JP2007269700A

JP2007269700A - 肝炎予防・治療剤および食品

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Publication number: JP2007269700A
Application number: JP2006097819A
Authority: JP
Inventors: Kenichi Matsunaga; 謙一松永
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2007-10-18

Abstract

【課題】マツタケ（Tricholoma matsutake）を利用して、安全で、長期間投与・摂取可能な、肝炎予防・治療剤および食品を提供する。
【解決手段】マツタケ（Tricholoma matsutake）、特にはマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株、の菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）のいずれかをそのまま、あるいはその乾燥物、あるいはそれらの抽出物（例えば熱水抽出液、アルカリ溶液抽出液）を含有する、肝炎（薬剤誘発タイプや先天的で自然発症タイプの肝炎など）の予防・治療剤および食品。
【選択図】図４

Description

本発明は、動物やヒトにおける肝炎の予防・治療のための薬剤および食品に関する。本発明の薬剤および食品は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。

少子・高齢社会を健康で活力あるものにするため、（財）「健康・体力づくり事業財団」により、生活習慣病などを予防し、壮年期死亡の減少、健康寿命の延伸等を目標とする２１世紀における国民健康づくり運動「健康日本２１」が提唱され、生活習慣病や高齢化に伴う障害の予防・治療のため、個人が生活習慣を改善し、病気を予防する、いわゆる“ヘルスケア（健康管理）”が求められている。このような社会的背景のもと、食品や食物のもつ機能性が注目されている。

肝臓の炎症である肝炎は、ウイルス（肝炎ウイルスＡ、Ｂ、Ｃなど）やアルコール、薬物（医薬品や毒物などの化学物質）、自己免疫、胆道疾患などにより引き起こされ、その経過パターンから、急性肝炎、肝炎が半年以上持続する慢性肝炎、および劇症肝炎に区別される。慢性肝炎が進行すると肝硬変になり、肝臓の構造は変化し、機能が低下する。

肝臓は沈黙の臓器といわれ、急性肝炎を除くと、病期が進行するまではっきりとした症状はない。特記すべき症状は全身倦怠感や右季脇部痛、吐き気・嘔吐、食欲不振、熱の持続、腹部膨満感、皮膚の痒み、クモ状血管形成などであり、日常動作が辛くなり、ＱＯＬ（quality of life；生活の質）は大きく低下する。ウイルス性肝炎のうち、Ａ型は急性であり、たまに劇症肝炎になるものの、慢性化せず、予後は良好である。一方、Ｂ型やＣ型肝炎の多くは慢性化し、肝硬変や肝臓癌に進行し、致命的な経過をたどる場合が多く、早期発見・治療が望まれている。

近年の食生活パターンやライフスタイルの変遷とともに、本疾患は増加傾向にある。日本国内の慢性肝炎の患者数は約１５０万人、肝硬変のそれは約３０万人で、ウイルス性肝炎が最も多い。これら疾患から約３万人に肝癌が発生し、年間４万人を超える人が死亡していると推定されている。また、世界総人口のおよそ３．３％にあたる１億７千万人の人がＣ型肝炎にかかっていると推定されている。

肝炎治療の基本は、安静および食事療法であり、薬物が原因の場合は薬物の投与・摂取の中止、アルコールが原因の場合は禁酒とされている。肝炎治療薬剤としては、（i）ウルソデスオキシコール酸など、肝の血液量を増加させて、肝機能を改善する「肝庇護剤」、（ii）インターフェロンαやインターフェロンβなど、ウイルスの増殖を抑える「インターフェロン製剤」、（iii）デキサメタゾンや酢酸コルチゾンなど、炎症反応と免疫反応を抑える「副腎皮質ステロイド剤」、（iv）「漢方薬」、などが挙げられるが、いずれも発熱やインフルエンザ様症状などの副作用が問題視されている。したがって、副作用が少なく、長期間投与可能な薬剤や機能性食品が求められている。

ところで、きのこ類は多用な生物活性を有することから、古くから日本人の健康に寄与してきた。例えばマツタケ〔Tricholoma matsutake（S. Ito & Imai）Sing.〕については、特公昭５７−１２３０号公報（特許文献１）に、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水または希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、およびエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示され、特許第２７６７５２１号公報（特許文献２）には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。

さらに、本発明者らにより、マツタケ熱水抽出液、マツタケアルカリ溶液抽出液、あるいはこれら抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分が免疫増強活性を有することが見出されている（国際公開第０１／４９３０８号パンフレット（特許文献３））。本発明者らはまた、マツタケの特定の菌糸体由来の部分精製画分にストレス負荷回復促進作用があることも見出した（特開２００３−０５０２２７号公報(特許文献４)）。

特公昭５７−１２３０号公報特許第２７６７５２１号公報国際公開第０１／４９３０８号パンフレット特開２００３−０５０２２７号公報

上述のようにマツタケには抗腫瘍活性、免疫増強活性、ストレス負荷回復促進作用などの種々の生理活性が含まれることが見出されている。しかしながら、本発明者の知る限りにおいて、マツタケが肝炎に対して優れた予防・治療効果を有するということについては、これまで報告がされていない。

本発明者は、マツタケが肝炎に対し優れた予防・治療効果を有することを新たに見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の課題は、マツタケを利用した肝炎の予防・治療剤および食品を提供することにある。

本発明は、マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、肝炎予防・治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、上記肝炎予防・治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭＢＰ−７３０４株である、上記肝炎予防・治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、上記肝炎予防・治療剤および食品に関する。

また本発明は、マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液である、上記肝炎予防・治療剤および食品に関する。

本発明により、安全で、安定的に大量供給が可能な、肝炎予防・治療のための薬剤および食品が提供される。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品に用いられるマツタケ〔Tricholoma matsutake（S. Ito & Imai）Sing.〕は、菌糸体、培養物（Broth）、子実体のいずれの形態のものも用いることができ、生でも乾燥したものでもよい。本発明では子実体は胞子も含むものとする。これら菌糸体、培養物（Broth）、子実体の各抽出物も用いることができる。

本発明では特にマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株が好ましく用いられる。

マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、本出願人によって新規菌株として従前に出願され（国際公開第０２／３０４４０号パンフレット）、独立行政法人産業技術総合研究所（（旧）工業技術院生命工学研究所）に平成１２年９月１４日に寄託されている。このマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、京都府亀岡市で採取したマツタケＣＭ６２７１株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養することにより菌糸体継代株を得たものであり、株式会社クレハ生物医学研究所で維持している。

マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の子実体の形態は、「原色日本新菌類図鑑（１）」（今関六也・本郷次雄編、保育社、昭和３２年発行）プレート（plate）９頁および２６頁に記載のマツタケ子実体に合致するものであった。

マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の継代は、エビオス寒天斜面培地で実施することができる。マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体をエビオス寒天平板培地に接種すると、白色の菌糸が放射状に密に生育し、大きなコロニーを形成する。走査型電子顕微鏡で観察すると、太さ１〜２μｍの枝状の菌糸体が無数に存在し、菌糸体側部に数μｍ程度の突起物が時々みられる。該菌株の菌糸体を大量培養する場合は、液体培地に接種し、静置培養、振盪培養、タンク培養等により行うことができる。

なお、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、もっぱら菌糸体の形状で継代維持または培養することが可能であるが、子実体の形状となることもある。

マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌学的性質は以下のとおりである。

（１）麦芽エキス寒天培地における培養的・形態的性質
白色の菌糸が放射状に密に生育してコロニーを形成する。接種３０日目のコロニー径は約４ｃｍである。

（２）ツアペック寒天培地、オートミール寒天培地、合成ムコール寒天培地、およびフェノールオキシダーゼ反応検定用培地における培養的・形態的性質

上記いずれの培地においても、接種後１ヶ月経過しても菌糸の発育はほとんどみられない。

（３）ＹｐＳｓ寒天培地における培養的・形態的性質
白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約５ｍｍである。

（４）グルコース・ドライイースト寒天培地における培養的・形態的性質
白色の光沢を有し、マット状に生育する。接種３０日目の生育距離は約２ｍｍである。

（５）最適生育温度および生育範囲
滅菌処理した液体培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス、ｐＨ７．０）１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、５〜３５℃の種々の温度でそれぞれ培養し、２８日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定した。その結果、菌体質量は５〜１５℃の範囲で直線的に増加し、１５〜２５℃の範囲で緩やかに増加した。２７．５℃以上ではほとんど増殖しなかった。最適生育温度は１５〜２５℃である。

（６）最適生育ｐＨおよび生育範囲
液体培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス）のｐＨを１モル／Ｌ塩酸または１モル／Ｌ水酸化カリウムで調整し、ｐＨ３．０〜８．０の種々の培地を調製して菌体の生育ｐＨを調べた。すなわち各培地をフィルター滅菌し、培地１０ｍＬを滅菌済１００ｍＬ容三角フラスコに分注した。マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種後、２２℃で培養し、フラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定した。その結果、菌体の生育限界はｐＨ３．０〜７．０、最適生育ｐＨは４．０〜６．０であった。

（７）対峙培養による帯線形成の有無
エビオス寒天平板培地に、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株のブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）と、公知の１３種類のマツタケ株（例えば、ＩＦＯ６９１５株；（財）発酵研究所）の各ブロック（約３ｍｍ×３ｍｍ×３ｍｍ）とを、約２ｃｍ間隔に対峙して植菌し、２２℃で３週間培養した後、両コロニー境界部に帯線が生じるか否かを判定した。

その結果、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、公知のマツタケ株（１３種類）のいずれの株に対しても明確な帯線を形成しなかった。なお、マツタケでは異株間対峙培養で帯線は生じないとされており、公知のマツタケ株（１３種類）間についても、明確な帯線を形成した組み合わせはなかった。

（８）栄養要求性
滅菌処理した菌根菌用合成培地（「太田培地」。Ohtaら、"Trans. Mycol. Soc. Jpn.", 31, 323-334, 1990)１０ｍＬの入った１００ｍＬ容三角フラスコに、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の種菌約２ｍｇを接種し、２２℃で培養し、４２日目にフラスコから菌体を取り出し、蒸留水でよく洗浄した後に乾燥させ、質量を測定したところ、菌体４４１ｍｇが得られた。

上記菌根菌用合成培地中の炭素（Ｃ）源であるグルコースの代わりに、２８種類の糖質関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。その結果、菌体質量が多かった糖質関連物質から菌体質量が少なかった糖質関連物質を順に示せば、以下のとおりである。

小麦デンプン＞トウモロコシデンプン＞デキストリン＞メチルβグルコシド＞セロビオース＞マンノース＞フラクトース＞アラビノース＞ソルビトール＞グルコース＞ラクトース＞グリコーゲン＞マンニトール＞リボース＞マルトース＞トレハロース＞ガラクトース＞ラフィノース＞メリビオース＞Ｎ−アセチルグルコサミン。

なお、セルロース、ダルチトール、シュークロース、キシロース、メチルαグルコシド、イヌリン、イノシトール、およびソルボースでは、菌の発育はほとんどみられなかった。

次に、上記菌根菌用合成培地中の窒素（Ｎ）源である酒石酸アンモニウムの代わりに、１５種類の窒素関連物質のいずれか１つを加えた各培地に、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。

その結果、菌体質量が多かった窒素関連物質から菌体質量が少なかった窒素関連物質を順に示せば、以下のとおりである。

コーンスティープリカー＞大豆ペプトン＞ミルクペプトン＞硝酸アンモニウム＞硫酸アンモニウム＞酒石酸アンモニウム＞炭酸アンモニウム＞アスパラギン＞リン酸アンモニウム＞塩化アンモニウム＞硝酸ナトリウム＞肉エキス＞酵母エキス＞カザミノ酸＞クロレラ＞トリプトーン＞硝酸カリウム。

さらに、上記合成培地中のミネラルおよびビタミン類のうち、特定の１成分を除去した培地に、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株を接種して培養し、培養終了後、菌体質量を測定した。

その結果、塩化カルシウム・二水和物、硫酸マンガン（II）・五水和物、硫酸亜鉛・七水和物、硫酸コバルト・七水和物、硫酸銅・五水和物、硫酸ニッケル・六水和物、塩酸アミン、ニコチン酸、葉酸、ビオチン、塩酸ピリドキシン、塩化カーチニン、アデニン硫酸・二水和物、または塩酸コリンのいずれか１つを培地から除いても、菌体質量にほとんど影響がなかった。

一方、硫酸マグネシウム・七水和物、塩化鉄（II）、またはリン酸二水素カリウムのいずれか１つを培地から除くと、菌体質量は顕著に減少した。すなわち、マグネシウム、鉄、リン、およびカリウムは、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の増殖に必須と考えられる。

（９）ＤＮＡ塩基組成（ＧＣ含量）
ＧＣ含量は４９．９％である。

（１０）ＲＡＰＤ法により生成するＤＮＡパターン
６種類の異なるＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction)用プライマー（１０ｍｅｒ）をそれぞれ単独で用いるＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）法により生成するＤＮＡパターンについて、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株と、公知の４４種類のマツタケ株（例えば、ＩＦＯ６９１５株；（財）発酵研究所）とを比較したところ、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株は、公知のマツタケ株（４４種類）のいずれとも異なるＤＮＡパターンを示した。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品は、有効成分として、（i）マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体）の生のものをそのまま、あるいはこれを乾燥粉末としたもの、（ii）マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の熱水抽出液（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体の、熱水抽出液）、（iii）マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株のアルカリ溶液抽出液（例えば、当該株の菌糸体、培養物（Broth）または子実体の、アルカリ溶液抽出液）などを含む態様が好ましく例示されるが、これら例示に限定されるものではない。

本発明では上記（i）の態様が好ましい。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物から適当な除去手段（例えば、濾過）により培地を除去しただけの状態で使用することもできるし、あるいは、培地を除去した後の菌糸体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した菌糸体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記菌糸体乾燥物を粉砕した菌糸体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の培養物（Broth）としては、例えば、培養により得られる菌糸体（すなわち培養菌糸体）と培地との混合物の状態で使用することもできるし、あるいは、前記混合物から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した培養物（Broth）乾燥物の状態で使用することもでき、さらには前記培養物（Broth）乾燥物を粉砕した培養物（Broth）乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

上記培養工程は、特に限定されるものでなく、一般にマツタケ菌を培養する方法を任意に用いることができるが、例えば、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株（「マツタケ菌I」）を固形培地または液体培地で培養または保存してマツタケ菌IIを得る工程、前記マツタケ菌IIを静置液体培養してマツタケ菌IIIを得る工程、前記マツタケ菌IIIを振盪培養してマツタケ菌IVを得る工程、前記マツタケ菌IVを１００Ｌ未満の小型培養装置を用いて、培養液中に通気を行わない攪拌培養してマツタケ菌Vを得る工程、前記マツタケ菌Vを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部攪拌培養してマツタケ菌VIを得る工程、前記マツタケ菌VIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部攪拌培養してマツタケ菌VIIを得る工程、および前記マツタケ菌VIIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養してマツタケ菌VIIIを得る工程、からなる培養方法（国際公開第２００４／０３８００９号パンフレット）が、マツタケ菌の生理活性を損うことなく大量生産できるという点から好適に用いられる。

〈マツタケ菌Iを培養または保存してマツタケ菌IIを得る工程〉
用いる培地としては、一般にマツタケ菌を培養する栄養源基質を有する培地であれば特に制限なく使用することができる。例えば、太田培地（Ohtaら、"Trans. Mycol. Soc. Jpn.", 31, 323-334, 1990）、ＭＭＮ培地（Marx, D. H., "Phytopathology", 59:153-163, 1969）、浜田培地（浜田、"マツタケ", 97-100, 1964）等が挙げられるが、これら例示に限定されるものでない。

固形培地用の固形化剤としては、カラギーナン、マンナン、ペクチン、寒天、カードラン、デンプン、アルギン酸等が好適例として挙げられる。これらのうち寒天が好ましい。

使用可能な培地の栄養源基質には、炭素源、窒素源、無機元素源などが挙げられる。

上記炭素源としては、米デンプン、小麦粉デンプン、バレイショデンプン、サツマイモデンプン等のデンプン類；デキストリン、アミロペクシン等の多糖類；マルトース、シュクロース等の少糖類；フラクトース、グルコース等の単糖類などが挙げられる。さらに麦芽エキスを挙げることができる。マツタケ菌の生長速度から、グルコースなどの単糖類が好ましい時期と、デンプン類が好ましい時期とがあるので、時期に応じた炭素源を選択し、必要に応じて組合せて使用する。

上記窒素源としては、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティーブリカー、大豆粉、大豆ペプトンなどの天然由来物質や、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素などが挙げられる。これらは単独で、あるいは組合せて用いることができる。一般に生長速度を考慮すると、天然由来物質、特に酵母エキスが好ましい。

上記無機元素源は、リン酸および微量元素を供給するために使用される。例を挙げると、リン酸塩のほか、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、マンガン、銅、鉄などの金属イオンの無機塩（例えば、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩、等）があり、必要量を培地中に溶解する。

また、培地にビタミンＢ₁などのビタミン類、アミノ酸類を添加することもできる。

さらに、使用するマツタケ菌の性質に応じて、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質などを添加することができる。植物抽出物としては、果菜類、根菜類、葉菜類などの抽出物が例示される。有機酸としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、フマル酸、乳酸などが例示される。核酸関連物質としては、市販の核酸、核酸抽出物、酵母、酵母エキスなどが例示される。

固形培地を調製する場合、炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは１０〜５０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２０〜３０ｇ／Ｌである。

窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌである。さらに他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。また、調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．０、特に好ましくは５．０〜５．５とする。

〈静置液体培養〉
次に、マツタケ菌II（マツタケ菌Iを固形培地または液体培地で培養または保存したマツタケ菌）を静置液体培養してマツタケ菌IIIを製造する方法について記載する。

通常、１００ｍＬ〜２Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。

この静置液体培養は、液体培地にマツタケ菌IIを接種することにより開始する。

接種したマツタケ菌IIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌IIを含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍となる量の液体培地を使用する。

接種したマツタケ菌IIを含有する培養液中のマツタケ菌IIの乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌IIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌IIを含有する培養液を接種する。

該静置液体培養での培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃であり、培養期間は３０〜４００日間が好ましく、より好ましくは１２０〜２４０日間である。培養期間が３０日未満、あるいは４００日超では、大量培養に適した生育能を有するマツタケ菌IIIを得ることが困難となる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）を初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加率」）が、２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点から好ましい。

静置液体培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

静置液体培養に用いる栄養源基質として、マツタケ菌Iを培養する固形培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ₁などのビタミン類、アミノ酸類等を使用することができる。

炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。通常、グルコース等の単糖類を使用する。

リン酸塩を使用する場合は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌになるようにする。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。

調製した栄養源基質溶液のｐＨを、好ましくは４〜７、より好ましくは４．５〜６．５、特に好ましくは５．０〜６．０とする。

マツタケ菌IIIを含有する静置液体培養による培養液の一部若しくは全部を、マツタケ菌IIを含有する培養液（若しくは培養物）と同様に静置液体培養の接種源として、再度、静置液体培養工程で使用することもできる。

〈振盪培養〉
次いで、マツタケ菌III（マツタケ菌IIを静置液体培養して得られたマツタケ菌）を振盪培養して、マツタケ菌IVを製造する方法について記載する。

通常、３００ｍＬ〜５Ｌ容の三角フラスコを用いて行う。

この振盪培養は、液体培地にマツタケ菌IIIを接種することにより開始する。

接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。

なお、接種時拡大倍率に見合う培養液の量を確保するために、静置液体培養を複数の培養装置を用いて製造することもできる。

接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液中のマツタケ菌IIIの乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌IIIを含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌IIIを含有する培養液を接種する。

振盪培養では、培養温度は１５〜３０℃が好ましく、より好ましくは２０〜２５℃であり、培養期間は７〜５０日間が好ましく、より好ましくは１４〜２８日間である。

振盪培養に要する動力として、通常、三角フラスコ内の培養液単位体積あたりの攪拌所要動力０．０５〜０．４ｋＷ／ｍ³を用いる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加倍率」）が２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点で好ましい。

振盪培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

振盪培養に用いられる栄養源基質として、マツタケ菌IIを培養する液体培地と同じ炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ₁などのビタミン類、アミノ酸類を使用することができる。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０２モル／Ｌになるようにする。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜添加することができる。

〈攪拌培養〉
次に、攪拌培養により、マツタケ菌V、マツタケ菌VI、マツタケ菌VII、マツタケ菌VIIIを製造する方法について記載する。

この攪拌培養は、液体培地にマツタケ菌（IV〜VII）を接種することにより開始する。以下の説明において、マツタケ菌IVは、マツタケ菌IIIを振盪培養して得られるマツタケ菌をいい；マツタケ菌Vは、マツタケ菌IVを１００Ｌ未満の小型培養装置を用いて培養液中に通気を行わない撹拌培養を行って得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIは、マツタケ菌Vを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIIは、マツタケ菌VIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいい；マツタケ菌VIIIは、マツタケ菌VIIを１００Ｌ以上の中型・大型培養装置を用いて深部撹拌培養して得られたマツタケ菌をいう。

攪拌培養で用いる液体培地は、次のようにして調製することができる。

栄養源基質は、振盪培養で使用する、炭素源、窒素源、無機元素源、ビタミンＢ₁などのビタミン類、アミノ酸類と同じものを使用することができる。

炭素源の使用量は、好ましくは１０〜１００ｇ／Ｌ、より好ましくは２０〜６０ｇ／Ｌ、特に好ましくは２５〜４５ｇ／Ｌである。デンプン類を好ましく使用できる。

攪拌を行う培養液中の浸透圧に影響するグルコースなどの単糖類を併用する場合、その使用量は、好ましくは０．１〜６０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜４０ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．７〜２０ｇ／Ｌである。

窒素源の使用量は、窒素元素相当量で０．００５〜０．１モル／Ｌが唖好ましく、より好ましくは０．００７〜０．０７モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

リン酸塩の使用量は、リン元素相当量で０．００１〜０．０５モル／Ｌが好ましく、より好ましくは０．００５〜０．０３モル／Ｌ、特に好ましくは０．０１〜０．０５モル／Ｌである。

さらに、他の無機塩、ビタミン類、アミノ酸類、植物抽出物、有機酸、核酸関連物質など、マツタケ菌の性質に応じて適宜、添加することができる。

攪拌培養に使用する液体培地は、その浸透圧を、好ましくは０．０１〜０．８ＭＰａ、より好ましくは０．０２〜０．７ＭＰａ、特に好ましくは０．０３〜０．５ＭＰａとなるように、栄養源基質を使用する。

攪拌培養の培養温度は、１５〜３０℃、好ましくは２０〜２５℃とする。

接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液と液体培地とを合せた混合物と、接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液との体積比（「接種時拡大倍率」）が、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは３〜３０倍、特に好ましくは５〜１０倍となる量の液体培地を使用する。

接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液中のマツタケ菌（IV〜VII）の乾燥菌糸体質量と、接種したマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液と液体培地とを合せた混合物の体積比（「初発菌糸体濃度」）を、好ましくは０．０１〜５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜３ｇ／Ｌ、特に好ましくは０．１〜２ｇ／Ｌとなるように、液体培地にマツタケ菌（IV〜VII）を含有する培養液を接種する。

攪拌培養で得られるマツタケ菌（V〜VII）を、さらに攪拌培養の母菌として用いる場合の培養日数は、３〜２０日間が好ましく、特には５〜１４日間である。

これらの培養日数後に、マツタケ菌（V〜VII）の乾燥菌糸体含有量が、好ましくは０．５〜１０ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜８ｇ／Ｌ、特に好ましくは１〜６ｇ／Ｌになっている培養液は、攪拌培養に適した生育能を有するマツタケ菌（V〜VII）を含有している。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加率」）が２〜２５倍となるように培養することが、生育能の点で好ましい。

他方、攪拌培養で得られるマツタケ菌（V〜VIII）を、マツタケ菌糸体として分離する場合の培養日数は５〜３０日間であり、好ましくは７〜２０日間、特に好ましくは１０〜１５日間である。

これらの培養日数から、炭素源の資化速度が著しく低下した時を培養終了とするのが好ましいが、適宜、製造サイクル、製造コスト等の製造形態に合せて決定することができる。

静置液体培養後の培養液中の乾燥菌糸体含有量（単位：ｇ／Ｌ）と初発菌糸体濃度との比（「菌糸体増加倍率」）が３５〜１００倍となるように培養することが、工業的な生産の点で好ましい。

マツタケ菌IVを含有する振盪培養で製造した培養液を、１００Ｌ以上の中型、および大型培養槽などの培養装置による攪拌培養工程で使用することもできる。

攪拌培養に使用する培養装置は、通気攪拌ができ、無菌性が確保できれば特に制限なく使用することが可能で、必要に応じて通気することができ、または通気装置を装着できるものを使用する。したがって、通常の、小型、中型および大型の培養槽、またはジャーファーメンターを使用することができる。

１００Ｌ未満のジャーファーメンターまたは小型培養槽を用いて、マツタケ菌IVの培養を行いマツタケ菌Vを製造する場合、液体培地中に通気せずに、攪拌培養を行うのが好ましい。１００Ｌ未満のジャーファーメンターまたは小型培養槽で通気を行って培養すると、菌糸が凝集し、成長点が欠失して母菌としての生育能が損われる場合があるからである。

また、１００Ｌ以上の中型、および大型培養槽などの培養装置により工業スケールで深部攪拌培養を行う場合、必要に応じて通気を行う。この場合の通気量は０．０５〜１．０ｖｖｍ、特には０．２〜０．５ｖｖｍとするのが好ましい。

攪拌培養における攪拌は、培養初期では培養液単位体積あたりの所要攪拌動力で制御する。通常、０．０１〜２ｋＷ／ｍ³、好ましくは０．０５〜１ｋＷ／ｍ³の範囲で攪拌を行うことにより、マツタケ菌糸体が良好に生育する。培養初期を過ぎれば菌が生育を始め、酸素供給量が不足し、さらに、生育した菌糸体の分散が不十分になるので、適宜、攪拌の強度を大きくすることが必要になる。当該深部攪拌では、培養初期には低通気、低撹拌速度で培養し、培養後期には高通気、高攪拌速度で培養するのが好ましい。

深部攪拌培養から得られたマツタケ菌糸体の分離・回収は、常法によって行うことができる。例えば、フィルタープレスなどによる濾過、遠心分離などである。

得られた菌糸体は、例えば蒸留水により充分に洗浄してから、次の熱水抽出工程を実施するのが好ましい。また抽出効率が向上するように、破砕物または粉体の状態に加工するのが好ましい。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の子実体としては、例えば、子実体をそのままで、または子実体を破砕した状態で使用することもできるし、あるいは、子実体から適当な除去手段（例えば、凍結乾燥）により水分を除去した子実体乾燥物の状態で使用することもでき、さらには、前記子実体乾燥物を粉砕した子実体乾燥物粉末の状態で使用することもできる。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の熱水抽出液は、例えば培養により得られるマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体（すなわち培養菌糸体）、培養物（Broth）、または子実体を熱水で抽出することにより得ることができる。

熱水抽出に用いる熱水の温度は、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株に含有される肝炎予防・治療効果を示す成分が、熱水抽出液中に充分に抽出される温度である限り特に限定されるものではないが、６０〜１００℃程度が好ましく、８０〜９８℃程度がより好ましい。

菌糸体または子実体を熱水抽出に用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物または粉体の状態に加工することが好ましい。

また抽出の際には、抽出効率が向上するように、攪拌または振盪しながら実施するのが好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常１〜６時間程度であり、２〜３時間程度が好ましい。

得られた熱水抽出液は、不要物が混在する状態で、そのまま、本発明の肝炎予防・治療剤の有効成分として用いることもできるし、あるいは不溶物を除去してから、さらにはそこから抽出液中の低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、本発明の肝炎予防・治療剤の有効成分として用いることもできる。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品における有効成分として用いられ得るマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株のアルカリ抽出液は、例えば、上述したマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の熱水抽出液の製造方法において、熱水の代わりにアルカリ溶液を用いること以外は、上記熱水抽出液の製造方法に準じた方法により得ることができる。

アルカリ溶液抽出に用いるアルカリ溶液としては、特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（ナトリウム、カリウムなど）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。アルカリ溶液のｐＨは８〜１３が好ましく、９〜１２がより好ましい。アルカリ溶液抽出は０〜３０℃程度で実施するのが好ましく、０〜２５℃程度がより好ましい。抽出時間は、例えば、菌糸体残渣の状態（例えば、破砕物または粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、アルカリ溶液のｐＨ若しくは温度、または攪拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常３０分間〜５時間程度であり、１〜３時間程度が好ましい。得られたアルカリ溶液抽出液は、そのまま、あるいは所望により中和処理を実施してから、本発明の肝炎予防・治療剤および食品に用いる。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品は、有効成分であるマツタケ、特にはマツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株、あるいはその抽出物を、単独で、あるいは所望により薬剤学的に許容し得る担体とともに、ヒトや動物に投与することができる。

本発明において「肝炎予防・治療」とは、動物やヒトなどにおいて、肝炎発症の予防、肝炎発症後（病的状態）の治療を意味するが、肝炎の発症を遅延・抑制せしめる効果も含む。また肝炎により誘発され得る疾患の発症防止効果も含む。したがって、本発明の肝炎予防・治療剤および食品の投与・摂取時期は、特に限定されるものではないが、日常的に継続投与・摂取するのが好ましい。

本発明における肝炎予防・治療効果は、肝炎のタイプを問うものでなく、いずれのタイプの肝炎に対しても奏功し得るが、特には薬剤誘発タイプや先天的で自然発症タイプの肝炎の予防・治療効果に特に優れる。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品の投与・摂取剤型としては特に限定されるものでなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、座剤、局所投与のクリーム、点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。

経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、または合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法により製造することができる。

非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内など）等が例示される。なかでも注射剤が最も好適に用いられる。

例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、または乳化剤などを任意に用いることができる。

また、本発明の肝炎予防・治療剤および食品は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の肝炎予防・治療剤および食品をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療すべき組織中に外科的に移植することができる。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品は、これに限定されるものではないが、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株あるいはその抽出物等の有効成分を０．０１〜９９質量％、好ましくは０．１〜８０質量％の量で含有することができる。

本発明の肝炎予防・治療剤および食品を用いる場合の投与・摂取量は、被投与者の年齢、性別、体重、または投与・摂取方法などに応じて適宜決定することができ、経口的にまた非経口的に投与・摂取することが可能である。

また、投与・摂取形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）やいわゆる健康食品（いずれも飲料を含む）、または飼料として飲食物の形で与えることも可能である。さらには、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨き剤、洗口剤、チューインガム、うがい剤などの形で与えることも、あるいは鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株あるいはその抽出物等の有効成分を、添加剤（食品添加剤など）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、またはうがい剤等に添加することができる。

なお、上記において、特定保健用食品は、その食品が持つ健康機能の表示が認められる食品（食品ごとに厚生労働省の許可を必要とする）をいい、栄養機能食品は栄養成分の機能を明記できる食品（厚生労働省が作成した規格基準を満たす必要あり）をいい、いわゆる健康食品とは上記保健機能食品以外の食品一般を広く意味するもので、健康補助食品等を含むものである。

次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例によってなんら限定されるものでない。

（実施例１）
［マツタケ菌糸体粉末の調製］
株式会社クレハ生物医学研究所で樹立および維持しているマツタケＣＭ６２７１株（マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株）の菌糸体を、滅菌済み培地（３％グルコース、０．３％酵母エキス、ｐＨ６．０）１００ｍＬの入った５００ｍＬ容三角フラスコ２０本に接種し、２２℃で２５０ｒｐｍの振盪培養機で４週間培養を行った。培養終了後、培養物（Broth）を濾紙濾過により菌糸体を分離し、蒸留水で充分に洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥物を粉砕して菌糸体粉末（以下、単に「ＣＭ６２７１」とも記す）２０ｇを得た。

（実施例２）
［四塩化炭素（ＣＣｌ₄）誘発肝障害に対する防御効力の評価］
ＣＣｌ₄は肝薬物代謝酵素Ｐ−４５０によって代謝され、トリクロロメチルラジカル（・ＣＣｌ₃）となり、このラジカルの連鎖反応により肝細胞膜脂質が過酸化され、肝壊死に至る肝実質細胞障害型の肝毒物である。薬物注射により再現性よく肝炎を誘導できることから、肝疾患治療薬の第一次スクリーニング法として汎用されている。そこで、ＣＣｌ₄による肝炎モデルに対するＣＭ６２７１の作用を調べた。

（i）試験動物
日本チャールスリバー（株）から７週齢の雄性Wistar（SPF/VAF Crlj:WI）ラットを購入し、１週間予備飼育の後、試験に供した。なお飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。

（ii）薬剤肝炎の誘発方法
薬剤肝炎の誘発は佐藤らの方法に準じた（佐藤ら、「実験的肝障害に対するクマヤナギの防御効果」、薬学雑誌、社団法人日本薬学会、１９９５年、第１１５巻、２９５−３０６頁）。すなわち、ＣＣｌ₄（和光純薬（株）製）を用い、日本薬局方のオリーブ油（溶媒）で２０％溶液としたものを、ラットに１．５ｍＬ／ｋｇ（ＣＣｌ₄換算で０．３ｍＬ／ｋｇ）量腹腔内投与することにより行った。

（iii）ＣＭ６２７１の投与
ＣＭ６２７１は、０．５％メチルセルロース４００ＣＰ（信越化学工業（株）製）溶液に懸濁したものをラットに経口投与した。

（iv）実験群構成、処置および結果
上記予備飼育後の雄性Wistarラットを無作為に下記のようにＡ〜Ｄ群の４群（各群：ｎ＝１０）に分け、ＣＭ６２７１１ｇ／ｋｇ／日（上記（iii））または蒸留水０．２ｍＬ／匹／日を１０日間連日経口投与し、最終投与３０分間経過後に、ＣＣｌ₄溶液（上記（ii）に示す薬剤）または日本薬局方のオリーブ油（溶媒のみ）を腹腔内注射した。

ラットの実験群構成は以下のとおりである。

Ａ群：蒸留水経口投与（１０日間）＋オリーブ油腹腔内注射［溶媒処置対照群］、
Ｂ群：ＣＭ６２７１経口投与（１０日間）＋オリーブ油腹腔注射［溶媒処置ＣＭ６２７１投与群］、
Ｃ群：蒸留水経口投与（１０日間）＋ＣＣｌ₄溶液腹腔内注射［ＣＣｌ₄処置対照群］
Ｄ群：ＣＭ６２７１経口投与（１０日間）＋ＣＣｌ₄溶液腹腔内注射［ＣＣｌ₄処置ＣＭ６２７１投与群］。

上記腹腔内注射の２４時間経過後、エーテル麻酔下でラットをと殺し、腹部大静脈より採血した。常法により血清を分離後、自動分析化学機を用いて、血清中のグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ；glutamate oxaloacetate transaminase）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ；glutamate pyruvate transaminase）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ；lactate dehydrogenase）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ；alkaline phosphatase）、ロイシンアミノペプチダーゼ（ＬＡＰ；leucine aminopeptidase）、および総ビリルビン（Ｔ−ＢＩＬ；total bilirubin）を測定した。結果を表１に示す。

また採血後、ただちに肝臓を摘出してホルマリン固定し、パラフィン包埋した。その薄切標本をヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）し、病理鑑定した。肝臓の病理鑑定については、図１、図２、図３、図４に、それぞれＡ群、Ｂ群、Ｃ群、Ｄ群の肝臓薄切標本（ＨＥ染色した肝臓病理組織）の顕微鏡写真（２０倍）を示す。

表１に示す結果から明らかなように、ＣＭ６２７１は、ＣＣｌ₄に誘導される誘導される酵素（ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、ＡＬＰおよびＬＡＰ）の増加を有意に抑制した（Ｃ群とＤ群との対比）。一方、ＣＣｌ₄を含まない溶媒（オリーブ油）のみの腹腔内注射では、ＣＭ６２７１は血清生化学パラメーターのレベルにほとんど影響を及ぼさなかった（Ａ群とＢ群との対比）。

また肝臓の病理鑑定につき、図１〜４に示す顕微鏡写真から以下のように鑑定した。

Ｃ群では、静脈中心域で肝細胞の強い変性がみられ、病巣部には壊死も存在し、組織球などの炎症細胞浸潤も散見され、また、肝小葉中心性壊死および炎症性細胞の浸潤がみられた（図３）が、Ｄ群では、全域に軽い水腫様の腫大を認めるが、グリソン鞘を含めその他に大きな変化はなく、また、中心性壊死巣は認められず、炎症性細胞もＣ群に比べて少なかった（図４）。

またＡ群、Ｂ群はともに、ごく軽度の水腫様の腫大を認めるが、著変はなかった（図１、２）。

（実施例３）
［α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）誘発肝障害に対する防御効力の評価］
ＡＮＩＴは肝薬物代謝酵素により代謝されて活性化物質に変換される。本活性化物質は肝胆上皮細胞の壊死・脱落等を引き起こし、いわゆる「肝胆系障害型」の胆汁鬱停の症状を呈する。さらに、肝障害の結果、胆汁中に排泄されるべきビリルビンや胆管上皮細胞に存在するＡＬＰ等の酵素は血液中に流出される。

（i）試験動物
実施例２と同様にして飼育した雄性Wistarラットを試験に供した。

（ii）薬剤肝炎の誘発方法
薬剤肝炎の誘発は佐藤らの方法に準じた（佐藤ら、「実験的肝障害に対するクマヤナギの防御効果」、薬学雑誌、社団法人日本薬学会、１９９５年、第１１５巻、２９５−３０６頁）。すなわち、ＡＮＩＴ（シグマアルドリッチジャパン（株）製）を用い、日本薬局方のオリーブ油（溶媒）で７５ｍｇ／ｋｇ量に調整して、ラットに経口投与することにより行った。

（iii）ＣＭ６２７１の投与
実施例２の方法と同様にして行った。

（iv）実験群構成、処置および結果
上記予備飼育後雄性Wistarラットを無作為に下記のようにＥ〜Ｈ群の４群（各群：ｎ＝１０）に分け、ＣＭ６２７１１ｇ／ｋｇ／日または蒸留水０．２ｍＬ／匹／日を１０日間連日経口投与し、最終投与３０分間経過後に、ＡＮＩＴ溶液（上記（ii）に示す薬剤）または日本薬局方のオリーブ油（溶媒のみ）を腹腔内注射した。

なおラットの実験群構成は以下のとおりである。

Ｅ群：蒸留水経口投与（１０日間）＋オリーブ油腹腔内注射［溶媒処置対照群］、
Ｆ群：ＣＭ６２７１経口投与（１０日間）＋オリーブ油腹腔注射［溶媒処置ＣＭ６２７１投与群］、
Ｇ群：蒸留水経口投与（１０日間）＋ＡＮＩＴ溶液腹腔内注射［ＡＮＩＴ処置対照群］
Ｈ群：ＣＭ６２７１経口投与（１０日間）＋ＡＮＩＴ溶液腹腔内注射［ＡＮＩＴ処置ＣＭ６２７１投与群］。

上記腹腔内注射の４８時間経過後、エーテル麻酔下でラットをと殺し、腹部大静脈より採血した。実施例２と同様の方法により、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、ＡＬＰおよびＴ−ＢＩＬを測定した。結果を表２に示す。

表２に示す結果から明らかなように、ＣＭ６２７１は、ＡＮＩＴに誘導される誘導される酵素（ＧＰＴ、Ｔ−ＢＩＬ）の増加を有意に抑制した（Ｇ群とＨ群との対比）。ＧＯＴとＬＤＨにも抑制傾向がみられた。一方、ＡＮＩＴを含まない溶媒（オリーブ油）のみの腹腔内注射では、ＣＭ６２７１は血清生化学パラメーターのレベルにほとんど影響を及ぼさなかった（Ｅ群とＦ群との対比）。

（実施例４）
［Long-Evans Cinnamon（ＬＥＣ）ラット肝障害に対する防御効力の評価］
ＬＥＣラットは、生後４ヶ月齢前後で肝炎を発症し、その約５０％は激症型肝炎により２週間以内に死亡する自然発症型の肝疾患モデルであり、第１６染色体に肝炎発症原因遺伝子が報告されている。激症型肝炎死を免れ、回復した動物は慢性肝炎に移行し、肝硬変、肝癌の経過をたどり最終的に、肝細胞癌が発生して死亡する。そこで、このモデルラットにＣＭ６２７１添加飼料を連日摂取させ、肝機能酵素の変動をモニターした。

(i)試験動物
日本チャールスリバー（株）から４週齢の雌性ＬＥＣ（SPF/VAF Crlj:LEC）ラットを購入し、１５週齢に達するまで予備飼育して試験に供した。なお予備飼育は、温度２２±５℃、湿度５０±１０％、１２時間明暗サイクルの環境下にある飼育室で行った。

（ii）飼料の調製、実験群構成および処置
飼料ＣＥ−２粉末に、実施例１で得たＣＭ６２７１（マツタケＦＥＲＭＢＰ−７３０４株菌糸体の乾燥粉末）を２質量％の割合で添加して、ＣＭ６２７１含有飼料を調製した。

対照飼料として、飼料ＣＥ−２粉末に、コーンスターチを２質量％の割合で添加して調製した。

そして、１５週齢に達したモデルラットを無作為に下記２群（各群：ｎ＝１０）に分け、それぞれの飼料を試験開始日から連日、自由摂取させた。

I群：対照飼料摂取群
II群：ＣＭ６２７１含有飼料摂取
実験期間は２０週間とし、５週間隔で４回、経時的に採血し、血清を分離し、実施例２と同様の方法により自動分析化学装置を用いて、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、ＬＡＰおよびＴ−ＢＩＬを測定した。結果を表３に示す。

表３に示す結果から明らかなように、I群（コントロール群）では、１５〜２０週齢の間に２匹、２０〜２５週齢の間に６匹が死亡した。死亡時の剖検では、肝炎と推定された。２０週齢の時点において、コントロール群の平均体重は一過性に低下したが、２５週齢以降回復して緩やかに増加した。肝機能の指標である血清ＧＯＴおよびＧＰＴの平均値は、２０および２５週齢で増加したが、３０週齢では低下した。

一方、II群（ＣＭ６２７１含有飼料摂取群）では、２０〜２５週齢にかけての肝炎死亡例は、対照群に比して少なく、体重減少の程度は低く、回復も比較的速やかであった。また、２０〜２５週齢における血清ＧＯＴおよびＧＰＴの増加は、対照群に比して緩やかであり、３０週齢では対照群とほぼ同じレベルにあった。

（まとめ）
肝疾患治療薬スクリーニング法として既に試験方法が確立している２種類の評価系および自然発症モデル動物を用いて、肝炎に対するＣＭ６２７１の作用を検討した。

ＣＣｌ₄処置群では、肝実質障害マーカーであるＧＯＴ、ＧＰＴ等の逸脱酵素が血液中に急増し、激しい急性肝障害の様相を呈した。ＡＮＩＴ処置群ではＡＬＰおよびＴ−ＢＩＬの著しい上昇を引き起こした。

また、自然発症モデル動物においては、生後２０〜２５週において劇症肝炎が発症し、６０％の個体が死亡した。これらの結果は、それぞれの実験系で、肝炎発症のタイプの違いを示唆している。

以上のことから、ＣＭ６２７１の投与が、ＣＣｌ₄およびＡＮＩＴ誘発の肝障害を防御し、自然発症モデル動物の肝炎症状を緩和し、死亡例を減少させることが確認された。

実施例２におけるＡ群の肝臓薄切標本（組織）の顕微鏡写真を示す図面代用写真である。実施例２におけるＢ群の肝臓薄切標本（組織）の顕微鏡写真を示す図面代用写真である。実施例２におけるＣ群の肝臓薄切標本（組織）の顕微鏡写真を示す図面代用写真である。実施例２におけるＤ群の肝臓薄切標本（組織）の顕微鏡写真を示す図面代用写真である。

Claims

マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、肝炎予防・治療剤。
マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項１記載の肝炎予防・治療剤。
マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭＢＰ−７３０４株である、請求項１または２記載の肝炎予防・治療剤。
マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の肝炎予防・治療剤。
マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液、である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の肝炎予防・治療剤。
マツタケ（Tricholoma matsutake）またはその抽出物を含む、肝炎予防・治療のための食品。
マツタケ（T. matsutake）が菌糸体、培養物（Broth）または子実体（胞子を含む）である、請求項６記載の食品。
マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭＢＰ−７３０４株である、請求項６または７記載の食品。
マツタケ（T. matsutake）がＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の乾燥粉末である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の食品。
マツタケ抽出物が、ＦＥＲＭＢＰ−７３０４株の菌糸体の熱水抽出液またはアルカリ溶液抽出液、である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の食品。