 3을 참조하면, 이러한 균주가 식품 및 가죽 산업에서 많은 응용 분야를 가진 다양한 효소를 분비한다는 점을 확인하였다. 특히, 알칼리 포스파타제(Alkaline phosphatase), 에스터레이즈(Esterase), 에스터레이즈 리파제(Esterase lipase), 리파제(Lipase), 류신 아릴아미다제(Leucine arylamidase), 발린 아릴마이다제(Valine arylamidase), 알파-키모트립신(alpha-Chymotrypsin), 애시드 포스파타아제(Acid phosphatase), 알파-글루코시다제(alpha-Glucosidase), 및 알파-푸코시다제(alpha-Fucosidase) 효소들을 강하게 분비하였다.

[실험 예 4] 항생제 감수성 검사

항생제 감수성 검사는 상기 [실시 예 1]의 균주를 대상으로 진행되었다. 상기 개시된 항생제 감수성 검사의 결과는 하기 표 4에 기재하였다.

[표 4]

상기 표 4를 참조하면, 상기 균주 모두 테스트된 거의 모든 항생제에 대해 강한 민감성을 갖고 있음을 보여준다. 특히, 클로람페니콜(Chloramphenicol), 카나마이신(Kanamycin), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 테트라사이클린(Tetracycline), 스트렙토마이신(Streptomycin), 설파푸라졸(Sulphafurazole), 콜리스틴 메탄 설포네이트(Colistin methane sulphonate), 디클록사실린(Dicloxacilline), 암피실린(Ampicillin), 젠타마이신(Gentamicin), 세파렉신(Cefalexin), 및 세프록심(Cefuroxine)에 강한 민감성을 갖는 것을 확인했다.

[실험 예 5] 항균 활성

유산균 세포 외 대사 산물의 항균 활성(well diffusion assay, time-killing assay against Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, 및 Staphylococcus aureus)은 이전에 공지된 연구(Soundharrajan, I.; Kim, D.; Kuppusamy, P.; Muthusamy, K.; Lee, H.J.; Choi, K.C. Probiotic and Triticale Silage Fermentation Potential of Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus brevis and Their Impacts on Pathogenic Bacteria. Microorganisms 2019, 7, 318)에 따라 진행되었다. 상기 연구에 따른 항균 활성 실험(well-diffusion assay and time-dependent killing assay)을 통해 병원성 균주의 생존력에 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주의 세포 외 상청액(ECS; Extracellular Supernatant)이 미치는 영향에 대해 조사했다. 상기 항균 활성 실험의 결과는 하기 표 5와 같다.

[표 5]

상기 표 5를 참조하면, KCC-51 균주의 ECS(Extracellular Supernatant)는 엔테로코커스 패칼리스(E. faecalis; Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(E. coli; Escherichia coli), 슈도모나스 아에루지노사(P. aeruginosa; Pseudomonas aeruginosa), 및 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus; Staphylococcus aureus)에 대항하는 상당한 항균 활성을 나타냈다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P)의 CFS(Cell Free Supernatant)는 E. coli에 대해 최대 억제 영역을 나타냈고, E. faecalis, P. aeruginosa, 및 S. aureus에 대해 다소 낮은 억제 영역이 나타났다.

도 1a 내지 도 1d는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주의 동결 건조된 ECS의 농도 및 시간에 따른 항균 활성을 나타낸 그래프이다.

도 1a 내지 도 1d를 참조하면, 병원성 균주의 생장 농도 및 시간 기반 억제 정도에 있어서, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주의 동결건조된 CFS의 항균 활성을 확인했다. 병원성 균주는 두 균주의 동결건조된 CFS의 다른 농도로 처리되고 48시간 동안 배양되었다. 시간-의존적 분석은 다양한 농도(T1: 20㎎/㎖, T2: 10㎎/㎖, T3: 5㎎/㎖, T4: 2.5㎎/㎖, T5: 1.25㎎/㎖)에서 CFS 처리가 병원성 세균의 생장을 억제하는 것으로 나타났다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주의 CFS 농도가 증가하면 모든 박테리아의 생장이 감소했다.

[실험 예 6] 프로바이오틱 특성

프로바이오틱 특성(위, 십이지장 및 장액에서의 생존율, 소수성, 자가 응집, 및 공동 응집)은 이전에 공지된 연구(Soundharrajan, I.; Kim, D.; Kuppusamy, P.; Muthusamy, K.; Lee, H.J.; Choi, K.C. Probiotic and Triticale Silage Fermentation Potential of Pediococcus pentosaceus and Lactobacillus brevis and Their Impacts on Pathogenic Bacteria. Microorganisms 2019, 7, 318)에 따라 진행되었다.

락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주는 우수한 항균력을 보였기 때문에, 위장관(GIT; Gastrointestinal Tract)에서의 생존력, 소수성, 응집 특성을 포함하는 프로파이오틱 잠재력을 확인했다. 여기서, 가장 뛰어난 프로바이오틱 균주를 선택하기 위한 필수 기준인 GIT 조건에서 상기 균주의 생존력을 확인하기 위해 GIT액(Gastrointestinal, Duodenal, and intestinal juices)를 사용하여 실험을 진행하였다.

도 2a 내지 도 2d는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주의 프로바이오틱 특성을 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2a 내지 도 2d를 참조하면, 상기 균주는 GIT의 거친 조건에서 3시간 배양 후에 상당한 비율로 생존할 수 있었다. 무극성 용매 자일렌(xylene) 및 산성 용매 클로로포름(chloroform)으로 이 균주의 소수성을 확인하였다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주는 30분 배양 후에 52.5% 생존 비율이 나타났고, 60분 배양 후에 63.4% 생존 비율이 나타났다. 탄화수소와 균주의 친화력은 배양 시간이 늘어날 때 증가했다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주는 클로로포름에 비해 자일렌과의 친화력이 더 높았다. 상기 균주의 자가 응집은 침강 특성과 명확한 솔루션 개발을 기반으로 수행되었다. 이 균주는 90분 배양 시에 더 높은 자가 응집 특성(>70%)을 나타냈다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주는 30분 배양 후에 45.4 ± 2.6% 생존 비율이 나타났고, 60분 배양 후에 58.4 ± 5.9% 생존 비율이 나타났으며, 90분 배양 후에 80.5 ± 0.8% 생존 비율이 나타났다. 결론적으로, 상기 응집 연구는 상기 균주가 시간 의존적인 조건에서 E. coli와 유사한 응집 능력을 보유함을 보여주었다.

[실험 예 7] 사일리지의 영양 성분 함량

총 20개의 사일리지 백을 준비하였고 180일 동안 실험실 조건에서 보관하였다. 180일에 개봉한 후, 사일리지의 pH 및 CP, ADF(AOAC, 2000), NDF(Van Soest et al., 1991), 및 TDN(TDN=89.9-(ADF*0.79) 같은 영양 성분 함량을 측정했다.

180일 째에 비접종 사일리지와 접종 사일리지의 pH와 영양 성분을 확인했다. 확인된 상기 pH와 영양 성분의 결과는 하기 표 6과 같다.

[표 6]

상기 표 6을 참조하면, 확인한 결과, 접종의 첨가가 트리티케일의 건조 물질(DM; Dry Matter) 및 영양 성분(CP, ADE, NDF, and TDN)에 영향을 미치지 않았다. 고 수분(pH 6.12) 및 저 수분(pH 5.85)의 두 비접종 사일리지에서 더 높은 pH 레벨이 나타났는데, 이는 식물에 있는 토착 유산균이 사일리지의 pH를 낮추기에 충분하지 않으며 식물에 있는 천연 유산균이 밀봉된 상태에서 발효를 향상시킬 수 있는 능력이 없다는 것을 의미한다. 그러나, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주 접종제(High moisture: pH 4.29 and low moisture: pH 4.62)의 첨가는 비접종 사일리지(pH 6.12; p < 0.05)에 비해 고 수분 및 저 수분인 트리티케일 사일리지의 pH를 더 낮췄다.

[실험 예 8] 사일리지의 발효 대사 산물 및 미생물 계수의 정량화

각 사일리지 샘플 10g을 실험실 블렌더에서 90㎖와 3분 동안 혼합했다. 혼합물을 이중층의 멸균된 무명천으로 여과하고 세 포션(portion)으로 나눴다. 포션 I(Portion I)은 보정된 pH 미터(lab pH meter, Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA)를 사용하여 샘플의 pH를 측정했다. 포션 II(Portion II)는 HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 시스템(HP1100 Agilent Co., Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 젖산, 아세트산, 및 부티르산과 같은 발효 대사 산물의 정량화를 진행했다. 포션 III(Portion III)은 총 균, 유산균, 곰팡이, 및 효모의 정량화에 사용했다. 추출액의 10배 연속 희석은 멸균 증류수에서 진행되었다. 유산균을 위한 MRS 고체 배지에 각 샘플의 100㎕를 부었다; 총 박테리아의 경우 영양 한천에 넣어서, 효모 및 곰팡이의 경우 페트리접시에 1㎖를 넣어서 계수를 계산(3M Microbiology Products, USA)하며, 30±2℃(48h for LAB and 72-120h for yeast and mold)에서 배양하였다. 앞서 논의한 바와 같이, 퀀텀(QUANTOM^TM) 생세포 염색 키트를 사용하여 샘플의 총 박테리아를 정량화했다.

앞서 개시된 실험들은 2개의 처리와 처리마다 5개의 반복을 포함하는 무작위 설계였다. 분산 분석(one-way ANOVA, multivariate analysis, included post hoc, Duncan and descriptive analysis parameters)을 사용하여 SPSS16 소프트웨어로 대조군과 실험 샘플 간의 유의한 차이를 분석한 다음 최소 유의성 차이 테스트를 수행했다. 0.05 미만의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주가 사일리지의 pH를 상당히 낮췄기 때문에, 비접종 사일리지와 접종 사일리지의 밀봉된 사일리지에서 발견되는 주효 발효 산을 정량화했다.

상기 정량화의 결과는 하기 표 7과 같다.

[표 7]

상기 표 7을 참조하면, 고 수분 및 저 수분인 비접종 트리티케일 사일리지는 젖산(high: 0.04 vs. low: 0.05 DM% lactic acid)이 낮았고 부티르산(high: 0.06 vs. low: 0.027 DM% butyric acid)이 높았는데, 이는 식물의 토종 균이 발효 과정을 유도하기에 충분하지 않으며 통제된 조건에서 사일리지의 pH를 낮추지 못함을 의미한다. 그러나, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주를 첨가하면 고 수분 및 저 수분인 사일리지 모두에서 대조군에 비해 아세트산의 한계 량과 함께 젖산의 양이 급격하게 증가하고, 이는 접종제 처리로 성공적인 발효 및 사일리지의 산성화가 강화됨을 의미한다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주를 첨가하면 대조군 사일리지(0.20 DM%)에 비해 저 수분인 사일리지에서 아세트산의 레벨(0.22 DM% acetic acid)이 약간 증가했다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주가 처리된 고 수분 사일리지는 대조군에 비해 아세트산의 양이 약간 증가했다.

상기 미생물 계수의 정량화는 하기 표 8과 같다.

[표 8]

상기 표 8을 참조하면, 비접종 사일리지에서 총 균의 수와 유산균의 수는 더 낮고 효모 수는 더 많았다. 이는 접종된 사일리지에 비해 비접종 사일리지의 젖산 농도가 더 낮은 주요 요인이다. 대조적으로, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주로 처리한 사일리지에서는 총 균의 수와 유산균의 수는 더 높고, 효모 수는 더 적었다. 비접종 및 접종 트리티케일 사일리지 모두에서 곰팡이는 검출되지 않았다.

상술한 바와 같이 본 발명에서는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51 균주가 다양한 탄수화물 기질 발효능, 식품 및 가축 산업에 유용한 여러 종류의 세포 외 효소 생상능, 15종의 항생제에 대한 우수한 항생제 감수성, 주요 균주들에 대한 강력한 항균 활성, 소수성, 응집 특성, 저 수분 및 고 수분 조건에서 산성화 증가, 및 위액, 십이지장액, 및 장액에 대한 내성 등을 보유함을 실험 예로 밝히고 있으며, 상기 균주를 이용함으로써, 원치 않는 미생물의 성장이 억제된 고품질의 사일리지를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시 예에 따른 사일리지는 일반적인 사일리지인 고 수분 사일리지뿐만 아니라, 저 수분 사일리지(헤일리지)로 제조할 수 있다.

이상 설명한 내용을 통해 당업자라면 본 발명의 기술 사상을 일탈하지 아니하는 범위에서 다양한 변경 및 수정이 가능함을 알 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 기술적 범위는 명세서의 상세한 설명에 기재된 내용으로 한정되는 것이 아니며 특허 청구의 범위에 의해 정해져야만 할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC92336P

20210202

<110> REPUBLIC OF KOREA(RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> LACTOBACILLUS RHAMNOSUS KCC-51 STRAIN AND COMPOSITION COMPRISING THE SAME <130> FP-2012069-KR <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1428 <212> RNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 1 tcgaacgagt tctgattatt gaaaggtgct tgcatcttga tttaattttg aacgagtggc 60 ggacgggtga gtaacacgtg ggtaacctgc ccttaagtgg gggataacat ttggaaacag 120 atgctaatac cgcataaatc caagaaccgc atggttcttg gctgaaagat ggcgtaagct 180 atcgcttttg gatggacccg cggcgtatta gctagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg 240 caatgatacg tagccgaact gagaggttga tcggccacat tgggactgag acacggccca 300 aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg gacgcaagtc tgatggagca 360 acgccgcgtg agtgaagaag gctttcgggt cgtaaaactc tgttgttgga gaagaatggt 420 cggcagagta actgttgtcg gcgtgacggt atccaaccag aaagccacgg ctaactacgt 480 gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaagc 540 gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccctcg gcttaaccga ggaagtgcat 600 cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa 660 tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc 720 tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa 780 cgatgaatgc taggtgttgg agggtttccg cccttcagtg ccgcagctaa cgcattaagc 840 attccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca 900 caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac 960 atcttttgat cacctgagag atcaggtttc cccttcgggg gcaaaatgac aggtggtgca 1020 tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080 tatgactagt tgccagcatt tagttgggca ctctagtaag actgccggtg acaaaccgga 1140 ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta 1200 caatggatgg tacaacgagt tgcgagaccg cgaggtcaag ctaatctctt aaagccattc 1260 tcagttcgga ctgtaggctg caactcgcct acacgaagtc ggaatcgcta gtaatcgcgg 1320 atcagcacgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatga 1380 gagtttgtaa cacccgaagc cggtggcgta acccttaggg agcgagcc 1428

Claims

사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주.
제1 항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 염기서열의 16S rRNA를 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주.
제1 항에 있어서,
상기 균주는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상에 대해 항균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주.
제3 항에 따른 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들 모두를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물.
사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 포함하는 사일리지 발효용 미생물 첨가제.
사일리지 제조용 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 포함하는 사료용 조성물.
트리티케일에 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) KCC-51(기탁번호: KACC 92336P) 균주를 배합하는 배합 단계; 및
상기 배합 단계의 결과물을 밀봉하여 발효시키는 발효 단계를 포함하여 사일리지를 제조하는 사일리지 제조 방법.
제7 항에 있어서,
상기 사일리지는 상기 트리티케일 중량의 40 % 내지 50 %인 수분 함량을 포함하는 저 수분 사일리지인 사일리지 제조 방법.
삭제
제7 항 또는 제8 항에 따른 사일리지 제조 방법을 이용하여 제조된 사일리지.