WO2005035571A1

WO2005035571A1 - 新規の糖タンパク質及びそれを含有する医薬組成物

Info

Publication number: WO2005035571A1
Application number: PCT/JP2004/015057
Authority: WO
Inventors: Kenichi Matsunaga; Hirotaka Hoshi
Original assignee: Kureha Corporation
Priority date: 2003-10-14
Filing date: 2004-10-13
Publication date: 2005-04-21
Also published as: US20070066515A1; JPWO2005035571A1; EP1686136A4; EP1686136A1

Abstract

　（ａ）分子量が約６０ｋＤａであり、（ｂ）糖質とタンパク質との含有比率（糖質：タンパク質）が１６．４：１．０である、新規糖タンパク質を開示する。前記糖タンパク質は、（１）マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出し、（２）得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させ、（３）前記陰イオン交換樹脂から、溶離液により吸着画分を溶出させ、（４）ゲル濾過により、分子量５０～７０ｋＤａの画分を取得することにより、調製することができる。　前記糖タンパク質は、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤の有効成分として有用である。

Description

明細書

新規の糖タンパク質及びそれを含有する医薬組成物

技術分野

[0001] 本発明は、新規の糖タンパク質並びにそれを含有する医薬組成物、例えば、新規免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤に関する。本発明の免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、若しくは抗腫瘍剤、又は本発明の新規糖タンパク質は、医薬品として投与することができるだけでなぐ種々の形態、例えば、健康食品 (好ましくは機能性食品）又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。なお、前記食品には飲料が含まれる。更には、オーラル衛生用組成物、例えば、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。なお、本明細書における免疫増強活性には、抗腫瘍活性が含まれる。

背景技術

[0002] マツタケ [Tricholoma matsutake (S. Ito & Imai) Sing. ]には種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、例えば、特許文献 1及び特許文献 2には、マツタケに含有される各種の抗腫瘍性物質が開示されている。前記特許文献 1〖こは、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水又は希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液力も分離精製されたエミタニン 5— A、エミタニン 5— B、エミタニン 5— C、及びエミタニン 5— Dに、サルコ一マ 180細胞の増殖阻止作用があることが開示されている。また、前記特許文献 2には、マツタケ子実体の水抽出物力分離精製された分子量 20— 21万のタンパク質 (サブユニットの分子量 = 10— 11万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。

[0003] また、本発明者は、マツタケ熱水抽出液、マツタケのアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換榭脂吸着画分が、免疫増強活性を有することを既に見出している (特許文献 3)。

更に、本発明者らは、特定のマツタケ株を特定の培養方法により培養して得られた菌糸体由来の部分精製画分に、免疫増強作用及びストレス負荷回復促進作用があることも既に見出している（特許文献 4)。なお、前記特許文献 4に記載の前記部分精製画分は、理化学的性質の点で、公知の画分 (例えば、前記特許文献 3に記載の陰イオン交換榭脂吸着画分)とは異なる画分である。

特許文献 1：特公昭 57— 1230号公報

特許文献 2：特許第 2767521号明細書

特許文献 3：国際公開第 WO01Z49308号パンフレット

特許文献 4:国際公開第 WO03Z070264号パンフレット

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明者は、免疫増強活性及び Z又はストレス負荷回復促進活性を有するマッタケ由来の前記抽出液又は画分に含まれる活性本体の精製を試みたが、天然由来高分子物質の複雑きわまる特性 (特に糖タンパク質)の点で、単一ピークとして単離することは容易なことではな力つた。しかし、イオン交換分離の後、分子量分画操作を組み合わせたところ、免疫増強活性、ストレス負荷回復促進活性、及び抗腫瘍活性を有する化合物を単一ピークとして単離することに成功し、更に、それが新規の糖タンノク質であることを新たに見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。

[0005] 従って、本発明の課題は、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、及び Z又は抗腫瘍剤の有効成分として有用な、新規の糖タンパク質を提供し、更に、それを含有する新規の医薬組成物、例えば、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤を提供することにある。

課題を解決するための手段

[0006] 前記課題は、本発明による、下記の性質を有する糖タンパク質：

(a)分子量:約 60kDa (ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による）

(b)糖質とタンパク質との含有比率：（糖質:タンパク質） 16. 4: 1. 0

により解決することができる。

また、本発明は、（1)マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出する工程、 (2)得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させる工程、

(3)前記陰イオン交換樹脂から、適当な溶離液により吸着画分を溶出する工程、及び

(4)前記溶出工程で得られた溶出画分を、ゲル濾過により分画し、分子量 50— 70k Daの画分を取得する工程

を含む製造方法により調製することのできる、糖タンパク質に関する。

また、本発明は、前記糖タンパク質と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する、医薬組成物に関する。

また、本発明は、前記糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤に関する。

また、本発明は、前記糖タンパク質を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫増強方法に関する。

また、本発明は、前記糖タンパク質を、ストレス負荷回復促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ストレス負荷回復促進方法に関する。

また、本発明は、前記糖タンパク質を、腫瘍の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、腫瘍の治療又は予防する方法に関する。

また、本発明は、前記糖タンパク質の、免疫増強剤若しくは免疫増強用医薬組成物、ストレス負荷回復促進剤若しくはストレス負荷回復促進用医薬組成物、又は抗腫瘍剤若しくは抗腫瘍用医薬組成物を製造するための使用に関する。

発明の効果

[0007] 本発明の免疫増強剤によれば、免疫増強が必要な対象の免疫能を増強することができる。また、本発明のストレス負荷回復促進剤によれば、ストレス負荷に対する回復を促進することができる。更に、本発明の抗腫瘍剤によれば、腫瘍を治療又は予防することができる。本発明の糖タンパク質は、前記免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤の有効成分として有用である。

発明を実施するための最良の形態

[0008] [1]本発明の糖タンパク質

本発明の糖タンパク質は、以下の性質を有する。 (1)分子量：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS - PAGE) により決定される分子量が約 60kDa (50— 70kDa)である。

(2)タンパク質含量及び糖質含量:本発明の糖タンパク質の加水分解により得られるアミノ酸量を基に算出したところ、 38.42 gZmgである。また、本発明の糖タンパク質の加水分解により得られる単糖量を基に算出したところ、 628.72/zgZmgである。糖質とタンパク質との比率 (糖質:タンパク質）は、 16.4:1.0である。

(3)脂肪酸含量:ステアリン酸 (C18:0)l.86 gZmg、パルミチン酸 (C16:0) 1.8 4 ₈ !11₈、ォレィン酸[じ18:1(9)]1.52 gZmg、リノール酸 [C18:2(9, 12)] 0.94^₈/πι₈,及びミリスチン酸（C14: 0)0.55/zgZmgである。

(4)アミノ酸糸且成：ァスパラギン酸及びァスパラギン 9.65mol%、トレオニン 6.15mo 1%、セリン 6.83mol%、グルタミン酸及びグルタミン 10. 19mol%、グリシン 8.74m ol%、ァラニン 9.84mol%、ノリン 6.94mol%、 1/2—シスチン 0. 15mol%、メチォニン 1.31mol%、イソロイシン 5.47mol%、ロイシン 9.55mol%、チロシン 2.64 mol%、フエ-ルァラニン 4.09mol%、リシン 4.99mol%、ヒスチジン 1.97mol%、アルギニン 5.00mol%、トリプトファン 1.17mol%、及びプロリン 5.33mol%である

(5)中性糖組成：グルコース 561.45 μ gZmg、マンノース 16.68 μ g/mg,ガラクト―ス 42.65 μ gZmg、及びフコース 9.57 μ gZmgである。なお、キシロースは検出限界以下である。

(6)アミノ糖組成:ダルコサミン 0.36 gZmgである。なお、マンノサミンは検出限界以下である。

(7)円偏光二色性分析 (CD)：図 7に示すスペクトルを示す。

(8)核磁気共鳴 (NMR)分析

(i) 一次元 NMR分析:本発明の糖タンパク質は、図 8に示すスペクトルを示す。ヒドラジン処理により本発明のタンパク質力もタンパク質を除いた場合には、図 9に示すスペクトルを示す。

(ii) ¹³C—次元 NMR分析：本発明の糖タンパク質は、図 10に示すスペクトルを示す。ヒドラジン処理により本発明のタンパク質力もタンパク質を除いた場合には、図 11 に示すスペクトルを示す。

(9)糖質部の糖結合位置:本発明の糖タンパク質における糖質部は、表 6に示す各結合様式を、表 6に示す割合で含む。 1→4結合のグルコースが主要な結合である。

(10)赤外分光分析 (IR)：図 12に示すスペクトルを示す。

(11)紫外分光分析 (UV)：図 13に示すスぺクトルを示す。

[0009] 本発明の糖タンパク質は、前記性質を示す限り、その由来は特に限定されるものではないが、例えば、マツタケ力も分離することができる。

前記マツタケとしては、例えば、天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、又は培養により得られるマツタケの菌糸体若しくは培養物（Broth)を挙げることができる。培養に用いる前記マツタケとしては、例えば、国際公開第 WO02Z30440号パンフレットに記載のマツタケ FERM BP— 7304株を挙げることができる。前記マツタケ FER M BP - 7304株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター [ ( 旧）工業技術院生命工学工業技術研究所 (あて名： τ 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6) ]に平成 12年 9月 14日より寄託して、るものである。このマツタケ FERM BP— 7304株は、京都府亀岡巿で採取したマツタケ CM6 271株力ゝら子実体組織を切り出し、試験管内で培養することにより、菌糸体継代株を得たものであり、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で維持している。

[0010] 本発明の糖タンパク質は、以下の操作に限定されるものではないが、例えば、マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出する工程 (以下、抽出工程と称する）、得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させる工程 (以下、陰イオン交換榭脂吸着工程と称する)、

前記陰イオン交換樹脂から、適当な溶離液により吸着画分を溶出する工程 (以下、溶出工程と称する）、

前記溶出工程において、以下に示す溶出条件で溶出された所定画分を、ゲル濾過により分画し、分子量 50— 70kDaの画分を取得する工程 (以下、ゲル濾過分画工程と称する）

を含む製造方法により、調製することができる。なお、本発明の糖タンパク質には、前記製造方法により調製された糖タンパク質が含まれるだけでなぐ前記製造方法により調製された糖タンパク質と同じ性質を示す糖タンパク質である限り、前記製造方法以外の製法で調製された糖タンパク質も含まれる。

[0011] 前記抽出工程において、マツタケとして子実体又は菌糸体を用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。

抽出工程で熱水を用いる場合には、その熱水の温度は、 60— 100°Cであることが好ましぐ 80— 98°Cであることがより好ましい。また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、マッタケの状態 (すなわち、子実体、菌糸体、又は培養物のいずれの状態である力あるいは、破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、 1一 6時間であり、 2— 3時間であることが好ましい。

[0012] 抽出工程でアルカリ溶液を用いる場合には、前記アルカリ溶液としては、これに限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）の水酸化物、特には水酸ィ匕ナトリウムの水溶液を用いることができる。前記アルカリ溶液の pHは、 8— 13であることが好ましぐ 9一 12であることがより好ましい。アルカリ溶液抽出工程は、 0— 20°Cで実施することが好ましぐ 0— 15°Cで実施することがより好ましい。アルカリ抽出工程で得られた抽出液は、中和処理を実施してカゝら次の陰イオン交換榭脂吸着工程に用いることができる。

[0013] 抽出工程で得られた抽出液は、不溶物が混在する状態で、そのまま、次の陰イオン交換榭脂吸着工程に用いることもできる力不溶物を除去してから、あるいは、不溶物を除去し、更に、抽出液中の低分子画分を除去してから、次の陰イオン交換榭脂吸着工程に用いることが好ましい。例えば、不溶物が混在する抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、得られる上清のみを、次の陰イオン交換榭脂吸着工程に用いることができる。あるいは、不溶物が混在する抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、低分子画分 (好ましくは分子量 3500以下の画分)を除去してから、次の陰イオン交換榭脂吸着工程に用いることができる。

[0014] また、抽出工程で得られた抽出液は、次の陰イオン交換榭脂吸着工程に用いる前に、脱脂工程を実施することもできる。なお、この脱脂工程と前記不溶物及び Z又は低分子画分除去工程は、いずれか一方のみを実施することもできるし、両方を実施することちでさる。

前記脱脂工程に用いる有機溶媒としては、例えば、脂溶性有機溶媒 (例えば、クロ口ホルム、メタノール、エーテル、エタノール、酢酸ェチル、又はへキサン等）又はそれらの混合物（例えば、クロ口ホルムとメタノールとの混合液）を用いることができ、クロ口ホルムとメタノールとの混合液が好ましヽ。前記有機溶媒としてクロ口ホルムとメタノールとの混合液を使用する場合には、その混合比 [クロ口ホルム:メタノール (v/v) ] は、例えば、 10 : 1— 1 : 10であることができる。脱脂工程は、 15— 30°Cの温度で実施することが好ましい。

[0015] 陰イオン交換榭脂吸着工程に用いることのできる陰イオン交換榭脂としては、公知の陰イオン交換榭脂を用いることができ、例えば、ジェチルアミノエチル (DEAE)セルロース又はトリェチルアンモ-ォェチル (TEAE)セルロースを挙げることができる。

[0016] 溶出工程に用いる溶離液は、陰イオン交換榭脂吸着工程に用いる陰イオン交換榭脂の種類に応じて適宜決定することができ、例えば、塩ィ匕ナトリウム水溶液などを挙げることができる。溶出工程により溶出される画分の内、以下に示す溶出条件で溶出された画分 (例えば、後述の実施例 2におけるフラクション B)を、次のゲル濾過分画工程に使用することができる。

例えば、前記吸着工程において、陰イオン交換榭脂として、例えば、 DEAE TOY OPEARL PAK 650M充填カラム（ φ 22mm, h20cm) ]を使用し、吸着させるサンプルを 50mmolZL— Tris— HC1緩衝液（pH7. 2)に溶解させてアプライした場合、溶出工程において、溶出液 A(50mmolZL— Tris— HC1緩衝液)及び溶出液 B (l molZL塩化ナトリウム含有 50mmolZL— Tris— HC1緩衝液）のリニアグラジェント溶出を流速 5mLZminで行い、 12分ー15分(液量15111 に溶出される画分を、次のゲル濾過分画工程に使用することができる。

[0017] ゲル濾過分画工程は、常法に従って実施することができ、分子量 50— 70kDaの画分 (例えば、後述の実施例 2におけるフラクション B— 1—2)を取得することにより、本発明の糖タンパク質が単一ピークとして含まれる画分を取得することができる。ゲル濾過分画工程は、分画範囲の異なる複数 (例えば、 2種類)のゲル濾過カラムを用いて複数段階 (例えば、 2段階)で実施することができ、例えば、分画範囲が分子量 1 X 1 0³— 1 X 10¾aであるゲル濾過カラムを使用し、前記ゲル濾過カラムにより分画された分子量 lOkDa以上の画分 (例えば、後述の実施例 2におけるフラクション B— 1)を、続いて、分画範囲が分子量 4 X 10⁴— 2 X 10⁷Daであるゲル濾過カラムにアプライし、分子量 50— 70kDaの画分 (例えば、後述の実施例 2におけるフラクション B— 1— 2)を取得することができる。

[0018] [2]本発明の医薬組成物

本発明の医薬組成物、特には、本発明の免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤は、有効成分として、本発明の糖タンパク質を含有する。

本発明の免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤は、有効成分としての本発明の糖タンパク質を、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、動物、好ましくは哺乳動物 (特にはヒト）に投与することができる。すなわち、本発明の組成物 (好ましくは医薬組成物）、例えば、本発明の免疫増強組成物 (好ましくは免疫増強医薬組成物）、ストレス負荷回復促進組成物 (好ましくはストレス負荷回復促進医薬組成物）、又は抗腫瘍組成物 (好ましくは抗腫瘍医薬組成物）は、有効成分としての本発明の糖タンパク質と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する。

[0019] 本発明の免疫増強剤における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、免疫増強活性を有する。前記免疫増強活性には、例えば、国際公開第 WO03Z070264 号パンフレットに記載の各種活性、例えば、抗腫瘍活性 [例えば、担癌個体における生存期間の延長活性、抗原発腫瘍活性 (特には、原発腫瘍の増殖抑制活性)、又は抗転移活性 (特には、転移巣の増殖抑制活性) ]、キラー活性誘導促進活性 (特には、腸管リンパ球のキラー活性誘導促進活性)、腫瘍細胞認識増強活性、インターロイキン 12 (IL— 12)遺伝子発現増強活性、又は血清 IAP値上昇活性、あるいは、 TGF - β (免疫抑制物質の 1つ)活性抑制活性などが含まれる。

本発明の免疫増強剤による治療又は予防の対象となる疾病としては、例えば、癌、感染症、自己免疫疾患、慢性疲労症候群、又は生活習慣症などを挙げることができる。 [0020] 本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することができる。

また、本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、免疫増強組成物 (好ましくは免疫増強医薬組成物)、免疫増強健康食品 (好ましくは免疫増強機能性食品）、あるいは、免疫増強用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。

[0021] 本発明のストレス負荷回復促進剤における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、ストレス負荷に対する回復促進活性を有する。本発明のストレス負荷回復促進剤による治療又は予防の対象となる疾病としては、例えば、癌、感染症、自己免疫疾患、慢性疲労症候群、又は生活習慣症などを挙げることができる。

本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ストレス負荷に対する回復促進が必要な対象に、有効量で投与することができる。

また、本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、ストレス負荷に対する回復促進組成物 (好ましくは、ストレス負荷に対する回復促進医薬組成物）、ストレス負荷に対する回復促進健康食品 (好ましくは、ストレス負荷に対する回復促進機能性食品）、あるいは、ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。

[0022] 一般に、動物に対して、単発的に、あるいは、或る期間に亘つてストレスを与えると、通常、その動物における免疫能は低下するが、前記ストレス負荷力解放されると、自発的な免疫力の回復が起こる。本明細書における「ストレス負荷に対する回復促進活性 (ストレス負荷回復促進活性)」とは、ストレス負荷から開放した後、免疫力回復期における免疫力の回復を、自発的な回復よりも促進する活性を意味する。

本発明のストレス負荷回復促進剤の投与時期は、ストレス負荷により一時的に低下した免疫力を、その投与により回復促進可能である限り、特に限定されるものではなぐ例えば、ストレス負荷の前、ストレス負荷中、及び Z又はストレス負荷から開放した後の免疫力回復期に投与することができる。

[0023] なお、本発明における前記「ストレス負荷回復促進活性」は、本発明者が見出した前記の単なる「免疫増強活性」とは異なる。すなわち、「免疫増強活性」とは、そのような活性を有する有効成分を投与した場合に、投与前の状態 (ストレスの負荷がなぐ免疫力が通常の状態であることもできるし、あるいは、ストレス負荷により、免疫力が低下している状態であることもできる）と比較して、免疫力の向上がみられる活性を一般に意味し、従って、免疫力それ自体を向上させる活性である。一方、本発明における「ストレス負荷回復促進活性」とは、前述のように、免疫力回復期における免疫力の回復を促進する活性であって、従って、免疫力の回復速度を向上させる活性である。本発明のストレス負荷回復促進剤を投与すると、本発明のストレス負荷回復促進剤を投与しない場合と比較して、免疫力の回復速度が上昇する。

[0024] 更には、「免疫増強活性」にお!/、ては、そのような活性を有する有効成分を投与すると、直接的に、免疫力の向上がみられるのに対して、本発明のストレス負荷回復促進剤における有効成分である、本発明の糖タンパク質を、予め、ストレスを負荷する前に対象動物に投与しておくと、ストレス負荷中及び免疫力回復期中に、本発明の糖タンパク質を投与しなくても、免疫力回復期において免疫力の回復が促進される。この点においても、本発明における「免疫増強活性」と本発明における「ストレス負荷回復促進活性」とは、異なる活性である。

[0025] 本発明の抗腫瘍剤における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、抗腫瘍活性を有する。なお、前記抗腫瘍活性は免疫増強活性に含まれる。前記抗腫瘍活性には、例えば、担癌個体における生存期間の延長活性、抗原発腫瘍活性 (特には、原発腫瘍の増殖抑制活性)、又は抗転移活性 (特には、転移巣の増殖抑制活性)などが含まれる。本発明の抗腫瘍剤による治療又は予防の対象となる癌としては、例えば、肺癌、胃癌、肝臓癌、結腸 ·直腸癌、脾臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病などを挙げることができる。

[0026] 従って、本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、腫瘍の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することができる。

また、本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、抗腫瘍組成物（好ましくは抗腫瘍医薬組成物)、抗腫瘍健康食品 (好ましくは抗腫瘍機能性食品）、あるいは、抗腫瘍用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。

[0027] 本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなぐ例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、ェマルジヨン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。

[0028] これらの経口剤は、例えば、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビュルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケィ酸マグネシウム、無水ケィ酸、又は合成ケィ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。

[0029] 非経口投与方法としては、注射 (皮下、静脈内等)、又は直腸投与等が例示される oこれらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。

例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩ィ匕ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。

また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビュル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。

[0030] 本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、本発明の糖タンパク質を、 0. 01— 99重量％、好ましくは 0. 1— 80重量％の量で含有することができる。本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。

[0031] また、投与形態も医薬品に限定されるものではなぐ種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品）又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。なお、前記食品には飲料が含まれる。

食品には、（1)栄養素としての働き (第一次機能)、（2)人間の五感に訴える働き（第 2次機能)の他に、（3)人間の健康、身体能力、又は心理状態に好ましい影響を与える働き (第 3次機能)、例えば、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統を調節して、健康の維持や健康の回復に好ましい効果を及ぼす働きがあることが知られている。本明細書において「健康食品」とは、健康に何らかの効果を与えるか、あるいは、効果を期待することができる食品を意味し、「機能性食品」とは、前記「健康食品」の中でも、前記の種々の生体調節機能 (すなわち、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統の調節機能)を充分に発現することができるように設計及び加工された食品を意味する。

[0032] 更には、オーラル衛生用組成物、例えば、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、本発明の糖タンパク質を、添加剤（例えば、食品添加剤）として、所望の食品 (飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤等に添カロすることができる。

実施例

[0033] 以下、実施例によって本発明を具体的に説明する力これらは本発明の範囲を限定するものではない。

[0034] 《実施例 1：活性の評価方法》

後述の実施例 2で実施したマツタケ FERM BP— 7304株菌糸体及びそれに由来する各画分の活性の評価方法として、（1)ストレス負荷に対するナチュラルキラー [ Natural Killer (以下、 NKと称する）]細胞の回復促進活性、及び（2)ヒト遺伝子組み替えトランスフォーミング増殖因子 [Transforming

Growth Factor- 18 (以下、 TGF— と称する）]結合活性を用いた。

1 1

[0035] (1)ストレス負荷に対する ΝΚ細胞活性回復促進活性の評価

ストレス負荷に対する ΝΚ細胞活性回復促進活性は、評価用サンプルをマウスに 1 0日間経口投与した後、拘束ストレスを 18時間負荷し、ストレス解放後の ΝΚ細胞活性を測定することにより、評価した。

具体的には、日本チャールズリバ一から購入した 8週齢雄性 C57BLZ6マウス (各群 = 5匹）に、評価用サンプルの水溶液を 10日間に亘つて、通常の飼育ケージ中で経口投与 (マツタケ菌糸体の 300mgZkgZ日相当量)した。続、て、マウスを前記飼育ケージ力も取り出し、空気抜けの穴を開けた 50mL容のキャップ付きポリプロピレン製遠心用チューブ (カタログ番号 2341-050 ;テクノグラス社）にマウスを 1匹ずつ閉じ込めた。このチューブ中に閉じ込められたマウスは、身動きができない状態となった。次に、それらのチューブを飼育用ケージに戻し、 18時間その状態で放置することにより、拘束ストレスを与えた。 18時間のストレスの後、チューブからマウスを取り出し、飼育用ケージに戻し、普通の環境下で飼育した。

[0036] 前記拘束ストレスを解放してから、 7日後にマウスを屠殺し、 Greenbergらの方法により（Greenberg AHら， J Exp Psychol, 12, 25-31, 1986)、以下の手順に従って、試験管内で NK感受性の腫瘍細胞株 YAC— 1に対するリンパ節細胞の細胞傷害活性を測定することにより、ナチュラルキラー (NK)細胞活性を評価した。

すなわち、マウス力も脾臓を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液 (Hanks Balanced Salt Solution)を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。 10%牛胎児血清（ 56°Cで 30分間の熱処理を実施）添加 RPMI 1640培地で細胞を 3回洗浄した後、 2 OmmolZLの 4— (2—ヒドロキシェチル）—1—ピぺラジンエタンスルフォン酸、及び 20 μ gZmLゲンタマイシンをそれぞれ添カ卩した RPMI 1640培地で、細胞濃度を 5x10 6個 ZmLに調整して得た細胞懸濁液をエフェクター細胞として用いた。

[0037] 一方、標的細胞として用いた YAC— 1細胞は、 10%牛胎児血清（56°Cで 30分間の熱処理済み)添加 RPMI1640培地中で、呉羽化学工業株式会社，生物医学研究所で継代維持したものである。前記 YAC— 1細胞にクロム酸ナトリウム（アマシャムジャパン)を加え、 37°Cで 20分間反応させた。未結合の放射性クロム酸ナトリウムを、 10 %牛胎児血清（56°Cで 30分間の熱処理済み）添加 RPMI 1640培地で 3回洗浄すること〖こより除去し、放射性クロム標識腫瘍細胞を 5xl0⁴個 ZmLに調整した。

[0038] 先に調整した前記エフェクター細胞懸濁液又はその 2倍希釈系列と、前記放射性クロム標識腫瘍細胞とを、試験管に 0. lmLずつ加え、 37°Cの 5%炭酸ガス培養器中で 4時間反応させた。なお、この際、後述する特異的傷害率を算出するために、放射性クロム標識腫瘍細胞と培地とを試験管に加えた懸濁液、そして、放射性クロム標識腫瘍細胞と界面活性剤（トリトン;最終濃度 =0. 05%)とを試験管に加えた懸濁液についても、 37°Cの 5%炭酸ガス培養器中で 4時間反応させた。反応終了後、 10% 牛胎児血清（56°Cで 30分間の熱処理済み）添加 RPMI 1640培地をそれぞれの試験管に 1. 5mLずつ加え、ミキサーでよく混合した後、遠心分離（1200rpm, 5分間， 4°C)して、上清を分離し、放射活性をガンマカウンターを用いて測定した。

[0039] 特異的傷害率 [Specific Lysis ; S. L. (単位 =%；) ]は、式：

[S. L. ] = { (B-Bf) / (Bmax-Bf) }χ100

[式中、 Bは実験群上清の放射活性 (単位 = Bq)であり、 Bfは自然遊離群上清の放射活性 (単位 = Bq)であり、 Bmaxは最大遊離群の放射活性 (単位 = Bq)である] 力も算出し、エフェクター細胞 10⁷個当り 30%の腫瘍細胞を傷害する細胞数、すなわち、「30%傷害単位（Lytic Units 30%;LU3O)」で NK細胞活性を算出した。そして、評価用サンプルの NK細胞活性値が、対照の蒸留水投与群の NK細胞活性値に対し、有意に促進されている場合 (P< 0. 05)に「促進活性あり」、有意差がない場合 (p >0. 05)に「促進活性なし」と表示した。

[0040] (2)TGF- |8 結合活性の評価

TGF— 18 結合活性は、 TGF— 18 標品と評価用サンプルとを試験管内で 2時間反応させた後、酵素免疫測定法により、結合 TGF— を定量することにより、評価した具体的には、タンパク質吸着の少な、ポリプロピレンチューブ（マルチシリコナイズチューブ， Safe Seal Microcentriluge Tube ;フナコシ）中で、 TGF— j8 標品（フナコシ )を 2%アルブミン含有リン酸緩衝液 (pH7. 2)に溶解し、 100ng/mL溶液に調整した。一方、評価用サンプルを 2%アルブミン含有リン酸緩衝液に溶解させ、 2mg/m L濃度に調整した。前記 TGF— 溶液と評価用サンプル溶液の段階希釈溶液とを 0 . 5mLずつ、タンパク質吸着の少ないチューブに入れ、 22°Cで 3時間反応させた。反応終了後、反応液中の TGF— 18 含量を市販の測定キット（Quantikine

human TGF- β ELISA kit；フナコシ）を用いて測定した。

1

[0041] 結合率 (単位 = %)は、式：

[結合率 (％) ] = { (Tc-T) /Tc}xlOO

[式中、 Tは評価用サンプル添加群の TGF— β 実測値 (単位 = ng/mL)であり、 Tc は 2%アルブミン含有リン酸緩衝液添加群の TGF— β 実測値 (単位 =ngZmL)である]により算出した。そして、評価用サンプルの TGF— 18 結合率が、 30%以上の場合に「結合活性あり」、 30%以下の場合に「結合活性なし」と表示した。

[0042] 《実施例 2 :マツタケ FERM BP— 7304株菌糸体の乾燥粉末からの活性画分の単離 )>

マツタケ FERM BP— 7304株菌糸体の乾燥粉末（ロット番号： M65T1Y1) 2. Og を、 500mL容の三角フラスコに入れ、これに 0. 2molZLの水酸化ナトリウム lOOmL を添加し、 23°Cでスターラー攪拌下、 1時間抽出した。遠心分離（12000rpm, 30分間， 4°C)の後、 1. OmolZLの塩酸で pHを 7. 0に調整し、上清 (アルカリ抽出液）と沈殿 (アルカリ抽出残渣)を回収した。アルカリ抽出液を、 500mL容の分液ロート〖こ入れ、次いでクロ口ホルムとメタノールとの混合液 [1： 1 (v/v)；以下、 ChMeと称する]を lOOmLカ卩え、 23°Cで抽出した。水層部と ChMe層部をそれぞれ回収し、凍結乾燥を実施し、それぞれの粉末 0. 5gと 0. 05gを得た。生物活性は水層部にみられた (表 1)。

[0043] [表 1] No. サンプル TGF- 結合活性 NK細胞回復促進活性

1 BP7304乾燥粉末 (初発物質） N. D. 300 mg/kgで活性あり

2 アルカリ抽出液 100 mg/mLで活性あり 150 mg/kgで活性あり

3 アルカリ抽出残渣 N. D. 300 mg/kgで活性なしアルカリ抽出液を C h M e

4 100 mg/mLで活性あり 150 mg/kgで活性あり処理した後の水層部

アルカリ抽出液を C h M e

5 100 mg/mLで活性なし 300 mg/kgで活性なし処理した後の C h M e層部

6 再構築（4と 5 ) 100 mg/mLで活性あり 150 mg/kgで活性あり

N.D. ;未試験

[0044] 次に、水層部粉末 0. 5gを 0. 05molZL— Tris塩酸緩衝液 (pH7. 2) 5mLに溶解し、前以て 0. 05molZL— Tris塩酸緩衝液で平衡化させたジェチルアミノエチル（D EAE)TOYOPEARL PAK 650M充填カラム（ φ 22mm, h20cm)にアプライし、溶出液 A (50mmolZL— Tris— HC1緩衝液)及び溶出液 B ( ImolZL塩ィ匕ナトリウム含有 50mmol/L— Tris— HC1緩衝液）のリニアグラジェント溶出を流速 5mL/mi nで行い、 280nmの吸収度を指標に分画した。

その結果、図 1に示すようなパターンを示した。得られたピークを 5つに分け、各画分を分画分子量 13000の透析膜中（外液は蒸留水)で 20時間以上透析した後、各透析膜内画分について、それぞれの生物活性を測定したところ、活性はフラクション Bにみられた (表 2)。

[0045] [表 2]

N.D. ;未試験

[0046] 更に、 B画分の前記透析膜内画分を、 0. 05molZL— Tris塩酸緩衝液で前以て平衡化させたセフアクリル（Sephacryl) S— 100 (フアルマシア社）充填カラム（ φ 16mm , h300mm)にアプライし、同緩衝液で溶出させ、 280nmの吸収度を指標に分画した。その結果、図 2に示すようなパターンを示し、得られたフラクションを 3つに分け、生物活性を測定したところ、活性はフラクション B— 1にみられた（図 3及び表 3)。

[0047] [表 3]

[0048] フラクション B— 1を、 0. 05molZL— Tris塩酸緩衝液で前以て平衡化させたセファクリル（Sephacryl) S— 500 (フアルマシア社）充填カラム（ φ 16mm, h600mm)にァプライし、同緩衝液で溶出させ、 280nmの吸収度を指標に分画した。その結果、図 4 に示すようなパターンを示し、得られたフラクションを 3つに分け、生物活性を測定したところ、活性はフラクション B— 1—2にみられた (表 4)。

[0049] [表 4]

[0050] フラクション B— 1—2を、 0. 05molZL— Tris塩酸緩衝液で前以て平衡化させた C1 8逆相カラムである Intesil EP300 (GLサイエンス社）充填カラム（ φ 4. 5mm, hl5 Omm)にアプライし、 A溶液 (0. 05%ギ酸)及び B溶液 [ァセトニトリル Z水（90ZlO ) +0. 05%ギ酸]のリニアグラジェントで溶出させ、 280nmの吸収度を記録した。その結果、図 5に示すような単一ピーク（以下、 PGと称することがある）を示した。生物活性も確認された (表 5)。初発物質に比べ、比活性は、 TGF— 18 結合活性で約 33 倍、 NK細胞回復促進活性で約 60倍に増加した。

[0051] [表 5] No. サンプル TGF-;^結合活性 NK細胞回復促進活性

1 C18逆相ク Πマト'フラクション- 1 3 mg/mLで活性あり 5 mg/kgで活性あり

[0052] 《実施例 3 :活性構造の解析》

(1)ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE)分析実施例 2で得られた PGの 5 μ gを水 10 μ Lに溶解した後、泳動バッファー (0. 25m ol/L-Tris-HCl, 2%SDS, 10%メルカプトエタノール， 30%グリセロール， 0. 01 %ブロモフエノールブルー） 10 μ Lを加え、 65°Cで 15分間熱変性させ、電気泳動を実施した。条件は以下のとおりである。

•ゲル： PAGミニ「第一」 15Z25 (第一化学）

'泳動用緩衝液：トリスグリシン'ランニングバッファー（第一化学）

•泳動条件： 35mAで 60分間泳動を行った。

•MWマーカー：各ノンド（MW= 97400, 66300, 42400) (第一ィ匕学）

•染色:銀染色

その結果、図 6に示すように、分子量が約 60kDa付近に 1本のスポットが検出された。

[0053] (2)アミノ酸組成分析

酸加水分解は、以下の手順で実施した。すなわち、 PG6. 30mgを秤量し、純水 3 . 15mLに溶解した後、 0. 22 mのフィルターで濾過し、 2mgZmLの溶液を得た。この溶液 200 /z Lをガラス試験管に採取し、エバポレーターで減圧乾固した。次いで、 6molZL塩酸 200 Lを添カ卩し、 110°Cで 22時間加水分解の後、エバポレーターで減圧乾固して残渣を得た。残渣を純水 100 Lに溶解し、その 50 Lをアミノ酸分祈に用いた。

[0054] また、アルカリ加水分解 (トリブトファン分析用）は、以下の手順で実施した。すなわち、前記 PG溶液（2mgZmL) lmLをエツペンドルフチューブに入れて減圧乾固した後、可溶性デンプン（Starch Soluble) 5mgを含む 4. 2molZL水酸化ナトリウム溶液 100 /z Lを加えた。このチューブをガラス試験管に入れ、真空封管下、 110°Cで 16 時間加水分解した。空冷後、開封し、チューブを氷中で冷却し、 6111017 塩酸30 Lを添カ卩し、中和した。更に、精製水 420 μ Lを添カ卩して総量を 500 μ Lとし、その 50 /z Lをアミノ酸分析に用いた。

アミノ酸分析の装置として日立 L 8500型アミノ酸分析計（日立製作所)を使用し、ニンヒドリン発色により定量した。

[0055] 分析の結果、アミノ酸組成は、ァスパラギン酸及びァスパラギン 9. 65mol%、トレオニン 6. 15mol%、セリン 6. 83mol%、グルタミン酸及びグルタミン 10. 19mol%、グリシン 8. 74mol%、ァラニン 9. 84mol%、ノリン 6. 94mol%、 1/2—シスチン 0. 1 5mol%、メチォニン 1. 31mol%、イソロイシン 5. 47mol%、ロイシン 9. 55mol%、チロシン 2. 64mol%、フエ-ルァラニン 4. 09mol%、リシン 4. 99mol%、ヒスチジン 1. 97mol%、アルギニン 5. 00mol%、トリプトファン 1. 17mol%、及びプロリン 5. 3 3mol%であった。

[0056] (3)タンパク質部 N末端の分析

PGを PVDF (polyvinylidene difluoride)膜にブロッテイング後、電気泳動後のゲルを PVDF膜に載せ、 50mAで 2時間、ブロッテイングした。なお、ブロッテイングバッファ一には、電気泳動バッファーに 10%容量のメタノールをカ卩えた溶液を用いた。ブロッティング後、クーマシーブリリアントブルー（CBB)染色液 [2. 5% (w/v) CBB R— 250, 25% (w/v)エタノール， 10% (w/v)酢酸]中で 15分間振盪後、脱色液 [25 % (w/v)エタノール， 10% (w/v)酢酸]で余分な染色が取れるまで脱色を行った。そして、目的のバンドを切り出し、アミノ酸シーケンス分析に用いた。

[0057] 気相シーケンサーによる N末端のアミノ酸分析は下記条件で行った。すなわち、試料を 50%メタノール Z0. 1%トリフルォロ酢酸 (TFA)、メタノールで洗浄後、乾燥し、下記の機器を用いてエドマン分解を実施し、 N末端より 8残基までアミノ酸配列検出を試みた。

•プロテインシーケンサー： Prodse _CLC 492cLC (アプライドバイオシステムズ）

• PTHアナライザー： 140D (アプライドバイオシステムズ）

• UV検出器： S200 (アプライドバイォシステムズ）

'分析プログラム： Pulsed- liquid ProSorb cLC

[0058] その結果、エドマン分解の各サイクルで複数のフエ-ルチオヒダントイン（PTH)標識アミノ酸が検出され、且つ各サイクル前後で増減ある PTH標識アミノ酸は見られず

、配列を決定することはできな力つた。

[0059] (4)円偏光二色性分析 (CD)

検体 (PG約 3mg)に精製水を添加して 2mgZmLとし、測定に使用した。測定装置として、 JASCOJ— 500Aを使用し、溶媒として水を使用した。波長範囲 2

00— 250nm、セル長 lmm、温度は室温（23°C)であり、積算回数は 8回である条件で測定した。

得られた CDスペクトルを図 7に示す。 2次構造解析の結果、 αヘリックス 21%、 β シート 34%であり、残りは不規則構造と推定された。

[0060] (5)中性糖及びアミノ糖分析

PG6. 30mgを秤量し、純水 3. 15mUこ溶解した後、 0. 22 mのフィルターで濾過し、 2mg/mLの溶液を得た。この溶液 500 Lをガラス試験管に採取し、エバポレーターで減圧乾固した。次いで、 2mol/Lのトリフルォロ酢酸 200 Lを添カ卩し、 1 00°Cで 6時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固して残渣を得た。残渣を純水 200 Lに溶解し、更に、純水で 20倍又は 200倍希釈した。この溶液 50 に内部標準物質ヘプトース 500ngを添カ卩し、カラム TSK— gel Sugar AXG 15cmx 4. 6mm ID (東ソ一）と検出器分光光度計 RF-535 (島津製作所)とを装着した高速液体クロマト装置 LC 9A (島津製作所）にアプライした。カラム温度は 70°Cであり、移動相及びその流速は 0. 5mol/Lホウ酸カリウム緩衝液 (pH8. 7)及び 0. 4mL Z分であった。ポストカラム標識の条件は、反応試薬として 1%アルギニン Z3%ホウ酸を用い、流速は 0. 5mLZ分であり、反応温度は 150°Cであり、検出波長は Ex32 Onm及び EM430nmであった。

PGの中性糖組成は、多い方から順に、グルコース 561. 45 μ g/mg,マンノース 1 6. 68 μ gZmg、ガラタト—ス 42. 65 μ g/mg,及びフコース 9. 57 μ gZmgであつた。なお、キシロースは検出限界以下であった。

[0061] 一方、前記 PG溶液 500 μ Lをガラス試験管に採取し、エバポレーターで減圧乾固した。次いで、 4molZLの塩酸 200 Lを添カ卩し、 100°Cで 6時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固して残渣を得た。残渣を純水 200 /z Lに溶解し、そのうち 50 Lを、カラム TSK— gel Sugar SGX 15cmx4. 6mm ID (東ソ一）と検出器分光光度計 RF-10AXL (島津製作所)とを装着した高速液体クロマト装置 LC-9A( 島津製作所）にアプライした。カラム温度は 60°Cであり、移動相及びその流速は 0. 0 4mol/Lホウ酸カリウム緩衝液 (pH7. 6)及び 0. 3mLZ分であった。ポストカラム標識の条件は、反応試薬として 1%アルギニン Z3%ホウ酸を用い、流速は 0. 5mL/ 分であり、反応温度は 150°Cであり、検出波長は Ex320nm及び EM430nmであつた。

PGのァミノ糖組成は、グノレコサミン 0. 36 gZmgであった。なお、マンノサミンは検出限界 (0. 2 /z gZmg)以下であった。

[0062] (6)タンパク質の定量

前記実施例 3 (2)の PG加水分解により得られたアミノ酸量を基に、タンパク質含有量を算出すると、 38. 42 /z gZmgの値になった。

[0063] (7)糖質の定量

前記実施例 3 (5)の PGの加水分解により得られた単糖量を基に、糖質含有量を算出すると、 628. 72 /z g/mgの値になった。

[0064] (8)核磁気共鳴 (NMR)分析

(i) PGの¹ H—次元 NMR分析

PG11. 6mgに D 02. 5mLを加え、超音波で約 5分間処理した。サンプル溶液に

2

は少し濁りがあった。 ¾ NMRの測定条件は以下のとおりとした。すなわち、測定装置としては、 Unity plus 500型（Varian社）を使用し、観測周波数は 500. 2MHz (¾核)である。溶媒として D O溶液を使用し、濃度は飽和溶液である。標準としてァ

2

セトン 2. 225ppmを用い、温度は 25°Cと 45°C、観測幅 8kHz、データ点 64K、パルス幅約 45° 、パルス繰り返し時間 5. 5秒、積算回数を 128回とした。

[0065] 得られたスペクトルを図 8に示す。 PG中性糖の主成分であるグルコースについて解祈した。すなわち、 25°Cの¹ H NMRでは、グルコースの 1位のプロトンに特徴的な 4 . 5ppm— 5. 5ppmに着目すると、 5. 4ppmと 5. 2ppm付近がグノレコースの α 1位と考えられる。また、 4. 65ppm付近のマイナーピーク（ダブレットピーク）は j8 1位と考えられる。 4. 75ppm— 5. 15ppm付近のピーク（45°C測定での 4. 79ppmのピークも含む）はグルコース以外の糖やタンパク質の aプロトン由来と推定される。

[0066] (ii)ヒドラジン処理 PGの¹ H—次元 NMR分析

PG糖質部の構造解析のため、タンパク質部をヒドラジン処理により除、たサンプル (以下、ヒドラジン処理 PGと称する）を調製した。すなわち、 PGを試験管（ φ 5mmxh 50mm)に入れ、ヒドラグラフ（生化学工業）内にセットし、 50°Cで 5時間真空乾燥した。次いで、無水ヒドラジン 2mLを添カ卩して 100°Cで 2時間加熱することにより、気相ヒドラジン分解を行った。ヒドラジンを留去し、残渣を純水 0. 5mLに溶解し、純水を外液にしてー晚透析した。透析内液をエバポレーターにて減圧乾固し、 NMR測定用試料とした。サンプル濃度が 7. 7mg/2. 5mLであること以外は、測定条件は実施例 3 (8) (i)と同じである。

[0067] 得られたスペクトルを図 9に示す。 25°Cの¹ H NMRスペクトルは、実施例 3 (8) (i) のそれよりもブロードであった。これは、ヒドラジン処理によりタンパク質がなくなり、多糖の濃度が増加したためと考えられる。また、実施例 3 (8) (i)でみられた 3. 66ppm の大きなピークはなくなつて、た。

グノレコースの 1位のプロトンに特徴的な 4. 5ppm— 5. 5ppmに着目すると、 5. 4pp m付近がグルコースの a 1位と考えられる。また、 4. 7ppm— 5. 2ppm付近のピーク (45°Cでの 4. 78ppmのピークも含む）は j8 1位またはグルコース以外の糖由来と推定される。

[0068] (iii) PGの¹³ C—次元 NMR分析

PGを、約 11. 6mg/2. 5mLになるように、 D Oに溶解した。サンプル溶液には少

2

し濁りがあった。 ¹³C NMRの測定条件は以下のとおりである。すなわち、観測周波数は 125. 8MHzであり、基準はアセトン（30. 5ppm)、温度は 25°C、観測幅は 31. 4KHz、データ点は 128K、パルス幅は約 45° 、パルス繰り返し時間は 4. 0秒、積算回数 40000、完全デカップリングである条件で測定を実施した。

[0069] 得られたスペクトルを図 10に示す。¹³ C NMRについては、感度が上がらないため、 SZN比が不充分で解析は難し力つた。 60. 7ppmの大きなピークは糖質以外の成分由来と推定された。 65ppm— 80ppmのピークが均一でないことから、構成糖は不均一であると推定された。 100. lppmのピークは、グルコースの 1位の炭素で、 α型でグルシド結合したものと考えられ、¹ H NMRの結果を支持している。

1位以外については、 60— 80ppmのピークの化学シフトを解析した。グルコース単糖又は 2糖の化学シフトを解析すると、グルコースのひ 2位及び 4位の炭素がダルシド結合していると考えられ、結合様式は、 a 1 2又は a 1 4と推定された。

[0070] (iv)ヒドラジン処理 PGの¹³ C—次元 NMR分析

得られたスペクトルを図 11に示す。 ¹³C NMRについては、実施例 3 (8) (iii)よりも SZN比がやや改善したスペクトルが観測され、化学シフト値はほぼ同様であった。実施例 3 (8) (iii)にあった 60. 7ppmの大きなピークはなくなつた。

65ppm— 80ppmのピークは均一でな!、ことから、糖の結合様式は不均一であると推定された。 100. Oppmのピークは、グルコースの 1位の炭素で、 α型でダルシド結合したものと考えられ、¹ H NMRの結果を支持している。

1位以外については、 60ppm— 80ppmのピークの化学シフトを解析した。ダルコ一ス単糖又は 2糖の化学シフトと比較すると、グルコースのひ 2位及び 4位の炭素がグルシド結合している可能性が実施例 3 (8) (iii)と同様考えられ、結合様式は α 1— 2又は α 1— 4と推定された。

[0071] (9)メチルイ匕による糖結合位置の分析

PG糖質部を、粉末水酸化ナトリウム存在下、ヨウ化メチルで完チルイ匕し、生成したメチルイ匕多糖を単糖に分解し、得られたメチルイ匕単糖を還元ァセチルイ匕し、部分メチル化糖アルコールのァセチル誘導体（部分メチル化アルジトールアセテート）の形にしてガスクロマトグラフィー（GC)及びガスクロマトグラフ質量分析 (GC/MS)測定により誘導体の同定を行い、組成比を求めた。

[0072] すなわち、バイアル瓶に PG2. 4mgを秤量し、 5酸化リン存在下でー晚乾燥させた。これに、ジメチルスルホキシド（DMSO) O. 8mLを添カ卩して 5時間攪拌後、粉末の水酸化ナトリウム 80mgを加えて 4時間攪拌した。次に、ヨウ化メチル 0. 6mLを添加して 1時間攪拌後、クロ口ホルム lmLで 3回抽出した。純水にて 3回洗浄の後、クロロホルム層を回収し、無水硫酸ナトリウム 1. 8gを加えて脱水し、室温で 1時間放置した。この溶液を濾過し、得られた濾液を濃縮した後、その少量をサンプリングして、薄層ク口マト板にスポットし、薄層クロマトグラフィーを行い、オルシノール硫酸で発色させてメチル化糖の存在を確認した。この溶液をエバポレーターにて乾固し、得られた残渣に少量の純水をカ卩えて洗浄した。この洗浄操作を 3回繰り返した後、純水 0. 5mLを加えて残渣を溶解し、 NaBH 20mgZ純水 2mLを 0. 5mLカ卩えて攪拌し、室温にて

4

4時間放置した。酢酸で過剰の NaBHを分解し、エバポレーターにて減圧乾固した

4

。得られた残渣をメタノール 2mLで 5回洗浄し、次いで無水酢酸'ピリジン混液（1Z1 ) lmLを添カ卩して 100°Cにて 4時間加熱した後、エバポレーターにて減圧乾固した。得られた残渣にクロ口ホルム 2mLをカ卩えて抽出し、更に、純水 2mLを添カ卩して混和させた。クロ口ホルム層に無水硫酸ナトリウム 1. 5gをカ卩えて脱水し、室温で 30分間放置後、濾過し、濾液を得た。この濾液をエバポレーターにて減圧乾固した後、クロロホルムに溶解し、 GC及び MS分析を行なった。

[0073] GC— MS測定条件は以下の通りとした。すなわち、 GC分析装置は Hewlett— Pac kerd HP5890 SERIESで、カラム液相は SPB— 5 (スペルコジャパン）、カラムタイプは fused silica capillary 30mxO. 25mm IDを用い、キヤリヤーガスは He、カラム温度は 60°C ( 1分保持)→280°C ( + 8°CZ分で昇温）、注入口温度は 280°C、検出モードは FID、注入量は 0. で、注入モードは splitlessであった。 MSは、装 g[MS DX - 303質量分析計（日本電子）とデータ処理システム JMA DA5000 データ処理システム（日本電子）とを用い、 MS部のイオンィ匕方式は EI、電子加速電圧は 70V、イオン化電流は 300 μ Α、イオン源温度は 250°C、イオンカ卩速電圧は 3.

0KV、走査速度は 156じ73じ&11

10—500)、走查間隔は156₍：でぁった。

[0074] 部分メチルイ匕アルジトールアセテートの標準マススペクトルと照合することにより、試料のクロマトグラム上の各ピークを同定した結果を表 6に示した。更に、ガスクロマトグラムで得られた各ピークの面積から、部分メチルイ匕アルジトールアセテートの組成比を求めた結果も表 6に示した。これらの結果から、 PGの糖鎖は 1→4結合のダルコ一スが主要な結合であることが示唆された。

[0075] [表 6] 保持時間ピーク

メチル化耱結合位置組成比組成

(分）面種

1 20.31 2, 3, 4-トリ -0-メチルグルコース →4 Glc 1→ 28543 6.63 86.33

2 20.33 3, 4, 6 -トリ -0-メチルグルコース →1 Glc 1→ 270 0.06 0.82

3 20.40 3, 4, 6-トリ -0-メチルグルコース →6 Glc 1→ 285 0.07 0.86

4 21.50 2,3-ジ- 0-メチルグルコース →4,6 Glc \→ 2958 0.19 8.95

5 22.12 3,6-トリ- 0-メチルグルコース →2,4 Glc 1→ 1008 0.64 3.05

Glc;グルコース、→4 Glc 1→;1→4結合のグルコース、→2 Glc 1→;1→2結合のグノレコース、→6

Glc 1→;1→6結合のグルコース、→4,6 Glc 1→; 1→4結合と→6結合のグルコース、 →2,4 Glcl→;l→2結合と→4結合のグルコース

[0076] (10) PG中の脂肪酸分析

PG6.65mgを 1.5mL容ポリチューブに秤量後、メタノール 0.2mLを加えた。 Sp eed Vacを用い、これを減圧乾燥し、乾燥物試料 6.22mgをガラス製ネジ付き試験管内に移した。これに、 5%塩酸'メタノール溶液 lmLを加え、オーブン内で 90°C、 1 6時間加熱反応させることにより、 PG中に存在する脂肪酸のトリダリセライドを脂肪酸メチルエステルに変換した。メタノリシス終了後、へキサン lmLをカ卩えて激しく振り混ぜ、静置した後にへキサン層を回収し、窒素パージで乾固後、クロ口ホルム（内部標準としてペンタデカン酸メチルを約 0.01%含む） 1. OmLに再溶解した。この溶液を、以下に記載する通り、 GC法により測定した。

[0077] 次に、定量用標準品としてォレイン酸メチル (ジーエルサイエンス株式会社) 25.3 7mgを lOmLメスフラスコに秤量し、内部標準を含むクロ口ホルムを標線までカ卩えて 2 537 gZmL標準溶液とした。更に、この溶液を、内部標準を含むクロ口ホルムで 25 倍希釈して 101.5/zgZmL溶液を調製した。更に、これを、内部標準を含むクロ口ホルムで順次 5倍希釈して 20.3/zgZmL溶液、 4.06/zgZmL溶液、及び 0.81 gZmL溶液を調製した。以下に記載する通り、これらを、試料溶液と同様に、 GC 分析を行い、得られたピーク面積と標準溶液の濃度より検量線を作成し、これより試料溶液中の各脂肪酸の定量分析を行った。

一方、定性用標準品として、以下の 2種類の標準溶液 (溶媒:クロ口ホルム）を用いた。（1) C14一 C18の飽和脂肪酸、及び 1一 3価不飽和脂肪酸のメチルエステル混合溶液。（2) C20— C26の飽和脂肪酸、及び 1価不飽和脂肪酸のメチルエステル混合溶液。

[0078] GC分析は下記の通リに実施した。すなわち、装置としてガスクロマトグラフ HP589 0型 (Hewlett Packard社)、検出器として水素炎イオン化検出器 (FID)、カラムとして SP238O (h3Omx O. 25mm,膜厚 0. 2 m)を用い、カラム温度 50。C (1分保持） →250°C ( + 8°CZ分で昇温）、注入口温度 250°C、注入量 1 μ L (splitless注入）の条件であった。なお、 GC分析は脂肪酸メチルとして行っているので、以下の式に従つて、試料中の脂肪酸量 (遊離脂肪酸として)を算出した。

[脂肪酸量] = [脂肪酸メチルとして得られた定量結果] X [遊離脂肪酸分子量 Z脂肪酸

メチル分子量]

その結果、 PGの脂肪酸組成は、多い方力も順に、ステアリン酸 (C18 : 0) 1. 86 g Zmg、ノレミチン酸（C16 : 0) 1. 84 μ g/mg,ォレイン酸 [C18 : l (9) ] l . 52 /z g Zmg、リノール酸 [C18 : 2 (9, 12) ]0. 94 gZmg、及びミリスチン酸（C14 : 0) 0. 55 μ gZ mgでめった。

[0079] (9)赤外分光分析 (IR)

赤外分光分析は、 KBr法により実施した。より具体的には、 PGlmgと KBr粉末 10 mgとを均質に混合した後、プレスして円盤状に成型し、 FTIR VAKOR— III型 [日本分光 (株） ]を用いて測定を実施した。得られた IR ^ベクトルを図 12に示す。

[0080] (10)紫外分光分析 (UV)

PGを純水に溶解し、 50mgZmL濃度で測定した。装置として、 Bio Spec 1600 (島津製作所)を使用した。得られた UVスペクトルを図 13に示す。

[0081] 《実施例 4 :抗腫瘍活性の評価》

[0082] (1)メラノーマ B16

日本チャールズリバ一（神奈川）から購入した 6週齢の雄性 C57BLZ6Nマウスの腋窩部皮下に、メラノーマ B16を 1 X 10⁶個 /0. 2mLハンクス平衡塩溶液/匹移植した（1群 6匹)。なお、メラノーマ B16は、 C57BL/6マウスの皮膚に発生した腫瘍に由来する腫瘍細胞株（An NY Acad. Sci 100: 762-790, 1963)であり、本実施例では、東北大学'加齢医学研究所付属医用細胞資源センター (保管番号: TKG0144)から入手し、呉羽化学工業株式会社 '生物医学研究所において、 C57BLZ6Nマウスの腋窩部皮下で継代 ·維持して!/ゝる細胞を使用した。

移植 24時間後から、実施例 2で得られた PG (生理食塩水に溶解)を 125mgZkg 又は 250mg/kg量、隔日に 10回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水 0. 2mLを用いた。

移植後、毎日生死を観察した。結果を図 14に示す。平均生存期間を求めたところ、対照群の平均生存日数（平均値士 SE) : 15. 5± 1. 2日に対し、検体 125mgZkg 及び 250mgZkg投与群のそれは、それぞれ、 19. 0± 2. 6曰及び 20. 5± 1. 9曰であり、検体投与により生存期間は延長された。

[0083] (2)形質細胞腫 X5563

チャールズリバ一 (神奈川）から購入した 6週齢の雌性 C3HZHeNマウスの腋窩部皮下に、形質細胞腫 X5563を 1 X 10⁶個 ZO. 2mLハンクス平衡塩溶液 Z匹移植した（1群 6匹)。なお、形質細胞腫 X5563は、 C3HZHeマウス回盲部に発生した腫瘍に由来する腫瘍細胞株 (JNCI 24: 1153-1165, 1960)であり、本実施例では、東北大学'加齢医学研究所付属医用細胞資源センター (保管番号: TKG0174)から入手し、呉羽化学工業株式会社 '生物医学研究所において、 C3HZHeNマウスの腹腔内で継代 ·維持して！/ヽる細胞を使用した。

移植後、 60日間毎日生死を観察したところ、対照群の 60日生存率 50% (3/6)に対し、検体 125mgZkg及び 250mgZkg投与群のそれは、それぞれ、 100% (6/6 )及び 67% (4Z6)であり、検体投与により生存率の向上がみられた。更に、生存個体においても、図 15に示すとおり、腫瘍サイズは、検体投与により明らかに抑制された。

[0084] (3)サルコ一マ 180 日本クレア (東京)力購入した 5週齢の雌性 ICRマウスの腋窩部皮下に、サルコ一マ 180[Sarcoma 180 (S180)]を 1 X 10⁶個 /0. 2mLハンクス平衡塩溶液/匹移植した（1群 10匹）。なお、サルコ一マ 180は、アルビノマウス由来の肉腫に由来する腫瘍細胞株（Cancer

Res 20: 930-939, 1969)であり、本実施例では、東北大学 ·加齢医学研究所付属医用細胞資源センター (保管番号: TKG0173)から入手し、呉羽化学工業株式会社 '生物医学研究所において、 ICRマウスの腹腔内で継代 ·維持している細胞を使用した。移植 24時間後から、実施例 2で得られた PG (生理食塩水に溶解)を 125mgZkg 又は 250mg/kg量、隔日に 10回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水 0. 2mLを用いた。

移植後 25日目に、マウスをと殺し、腫瘍結節を取り出して重量を測定したところ、対照群の腫瘍結節重量 [平均値士標準誤差 (SE) ] : 1. 05±0. 22gに対し、検体 125 mgZkg及び 250mgZkg投与群のそれは、それぞれ、 0. 01 ±0. Olg及び 0. 00 ±0. 00gであり、検体投与により、腫瘍増殖は明らかに抑制された。

(4)エーノレリツヒ癌

日本クレア (東京)カゝら購入した 5週齢の雌性 ICRマウスの腋窩部皮下に、エールリッヒ癌（Ehrlich)を 1 X 10⁶個 Z0. 2mLハンクス平衡塩溶液 Z匹移植した（1群 10匹）。なお、エールリツヒ癌は、 ddYマウスに発生した乳腺腫瘍に由来する腫瘍細胞株（ JNCI

13: 1299-1377, 1953)であり、本実施例では、東北大学'加齢医学研究所付属医用細胞資源センター (保管番号: TKG0147)から入手し、呉羽化学工業株式会社 '生物医学研究所において、 ICRマウスの腹腔内で継代 ·維持している細胞を使用した。移植 24時間後から、実施例 2で得られた PG (生理食塩水に溶解)を 125mgZkg 又は 250mg/kg量、隔日に 10回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水 0. 2mLを用いた。

移植後 25日目に、マウスをと殺し、腫瘍結節を取り出して重量を測定したところ、対照群の腫瘍結節重量 (平均値士 SE) : 1. 96±0. 50gに対し、検体 125mgZkg及び 250mgZkg投与群のそれは、それぞれ、 0. 01 ±0. Olg及び 0. 48±0. 33gであり、検体投与により、腫瘍増殖は明らかに抑制された。

[0086] (5)吉田肉腫

日本チャールズリバ一 (神奈川）から購入した 6週齢の雄性 Donryuラットの腹腔内に、吉田肉腫 (YS)を 1 X 10⁶個 /0. 2mLハンクス平衡塩溶液/匹移植した（1群 6 匹)。なお、吉田肉腫は、 o—アミノアゾトルエンを 3箇月間与え、亜ヒ素酸アルコールを塗布することにより発生した腫瘍に由来する腫瘍細胞株 (Proc Imp Acad Tokyo 20: 611-618, 1944)であり、本実施例では、東北大学 ·加齢医学研究所付属医用細胞資源センター (保管番号: TKG0088)から入手し、呉羽化学工業株式会社 '生物医学研究所において、 Donryuラットの腹腔内で継代 '維持している細胞を使用した。移植 24時間後から、実施例 2で得られた PG (生理食塩水に溶解)を 125mgZkg 又は 250mgZkg量、隔日に 4回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水 0. 2mLを用いた。

移植後、毎日生死を観察し、平均生存期間を求めたところ、対照群の平均生存日数 (平均値士 SE) : 8. 3±0. 3日〖こ対し、検体 125mgZkg及び 250mgZkg投与群のそれは、それぞれ、 9. 0±0. 4日及び 7. 5± 1. 1日であり、検体 125mgZkg投与により、生存期間は延長される傾向にあった。

[0087] (6)白血病 P388

日本チャールズリバ一 (神奈川）から購入した 6週齢の CDF1マウスの腋窩部皮下に、白血病 P388を 1 X 10⁶個 Z0. 2mLハンクス平衡塩溶液 Z匹移植した（1群 6匹 )。なお、白血病 P388は、 DBA/2マウスをメチルコランスレン処置することにより発生した白血病に由来する腫瘍細胞株 (Am J Pathol 33: 603, 1957)であり、本実施例では、東北大学'加齢医学研究所付属医用細胞資源センター (保管番号: TKG0326 )から入手し、呉羽化学工業株式会社 '生物医学研究所において、 CDF1マウスの腹腔内で継代 ·維持して!/ヽる細胞を使用した。

移植 24時間後から、実施例 2で得られた PG (生理食塩水に溶解)を 125mgZkg 又は 250mgZkg量、隔日に 4回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水 0. 2mLを用いた。

移植後、毎日生死を観察し、平均生存期間を求めたところ、対照群の平均生存日数（平均値士 SE)： 17. 3± 2. 2日に対し、検体 125mg/kg及び 250mg/kg投与群のそれは、それぞれ、 18. 3± 2. 4日及び 19. 6± 1. 7日であり、検体投与により、生存期間は延長傾向にあった。

[0088] (7)白血病 EL4

日本チャールズリバ一（神奈川）から購入した 6週齢の C57BLZ6N雄マウスの腋窩部皮下に、白血病 EL4を 1 X 10⁶個 /0. 2mLハンクス平衡塩溶液/匹移植した（ 1群 6匹）。なお、白血病 EL4は、マウスをジメチルベンズアントラセン（DMBA)処置することにより脾臓に発生したリンホーマに由来する腫瘍細胞株 (Cancer Res 16: 338-343, 1956)であり、本実施例では、東北大学 ·加齢医学研究所付属医用細胞資源センター (保管番号: TKG0150)から入手し、呉羽化学工業株式会社 '生物医学研究所において、 C57BLZ6Nマウスの腹腔内で継代 '維持している細胞を使用した。移植 24時間後から、実施例 2で得られた PG (生理食塩水に溶解)を 125mgZkg 又は 250mgZkg量、隔日に 4回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水 0. 2mLを用いた。

移植後、毎日生死を観察し、平均生存期間を求めたところ、対照群の平均生存日数（平均値士 SE)： 12. 0±0. 4日に対し、検体 125mg/kg及び 250mg/kg投与群のそれは、それぞれ、 13. 0±0. 0曰及び 11. 8±0. 3曰であり、検体 125mgZk g投与により、生存期間は延長傾向にあった。

[0089] (8)肝癌 AH13

日本チャールズリバ一 (神奈川）から購入した 6週齢の雄性 Donryuラットの腹腔内に、肝癌 AH13を 1 X 10⁶個, 0. 2mLハンクス平衡塩溶液,匹移植した（1群 6匹）。なお、肝癌 AH13は、ラットをジメチルアミノアゾベンゼン（DAB)処置することにより肝臓に発生した腫瘍に由来する腫瘍細胞株 (病理学会誌 11: 147-168, 1967)であり、本実施例では、東北大学 ·加齢医学研究所付属医用細胞資源センター (保管番号： TKG0011)から入手し、呉羽化学工業株式会社 '生物医学研究所において、 Donr yuラットの腹腔内で継代 ·維持して!/ヽる細胞を使用した。

移植後、毎日生死を観察したところ、対照群の 12日生存率 17% (1/6)に対し、検体 125mgZkg及び 250mgZkg投与群のそれは、いずれも 67% (4Z6)であり、検体投与により生存期間は延長された。

産業上の利用可能性

[0090] 本発明の糖タンパク質は、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、及び Z又は抗腫瘍剤の用途に適用することができる。

以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。

図面の簡単な説明

[0091] [図 1]アルカリ抽出液の ChMe処理により得られた水層部について、陰イオン交換ク口マトグラフィーを実施して得られた溶出パターンを示すクロマトグラフである。

[図 2]陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたフラクション Bについて、ゲル濾過クロマトグラフィー（セフアクリル S— 100)を実施して得られた溶出パターンを示すクロマトグラフである。

[図 3]陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたフラクション Bについて、ゲル濾過クロマトグラフィー（セフアクリル S— 100)を実施して得られた各画分における TGF— β の結合活性を示すグラフである。

[図 4]ゲル濾過クロマトグラフィー（セフアクリル S— 100)により得られたフラクション Β— 1につ、て、更にゲル濾過クロマトグラフィー（セフアクリル S— 500)を実施して得られた溶出パターン及び各画分における TGF— β の結合活性を示すグラフである。

[図 5]ゲル濾過クロマトグラフィー（セフアクリル S— 500)により得られたフラクション Β— 1—2につ、て、逆相クロマトグラフィーを実施して得られた溶出パターンを示すクロマトグラフである。

[図 6]逆相クロマトグラフィーにより得られた本発明の糖タンパク質について、 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した結果を示す、クロマトグラフである図面に代わる写真である。

[図 7]本発明の糖タンパク質の円偏光二色性分析により得られた CDスペクトルである [図 8]本発明の糖タンパク質の¹ H—次元 NMR測定により得られたスペクトルである。

[図 9]ヒドラジン処理糖タンパク質の¹ H—次元 NMR測定により得られたスペクトルである。

[図 10]本発明の糖タンパク質の¹³ C—次元 NMR測定により得られたスペクトルである

[図 11]ヒドラジン処理糖タンパク質の¹³ C—次元 NMR測定により得られたスペクトルである。

[図 12]本発明の糖タンパク質の赤外分光分析により得られたスペクトルである。圆 13]本発明の糖タンパク質の紫外分光分析により得られたスぺ外ルである。

[図 14]本発明の糖タンパク質を投与したメラノーマ B16移植マウスの生存率を示すグラフである。

[図 15]本発明の糖タンパク質を投与した形質細胞腫 X5563移植マウスにおける腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。

Claims

請求の範囲

[I] 下記の性質を有する糖タンパク質。

(a)分子量:約 60kDa (ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による)。

(b)糖質とタンパク質との含有比率：（糖質:タンパク質） 16. 4 : 1. 0。

[2] (1)マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出する工程、

(2)得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させる工程、

(3)前記陰イオン交換樹脂から、溶離液により吸着画分を溶出する工程、及び

を含む製造方法により調製することのできる、糖タンパク質。

[3] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する、医薬組成物。

[4] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、免疫増強剤。

[5] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス負荷回復促進剤。

[6] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、抗腫瘍剤。

[7] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫増強方法。

[8] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質を、ストレス負荷回復促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ストレス負荷回復促進方法。

[9] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質を、腫瘍の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、腫瘍を治療又は予防する方法。

[10] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質の、免疫増強剤又は免疫増強用医薬組成物を製造するための使用。

[II] 請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質の、ストレス負荷回復促進剤又はストレス負荷回復促進用医薬組成物を製造するための使用。

請求項 1又は 2に記載の糖タンパク質の、抗腫瘍剤又は抗腫瘍用医薬組成物を製造するための使用。