JP4619352B2 - 胎児ヘモグロビン、細菌エンドトキシン、および任意でさらなる胎児肝成分を含む組成物 - Google Patents
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- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Description
ヒツジ胎児肝抽出物(FSLE)の調製
出生前2〜4週の胎児を有する妊娠ヒツジを蒸気によって消毒した部屋で屠殺した。羊膜嚢の胎児を帝王切開によって全身を取り出し、直ちに冷蔵条件の実験室に移動させた。以下の段階を温度約+4℃で行った。羊膜嚢を消毒して、羊水を除去し、胎児の臓器、特に肝臓を滅菌条件で調製した。肝臓を滅菌水によって洗浄して、滅菌シリンジを用いて水によって動脈を洗浄した。次に、動脈を直径約1 cmの小片に切断して、小片を直ちに液体窒素に移して-80℃のフリーザーで保存した。
胎児肝粉末(1 kg)を滅菌NaCl(0.9%)6.5 Lと共に混合して、磁気攪拌子(コロラ(Colora))によって4℃で10〜15分間攪拌した。混合物をBechman-Coulter遠心機を用いて12,500 rpmで50分間遠心した。次に上清を50,000 rpmで1時間超遠心した(Bechman-Coulter、オプティマL70 Kin)。上清をゲルマンフィルター(スーパーDCF、薬学等級、滅菌0.8/0.2 nm EFA:1000 ml(CFS 92-DS))を用いて濾過滅菌した。FSLEの収量は、肝粉末1 kgに基づいて約2.5〜2.7 Lであった。抽出物のタンパク質含有量を自動分析装置インテグラ400(Roche Diagnostics)において推定したところ、50 g/Lの次数であることが判明した。タンパク質300 mg(1単位)を含む部分、すなわち抽出物6 mlを25mlフラスコに加えて凍結乾燥した。このように、凍結乾燥1単位は、タンパク質約300 mg、無機塩(主にNaCl)60 mg、および非タンパク質様有機物質約320 mgからなり、1単位は全体で約680 mgとなる。
-4日目にマウス(Balb/c×C57Bl/6)にFSLE 1 mgを含む溶液0.5 mlを皮下注射した。0日目に動物を屠殺して、脾臓を採取して細胞を培養する。
(活性化脾細胞+マクロファージの存在下における腫瘍細胞の増殖)/(腫瘍細胞の増殖)×100
FSLEの分画;プールCLP1bおよびCLP2pの調製
凍結乾燥ヒツジ胎児肝抽出物1.5 gを水8 mlに溶解して、10倍量の0.03 Mリン酸緩衝液(pH 7.4)に対して、透析緩衝液を2回交換して一晩透析した(カットオフ3,500ダルトンの透析バッグ)。緩衝液10 mlに調節した透析抽出物をSephadex(商標)G-100カラム(Pharmacia;容量600 ml、直径24 mm、長さ130 cm)に適用して同じ0.03 Mリン酸緩衝液によって平衡にした。溶出分画(8 ml)を回収して280 nmでの吸光度を読み取った(図4の溶出プロフィールを参照されたい)。分画をプールして、プール5個をそれぞれ、CLP1、CLP1b、CLP2p、CLP2、およびCLP2bと命名した。図4に示すように、CLP1bはプール1の吸光度の急激な減少の終わりの部分と吸光度の次の急激な減少のあいだに含まれ、分画53〜71に対応した(溶出容積424〜568 ml)。CLP2pは、プール1-bisの終わりとプールIIの吸光度の増加のあいだに含まれ、分画72〜82に対応する(溶出容積576〜656 ml)。
FSLEならびにCLP1bおよびCLP2pプールの生化学および物理化学分析
3.1 方法
3.1.1 生物アッセイ系
3.1.1.1 骨髄由来マクロファージ
他の文献に記述されているように[Hoffmann, P.、1989]、マウス骨髄由来マクロファージをインビトロで骨髄前駆細胞から分化させた。簡単に説明すると、骨髄細胞を6〜8週齢のBALB/cマウス(Charles River;スルツフェルド、または免疫生物学のためのMPI、フライブルク、ドイツ)の大腿骨および脛骨から洗い出して、RPMI 1640(Gibco BRL、Life Technologies、エッゲンスタイン、ドイツ)において2回洗浄して、テフロン製のフィルムバック(SLG、ゴーティング、ドイツ)において37℃および5%CO2で11日間増殖させた。培養培地は、M-CSF源としての15%L-細胞条件培地(下記参照)、10%熱不活化FCS、5%熱不活化ウマ血清、1 mMピルビン酸ナトリウム、50 U/mlペニシリン、50 μg/mlストレプトマイシン(全て、Seromed Biochrom KG、ベルリン、ドイツ)および5×10-5M 2-メルカプトエタノールを添加したRPMI 1640であった。培養を6×106個/50 mlで開始した。回収後マクロファージを1回洗浄して、計数し、10%FCS、2 mM L-グルタミン、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシンを添加した4.5 g/lグルコース(Seromed Biochrom KG)を含むDMEM(cDMEM)において2×106個/mlで再浮遊させた。L-細胞条件培地を得るために、L 929細胞1×105個/mlを細胞培養フラスコ(Falcon、Becton Dickinson、ハイデルベルグ)において、10%FCS、4 mM L-グルタミン、1%NEAA、100 U/mlペニシリン、および100 g/mlストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地において100 mlバッチで37℃および5%CO2で培養した。7日後、培養上清を回収して、遠心(1500×g、15分)によって細胞片を除去し、-20℃で保存した。
マウスB細胞リンパ腫細胞株Abelson 8-1を6ウェルプレート(Falcon、Becton Dickinson)においてcDMEMにおいて37℃、10%CO2で維持した。細胞を培養ウェルにおいてコンフルエンシーに達するまで増殖させて、週に2回継代した。
マクロファージ媒介腫瘍細胞増殖阻害[Hoffmann, P.、1989]を、アルカリホスファターゼアッセイ[Modolell, M.、1994]において決定した。細胞を平底マイクロタイタープレートにおいて全量200 μlで設定した。腫瘍細胞5×103個をBMDM 1×105個および様々な濃度のCLPプールと共にcDMEMにおいて10%CO2で培養した。3日後、プレートを660×gで2分間遠心して、上清をデカントした。各ウェルにジエタノールアミン(200 mM)、MgCl2(2 mM)、トライトンX-100(10%)、およびp-ニトロフェニルホスフェート(10 mM)を含むpH 10.2の緩衝液100 μlを加えて、プレートを室温の暗所で水平方向のシェーカーにおいて60分間インキュベートした。0.5 M NaOH 100 μl/ウェルを加えて酵素反応を停止させた。自動ELISAリーダー(MRX Dynatech、デンケンドルフ、ドイツ)においてO.D.を405/490 nmで測定した。O.D.>3.000のウェルは0.5 M NaOHによって新しいプレートに希釈して、再度測定した。腫瘍細胞および非刺激エフェクター細胞を含む培養物の値を100%に設定した。
氷中で10分間インキュベートしてテフロンバッグを軽く回転させた後成熟BMDMを採取した。細胞を1回洗浄して、10%FCS、1%NEAA、100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地に再浮遊させた。細胞1×105個/ウェルを96ウェル平底マイクロタイタープレートのウェル(Falcon、Becton Dickinson)に播種して、様々な濃度のCLPプール+/-IFN-γ(4〜20 U/ml)によって全量150 μlで刺激した。培養上清を24または48時間後に回収して、下記のように亜硝酸塩濃度に関してチェックした。アッセイは全て1試料あたり3個ずつ行った。
マクロファージによるNO・の産生[Stuehr, D.J.、1989]を、グリース試薬[Green, L.C.、1982]を用いて、培養上清におけるNOの安定な代謝物である亜硝酸塩を測定することによって決定した。培養上清100 μlをグリース試薬(2.5%リン酸中に1%スルファニルアミドおよび0.1%N-(1-ナフチル)エチレンジアミン)100 μlと混合して、ダイナテックMRX ELISAプレートリーダー(デンケンドルフ、ドイツ)を用いて570 nmでの吸光度を測定した。亜硝酸塩濃度は、亜硝酸ナトリウムによって作製した標準曲線から計算した。RPMI 1640培地単独の吸光度を全ての値から差し引いた。
FSLEおよびCLPプールのSDS-PAGE分析を、12〜20%ゲルを用いて標準的な技法[Laemmli, U.K.、1970]に従って実施した。
3.2.1 CLP1bおよびCLP2pにおける主な抗腫瘍マクロファージ活性化因子の熱安定性
CLP1bおよびCLP2pによるマクロファージ媒介抗腫瘍活性の強い刺激に対する熱前処理の影響を調べるために、凍結乾燥材料0.25 mgをpH 5.8の水またはpH 4.7の20 mM酢酸ナトリウム緩衝液に溶解してそれぞれ、4℃および100℃で60分間インキュベートした。熱処理および対照試料によるマクロファージの抗腫瘍活性化を、腫瘍細胞増殖阻害(TCGI)アッセイ(実施例3.1.1.3を参照されたい)において、[Modolell, M.、1994]に従ってBALB/cマウスからのインビトロ分化骨髄由来マクロファージとAbelson 8-1腫瘍細胞との共培養を用いて決定した。
抗腫瘍マクロファージ活性化因子のさらなる生化学的特徴付けのために。CLP1bおよびCLP2pプールに、タンパク質分解消化を行った。プロテイナーゼK、プロナーゼ、パパイン、サブチリシン、トリプシンおよびエンドプロテアーゼGlu-C(V8-プロテアーゼ)の発熱物質不含調製物をBoehringer Mannheim(ドイツ)から購入した。次に、CLP1bおよびCLP2p 0.24 mgを、選択したプロテアーゼのそれぞれによって、酵素対総蛋白質比1:10(w/w)で発熱物質不含水0.24 mlにおいて37℃で21時間処置した。15%(w/v)アクリルアミドゲル上でのSDS-PAGEによる分析のためにプローブを除去して銀染色を行った後、残った試料を100℃で30分間インキュベートして、個々のプロテアーゼを不活化した。CLP1bおよびCLP2pのプロテアーゼ処置試料および非処置対照を、TCGIアッセイにおいて抗腫瘍マクロファージ活性化に関して最終的に試験した(実施例3.1.1.3と比較されたい)。
CLP2pにおける抗腫瘍マクロファージ活性化因子に対する軽度の酸化の結果を、4℃での過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)処置によって分析した。簡単に説明すると、凍結乾燥材料の一部2.5 mgを、遮光ガラスバイアルにおいてpH 4.7の100 mM酢酸ナトリウム緩衝液0.9 mlに溶解した。2.5 mM過ヨウ素酸ナトリウム0.1 mlを加えて、絶えず攪拌しながら4℃で2時間過ヨウ素酸酸化を行った。エチレングリコール0.01 mlを加えて反応を停止させた。試料を、Spektra/Por(登録商標)凍結チューブ(内径11.5 mm;分子量カットオフ3500 Da;Serva、ドイツ)において発熱物質不含水に対して透析して、凍結乾燥した。凍結乾燥材料0.25 mgの試料に、0.5 M HCl/メタノール中で45℃で45分間メタノリシスを行い、アセトアンヒドリド/ピリジン(85℃、30分)においてペルアセチル化を行い、組み合わせたガス-液体クロマトグラフィー/質量分析によって単糖類の組成を分析した。試料の残りの部分および対応する対照を、TCGIアッセイにおいて抗腫瘍マクロファージ活性化に関して最終的に試験した。
3.3.1 リポ多糖類(LPS、エンドトキシン)
3.3.1.1 リムラスアメーバ溶解物試験、LAL試験
CLP1bおよびCLP2pにおいて細菌リポ多糖類(LPS)が存在する可能性を分析するために、市販の二つの色素産生リムラスアメーバ溶解物(LAL)アッセイ、すなわちQCL-1000(登録商標)試験(BioWhittaker;ウォーカースビル、メリーランド州、アメリカ)およびCOATEST(登録商標)エンドトキシン試験(Charles River Endosafe、チャールストン、アメリカ)を用いた。簡単に説明すると、凍結乾燥CLP調製物を溶解して、BioWhittaker(ウォーカースビル、メリーランド、アメリカ)から得たLAL試薬水に適当に希釈した(<0.005 EU/ml)。干渉する可能性があるタンパク質を不活化するために、試料を75℃で5分間プレインキュベートした後、激しく振とうさせて、37℃で30分間超音波処理した。その後、試料を較正標準として大腸菌O111:B4から調製したLPSを用いて製造元のプロトコールに従ってLAL試験に適用した。CLP1bおよびCLP2p全体で16ロットの他に、異なる3ロットのヒツジ胎児肝抽出物を、上記のLAL試験技法によって分析した。
LAL試験によって検出可能なLPSをCLP1bおよびCLP2pから枯渇する試みで、試料を、BIO-RAD(ハーキュリーズ、カリフォルニア州、アメリカ)から購入したLPS選択的アフィニティ樹脂であるAffi-Prep(登録商標)ポリミキシンによって試料の処置を行った。CLP-調製物を、発熱物質不含水0.7 mlにおいて最終濃度1 mg/mlでアフィニティ吸着剤0.05 mgの存在下または非存在下で軽く攪拌しながら4℃で14時間インキュベートした。その後、アフィニティ樹脂を5000×gで5分間の遠心によって沈降させて、上清をTCGIアッセイにおいて試験した。
CLP1bおよびCLP2pのNO誘導活性を、LPS反応体(C57B1/10 ScCn)およびLPS非反応体(C57B1/10 ScCr)マウスからの骨髄由来マクロファージにおいて決定した[Freudenberg, M.A.、1991]。図10に示すように、CLPプールに反応したNO放出は、LPS反応体マウスからのBMDMと比較してLPS非反応体動物からのBMDMでは顕著に減少する。しかし、LPS非反応体マウスからのBMDMにおいても低いものの有意な用量依存的なNO放出の誘導を認め、これは対照的にウマ流産菌(Salmonella abortus equi)または大腸菌から単離したLPSによる刺激後では全くまたはごくわずかなNO分泌しか示さない。
LPSと共に、IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13およびIFNγを含む多くの定義されたサイトカインは、インビトロおよびインビボでマクロファージを刺激して他のサイトカインを産生させる。CLPプールにおける材料をこれらの刺激物質と比較するために、CLP2pまたは組換え型サイトカインの単独、またはこれらの試薬の混合物と共にマクロファージまたは樹状細胞を培養する効果を比較した。さらに、細胞を、サイトカインに対するモノクローナル抗体の存在下でCLP2pまたはサイトカインによって処理した。サイトカイン産生をELISAによって測定した(試薬は全てPharmingen、サンジエゴ、カリフォルニア州から購入した)。FSLEはIL-2、IL-6、およびIL-10を含まないことが判明したことに注目することは重要である。
a 新鮮な接着脾細胞を4〜8週齢のDBA/2マウスのプールから得た。細胞0.5×106個/mlを含む培養物500 μlを1試料あたり3個ずつ表記の条件で18時間インキュベートして、サイトカインアッセイのために同等の群から上清をプールした。
b それぞれ1試料あたり3個ずつ行った3回の独立したアッセイの算術平均(±SD)。
LPSおよびCLP2pによる脾臓の接着細胞において誘導された刺激の類似性を考慮して、CLP2pが、LPS媒介刺激において重要なマクロファージ表面分子であるCD14に結合(および誘発)後に実際に細胞を刺激するか否かを調べた。市販の抗-CD14モノクローナル抗体(UCHM-1、Sigma)を用いて、異なる濃度の抗-CD14の存在下/非存在下で接着脾細胞によるTNFα産生の刺激を比較した。そのような三つの試験からプールしたデータを表2に示す。データは、CLP2pが抗-CD14抗体によって有意に阻害されること、そしてLPSおよびCLP2p活性の阻害に区別できるほどの差がないことを示している。
a 新鮮な接着脾細胞を4〜8週齢のDBA/2マウスのプールから得た。細胞0.5×106個/mlを含む培養物500 μlを1試料あたり3個ずつ表記の条件で18時間インキュベートして、サイトカインアッセイのために同等の群から上清をプールした。
b LPS/CLP2pによる刺激の際に抗-CD14を添加した場合、用いた濃度は示した通りであった。rTNFαの標準量を用いる対照試験において、サイトカインアッセイにおいて添加された抗-CD14のこれらの濃度自身は、TNF-αの検出レベルに変化を示さなかった。
c それぞれ、1試料あたり3個ずつ実施した独立した3回のアッセイの算術平均(±SD)。
最近の研究から、LPSによるマクロファージの刺激を、最適下濃度(最適に活性化する用量の1/100)のLPSと共に同じ細胞をプレインキュベートすることによって阻害できることが示された[Ziegler-Heitbrock, H.-W.、1992]。LPSまたはCLP2pのいずれかによる最適な刺激のためにLPSによって誘導される可能性がある交叉耐性を調べるために、細胞を10 ng/ml LPSと共にプレインキュベート(24時間)して、培地によって4回洗浄し、LPSまたはCLP2pのいずれかの至適濃度で再度培養した。18時間後にTNF-α産生をアッセイした。3回の実験からプールしたデータを表3に示す。
a 4〜8週齢のDBA/2マウスのプールから単離した新鮮な接着脾細胞6×106個を、培地単独(最初の3列)または10 ng/ml LPS(次の6列)、または3 ng/ml CLP2p(最後の3列)と共に24時間インキュベートした。LPSによって前処置したいくつかの細胞をWortmannin(0.3 M)と共に培養した。細胞を新鮮な培地10 mlによって4回洗浄して、表記のように(2番目の縦行)再度培養した。
b 細胞5×105個を培地500 μl、またはLPS(1 ng/ml)もしくはCLP2p(0.3 μg/ml)を含む培地において1試料あたり3個ずつ18時間インキュベートした。18時間目に同等の培養物から上清をプールした。
3.3.2.1 方法
3.3.2.1.1 タンパク質の推定およびパターン(SDS-PAGE)
CLP1bおよびCLP2pの総蛋白質含有量を、較正曲線として脂肪酸不含ウシ血清アルブミン(BSA)を用いて、PIERCE (ロックフォード、イリノイ州、アメリカ)から購入したビシンコニン酸(BCA(登録商標))アッセイによって決定した。CLP調製物の全体的なタンパク質組成を、[Laemmli, U.K.、1970]および[Heukeshoven & Dernick(1988)]に従って、15%(w/v)アクリルアミドゲル上でのSDS-PAGEおよび銀染色によって分析した。個々のタンパク質を調製的SDS-PAGEによって単離して、(Millipore、ベッドフォード;アメリカ)から得たポリビニリデンジフルオリド(PBDF)イモビロン-Pメンブレンにエレクトロブロッティングした。クーマシーブルーR250によって染色後、タンパク質のバンドを切り出してApplied Biosystems 473 Aタンパク質シークエンサー[Hunkapillerら、1983]を用いてN-末端マイクロシークエンシングを行った。
FSLEと共にCLP1bおよびCLP2pのタンパク質組成に関する詳細な特徴付けに関して、高解像度二次元電気泳動(2-DE)を行った[Jungblut, P.、1992;Jungblut, P、1994;Otto, A.、1996、Thiede, B.、1996;Muller, E.-C.、1999]。比較のために、ヒツジ成体肝に由来するCLP1b調製物のタンパク質組成も同様に2DE技術によって分析した。簡単に説明すると、CLP1b調製物を、試料緩衝液(25 mMトリス-HCl、pH 7.1;9 M尿素;50 mM KCl;3 mM EDTA;70 mM DTT;2.9 μMベンズアミジン、2.1 μMロイペプチン;0.1 μMペプスタチン;1 mM PMSFおよび全量で4%(w/w)担体両性電解質WITAlytes、pH 2〜11、WITA、テルトウ、ドイツ)においてCLP1b 10 mg/mlの濃度で溶解した。その後、試料溶液12 μlを等電点電気泳動の桿状ゲル(一次元;3.5%(w/v)アクリルアミド、0.3%(w/v)ピペラジンジアクリルアミド;Bio-Rad、ミュンヘン、ドイツ)の陽極側に適用して、8870 Vhを適用した。電気泳動後、125 mMトリス/リン酸塩、pH 6.9、40%グリセロール、70 mM DTTおよび3%(w/v)SDSを含む緩衝液においてゲルを10分間平衡にして、-70℃で凍結保存した。融解後、等電点電気泳動ゲルを直ちにSDS-PAGEゲル(23×30 cm;15%(w/v)アクリルアミド;0.2%(w/v)N,N'-メチレンビスアクリルアミド)に適用して、電流を開始時の120 mAで15分間の後に150 mAで7〜8時間の2段階で増加させて二次元電気泳動を行った。分析試験のために、0.75 mmゲルにおけるタンパク質をHeukeshoven[Heukeshoven, J.、1985]によって記述される方法に従って銀染色によって検出したが、質量分析技術に関する微量調製目的の場合には、Blum[Blum, H.、1987]の銀染色法を適用した。トリプシンによる切除スポットのゲル内消化後、ペプチド混合物を精製して、ペプチド回収装置によって脱塩し[Otto, A.、1996]および質量分析を行った。ペプチドの質量および配列決定は、タンデム質量分析(MS/MS)様式でナノフローZ-スプレーイオン源を備えたハイブリッド四極子直交加速時間飛行型(Q-Tof)質量分析装置(Micromass、マンチェスター、イギリス)によって行った[Muller, E.C.、1999]。さらに、対応する1.5 mmの2-DEゲルを、Immobilon PVDFメンブレン(Millipore、エシュボム、ドイツ)に半乾燥ブロッティング条件でエレクトロトランスファーした。ブロッティング後、タンパク質をクーマシーブリリアントブルーR-250によって可視化して、オンライン120A PTHアミノ酸アナライザを備えた477Aパルス液体シークエンサー(Applied Biosystems、フォスターシティ、カリフォルニア州、アメリカ)での自動エドマンシークエンシングによって切り出されたタンパク質スポットを分析した。質量分析および/またはエドマンシークエンシングによって、CLP 1pの銀染色した2-DEゲルにおける個々のスポットを一次同定した後、対応するタンパク質を、オーバーレイソフトウェアパッケージデルタ2D(DECODON GmbH;グライフスバルト)を適用することによって、胎児CLP1b調製物およびヒツジ成体肝臓から調製したCLP1b試料に割付した。
3.3.2.2.1 CLP1bおよびCLP2p(SDS-PAGE)のタンパク質パターン
凍結乾燥材料のCLP1b(>70%w/w)について高い含有量のタンパク質が測定された。対照的に、対応するCLP2p調製物では約3〜4倍低いタンパク質含有量が検出された。SDS-PAGEおよびその後の銀染色の分析から、双方のCLP-プールにおいて、CLP1bに関して分子量約4〜30 kDa、およびCLP2pに関して約4〜10 kDaの範囲の分子量の小さいタンパク質が多数を占めることが判明した(図11)。しかし、後者のCLP-プールのより大量を調べたところ、CLP1bに存在する10〜30 kDaのタンパク質種はまた、CLP2pにおいても微量レベルで検出された。全体で、単一のタンパク質バンド約20〜25個がいずれかのCLP-プールにおいて銀染色によって可視化されたが、これは、相対的な染色強度により、主要なバンド8〜10個および軽微なバンドの相補的サブセットの群にさらに分類された。調製的SDS-PAGE、エレクトロブロッティングおよびN-末端エドマンシークエンシングの後、CLP1bおよびCLP2pの一元電気泳動パターンにおける主要なタンパク質の5個が、ホスファチジルエタノール結合タンパク質(PEBPまたはPBP;P23.4)、ペプチジルプロリル-シス-トランス-イソメラーゼA(PPlase A;p16.9)、細胞レチノールタンパク質I(cRBP I;p14.6)、チオレドキシン(Trx;p9.5)、およびユビキチン(Ub;p6.2)であると同定された。
二次元電気泳動(2-DE)および銀染色による分析は、当初のFSLE(図12)と共に抽出物由来分画であるCLP1b(図13)およびCLP2p(図14)の全体的なタンパク質組成の特徴を調べるための迅速かつ再現性のよい技術であることが証明された。FSLEの二次元電気泳動分析において、分子量100〜2 kDaおよび等電点(I.P.)4.0〜9.0の範囲において約2200個の単一のタンパク質スポットの広いパターンが検出された(図12)。CLP1b調製物の2-DE分析から、個々のスポット全体で576個の非常に再現性のよいパターンが認められ、これらを分子量およびI.P.の大きい順の割付に従って系統的に番号を付けた(図13)。2-DE分離パターンにおけるスポットの大多数は、見かけの分子量領域40〜約6 kDa、等電点(I.P.)値4.0〜9.0の範囲において検出された。先の章で記述したタンパク質の群の他に、CLP1bの2-DE分離パターンにおいて大きい強度のスポットを表すタンパク質さらに20個が、エドマンシークエンシングまたはトリプシン消化およびデータベース関連配列相同性検索と組み合わせたMS/MS分析によって同定された(表4)。同定されたタンパク質は、哺乳類種において進化的に高度に保存されている細胞質タンパク質であることが判明した(表4)。一次元電気泳動分離に基づく最初のデータの確証において、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質(PBPまたはPEBP)、ペプチジル-プロピル-シス-トランス-イソメラーゼA(PPlase A)/サイロフィリンA(Cyp A)および細胞のレチノール結合タンパク質I(cRBP 1)が、CLP1bの2-DEパターンにおいて主要なスポット321、403/405および454に割付された。
標準的なFSLEに存在する重要なタンパク質は、主にそのアルギニン枯渇能のためにインビトロ細胞培養に対して阻害作用を有する酵素であるアルギナーゼである。Abelson 8-1腫瘍細胞の増殖に及ぼすアルギナーゼの直接的な用量依存的作用を示すことができた。アルギナーゼがCLP1bおよびCLP2pについて培養の条件で認められたTCGIにどの程度関与しうるかを分析するために、その活性を[Corraliza, J.M.、1994]に従ってこれらのプールにおいて決定した。表5は、CLP1bは何らかの軽微なアルギナーゼ活性を示すが、プール1は、標準的なFSLEにおいて認められた活性と同等の高いアルギナーゼ活性を示したことを示している。対照的に、アルギナーゼ活性は、このプールがTCGIアッセイにおいて非常に活性であるという事実にもかかわらず、CLP2pにおいて検出できなかった。したがって、アルギナーゼは、プールCLP1bおよびCLP2pに関して培養の状況で認められた増殖阻害効果の主な原因として除外することができる。
リポ多糖類と胎児ヘモグロビンとの相互作用
FSLEsに存在する少量のエンドトキシンは、これらの調製物の生物活性の程度を全く説明しなかった。したがって、FSLE、CLP1b、およびCLP2pの他に、エンドトキシンと相互作用することによってその生物活性を改変するさらなる成分が関与していると推測された。この成分の特徴を調べるために、以下の実験を実施した。
CLP1bにおけるLPSまたはリピッドA相互作用タンパク質を同定するために、LPS/リピッドA-特異的吸着アッセイを開発した。このスクリーニング系において、ポリ塩化ビニル96ウェルマイクロタイタープレート(Becton Dickinson)を、サルモネラ・エンテリカ血清型ミネソタからのS-型LPS、大腸菌F515からのRe-LPS、またはLAL試薬水においてトリエチルアミン(TEA)塩として可溶化した大腸菌株に由来するリピッドA調製物の濃度それぞれ5 μg/mlまたは2 μg/mlによって4℃で14時間コーティングした。対照として、一連のウェルをLPSまたはリピッドAを含まないLAL試薬水によって同様に処置した。その後、溶液をデカントして、ウェルを、マグネシウムまたはカルシウム塩を含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩液(D-PBS;Lifetechnologies)によって4回すすいた。CLP1bにおいてタンパク質の非LPSまたはリピッドA依存的結合の可能性を減少させるために、LPSまたはリピッドAコーティングウェルおよび対応する対照ウェルを、0.2%(w/v)ゼラチン(オーロン)のD-PBS溶液によって絶えず振とうさせながら37℃で1時間処理した。さらなるすすぎ(D-PBSによって4回)段階の後、ウェルを1.0および0.1 mg/ml CLP1bのD-PBS溶液によって絶えず振とうさせながら37℃で1時間インキュベートした。結合インキュベーションの上清をSDS-PAGEによる最終的な分析のために凍結乾燥した。次に、D-PBSによる37℃で20分間の絶えず振とうさせる一連の4段階の洗浄を行い、対応する洗浄溶液も同様に凍結乾燥した。この集中的な洗浄技法の後、SDS試料緩衝液50 μlを各ウェルに加えて、残っている吸着タンパク質およびコーティング材料を溶解した。さらに、先のCLP1bインキュベーションからの凍結乾燥試料およびその後の洗浄段階の試料をSDS-試料緩衝液50 μlに再浮遊させて、吸着アッセイから回収した試料の組成を、Heukeshoven[Heukeshoven, J.、1986]によって記述される方法に従って、15%(w/v)ポリアクリルアミドゲルにおけるSDS-PAGEおよび銀染色によって分析した。
SDS-PAGEおよび銀染色分析から、サルモネラ・エンテリカ血清型ミネソタ188233からのS-型LPS(図17)、大腸菌F515からのRe-LPS(図18)、および大腸菌株に由来するリピッドA調製物(図19)によってそれぞれコーティングしたウェルにおいて、見かけの分子量約12.0(±1.0)kDaを示すCLP1bからの単一のタンパク質バンドがLPSまたはリピッドA依存的に吸着することが一貫して明らかになった。吸着アッセイ(コーティング材料:大腸菌F515からのRe-LPS)の後にトリプシンペプチドの質量分析を調製的に行うことによって、このタンパク質バンドの主成分は、ヒツジヘモグロビンα鎖(Hb-α)(図20)であると同定された。LPSまたはリピッドAコーティングマイクロタイタープレートに対して認められたヒツジ胎児ヘモグロビン(HbF)または対応するHbFサブユニットの高度に選択的な吸着をさらに確認するため、急性期反応体ヒトハプトグロビン(1-1)[h-Hp(1-1);Sigma-Aldrich]をヘモグロビン特異的試薬として用いて、最初のヘモグロビン枯渇段階を試験系に含めた。吸着アッセイ(コーティング材料:大腸菌F515からのRe-LPS)においてCLP1bをh-Hp(1-1)と共にプレインキュベートすると、最終的なSDS-PAGE分析において非ハプトグロビン処置CLP1b試料(図21)と比較して12 kDa-バンドの強度が顕著に減少した。これまでの研究において、ヒト、ウシ、およびブタ成体ヘモグロビン(HbA)がLPSまたは遊離のリピッドAに結合することのみならず、精製成体ヘモグロビン調製物の存在下でインビトロおよびインビボでのLPS生物活性が実質的に増強されることが記述されており、無傷の赤血球におけるその主な酸素輸送機能の他に、溶血によって放出された遊離の哺乳類ヘモグロビンの新規免疫調節機能があることを示している[Roth, R.J.、1994;Roth, R.J.、1999;Belanger, M.、1995]。
氷冷H2O 2 mlに溶解した凍結乾燥した精製胎児または成体ヘモグロビン50 mgに、6 mM HClを含むアセトン45 mlを加えて、-20℃で維持した。-20℃で30分インキュベートした後、沈殿したタンパク質からピンク色の上清を分離して捨てた。沈殿したタンパク質を-20℃の純粋なアセトン45 mlによって3回洗浄した。2500×gで遠心後、アセトンを除去して、沈殿したタンパク質を氷冷水3 mlに溶解して凍結乾燥した。タンパク質は4℃で水に完全に溶解してもはや赤色を呈さなかった。アセトン処理タンパク質を15%SDS-PAGEによって分析すると、精製した未変性のヘモグロビンとほぼ同じパターンを示し、非還元状態で17 kDaで主要なバンドおよび34 kDaで小さいバンドを示し、還元状態で17 kDaの単一のバンドを示した(図25)。このように、これらはグロビンまたはヘム不含ヘモグロビンであると見なすことができる。
5.3.1 通常の方法[Bucci and Fronticelli、1965;Winterhalter and Colosimo、1971]
0.2 M NaClを含む0.1 M KH2PO4溶液 4mlに溶解した凍結乾燥精製胎児オキシヘモグロビン50 mgに、0.1 M NaOH 1 mlにまず溶解した後0.1 M KH2PO4 2 mlを加えて、1 M酢酸約75 μlによってpH 5.8に滴定した4-ヒドロキシ安息香酸水銀(HMB)(Sigma)8 mgを加えた。HMBとヘモグロビンのモル比は、7.5〜1であった。4℃で18時間インキュベートした後、過剰量のHMBを、pH 6.0の10 mM MES緩衝液で平衡にしたセファデックスG25カラム(Pharmacia)での濾過によって除去した。
共有結合クロマトグラフィーによるヘモグロビンサブユニット(α、β、およびγグロビン鎖)を分離するための新しくより有効な方法論を本明細書において記述する。
2.選択的α鎖溶出は、50%酢酸約20 mlによって行った。回収したヘミン含有1.0 ml分画を、Voyager-DE RP飛行時間型装置(PerSeptive Biosystems、フラミンガム、マサチューセッツ州、アメリカ)を用いて、MALDI/MS(マトリクス支援レーザー脱離/イオン化質量分析)によって評価した。異なる独立した2回のMALDI測定をそれぞれの分画について行って、平均でレーザーショット50回の再現性を評価した。質量分析は、αグロビン鎖の予想される質量に対応する15,120 Daの単一のピークを示した。精製α-グロビン/ヘミンは、556、538、420、343、および270 nmで典型的な吸収スペクトルを示した。産物は凍結乾燥によって単離した(収量、3.2 mg)。
3.20 mMジチオスレイトールのpH 7.5酢酸アンモニウム緩衝液溶液において、樹脂を室温で約2時間インキュベートして、pH 7.5の酢酸アンモニウム緩衝液によって繰り返し洗浄して、放出された2-チオピリドンおよび過剰量のチオールを除去した後、50%酢酸によって処置して、固相になおも吸着しているγ鎖を溶出した。回収した分画を、α鎖に関して先に記述したようにMALDI/MSによって分析した。質量分析は15,997 Daで単一のピークを示し、これはヒツジ胎児γ-グロビン鎖の予想質量に対応する(データは示していない)。吸収スペクトルはα鎖のスペクトルに非常に類似していた。産物は凍結乾燥によって単離した。収量、1.8 mg。
1.ヘモグロビンの「露出した」チオール基と活性化チオールアガロース樹脂との反応;
2.強い溶媒和物質によるαグロビン/ヘミンの選択的溶出;
3.ジスルフィド結合の還元後の強い溶媒和物質による純粋なβまたはγグロビン鎖の溶出
ヘモグロビン鎖を単離するための生化学技法を適用する他に、分子クローニングを用いた。ヒツジおよびヒトHb鎖のクローニングおよび発現のために用いた技法は以下の通りである。
を含めるように再設計した。以下のプライマーの組(ヒトPBLから単離したmRNAと共に)を、本戦略に用いた:
ヒトα鎖:
ヒトHbのγ鎖に対するモノクローナル抗体を産生するために、25量体ペプチド(完全長のγ鎖の48〜72位に対応する)(
)を合成して(American Peptide Co,、カリフォルニア州)、KLHに共役させた。ラットをKLH共役タンパク質によって免疫してから脾細胞を採取して、YB2親骨髄腫細胞と融合させて、ELISA(ペプチドまたはヘモグロビンのγ鎖をコーティングしたプレート)においてヒトγ鎖を検出するmAbを産生するハイブリドーマに関して選択した。
を用いて、BSA共役ペプチドと共に免疫し、上記のようにスクリーニングすることによって抗ヒツジγ鎖を産生した。異種およびmAbsが関連するヘモグロビン鎖を検出しすることの確認は、ウェスタンゲルによって得た。
LPS、リピッドAおよびモノホスホリルヘキサアシルリピッドAの調製および特徴付け
6.1.1 細菌の増殖、LPS抽出およびモノホスホリルヘキサアシルリピッドA(MPLA)の調製
大腸菌Re変異体株F515[Schmidt, G.ら、1970]の四つのバッチを、10 L発酵器において、1時間培養物の2%を接種したカゼインペプトン培地[Schlecht S.ら、1975]において37℃、pH 7.2で静止相まで18時間増殖させた。細菌を1%フェノールによって殺菌して遠心(JLA-8100、Beckman)によって回収した。細胞(湿重量402 g)を蒸留水、エタノール、アセトン(2回)各2L、およびジエチルエーテル1 Lによって1回洗浄した後乾燥させた(収量;101.5 g)。
粗モノホスホリルリピッドA(MPLA)を、大腸菌F515のRe-LPS 1.0 gから塩酸(0.1 M HCl)100 mLにおける100℃で30分間の加水分解によって得た。加水分解産物を氷中で冷却して、遠心(4,000 rpm、4℃、10分、ヘチッヒ、ロチキサRP)して、沈殿物をクロロホルム:メタノール80:20(容積)に浮遊させ、乾燥させると粗MPLA 731.8 mg(〜73%w/w)が得られた。この材料のTLCは、二つの主要な脂質がヘキサアシル(RF=0.77)およびペンタアシル(RF=0.71)MPLAと同時に移動するかなり均一な天然のMPLAを示した(図29)。
分析的TLC(図29)は、アルミニウムシリカゲルシート(0.2 mm、キーゼルゲル60 F254、Merck)において行い、各試料30 μgを1レーンあたり適用した。TLCシートをクロロホルム:メタノール:1%酢酸100:50:3(v/v/v)において展開して、エタノール:濃硫酸85:15(v/v)に浸して加熱することによって染色した。分析的TLCと同じ溶媒系を用いてシリカゲルをローディングした分取用薄層クロマトグラフィー(PLC)に粗リピッドA(全体で170 mg)を適用して、リピッドA分画の調製的精製を行った。分取用薄層クロマトグラフィー(PLC)は、PLCプレート(厚さ2 mm、20×20 cm、キーセルゲル60、Merck)あたり20 mgの少量の粗MPLA(160 mg)を8個ローディングすることによって行った。PLC後、プレートに2回蒸留水を噴霧すると、MPLAバンドは目に見えるようになった。乾燥したプレートから分画をかきとり、クロロホルム:メタノール80:20(v/v)によってシリカゲルから濾過によって溶出して、上記の溶媒10 mlによって2回洗浄した。純粋なMPLA分画をロータリーエバポレーターにおいて濃縮して、水2〜5 mlに再浮遊させて、それに対してトリエチルアミン水溶液(TEN、0.36 M)をpH〜8.5に達するまで滴下した。リピッドA TEN-塩浮遊液を水(600 ml、4回)に対して透析して、凍結乾燥した。
Stromingerら[Strominger, J.L.ら、1959]の方法によって、4 M HClによる加水分解(100℃、16時間)の後GlcNを決定し、ホスフェートをLowryら、1954の方法によって決定した。脂肪酸分析の場合、凍結乾燥したリピッドA試料(200 μg)を内部標準(ヘプタデカン酸、17:0)50 μgと混合した。密封したアンプルにおいて2 M HCl/MeOH 1.5 ml中で120℃で16時間メタノリシスを行った後、総脂肪酸分析を行った。メタノリシスした試料を水に溶解して、得られた脂肪酸メチルエステルをクロロホルム3 mlによって3回抽出して、濃縮し、GLCによって分析した。
MALDI-TOF MSを、加速電圧20 kVでリニアモードにおいてBruker-Reflex II(Bruker-Franzen、ブレーメン、ドイツ)によって行った。リピッドAをTEN水溶液(0.07 M)に2 μg/μL の濃度で溶解して、過剰量のナトリウムおよびカリウムを除去するために少量のアンバーライトIR-120(H+)陽イオン交換樹脂によって処理し、溶液1 μLを、マトリクス溶液として0.5 M 2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン(Aldrich、ダイセンホーフェン、ドイツ)のメタノール溶液1 μLと混合した。0.5 μLの少量を金属製の試料ホルダーに入れて、空気流において乾燥させた後直ちに分析した。質量分析スペクトルを陰および陽イオンモードで記録した。機器は、既知の化学構造を有する類似の化合物によって外部から質量の較正を行った。
NMR分析の場合、完全にプロトン化したリピッドA型を調製しなければならず、これは0℃で蒸留水2 mL中に精製MPLA 13 mgを浮遊させ、0.36 M TEN水溶液を加えることによってpHを〜9まで増加させて、その後0.1 M HClを冷所で滴下してpHを〜2まで減少させることによって得られた。沈殿したリピッドAを遠心(2500 g、5分、4℃)によって単離した。沈殿物を4:1クロロホルム/メタノール(v/v)3 mLに溶解して蒸留水5 mLによって3回洗浄した。溶媒を除去した後、残渣をデシケータにおいてP4O10上で乾燥させた。MPLAのNMRスペクトルを、5 mm高精度NMR試料チューブ(Promochem)においてクロロホルム-d/メタノール-d4 4:1(v/v)0.5 mLにおいて記録した。
6.2.1 リピッドAの精製および免疫染色によるTLC分析
粗リピッドA加水分解産物のTLC分析から、LPSの酢酸加水分解によって得られた場合と同様に、意外にも二つのみの分画が示された(図29)。分取用薄層クロマトグラフィー(PLC)によって以下の二つのMPLA分画が得られ、その既知のRF値[Zahringer, U.ら、2001]、およびMALDI-TOF質量分析:MPLAhexa(RF 0.77、13.1 mg)(収率8%w/w)に基づいて推定に割付した。全ての粗リピッドAに存在するMPLApentaはこれ以上調べなかった。
MPLAの脂肪酸分析から、(R)-3-ヒドロキシテトラデカノエート[14:0(3-OH)](1411 nmol/mg)がモル比3.7 mol/2 mol GlcNで存在することが判明したが、12:0(1.0 mol/2 mol GlcN)および14:0(0.8 mol/2 mol GlcN)は予想範囲内であることが判明した。ホスフェートは、0.9 mol/2 mol GlcNであると推定され、MPLAリピッドA骨格の構造[(4'-P-β-D-GlcpN-(1'→6)-D-GlcpN]と適合した。精製MPLAhexaにおける様々な脂肪酸の位置を割付けするためには、標的分子の完全な構造分析を行うためのMALDI-TOF質量分析およびNMR分光法によるさらなる分析が必要である。
MPLAhexaの陰イオンMALDI-TOF質量分析により、m/z 1716.15(図30)で顕著な分子イオンピーク[MMPLAhexa-H]-が明らかとなり(図30)、デ-1-ホスホリピッドA骨格からなり、14:0(3-OH) 4個を有し、それぞれの一つが12:0および14:0である(C94H193O30N2Pに関して計算された単同位体分子量Mr 1717.12)MPLAhexaと良好に一致した。スペクトルはまた小さいピークを示したが、これらはそれぞれ、14:0および[14:0(3-OH)+14:0]の断片化に対応する可能性が最も高い。
MPLAhexaの一次構造を、2:1クロロホルム-d/メタノール-d4(v/v)においてプロトン(1H)、炭素(13C)、燐(31P)NMR分光法によってさらに調べた。1Dおよび2D NMRスペクトルによって、ホスフェートおよび脂肪酸置換パターンを含むリピッドAの一次構造を明確に決定することができた(図31)。
ヒツジ胎児ヘモグロビンおよびヘム不含HbFのLPS-凝集解離活性の生化学特徴付け
7.1 方法
成体哺乳類ヘモグロビン(HbA)調製物によるLPS生物活性の増強の分子メカニズムに関して、生理的に多くを占める大きいLPS凝集体(分子量≧106 Da)がHbAによって強く分散されることが記述されている[Roth, R.J.、1994;Kaca, W.、1994;Roth, R.J、1999]。高度に精製されたヒツジ胎児ヘモグロビン(s-HbF)についても類似の作用があるか否かを分析するために、PhastSystem(商標)装置(Amersham Pharmacia Biotech)を用いて自動未変性PAGEアッセイを確立した。簡単に説明すると、大腸菌F515から精製したRe-LPSまたはサルモネラエンテリカ血清型ミネソタ188233からのS-型LPSを、分析したヘモグロビン調製物(0.375 μg/μl)の存在下または非存在下で、最終濃度0.275 μg/μlで37℃で30分間インキュベートした。その後、試料を氷中に入れて、4倍濃縮未変性試料緩衝液(200 mMトリス塩酸、pH=7.6;40 mM 2-メルカプトエタノール;40%(w/v)グリセロール;0.008%(w/v)ブロモフェノールブルー)を加えることによって未変性PAGE条件に合うように調節し、試料容積1 μlを、PhastSystem(商標)電気泳動ユニットにおいて未変性PhastGel(商標)未変性緩衝液小片を備えたPhastGel(商標)Homogeneous-20ゲルのスタッキングゲルゾーンに自動的に適用した。非変性電気泳動を4℃、400 Vの一定電圧でプログラムモードで行った。未変性PAGEの後、ゲルをHeukeshoven & Dernick[Heukeshoven J. and Dernick, R.、1988]のプロトコールに従ってPhastSystem(商標)展開ユニットにおいて銀染色した。先の未変性インキュベーション技法を通してのタンパク質成分の完全性を制御するために、SDSを最終濃度2%(w/v)で加えて、試料を95℃で5分間加熱した。変性した試料を、製造元の標準的なプロトコールに従って未変性PhastGel(商標)SDS緩衝液小片(Amersham Pharmacia Biotech)を備えたPhastGel(商標)Homogeneous-20ゲルにおけるSDS-PAGEの後に銀染色によって最終的に分析した。ヒトHbA(SIGMA-Aldrich)のヒツジHbF調製物と比較して、成体ヒツジヘモグロビン(s-HbA)およびヘム不含ヒツジ胎児ヘモグロビン(s-HbF/hf)を、未変性Phast(商標)PAGEアッセイにおいてLPS凝集解離活性に関して分析した。
未変性のPhast(商標)PAGE分析から、ヒツジ成体および胎児ヘモグロビン調製物の存在下と共にヒトHbAの存在下で、R-およびS-型LPSの双方が電気泳動時に20%ポリアクリルアミドゲルの分離ゲルゾーンまでより広範囲の距離を移動したが、非ヘモグロビン処置LPS調製物は、選択した未変性条件では大きい凝集体(分子量≧106 Da)が多量に形成されたためにスタッキングゲルゾーンに遅れて残っていることが判明した(図32)。ヒトHbAについて得られた未変性PAGEデータは、より大きい規模の未変性PAGEを用いたこれまでの報告からの結果と類似であった[Kaca, W.、1994]。本発明者らのデータは。、高度精製ヒツジHbAおよびHbF調製物によるLPS凝集体の強い分散を強く示している[Roth, R.J、1994;Kaca, W、1994;Roth, R.J、1999]。特に、未変性電気泳動データにより、ヒツジHbA調製物と比較してヒツジ胎児ヘモグロビンのより強いLPS凝集解離活性の証拠が提供された。意外にも、さらなる未変性Phast(商標)PAGE分析において、LPS凝集解離活性は、ヒツジ胎児ヘモグロビンのヘム鉄枯渇調製物においても保存されることが示された(図33)。
LPSまたはMPLAおよびヒツジ胎児ヘモグロビンのインビトロでの相乗的生物活性
8.1 LPSまたはリピッドAおよびヘモグロビンによる酸化窒素誘導
8.1.1 方法
8.1.1.1 試薬
S.エンテリカ血清型ミネソタRe-変異体R595からのLPSおよび遊離のリピッドAと共にMPLAを用いた。
6〜10週齢の雌性および雄性BALB/cマウスを、フライブルクのマックスプランク免疫研究所の交配施設から得た。
実施例3.1.1.1を参照されたい。
実施例3.1.1.4を参照されたい。
8.1.1.5.1 ヒトヘパリン加血からの単核球の単離
成人健康ドナーからのヒト単核球(MNC)を、フィコール密度勾配において単離した[Boyum、1968]。MNCをHBSSにおいて4回洗浄して、1%L-グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640培地に再浮遊させて、濃度を細胞4×106個/mlに調節した。
単離したばかりのヒトMNCを、48ウェルディッシュにおいて細胞密度1.6×106個/400 μl/ウェルで播種した、および/またはCLP2p(10 μl/ml)をLPS(10 μl/ml)の存在下または非存在下で37℃で30分間プレインキュベートして、MNCに加えた。22〜24時間インキュベートした後、無細胞上清を回収して、ELISAによるTNFα放出に関してアッセイした。
8.1.2.1 ヘムの存在下および非存在下でLPSまたはモノホスホリル-リピッドAにおよびHbFよって刺激したBMDMsによるNO産生の誘導
LPSと胎児ヘモグロビンと共にヘム不含HbFとのあいだの相乗効果の依存性を調べるために、BMDMにおけるNO産生の刺激能を調べた。
8.2.1 方法
マウス脾細胞またはヒトPBL(フィコールハイパック精製)をMEM培地(10%FCS)1 mlにおいて、単独またはLPSの様々な濃度の存在下、LPS不含(LALアッセイ)FSLEの存在下または非存在下、Hb または下部構造の存在下および非存在下で、細胞濃度1×106個/mlで37℃で24時間インキュベートした。上清を、組換え型マウスTNFαを標準物質として用いて、ELISAまたはバイオアッセイ(Wehi 1643腫瘍細胞の増殖阻害)によってTNFαに関してアッセイした。
LPSとHbまたは下位分画との相乗効果をアッセイするために二つのタイプの試験を行った。マウス脾細胞を用いる第一の一連の実験(図37および38)において、ヒツジ胎児Hb(ヒツジ成体Hbとは対照的に)を用いた場合、TNFα(図37)またはIL-6(図38)の産生において相乗効果の明確な証拠を認めた。第二の一連の実験において、ヒトPBLをLPSおよびHbによって処理した。この場合も、HbAと比較してHbFを用いた場合、TNFαの産生に関して顕著な相乗効果を認めた(図39)。最後に、無関係なヒトPBLドナー2人(図40のパネルAおよびB)を用いて、HbAまたはHbFの異なる下部構造を、その相乗効果の生成能を調べるために用いた。TNFα産生に関して最適な相乗効果が、LPSと共に胎児Hbα、γ二量体によって引き起こされたことは明白である(図40)。
生化学的に精製したヒツジ胎児γ鎖が相乗活性を示すか否かを分析するために、MPLAの生物活性に及ぼす効果を分析した(図40B)。ヒト末梢単球によるTNFα放出によって決定されるように、精製γ鎖は、MPLA生物活性の増強において劇的な効果を示したが、α鎖ははるかに活性が低かった(図40B)。これらの結果は、γ鎖がLPS生物活性に対するHbの作用の媒介に関与しているというこれまでの考え方を支持する。
得られた結果はLPSおよびHbの相乗効果およびCLPプールによる増強活性を示し、これを図40Cに示す。マウス脾細胞からのTGFβの放出によって決定されるように、LPS単独およびHb下部構造単独(上のパネル)では、サイトカイン放出は低かった(<250 pg/ml)。LPSおよびHb下部構造をCLP1bまたはCLP2pと共に分析すると(下のパネル)、胎児γ鎖の場合に明確な相乗効果を認めた。実際に、CLP1bを添加すると、TGFβ産生は対照(上のパネル、CLP1bなし)と比較して約2倍(中央のパネル)増強された。これらのデータは、CLP1b/CLP2pおよびしたがってFSLEにおいて、マウス脾細胞系においてLPS/Hb相乗効果を加速する分子が存在することを示している。
FSLE(CLP2pの形で)が、ヒト細胞の場合と同様に、相乗的なsHbF/LPS系において調節活性を示すか否かを試験するために、第8.1.1.5.1章に記述するようにヒト末梢血単球をLPS、sHbFおよびCLP2pと共に処置した。TNFα産生によって決定され、図40Dにおいて示されるように、CLP2pを添加した場合、LPS/sHbf相乗効果の有意な増強を認めた。この結果は、FSLEにおいて、ヒト系においてもHb/sLPS相乗作用を改変、すなわち増強する因子が存在することを示している。
LPS、Hb、および下位分画と共にFSLEおよびLPSを特に経口経路によって投与後のインビボでの免疫機能の調節
9.1 方法
マウスに経口針(PBS 100 μl)によって、および/またはi.p.もしくはi.m.経路によってチャレンジを行った。動物を24時間後に屠殺して、血清をTNFα(実施例8.2.1を参照されたい)およびIFNγ(ELISA)に関してアッセイした。さらに、腹腔洗浄液を遠心して細胞を除去し、サイトカインレベルに関して同様にアッセイした。
これまでに記述された研究のほとんどにおいて、CLP-プール(1b/2p)をインビボで投与する場合は常に、i.p.、i.m.、またはi.v.注射を適用した。これらの分画が、経口投与のような他の投与経路による投与後に作用(局所および全身的に)を示すか否かを調べた。
サイトカイン誘導におけるFSLE、Hb構造およびLPS間の相乗作用の証拠を調べるために、TNFαおよびIFNγ細胞の間接的な刺激をインビボで調べた。マウスに、LPS 10 μgをipもしくは経口針(PBS 100 μl)によって、またはFSLE(300 μg/マウス)を経口針によって投与した。各調製物を単独または併用して投与した。動物を24時間後に屠殺して、心穿刺によって血液を採取した。10%FCSを含む暖かいMEM 2.0 mlを腹腔に注入して、腹腔洗浄液を無菌的に回収した。後者、および血清を図41に示すようにTNFαおよびIFNγ濃度を推定するために滴定した。この場合も、バイオアッセイからのデータのみを示す(ELISA-バイオアッセイにおいて同等のデータが得られ、Wehi 279細胞を用いてIFNγに関するデータを得た)。さらに、一つの血清濃度および洗浄液の一つの濃度(それぞれの場合において20 μl/200 μl試験ウェル)に関するデータのみを示す。図41に示すように、LPSを経口またはi.p.によって投与したかによらず、CLPの経口針による投与後に、TNFα(血清中)およびIFNγ(腹腔洗浄液)の相乗的な産生の増加を認めた。最適な相乗効果はFSLE/LPSの双方の経口針による投与後であるように思われた。
FSLE(またはヘモグロビンタンパク質鎖)とLPS(またはリピッドA分画)とのインビボでの相乗的相互作用を調べるために、以下の試験を行った。C57BL/6マウス5匹の群に、生理食塩液100 μlの経口針による投与によって少なくとも1回の刺激を行った。図43に示す実験では、他の刺激(LPSまたはリピッドA部分構造)を腹腔内投与した。図44に示す実験データでは、さらなる刺激(LPS)を経口針溶液に含めた。マウスは全て24時間後に屠殺して血清を採取し、ELISAによってサイトカインに関して1試料あたり3回ずつアッセイした。さらなる詳細を図の説明文に示す。
マウスに異なるプール(CLP1b/CLP2p)をi.v.、i.p.、またはi.m.注射のみならず経口針(滅菌PBS 0.2 ml)によって投与した。用量は0.5〜50 μg/マウスの範囲であった。動物を処置後様々な時間(1〜48時間)に屠殺した。場合によっては、様々な起源からのリンパ様細胞(脾臓;パイエル板(PP);腋かリンパ節;腸間膜リンパ節;腹腔細胞)をさらに刺激を行わずに24時間インキュベートして、細胞上清におけるサイトカインをアッセイした。CLP1bの経口針による投与後のPP細胞からのサイトカイン産生を示すデータを表7に示す。
a C57BL/6マウス(8週齢)5匹の群に、屠殺の24時間前に経口針(PBS 0.2 ml)によってLPSまたはCLP1bを投与した。細胞の回収は全ての群において同じであった。それぞれの個体のパイエル板からの個々の細胞浮遊液(2×106個/ml)を、刺激を行わずに10%FCSを含むαMEMにおいて24時間培養した。上清を先と同じようにサイトカインに関してアッセイした。
b 異なるサイトカインに関する算術平均(全ての場合においてSD<15%)。
n.d. アッセイにおける検出下限を示す(検出不能)。
CLPプールの免疫調節活性(パート1)
TLR4遺伝子欠損マウスを用いたTNFα産生、NO産生、および脾細胞増殖を含むCLPプール活性
10.1 方法
10.1.1 マウス
C57Bl/10 ScSnおよびBalb/cマウス(いずれもLPS反応体)およびC57Bl/10 ScCrマウス(LPS非反応体、TLR4遺伝子欠損マウス)を、ドイツ、フライブルクのマックスプランク免疫研究所から得た。マウスを3〜5匹ずつケージに収容して、飼料および水を自由に与えた。
10.1.2 脾細胞の調製
マウス(6〜8週齢)を断頭によって屠殺した。脾細胞を無菌的に採取して、ガラスホモジナイザー(Braun、メルスンゲン、ドイツ)を用いて組織を破壊した。得られた細胞浮遊液を、添加物を含まないRPMIを用いて2回洗浄して、10%FCS、100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシンを含むRPMI(cRPMI)に浮遊させた。
脾細胞増殖は、DNAへの3H-チミジン取り込みを測定することによって決定した。培養を全量150 μl/ウェルで平底マイクロタイタープレートにおいて開始した。脾細胞3×105個およびCLP1b(100、20、4 μg/ml)、CLP2p(100、20、4 μg/ml)、またはLPS(1、0.1 μg/ml)を5%CO2でcRPMIにおいて培養した。対照培養には単純な培地を加えた。24時間後、3H-チミジン(23.125 KBq/ウェル)を添加して細胞を24時間パルスした。凍結融解後、DNAへの3H-チミジン取り込みを液体シンチレーション計数によって決定した。
刺激のために、骨髄由来マクロファージ(BMDM)(4×105個/ウェル)を全量600 μl/ウェルで24ウェルマイクロタイタープレート(Fa、Falcon、Becton Dickinsonヨーロッパ、Le Pont de Claix、フランス)において培養し、LPS(10 ng/ml〜0.01 ng/ml)および5 μg/ml FSLE(ロット072)によって刺激した。対照培養には通常の培地を加えた。培養物を37℃、5%CO2でインキュベートした。サイトカイン産生を測定するために、4または24時間後に上清を回収した。上清におけるサイトカイン濃度を、製造元の説明書に従ってELISAによって決定した(試薬は全て、Pharmingen、BD Biosciences、ハイデルベルク、ドイツから購入した)。
骨髄由来マクロファージ培養物の上清におけるNO産生の測定は、実施例3.1.1.4に記述した通りに行った。
10.2.1 TLR4遺伝子欠損マウスを用いた脾細胞増殖の誘導
脾細胞増殖実験の結果を図45に示す。C57Bl/10 ScSnマウスからの細胞は、1および0.1 μg/ml LPSによる刺激後の3H-チミジン取り込みの顕著な増加によって認められうるように、LPSに対して正常な反応を示した。近縁のC57Bl/10 ScCrマウスは、第4染色体に存在するLPS遺伝子においてヌル変異を有する[Poltorak, A.、1998]。このために、本明細書において脾細胞に関して示されるように、それらの細胞はLPS刺激に対して非常に不応性である。LPS反応体マウスにおいて、CLP1bは、100、20、または4 μg/mlで3H-チミジン取り込みの顕著な増加を誘導し、最大活性は約100 μg/ml周辺で認められた。CLP1bの活性はCLP2pの活性を超えていた。LPS非反応体マウスにおいて、CLP1bおよびCLP2pは、100、20、または4 μg/mlでかなり低いが有意な3H-チミジン取り込みを誘導した。
TLR4遺伝子欠損マウスにおいて骨髄由来マクロファージを用いたNO産生の誘導に関する実験の結果を図46に示す。C57Bl/10 ScSn LPS反応体マウスからのBMDMは、用いた用量(0.8〜100μg/ml)のCLP1bおよびCLP2pによる48時間の刺激後酸化窒素放出の強い増強を示した。C57Bl/10 ScCr LPS非反応体、TLR4遺伝子欠損マウスにおいて、CLP1bおよびCLP2pははるかに低い程度の活性であった。この実験は、CLPプールの生物活性がLPSに依存的であるが、活性の一部は別の要因によって媒介されることを証明している。
CLP-プールの免疫調節活性(パートII)
加齢関連免疫不均衡の回復
11.1 生物系(方法)
11.1.1 加齢関連実験におけるマウス系
若い(8週齢)および加齢(100〜115週齢)BALB/cNia、DBA/2Nia、およびC57BL/6Niaマウスをチャールスリバー研究所の国立老化研究所(ストニーリッジ、ニューヨーク州)から購入した。マウスを5匹ずつケージに収容して、飼料および水を自由に与えた。マウスは全て供給元からの到着後2週間以内に使用した。場合によっては、マウスに800 Radのγ線(137Cs源、線量率102 R/分)を照射して、脾細胞を尾静脈から注入して再構成した。
動物に、CLP1b/CLP2p 10〜100 μgのPBS溶液0.25 mlを3.5日毎に4回または6回(放射線を照射して脾細胞を再構成後)の腹腔内注射を行った。マウスを最後の注射の2日後に屠殺して、脾(またはパイエル板、リンパ節)細胞を採取した。場合によっては、マウスをインビボでヒツジ赤血球(SRBC)4×108個によって免疫するか、または致死量(900 Rad)の照射後同系骨髄細胞1×105個を投与した。実験によっては、いくつかの群にNG-メチル-L-アルギニン(L-NMMA)を30 mg/kgの用量で毎日静脈内注射した。
サイトカイン産生を評価するために用いた培養において、反応体細胞5×105個をマイクロタイタープレートにおいて5 μg/ml Con Aによって、またはウェルを抗CD3-ε(100 ng/ml)によって予めコーティングしたプレートにおいて1試料あたり3個ずつ刺激した。40時間目に同等のウェルからの上清をプールして、ELISAアッセイにおいてリンフォカイン産生に関して1試料あたり3個ずつアッセイした。
11.2.1 抗加齢成分としてのCLP1bおよびCLP2pの役割
加齢関連免疫反応性が大きく変化することは、今日まで研究された全ての哺乳類種について報告されている[Wechsler, M.E.、1992;McLachlan, J.A.、1995;Burns, E.A.、1997]。これらの変化は、免疫系のT細胞区画において最も顕著であるように思われる。多くの研究から、反応する細胞の頻度の普遍的な減少、年齢による細胞の反応能の機能的変化、および/または免疫系の全体的な機能を調節するサイトカイン、増殖因子およびホルモンの高度に調和されたネットワークの破壊[Miller, R.A.、1996]があるか否かを調べるために、年齢によるT細胞免疫のこのような脱調節に関して可能性がある説明に取り組んできた。以下の研究は、CLP1b/2pがマウスにおける加齢関連免疫変化を回復できることを明らかに証明している。
a 1群あたりマウス6匹を用いた。若いマウスは12週齢であり、加齢マウスは100〜120週齢であった。全てのマウスにヒツジ赤血球(SRBC)4×108個をPBS 0.5 mlにおいて静脈内注射した。
b マウスに、3日間隔でCLP2p(50 μg/マウス)を5回静脈内注射してから、SRBCによる免疫を行った。
c SRBC後7日目でのマウスにおけるPFC/脾細胞1×106個。平均的な細胞回収/脾臓は全ての群において同等であった(120×106±10×106個)。
a 骨髄をドナー3匹/群からプールした。若いマウスは12週齢であり、加齢マウスは24ヶ月齢であった。
b マウスに、3日間隔でCLP2pの静脈内注射(50 mg/マウス/注射)を3回行ってから、放射線を照射した。
c マウスを12日目に屠殺して、脾臓コロニーを肉眼で計数した。データはマウス8匹/群の算術平均(+SD)である。
* 年齢をマッチさせた対照と比較してp<0.05。
先に記述したように、免疫学の文献における最も重要な知見は、加齢が、刺激リンパ球からのサイトカイン産生の変化に関連しているという証拠である[Miller, R.A.、1996;Wechsler, M.E.、1992]。若い動物(およびヒト)は、主にIFNγおよびIL-2を産生するが、年齢と共にIL-4、IL-6、IL-10、およびTGFβの産生量が増加した。したがって、マウスに注射されたFSLE、特にCLPプール(CLP1bおよびCLP2p)が、加齢マウスにおけるサイトカイン産生プロフィールの変化を回復できるか否か、そしてこれらの効果が加齢動物における未刺激対メモリーリンパ球数の(既知の)変化によってどの程度説明されるかを評価するために、一連の試験を設計した(FSLEに関して[Gorczynski, R.M.、1998]を参照されたい)。
a ドナー4匹/群からの個々の脾細胞試料を試験した。反応体細胞5×105個をマイクロタイタープレートにおいて5 μg/ml ConAと共に1試料あたり3個ずつインキュベートして、上清を40時間目に回収した。マウスに50 μg/マウスCLp1b(またはCLP2p)を3日間隔で5回i.m.注射を行い、最後の注射の3日後にインビトロでサイトカイン産生のために脾細胞を用いた。対照(無処置)マウスには通常の生理食塩液(NS)のみを投与した。CLPプールに関する試験は、加齢マウスに限って示す。
b 若い(8週齢)または加齢(110週齢)DBA/2Niaマウスからの細胞培養を用いて1試料あたり3個ずつのアッセイからの3回の試験に関して平均したサイトカインレベルの算術平均(±SD)。
若いレシピエントからのサイトカイン産生に対するCLP-プール処置の有意な影響はなかった(最初の列と同等のデータ)。
* 対照と比較してp<0.05(最初の列)
# PBS単独を注射した年齢をマッチさせた対照マウスと比較してp<0.05。
CLPプールの免疫調節活性(パートIII)
CLP-プールの抗腫瘍活性
12.1 さらなるマウス系(方法)
12.1.1 マクロファージ/脾細胞媒介腫瘍細胞抑制の決定(増殖アッセイ)
マクロファージおよび脾細胞媒介細胞抑制を、エフェクターおよび標的細胞の同時培養において、3H-チミジン(メチル3H-TdR、比活性5 Ci=185 GBq/mMol、Amersham Buchler、ブランシュバイヒ、ドイツ)の腫瘍細胞DNAへの取り込みの減少によって決定した。培養を全量200 μlで平底マイクロタイタープレートにおいて行った。BMDMおよび/または脾細胞および様々な濃度のCLPプールと共に腫瘍細胞5×103個を、cDMEM(Abelson)またはcRPMI(Sp2/0)においてそれぞれ10%および5%CO2で1〜3日間培養した。25 μl=0.5 Ci3 H-TdR/ウェルを加えることによって、増殖細胞を最後の4時間標識した。標識培養物を凍結(-20℃)融解し、自動細胞ハーベスタ(Pharmacia LKB、フライブルク、ドイツ)によってガラス繊維フィルタープレートに回収した。組み入れられた放射活性は液体シンチレーション計数(βプレート、Pharmacia LKB)によって決定した。BMDMおよび/または脾細胞のみを含む対照培養を処置して、エフェクター細胞によって取り込まれた放射活性を補正するために、これらの培養物からのcpm値を共培養物のcpm値から差し引いた。
12.2.1 CLP1b/2pによって刺激したマクロファージおよび/または脾細胞による腫瘍細胞増殖阻害
CLP1b/2pを広い濃度範囲でTCGIアッセイに適用した。いずれのプールも強い用量依存的なマクロファージ活性化を誘導したが、その結果、約1 μg/mlまたはそれより低い濃度でAbelson 8-1腫瘍細胞増殖の強い阻害を誘導した(図47A)。脾細胞をマクロファージおよび腫瘍細胞の共培養物に加えると、CLP1bまたはCLP2pと共に行った培養物においてTCGI活性の顕著な増加が得られた(図47B)。
原発腫瘍からの腫瘍の転移は、重要な医学的問題であり、その現象を研究するモデルは非常に重要である。C57Bl/6マウスにおいて自然発症した腫瘍であるLewis肺癌を用いた系[Seguira, S.、1955]は、それが肺に転移することから特に有用である。その高度の悪性度は、その低い免疫原性特性に関連している[De Wys, W.D.、1972]。
異なる発達段階でのヒツジ肝抽出物またはプールにおけるマクロファージおよび脾細胞活性化因子のレベルを決定するために、新生児のみならず3〜4年齢の動物からの肝抽出物を調製して、Sephadex G-100(登録商標)において分離し、実施例2に記述されるように得られた分画をプールした。これらのプールをTCGI誘導活性に関する対応するCLPプールと比較して試験した。CLP2pプールにおいて主要な差が明らかとなった:胎児および新生児動物からのCLP2pは、成体動物から調製されたCLP2pよりマクロファージの刺激において100〜1000倍活性が高かった(図49)。それぞれの分離に関して最も活性の高いプール(胎児抽出物、新生児からの抽出物、および成体ヒツジからの抽出物)の活性を任意に100に設定して(図50を参照されたい)、異なる発達段階での抽出物から調製したプール1bおよび2pの相対的なTCGI活性と比較すると、CLP1bおよびCLP2pの相対活性が出生後減少していることは明らかである。これは、胎児生命の過程における刺激活性の消失によって、またはそれによって分離の際の化合物の異なる挙動が起こる、ヘモグロビンのような周産期の胎児活性成分の改変によって説明することができる。
12.3.1 末梢血からのヒトMNCの単離および単球の濃縮
血液試料を健康なヒトドナー(輸血内科、フライブルク大学病院)から得た。血液をPBSによって1:2希釈して、単核球(MNC)をフィコール・パック勾配(密度1.077 g/ml、Pharmacia、フライブルク)を用いて回収した。細胞をPBSによって4回洗浄して、ヒト自己血清を予めコーティングしたペトリ皿(MNC 1〜2×108個/RPMI 1640(F1215、Seromed Biochrom KG、ベルリン)20 ml)に加えた。細胞を1〜1.5時間インキュベートして、単球を接着させた。その後、非接着細胞を注意深く除去して、接着単球をセルスクレイパーによって優しく剥がした。細胞を1回洗浄して、細胞抑制アッセイにおいて直接用いるために10%FCS、1%非必須アミノ酸、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンを含むRPMI 1640(cRPMI)に再浮遊させるか、またはインビトロでマクロファージにさらに分化させた(下記を参照されたい)。
細胞抑制アッセイは、平底マイクロタイタープレート(Falcon 3075、Becton Dickinson、ハイデルベルク)においてcRPMI(上記を参照されたい)において行った。単離されたヒト単球(5×104個または2.5×105個/ウェル)をU937腫瘍細胞5×103個および様々な濃度の異なる刺激と共に全量200 μl/ウェルで37℃、5%CO2において72時間インキュベートした。同時培養の最後の4時間において、[3H]-チミジン(125 Bq=0.625 Ci/ウェル;比活性:185 GBq/mmol;Amersham Buchler、ブラウンシュバイヒ)を加えることによって増殖しつつある腫瘍細胞を標識した。凍結融解後、培養物を、自動細胞ハーベスター(タイプ1295-001、PharmaciaLKB、フライブルク)によってガラス繊維フィルター上で回収し、腫瘍細胞のDNAに取り込まれた放射活性を液体シンチレーションカウンター(ベータプレート1205、Pharmacia LKB)において測定した。増殖の阻害、すなわち取り込まれた放射活性の減少を計算して、影響を受けない対照(0%阻害)としての非刺激単球の存在下においてインキュベートしたU937細胞を定義する。
フィコールにおける1400 ×gで20分の密度勾配遠心(密度、1.077 g/ml、PharmaciaLKB、フライブルク、ドイツ)によってヒトPBMCを得た。混入している血小板を除去するために、回収した細胞をリン酸緩衝生理食塩液(PBS)によって6回まで洗浄した。単球およびBリンパ球を37℃および5%CO2でプラスチックに1時間接着させることによって減少させた。非接着細胞を25 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、1% NEAA、10%熱不活化仔ウシ胎児血清、100 U/mlペニシリン、50 μg/mlストレプトマイシン(全てSeromed Biochrom KG、ベルリン)を添加したRPMI 1640において培養した。細胞を濃度1×106個/mlで37℃、5%CO2において3〜4日間培養した。LAK細胞産生に関して、rhuIL-2(100 U/ml;Becton Dickinson、ハイデルベルク、ドイツ)またはCLP1bおよび2pの1:1混合物を対応する培養に加えた。
過塩素酸3,3'-ジオクタデシルオキサカルボシアニン(DIOC18(3)/「DIO」;2.5 mg/ml DMSO溶液;Molecular Probes、ユージン、オレゴン州、アメリカ)を、最終濃度10 μg/mlでRaji細胞(5×105個/ml)に直接加えた。標識は、標準的な培養条件で一晩行った。細胞障害アッセイを開始する前に、細胞を培養培地によって洗浄して遊離の標識を除去した。
末梢血から濃縮されたヒト単球は、CLP1bまたはCLP2pによって用量依存的に腫瘍細胞抑制性にすることができた。細胞抑制は、U 937腫瘍標的細胞のDNAへの3H-チミジンの取り込みによって3日間同時培養後に測定した:双方のプールは、かなり強い細胞抑制活性を誘導した(図51)。
12.5.1 腫瘍細胞
ヒト転移性前立腺癌細胞株LNCaPを、10%熱不活化FCS、1%非必須アミノ酸(NEAA)、100 U/mlペニシリン、および100 μg/mlストレプトマイシン(全て、Seromed Biochrom KG、ベルリン、ドイツ)を添加したRPMI-1640培地(GIBCO BRL、エッゲンスタイン、ドイツ)において維持した。
血液試料を健康なヒトドナー(輸血内科、フライブルク大学病院)から得た。血液をPBSによって1:2希釈して、単核球(MNC)をフィコール・パック勾配(密度1.077 g/ml、Pharmacia、フライブルク)を用いて回収した。細胞をPBSによって4回洗浄して、ヒト自己血清を予めコーティングしたペトリ皿(MNC 1〜2×108個/RPMI 1640(F1215、Seromed Biochrom KG、ベルリン)20 ml)に加えた。細胞を1〜1.5時間インキュベートして、単球を接着させた。その後、非接着細胞を注意深く除去して、接着単球をセルスクレイパーによって優しく剥がした。細胞を1回洗浄して、細胞抑制アッセイにおいて直接用いるために10%FCS、1%非必須アミノ酸、100 U/mlペニシリン、100 μg/mlストレプトマイシンを含むRPMI 1640(cRPMI)に再浮遊させた。
細胞抑制アッセイは、平底マイクロタイタープレート(Falcon3072、Becton Dickinson、ハイデルベルク)においてcRPMI(上記を参照されたい)において行った。単離されたヒト単球(5×105個、2.5×105個、または5×104個/ウェル)を一晩インキュベートした。その後LNCaP腫瘍細胞5×104個および様々な濃度の異なる刺激を全量200 μl/ウェルで加えて、37℃、5%CO2において72時間インキュベートした。同時培養の最後の24時間に、[3H]-チミジン(23 125 Bq=0.625 μCi/ウェル;比活性:185 GBq/mmol;Amersham Buchler、ブラウンシュバイヒ)を加えることによって増殖しつつある腫瘍細胞を標識した。
FSLE/CLP-プールによる骨髄系列の細胞におけるサイトカインおよび酸化窒素産生の誘導
13.1 マウスの系(方法)
13.1.1 樹状細胞/マクロファージの調製
上記のように各実験において異なる群の個々のマウスから脾細胞浮遊液を無菌的に調製した。細胞を樹状細胞/マクロファージの調製に用いる場合、組織をまず、コラゲナーゼ/ディスパーゼの混合液によって37℃で45分間消化してから、マウスリンフォパック(Cedarlane Labs、ホーンバイ、オンタリオ州、カナダ)に対して分離を行い、2-メルカプトエタノールおよび10%仔ウシ胎児血清(αF10)を添加したα-最小基本培地において細胞培養プレートに対して37℃で90分間接着させた。予め加温した培地25 mlによって3回洗浄後に非接着細胞を除去した。その後、一晩インキュベーション後に培養プレートを洗浄することによって、樹状細胞を非接着細胞として単離したが、粗マクロファージプールは、これらのプレートを剥がし取ることによって得られた細胞である。本発明者らの場合、この分離技法後のFITC-NLDC-145(抗DC)またはFITC-MAC-1(抗マクロファージ)によって脾細胞を通常に染色したところ、粗樹状細胞/マクロファージにおいて以下の染色パターンが得られた:それぞれ、85%±14%、12%±5%、および5%±3%、82%±16%。
実施例3.1.1.5と比較されたい。
13.2.1 インビトロでCLP1b/2pによるマウスマクロファージ/樹状細胞におけるサイトカイン産生の誘導
第一に、若いまたは加齢マウスから上記のように単離され、CLP1b(CLP2p)と共にインビトロでインキュベートしたスペリング(spelling)マクロファージまたは樹状細胞からのサイトカイン産生をアッセイした。これらのデータを表11および12に示す。比較のために、同じ動物からの細胞を100 ng/ml LPSによって刺激した。
a DBA/2Niaマウス4匹/群を用いて、各群における個々の脾臓試料をその後アッセイした。上記のように、組織マクロファージを各脾臓調製物に関して得た。細胞を表記のようにCLPプールと共に24時間インキュベートして、異なるサイトカインに関して上清を試験した。対照培養は、培地のみまたは100 ng/ml LPSと共にインキュベートした。
b 示したデータ(算術平均±SD)は、各サイトカインのアッセイに関して1試料あたり3個ずつの培養を用いた同一の試験4回からプールする。IL-6(pg/ml)を除き、サイトカインレベルをng/mlとして示す。
* p<0.05、培地単独(各ドナー群の最初の列)と共にインキュベートした年齢をマッチさせた対照細胞と比較して。
a+b 表4と同じ。既に記述したように各脾臓調製物について樹状細胞を得た[実施例13.1.1を参照されたい]。示したデータ(算術平均±SD)は、各サイトカインのアッセイに関して1試料あたり3個の培養を用いて、5回の実験からプールする。
* p<0.05、培地単独(各ドナー群の最初の列)と共にインキュベートした年齢をマッチさせた対照細胞と比較して。
マクロファージによるNOの産生は、それらの細胞によって行われる免疫調節に関与している[Stuehr, D.J.、1989;Nathan, C.、1992]。CLPプールがNO産生を乱すことによって(iNOSの誘導/活性に影響を及ぼすことによって)、その作用のいくつかを誘導する可能性があるか否かを調べるために、加齢対若いマウスにおけるサイトカイン産生のインビボ調節に及ぼすCLP2pおよびiNOS阻害剤であるL-NMMAの同時投与の影響を調べた。そのような試験からのデータを表13に示す。刺激した脾細胞からの血清中亜硝酸塩/硝酸塩と共にConA誘導サイトカイン産生を上記のように測定した。
a 若いまたは加齢(120週齢)C57BL/6Niaを用いた(1群4匹)。Nは、実験を通してL-NMMA(30 mg/kg)を毎日投与したことを指す。EはCLP2pの注射(100 μg/マウス、i.m.;3日間隔で4回投与)を示す。マウスをCLP2pまたは生理食塩液の最後の注射の3日後に屠殺した。
b 屠殺時のμMで表した血清中(亜硝酸塩+硝酸塩)の平均値(±SD)。
c 表11および12と同じ。
* p<0.05、第一の列と比較して。
# p<0.05、列4または6と比較して。
マウスBMDMをインビトロでCLP1bまたは2pによって42〜48時間刺激すると、NOの放出を用量依存的に誘導し、双方のプールは強力な誘導物質であった(図56)。双方のCLP1bおよび2pに関して、このプロセスの速度論を決定した(図56)。NOシンターゼの誘導型イソ型(iNOS)の関与は、L-NMMAを加えることによって証明することができた(図57)。さらに、CLP1b/2pは、iNOS活性化においてIFNγと相乗作用を示し(図58)、この作用はLPSについても認められた。CLPプールのNO放出誘導能は、BALB/cマウス近交系に限定されず、他のマウス近交系(例えば、C57Bl/6、C57Bl/10、129Sv)からのBMDMについても検出可能であった。
13.3.1 サイトカイン誘導および決定
健康なドナーの採血したばかりの末梢血からの全血培養を5 ml試験管(Falcon、Becton Dickinson)に全量500 μlで加えた。それらは、全血50 μl、刺激物質50 μl(100 μg/ml PHA、または1:10希釈のCLP1b/2p)およびL-グルタミン(2 mM)および抗生物質を添加したRPMI 1640培地400 μlからなった。48時間後、培養物を遠心して、上清を回収して、そのサイトカイン含有量に関してELISAによって試験した。
13.4.1 CLP1b/2pによるヒト白血球および単離された単球の培養物におけるサイトカインの産生
全血培養物を行って、細胞をCLP1bおよびCLP2pにによって48時間刺激した。IL-1β、TNF-α、およびIL-6の放出をELISAによって決定した。双方のプールは三つ全てのサイトカインについて類似の放出を誘導した(図59)。
マウスマクロファージにおけるCLP-プールの抗ウイルス作用
骨髄由来マクロファージ(緩衝液(DMEM)200 μl中に106個/ウェル)を異なる濃度でCLP-プールによって処理した(表14)。細胞を洗浄して、37℃で24時間維持した。上清(100 μl)をL929細胞に加えて、これをその後水疱性口内炎ウイルス(VSV)に感染させた。処置したL929細胞を48時間維持して、細胞の破壊を顕微鏡によって決定した。表14が示すように、CLP-プールは、おそらく(抗ウイルス性の)インターフェロンを誘導することによって、ウイルスの細胞抑制作用を阻害することができた。この抗ウイルス作用は、ヘルペス感染症がFSLEによる処置に感受性があることを示す臨床での知見によって確証される。Yokochi[Yokochi, S.、1977]は、IFNαと共に雄ブタの肝臓のフェノール抽出物が抗ウイルス作用を示すことを報告した。用いられた抽出物調製、生物学分析および試験系の方法が完全に異なることから、これらの知見は本発明にとって適切ではない。
FSLEおよびCLP-プールの臨床局面
15.1 免疫調節
男女異なる年齢(45〜85歳)でインフォームドコンセントを提出した健康なボランティアの協力を得て、FSLEの筋肉内注射(300 mgタンパク質/単位注射)後の全血によるサイトカイン産生の動態に関する定方向試験を行った。
これらの第一の試験から、FSLEの(i.m.)注射は数日から数週間以内にいくつかの関連するサイトカインの産生に波動様の変化を誘導し、1例のレベルは数ヶ月間変化したままであった。
要約すると、インビボFSLEおよびCLP1bおよびCLP2pは、協調して臨床的に重要な免疫アップおよびダウンレギュレート因子のカスケードを誘導する。さらに、ヒトボランティアにおける胎児肝抽出物についての臨床結果は、先に示した実施例においてインビトロおよびインビボでなされた知見を明らかに確認し、主に、前立腺のヒト腺癌細胞およびヒト単球を用いた知見、および同様に加齢マウスのサイトカインパターンの回復を記述した実験を確認する。近年、患者約100人を、腫瘍学目的、または慢性再発性もしくは慢性ウイルス疾患(ヘルペスならびにB型肝炎およびC型肝炎)のために治療した。前立腺癌の治療のために放射線治療を受ける多くの患者が、放射線治療がその効果を発揮し始めるかなり前にPSA(前立腺特異抗原)値を正常値まで低下させることによって、FSLEに対する即時型反応を示していた。再発性のヘルペスウイルスを有する多くの患者が、全く再発しないか、またははるかに再発の頻度が低い。B型およびC型肝炎の非反応体の数例は、疾患活動度のレベルより低いウイルス負荷で制御され続けており、おそらくインターフェロン産生の刺激に関連している。
Claims (21)
- 細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)またはその活性な部分、
胎児ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ、ならびに
任意でさらなる化合物、および任意で賦形剤からなる;または
細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)またはその活性な部分、
胎児ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ、ならびに
任意でさらなる化合物、薬学的に許容される担体および/または希釈剤および/または賦形剤を含む、
癌を治療するため、感染症を予防または治療するため、加齢に関連して起こるサイトカイン/ケモカイン産生の変化を回復させるため、および/または放射線照射の有害な副作用を緩和するための、薬学的組成物。 - 胎児ヘモグロビンもしくは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ、またはさらなる化合物が非ヒト胎児組織に由来する、請求項1記載の薬学的組成物。
- 非ヒト胎児組織がヒツジ、ヤギ、ウマ、またはウシに由来する、請求項2記載の薬学的組成物。
- さらなる化合物が胎児肝(糖)ペプチドである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 鎖の組み合わせが胎児ヘモグロビンのα、γ二量体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 鎖の組み合わせがヘムを含まない、請求項1〜5のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)の活性な成分が、LPS由来多糖類不含リピッドA成分である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)が天然または合成のペンタおよび/またはヘキサアシル-リピッドAである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 前記細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)が天然または合成のペンタおよび/またはヘキサアシル-リピッドAモノホスフェートである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 胎児ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ対細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)またはその活性な部分の組成物の重量比が、1:1〜1000:1の範囲である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 胎児肝(糖)ペプチドが、ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質(PBP)、ペプチジル-プロリル-シス-トランス-イソメラーゼA(PPlase A)、チオレドキシン、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)、ユビキチン、アルドース1-エピメラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、プロスタグランジン-Fシンターゼ(PGF)、プロスタグランジン-Fシンターゼ2(PGF2)、レグカルシン(RGN)、チオスルフェートスルフトランスフェラーゼ(TST)、カルボニルレダクターゼ1(CBR1)、3-ヒドロキシアントラニレート3,4-ジオキシゲナーゼ(3-HAO)、グアニジノアセテート-N-メチルトランスフェラーゼ(GAMT)、炭酸脱水素酵素III(CA-III)、炭酸脱水素酵素II(CA-II)、可溶性イソ型のカテコール-O-メチルトランスフェラーゼ(S-COMT)、シクロフィリンA(CypA)、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、細胞レチノール結合タンパク質I(cRBP I)、グリシン切断系Hタンパク質(GCSH)、ヘモグロビンγ鎖(Hb-γ)、ヘモグロビンα鎖(Hb-α)、肝臓脂肪酸結合タンパク質、およびアシル-CoA結合タンパク質(ACBP)からなる群より選択される、請求項4〜10のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 経口投与のために調製された請求項1〜11のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 胎児ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ0.1〜10 mg、ならびに細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)またはその活性な部分0.01〜1000 μgを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
- 癌を治療する組成物を調製するための、
細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)またはその活性な部分、
胎児ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ、ならびに
任意でさらなる化合物の使用。 - 感染症を予防または治療する組成物を調製するための、
細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)またはその活性な部分、
胎児ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ、ならびに
任意でさらなる化合物の使用。 - 加齢に関連して起こるサイトカイン/ケモカイン産生の変化を回復させる組成物を調製するための、
細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)またはその活性な部分、
胎児ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ、ならびに
任意でさらなる化合物の使用。 - 放射線照射の有害な副作用を緩和する組成物を調製するための、
細菌のS-もしくはR-型リポ多糖類(LPS)またはその活性な部分、
胎児ヘモグロビンまたは胎児ヘモグロビンのα鎖およびγ鎖を含む組み合わせ、ならびに
任意でさらなる化合物の使用。 - 癌が、前立腺癌、乳癌、子宮頚部扁平上皮癌、および膵臓腺癌から選択される、請求項14記載の使用。
- 感染症が慢性ウイルス性感染症である、請求項15記載の使用。
- 加齢関連免疫不均衡を回復させることが、マクロファージの活性化に関連する、請求項16記載の使用。
- 調製物が経口投与のために調製される、請求項14〜20のいずれか一項に記載の使用。
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