JPH0499481A

JPH0499481A - 新規細菌、新規ｌｐｓ、新規免疫機能活性化剤、新規動物用免疫機能活性化剤

Info

Publication number: JPH0499481A
Application number: JP2218599A
Authority: JP
Inventors: Genichiro Soma; 源一郎杣; Atsushi Yoshimura; 淳吉村; Daisuke Tsukioka; 大輔月岡; Denichi Mizuno; 水野　伝一; Haruyuki Oshima; 大島　治之
Original assignee: CHIBA SEIFUN KK
Current assignee: CHIBA SEIFUN KK
Priority date: 1990-08-20
Filing date: 1990-08-20
Publication date: 1992-03-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、新規な細菌、新規なＬＰＳ、新規な免疫機能
活性化剤、新規な動物用免疫機能活性化剤に間する。

より詳細には、本発明は、３種の新規なブドウ糖発酵性
のダラム陰性短桿菌、それに由来する新規なＬＰＳ、及
びそれらＬＰＳを含む経口、静注、経皮投与可能な新規
な免疫機能活性化剤、動物用免疫機能活性化剤に間する
。

［従来の技術］生物には、生体の内部環境が外来性及び内因性の異物に
よって撹乱されるのを防ぎ、生体の恒常性を維持するた
めの免疫機能が備わっている。従って、免疫機能の低下
は鍵康の悪化、各種疾病の発病、老化促進の原因となり
、その活性化は錐康向上、各種疾病の発病阻止、治癒、
老化防止につながる。

このため、免疫機能を活性化させる物質の提供が要請さ
れており、現在、ＰＳＫ　［別名クレスチン（呉羽化学
株式会社の登録商標）〕、レンチナン（味の素株式会社
の登録商標）、ベスタチン（日本化薬株式会社の登録商
標）、ソニフィラン（科研製薬株式会社の登録商標）、
０Ｋ−４３２［キャンサー　ケモセラビー　しボートウ
　バー）つ１（ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ−ａｐ
ｙ　　Ｒｅｐｏｒｔｓ　　Ｐａｒｔｌ）、ｖｏｌ。

５８、Ｎｏ、１，１０頁（１９７２）、別名ビシバニー
ル（中外製薬株式会社の登録商標）］等が知られている
。

［発明が解決しようとする８１１コ従来の免疫機能活性化剤のうちで、ＰＳＫ、レンチナン
、ベスタチン、ソニフィランにはＴＮＦ産生能がないの
で、それらの免疫機能活性化剤は低い。

一方、０Ｋ−４３２にはＴＮＦ産生能があるが、大量投
与が必要であることから、発熱、！！察、血圧低下、血
小板減少等の副作用の発生が避けられず、従フて化学療
法係数が小さい、更に、簡便な経口投与や経皮投与では
効果がないので、投与上の便宜に欠ける。

ここでｒＴＮＦＪとは、マクロファージにより産生され
る腫瘍障害因子（７ｕ　ｍ　ｏ　ｒＮｅｃｒｏｓｉｓ　
　Ｆａｃｔｏｒ）の総称［ザジャーナル　オブ　バイオ
ロジカル　ケミストリー（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　
　ｏｆ　　Ｂｊｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２６０．２３４５〜２３５４頁（１９８
５年）］であり、マクロファージの活性が高まるにつれ
てその産生量は増していく、「マクロファージ」は、免
疫担当細胞の一種であり、動物体内のほとんど全ての組
織に分布し、粒子状の異物や体内の老廃細胞などを捕食
して消化する大型のアメーバ状細胞の総称である。

本発明は、これら従来技術の欠点に鑑み、新たな免疫機
能活性化剤、動物用免疫機能活性化剤を提供するために
創案されたものである。

即ち、本発明は、高い免疫機能活性化能を持つ新規な免
疫機能活性化剤、動物用免疫機能活性化剤を提供するこ
と、及び、その活性成分である新規なＬＰＳを提供する
こと、及び、そのＬＰＳの供給源となる新規な細菌を提
供することを目的とする。

本発明のＬＰＳは、各別に使用できることはもちろん、
その意図される用途が阻害されない限り、それらの２種
以上を任意に朝み合わせ、又、更には他のいずれの物質
とも胡み合わせて使用できる。

［！！題を解決するための手段］細菌分離源本発明の３種の細菌は、本発明者等が検討した小麦から
はその産地、種類を問わず分離されている。従って、い
ずれの産地、種類の小麦及びその加工品からも分離され
ると推定される０本発明者等がそれら３種の細菌を分離
できることを確認した小麦粉の産地、種類は次の通りで
ある。

小　　麦　　粉　　の　　名　　称　　　　　　　　　
産　　地■ダーク・ノザン・スプリングス　　米国■ト
カナディアン・ホイート　　　カナダ■ハード・レッド
・ウィンター・　　米国セミハード ■オーストラリアン・スタンダード　オースト・ホイー
ト　　　　　　　　　　　　ラリア■ホロシリ　　　　
　　　　　　　　　日本ＬＰＳの分離上記繍１から本発明のＬＰＳを分離するには、ウエスト
ファル（Ｗｅｓｔｐｈａ＋）等がｒインメソッズ　イン
　カーボハイドレート　ケミストリー（Ｉｎ　　Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｃａｒｂ−ｏｈｙｄｒａｔｅ　　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）のｖｏｌ、Ｖ［米国ニューヨーク
のアカデミツクプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓ
ｓ）社が１９６５年に発行］の８３頁に記載した熱フェ
ノール法を用い、更に、陰イオン交換樹脂で精製すれば
よい。

即ち、菌体を蒸留水に懸濁した後、蒸留水と等容量の熱
フェノールと共に攪拌し、次いで、遠心分離により水層
を回収し、この水層を透析に付してフェノールを除去し
、限外濾過により濃縮して粗ＬＰＳｍ分を得、この両分
を常法に従って、例えば、ファルマシア社製のＦＰＬＣ
システムでファルマシア社製のモノローセファロース（
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　、Ｑ−セラフ０−ス（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）を使用して陰イオン交換クロマトグラフィ
ーに付して精製し、更に、常法に従って脱塩すればよい
。

以上の操作により、純度９６％以上の精製標品が得られ
る。

ＬＰＳの物性追フて実施例中で詳述する如く、本発明の３種のＬＰＳ
　（９８％以上純度標品）の物性は次の通りであフた。

■分子ｊｉ：５，０Ｏｏ±１，０００　（ＳＤＳ１１ｊ
Ｃ泳動法）リン数：２±１７分子量５，０００ヘキソサミン数＝９±１７分子量５，０００ＫＤＯ数＝
２±ｌ／分子量５，０００ ■分子量：６，５００±２，５００　（ＳＤＳ電気泳動
法）リン数＝１〜２７分子量５，０００ヘキソサミン数＝７±１７分子量５，０００ＫＤＯ数：
１から２／分子量５，０００■分子量：６，５００±２
，５００　（ＳＤＳ電気泳動法）リン数＝２±１７分子量５，０００ヘキソサミン数＝５±１７分子量５，０００ＫＤＯ数：
２±１７分子量５，０００提供の形態本発明のＬＰＳはそのまま、或いは任意の程度に濃縮し
た形で提供できる。又、保存性を高めるために、凍結乾
燥や噴霧乾燥などの任意の手段により乾燥粉末として提
供することもできる。これらはいずれも常法で生産でき
る。

免疫活性化能の渕本発明のＬＰＳの免疫活性化能は、マクロファージ活性
を通じての内因性ＴＮＦ産生能により確認した。

内因性ＴＮＦｔ生産生能動物体内にＴＮＦを産生させるためには、産生前Ｗ（ブ
ライミング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが
必要であることは、カーズウェル（Ｃａ　ｒ　ｓｗｅ　
１１）らにより、プロシーディング　オブ　ナショナル
　アカデミ−サイエンス　オブ　ニーニスニー（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｒ、ＵＳＡ、）７２．３Ｆ３８６〜３
６７０頁（１９７５年）に輻告されており、その後、各
段階で使用出来る薬剤の検討もすすめられている。ブラ
イミング段階開始のために投与される薬剤が「ブライミ
ング　（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガリン
グ段階開始のために投与される薬剤が「トリガー」　（
内因性ＴＮＦ産生剤）である。

ＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９細胞［プロシーディング　オ
ブ　ナショナル　アカデミ−サイエンス　オブ　ニーニ
スニー　ニス、　３６６６〜３６７０頁］に対する細胞
壽性を基にして、次のようにして測定する。

Ｌ９２９細胞を、５％仔牛脂児血清を加えたイーグルミ
ニマムエツセンシャル培地（以下、Ｎ、　ＥＭｔ８地と
表す）で育成し、９Ｘ１０’個の細胞ｂ１１００μｌの
同上培地に含まれる様にし、９６大の平底プレートで育
種する。育種条件は３７℃、２時間、５％Ｃｏｔ、１０
０　％　Ｈ２０’ｔ’　ｈ　’）　、　ｉｌ　７’Ｇの
細胞培養に用いられる方法でよ（１，その後、アクチノ
マイシンＤを培地中に終濃度１μｇ　／　ｍ　ＩＬとな
るように加え、培養液の液量を１５０μｉとする。即座
に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈したものを５０μλ
加える（この際稀釈率を適宜調製し、ＥＤ６＠を求める
事ができる）、更に、最終液量２００μ露となったし９
２９細胞を上記条件で１８時間培養する。

細胞障害活性を測定するには、まず全培地を除去し、つ
いでＣ０１％クリスタルバイオレットを含む１％メチル
アルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバイ
オレットは全有核細胞を染色するが、死細胞は染色後に
プレート底面より水洗で除去されるので、生存細胞の結
果から細胞障害活性を直接測定できる。この染色度を０
Ｄｓｅ＊、＊での吸光度を指標として測定し、対照群に
対する染色度と比較する事で細胞障害活性を測定する。

活性の定義は次の様に行う。

Ｌ９２９細胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）を
求める。対照としてウサギＴＮＳ　［腫瘍障害血清（Ｔ
ｕｍｏｒ　　ＮｅｃｒｏｓｉｓＳｅｔｕｍ）］を使用し
、このウサギＴＮＳの活性ｎ（単位／　ｍ　１１）を２
．４Ｘ１０８単位／ｍｇ／ｍｌＬのＴＮＦ−αを用いて
決定する。このウサギＴＮＳのＥＤａ＠　を与える稀釈
率＜Ｃ＞を求める。

検体活性（単位／　ｍ　ｔ）は　−　ＸＱ　　で計算す
る。

ＬＦ−乳Ｕ量本発明のＬＰＳは様々な用途に使用できる。

一つの用途は、その免疫機能活性化能をそのまま生かし
た免疫機能活性化剤、動物用免疫機能活性化剤である。

第２の用途は、その免疫機能活性能を指標にして入園そ
の他の動物の免疫機能をチエツクするための免疫Ｓ能検
査薬、動物用免疫機能検査薬である。

第３の用途は、その免疫機能活性化能の発現を期待して
配合される医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飲
料、飼料等である。

提供できる剤の製造方法これら免疫４Ｉ能活性化剤等のいずれもが常法で製造で
きる０例えば、免疫機能活性化剤、動物用免疫機能活性
化剤は医薬或は動物薬製造の常法に従って、経口薬とし
て、或いは静注薬、筋注薬として単独で、或いは仙薬と
の配合物として処方できる。又、皮膚にはマクロファー
ジが多いので、皮膚塗布剤として投与するとより高い効
果が得られる。

以下、実施例、実験例により本発明を更に詳細に説明す
る。

実施ｆ？４１０５０ｍ１コーニングチユーブに、１．０９％の灰分を
含む硬質小麦粉（カナダ産のトカナディアン・ホイー）
）１．０４ｇを秤量して入れ、２０ｍｉの薫留水を加え
て５０ｍｇ／ｍｌの小麦粉液を調製した。

■この液を３７℃の水浴中で振どう培養し、経過時閉０
時、１時、２時、３時、４時、６時、８時、１０時、１
２時、２０時、２４時、４５時に各０．５ｍｌを採取し
、１ｏｅ〜１０５倍希釈して標準寒天培地（日水製薬社
製の培地であり、下記の結成を持つ）に１００μ鼠宛を
まき込み、生菌数の測定、コロニーのａ察を行った。

ｌＩＬ中Ｈ酵母エキスペプトンブドウ糖カンテン７．１±０．１２　、６　ｇ６　、０　ｇ】、０ｇ１５．０ｇ０種類が異なると考えられた、培養経過時閉８時関口、
１０時時間区認められた黄〜クリーム色不透明コロニー
（コロニー１）、クリーム色不遇明コロニー（コロニー
２）　、ｌｔ色半透明ココロ（コロニー３）、乳白色不
透明コロニー（コロニー４）、白色不透明な小さなコロ
ニー（コロニ５）を上記と同種の別の標準寒天培地にま
き、植え継ぎ、一方で、コロニーｌ〜５の細菌のダラム
染色性、リムラス活性を調べた。ここで「リムラス活性
」とは、１９６８年にレヴイン（Ｌｅｖｉｎ）により創
案された、カブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用い
たエンドトキシン定量法であるリムラステストで陽性を
示すことをさす、このリムラステストはＬＰＳ検出演出
法て知られており、例えば、生化学工業株式会社からト
キシカラーシステムという名称で市販されている試薬セ
ットを使用して実施できる。

上記コロニーのうち、コロニー４及びコロニ５（共にダ
ラム染色性＋）のリムラス活性はコロニー１〜３（共に
ダラム染色性−）に比べて極めて低かったので、以後の
検討から除き、日水製薬社製の培地及びＩＤテスト・Ｅ
Ｂ−２０を使用して、コロニー１〜３の形態、生化学的
性状を観察した０次の結果が得られた。

コロニー１を形成するＪｌｌ（９００８１４−１）（１
＆工研菌寄第１１６６４号として平成２年８月２０日か
ら通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている）ｌａｌ影態 ■短稈状 ■運動性なし ■ダラム染色性：（ｂ）生育状態 ■標準寒天培地：黄〜クリーム色で丸形の不透明なコロ
ニーを形成する。

■ＳＳ寒天培地：白色で半透明なコロニを形成する。

［ＳＳ寒天培地：日永製薬コード０５０３１］組成１１
中　　肉エキス　　　　５．０ｇ胆汁酸塩　　　　９．
０ｇペプトン　　　　７．５ｇラクトース　　１０．０ｇクエン酸ナトリウム　　８．５ｇチオ硫酸ナトリウム　　５．５ｇクエン酸第二鉄　　　　１．０ｇニュートラルレッド　０．０２５ｇブリリアントプリン　０．０３３ｇカンテン　　　　　　１３．５ｇｐＨ７，１±０．１ ■ＴＳ　Ｉ！ＩＦ天培地：斜面部での変化はないが、高
層部は黄変する。

ガスを生成する。

［ＴＳＩ寒天培地：日永ｍＷコード０５１０３］組成１
呻　　肉エキス　　　　５．０ｇＮａＣ１５，Ｏｇペプトン　　　１５．０ｇラクトース　　１０．０ｇシュクロース　ＩＯ，Ｏｇブドウ糖　　　　１．０ｇクエン酸第二鉄　　　　０．２ｇチオ硫酸ナトリウム　　０．２ｇフェノールレッド　　　０．０２ｇカンテン　　　　　　１５．０ｇｐＨ７，６±０．１（ｃ）生理的性質 ■フォーゲス・プロスカラエル反応：＋■インドールの
生成： ■硫化水素の生成： ■クエン酸の利用：＋ ■ウレアーゼ： ■オキシダーゼ： ■Ｏ−Ｆテスト：＋（ｄ）炭′ｘｆｌＩの利用性 ■ラクトース：＋ ■アトニット： ■ラムノース：＋ ■マンニット：＋ ■エスクリン：＋ ■イノジット： ■ソルビット：＋ ■アラビノース：＋ ■ラフィノース：＋［相］シュクロース：＋（ｅ）その他 ■リジンの脱炭酸反応： ■マロン酸の利用： ■アルギニンの分解： ■フェニルアラニンの脱アミノ化反応：■オルニチンの
脱炭酸反応：：ｌ１ロ：−２を形成する細１１（９００８１４−２）
２０日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている）（ａ）形態 ■短稈状 ■運動性なし ■ダラム染色性：（ｂ）生育状態 ■標準寒天培地：クリーム色で不透明なコロニーを形成
する。

■ＳＳ寒天培地：赤色で不透明なコロニを形成する。

■ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。

ガスを生成する。

（ｃ）生理的性質 ■フォーゲス・プロスカラエル反応：＋■インドールの
生成： ■硫化水素の生成： ■クエン酸の利用：＋（微工研曹寄第１１６６５号として平成２年８月 ■ウレアーゼ： ■オキシダーゼ： ■０−Ｆテスト：＋（ｄ）炭素源の利用性 ■ラクトース：＋ ■アトニット： ■ラムノース：＋ ■マンニット：＋ ■エスクリン：＋ ■イノジット： ■ソルビット：＋ ■アラビノース：＋ ■ラフィノース：＋０シュクロース：＋［ｅ）その他 ■リジンの脱炭酸反応： ■マロン酸の利用：十 ■アルギニンの分解：＋ ■フェニルアラニンの脱アミノ化反応：■オルニチンの
脱炭酸反応：＋コロニー３を　　する　薗（９００８１４−３）（微工
研曹寄第１１６６６号として平成２年８月２０日から通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄托されて
いる）（ａ）形態 ■短稈状 ■運動性なし ■ダラム染色性：（ｂ）生育状態 ■標準寒天培地：黄色で丸形の半透明なコロニーを形成
する。

■ＳＳ寒天培地：コロニーを形成しない。

■ＴＳＩ塞天培地：斜面部での変化はないが、高層Ｓは
黄変する。

ガスを生成しない。

［ｃｌ生理的性質 ■フォーゲス・プロスカラエル反応：＋■インドールの
生成： ■硫化氷雪の生成： ■クエン酸の利用：＋ ■ウレアーゼ； ■オキシダーゼ： ■Ｏ−Ｆテスト：＋Ｃｄ）炭素源の利用性 ■ラクトース：＋ ■アドニ・ント二 ■ラムノース：＋ ■マンニット：＋ ■エスクリン：＋ ■イノジット： ■ソルビット：＋ ■アラビノース：＋ ■ラフィノース：＋０シュクロース：＋（ｅ）その他 ■リジンの脱炭酸反応： ■マロン酸の利用：＋ ■アルギニンの分解： ■フェニルアラニンの脱アミノ化反応：■オルニチンの
脱炭酸反応： ■コロニー１，２．３をそれぞれ１１のし一肉汁培地［
Ｄｊｆｃｏ（デイフコ）社のポリペプトン１０ｇ、同社
の酵母エキス５ｇ、和光純薬社の特級ＮａＣλ５ｇを蒸
留水に入れ、ＮａＯＨでｐ）（７，５に合わせ、オート
クレーブし、別途、予め調製しておいた和光純薬社の特
級グルコースの４０％溶液を４００倍に希釈して加えて
調製〕に移し、３７℃で一夜振とうし、δ、０００ｇ−
４℃で２０分間遠心処理して集菌した。

■各曹体をそれぞれ５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、これに
５０ｍ１（７）９０％熱フェノールを加えて６５〜７０
℃で２０分間攪拌し、冷却後に、１０゜０００ｇ、４℃
で２０分間遠心処理して、水層を回収した。フェノール
層を更に２回上記と同一の操作に付した。３つの水層を
合わせ、−夜透析してフェノールを除去し、内液を、ア
ドヴアンテック・トーヨー（ＡＤＶＡＮＴＥＣＴＯＹＯ
）７１のＵＫ−２００を使用して限外１１遇に付して分
子量２０万カット−オフにより濃縮した（Ｎ２圧：２気
圧）。

■この濃縮サンプルを、ファルマシア社製のＱ−セファ
ロース　ファスト　フロー（Ｑ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　
　Ｆａｓｔ　　Ｆｌｏｗ）を使って陰イオン交換クロマ
トグラフィーに付した。即ち、１０ｍＭ）リス−ＨＣｔ
（ｐＨ７，５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試
料をカラムに付した後、４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭ
）リス−ＨＣａ（ｐＨ７，５）でリムラス活性画分を溶
出させた。この溶出液を上記と同じ条件で限外濾過に付
して脱塩、濃縮して、純度９６％以上のＬＰＳを得た。

なお１、核酸はＩＭＮａＣ＆／１０ｍＭトリス−ＨＣａ
（ｐＨ７，５）で溶出した。

各一体の結果は次表１〜３の通りであった。なお、ＬＰ
Ｓ量は、リムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換算値であ
り、ＩＩはフェノール−硫酸法で、蛋白はローリ−法で
測定した。又、核酸量は０Ｄ２１１１１ｎ−での測定値
に基づき（１０Ｄ＝５０μｇ）、純度（％）は次式に基
づいて計算した。

乾燥収ｊｉ−（ＩＦ白量＋核１１１１）純度＝　　　　
　　　　　　　　　　　Ｘ１００乾燥収量表１一体９００８１４−１総乾燥収量（ｍｇ）　　　６．５ＬＰＳ　（ｍｇ）　　　］９．８糖（ｍｇ）　　　　　３．１蛋白（μｇ）　　　　８６核酸（μｇ＞　　　　　＜１６１純度　（％）　　　　９６〈聚ス体９００８１４−２総乾燥収量（ｍｇ）　　１０．４ＬＰＳ　（ｍｇ）　　　　７５．６糖（ｍｇ）　　　　　２．５蛋白（μｇ）　　　　６４核ｍｌ（μｇ＞　　　　　＜１０８純度　（％）　　　　９８くｊ一体９００８１４−３総乾燥収量（ｍｇ）１９．２ＬＰＳ　＜ｍｇ）　　１０３．６糖（ｍｇ）　　　　　７．６蛋白（μｇ）　　　　７３核酸（μｇ）　　　　　＜１３７純度　（％）　　　　　９９〈 ■分子量各ＬＰＳを蒸留水に溶解してＩｍｇ／ｍλ溶液を調製し
、その４μｉを１．５ｍｌのトレフチューブに入れた。

これに、別途、１ｍＭのＥＤＴＡに２．５％ＳＤＳ、５
％メルカプトエタノール、１０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ８
，０）を加えて調製したＳＤＳ処理液１μ艷を加え、こ
の混液を３分間沸騰水に浸した。ファルマシア社製のフ
ァストシステム（Ｐｈａｓｔ　　Ｓｙｓｔｅｍ）を使用
し、電極との間に５ＤＳ−バッファー　ストリップ＜Ｂ
ｕｆｆｅｒ　　５ｔｒｉｐ）（ファルマシア社ｍ＞が介
在せられた１μ露の上記混液をゲル［ファルマシア社製
のファスト　ゲル　グラデイエン）　　　（Ｐｈａｓｔ
　　　　Ｇｅｌ　　　　Ｇｒａｄｊｅｎｔ　　　　８〜
２５）に塗付し、最大電圧２５０ｖ、最大電流１０ｍＡ
にセットして泳動を開始させた。泳動終了後、クマシー
染色と銀染色における挙動をＩｍ寥した。

クマシー染色では、染色液としてファルマシア製の０．
１％ファスト　ゲル　ブルー　（Ｐｈａｓｔ　　Ｇｅｔ
　　Ｂｌｕｅ）　　Ｒを、脱色液として、メタノール：
酢酸：蒸留水（容量比３：１：６）混液を使用し、次の
噸序で染色・脱色を行った。

１〕５０℃で８分閏染色２）５０℃で５分閏脱色３）５０℃で８分閏染色４）５０℃で１０分間脱色５）５０℃で５分閏保ｌ！（グリセロール、酢酸、蒸留
水の容量比５：１０：８５混液）６）乾燥銀染色は、次の順序で行った。

１】５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比５：１：４混液）で処理２）６０℃で２分間
、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留水の容量比１０：５
：８５混液）で処理３）５０℃で４分間、洗浄液（エタ
ノール、酢酸蒸留水の容量比１０：５：８５混液）で処
理４）５０℃で６分間、増感液（８，３％グルタルジア
ルデヒド）で処理５〕５０℃で３分間、洗浄液（エタノール、酢酸蒸留水
の容量比１０：５：８５混液）で処理６）５０℃で５分
間、洗浄液（エタノール、酢酸蒸留水の容量比１０：５
：８５混液）で処理７）６０℃で２分閏、洗浄液（脱イ
オン水）で処理８）５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理９）４０℃で１３分間、０．２５ｗ／ｖ％硝酸銀で処理１０３３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理１１１３０℃で３０秒問、洗浄液（脱イオン水）で処理１２］３０℃で３０秒問、現像ｆｉ（０，０４ｖ／ｖ％
ホルムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄
液）で処理１３１３０℃で４分間、現像液（０，０４ｖ／ｖ％ホル
ムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄液）
で処理１４１５０℃で２分間、反応停止液（５％ｖ／ｖ％酢Ｉ
Ｉ）で処理１５１５０℃で３分閏、保護液（酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比１０：８：８５混液）で処理１６）乾燥ＬＰＳは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を利用して染色帯を観察したら、添付図面１に示
されるように、本発明の３種のＬＰＳの主要染色帯は分
子量５，０００付近に認められた。又、菌体９００８１
４−１に由来するＬＰＳ（以下、ＬＰＳＩと称す）は分
子量３万付近にややまとまった染色帯を示した。菌体９
００８１４−２に由来するＬＰＳ　（以下、ＬＰＳ２と
称す）はａｏ、ｏｏｏから４３，０００の間に染色帯が
認められるが、１４，０００以下の染色帯の染色度と比
較すると、高分子のものは極めて少ないと推定される。

糖量、ヘキソサミン量（後述する）からも、ＬＰＳ２は
最も糖含有率が低く、ついで、菌体９００８１４−３に
由来するＬＰＳ（以下、ＬＰＳ３と称す）、ＬＰＳｌの
順で高くなり、電気泳動でａ察されたパターンと一致す
ると考えられる。又、ＬＰＳ量／総乾燥収量の比もＬＰ
Ｓ２、ＬＰＳ３、ＬＰＳ　１の順に低くなフている０以
上の観察結果から、ＬＰＳ２は比較的低分子のＬＰＳが
多く、次いで、ＬＰＳ３、ＬＰＳｌの順にその割合は少
なくなると推定される。

■リン含有量チェシートリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒ　１ｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル　ケミスト　リ　（Ａ
ｎａｌｙｔｉｃａｌ　　　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、
ｖｏ　１．２Ｂ、１７５６〜１７５Ｂ頁（１９５６年）
に準拠して次の通りに行った。

ＬＰＳ　１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を各別に蒸留水に溶解
して、それぞれ、３１．６μｇ、５７．６μｇ、１０３
．６μｇのＬＰＳを含む２０μ丸の溶液を１ｌＩＩ！シ
、小試験管に入れた。２０μ露の５０　ｖ／ｖ％硫酸を
添加し、　１６０℃で２時間加熱した０次いで、２０μ
丸の１０ｖ／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバーナー
で１分隔加熱して灰化させた。その後に０．５ｍ１Ｌの
蒸留水、次いで０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌＬの６Ｎ
硫酸、２ｍ鼠の蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブ
デン酸アンモニウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコ
ルビン酸を混合して調製し、その０．５ｍｌを使用）を
添加して室温で３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの
吸光度（ＯＤ含２・０．）を測定した。

なお、検量線作成用の試料としては、リン酸二水素カリ
ウム（和光純薬社製）を蒸留水で希釈し、リン酸重量と
してそれぞれ２．５μｇ、１μｇ、０．２５９ｇ、ｏ４
ｇを含む０．５ｍｌの溶液を調製して使用した。なお、
リン１ｇはリン酸二水素カリウム４．３９ｇに相当する
。結果を次表４に示す、なお、吸光度を示す数値は、無
機リンの混入（例えば、リン酸緩衝液に由来する）によ
る誤差を避けるために、加熱処理をしていない対照のデ
ータを減じた値である。また、リン数（２敗）は、分子
ｔ５，０００当たりの換算数である。

青４Ｐ量＝吸光度十０．６７ ■ヘキソサミン含有量エルソシーモルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法（
東京化学同人出版「生化学実験ｌｌｌ塵」Ｎｏ、４の３
７７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。

ＬＰＳを蒸留水に溶解して１．５８ｍｇ　（ＬＰＳ　１
）　、２．８８ｍｇ　（ＬＰＳ２）　、５．１８ｍ　ｇ
　（Ｌ　Ｐ　Ｓ　３　）　／　ｍ　ＩＬの溶液をｌｌｌ
製し、その１００μｉをスクリューキャップ付きスピッ
ツ（イワキガラス社ＩＩ）に入れ、これに１００μ鼠の
８ＮＨＣ＆を添加して１１０℃で１６時間加熱した。

４ＮＮａＯＨを約２００μＩＬ添加してｐＨ７とした。

その１００μ露を分取し、別のスクリューキャップ付き
スピッツに入れ、２００μ灸の下記試薬Ａを加えた後に
、１０５℃で１．５時間加熱し、次いで流水で冷却した
０次いで、１００μλを分取し、６７０μ露の９６％エ
タノールを加え、更に、６７μｌの下記賛藁Ｂを加えた
後に室温で１時隔放置し、５３５ｎｍで吸光度を測定し
た。検量線作製用試料としては０．２０〜２００μｇ／
ｍｉのＮ−アセチル　グルコサミン（和光純薬社Ｉｌ）
を使用した。

（試薬Ａ）７５μ２のアセチルアセトンと２．５ｍλの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製（試薬Ｂ）１
．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと３０ｍ１の濃
塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合して調製結果、ＬＰＳＩ、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３のへキソサミン数
はそれぞれ９±】／分子量５，０００．７±１／分子量
５，０００．δ±１／分子量６゜０００だった。

■ＫＤＯ含有量ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ　アール（Ｓｈａｂｙ　
　Ｒ，）等著、アナリティカルバイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、）、５Ｂ　（１）　
、１２３〜１２９頁＜１９７４年）コに準拠して次の通
りに行った。

５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｊｋのエタノール
、４５ｍ鼠の氷酢酸、５０ｒｎｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００．髪に、（１）０．５０５ｍｇ／ｍｌＬのＬＰＳＩ
を含む２５０　μ＋１蒸留水溶液；（２）　０　、５７
６　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｕのＬＰＳ２を含む２５０　μｆ
Ｌ＠留水溶液；　（３）０．５１８ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ
３を含む２５０μｍ蒸留水溶液；のいづれかを合わせ、
１００℃の沸騰水浴中で３３分閏加熱後に冷水（２４，
５℃）中で３０分間冷却し、ついで日立分光光度計３２
０を使って４２０．４７０．６３０．６５０ｎｍでの紫
外部吸収を測定した（それぞれｋａｔ−・Ａ　ａ　ｔ・
・Ａｓ５−・Ａｓｓ・とする）、標準試料としては、０
．５ｕモル／ｍｌのＫＤｏアンモニウム塩［米国シグマ
（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）社１！］を含む蒸留水２５０μ鼠を
使用した。

検体試料、標準試料それぞれについて、次式の罐を求め
た。

Ｓ”ＡＪ２・−Ａ　ａ　ｖ榔＋　Ａ　ａｓｓ　−Ａ　１
１６１検体試料の値（ＳＴ）はＬＰＳＩで０．１０９、
ＬＰＳ２で０．０７８、ＬＰＳ３で０．０９９であった
。標準試料の値（Ｓ６）は０．２４６であり、蒸留水の
みの値は０．００５であった。

この値の比較により、ＬＰＳ　１には２±１７分チエ５
，０００．ＬＰＳ２には１〜２／分子量５０００．ＬＰ
Ｓ３には２±ｌ／分子量５，０００のＫＤＯが含まれる
と推定された。

なお、これらの値は、ＬＰＳｌを例にとると、次のよう
に計算される。

溶液に含まれるＫＤＤの濃度をχ（μモル／ｍ見）とす
ると、０．２４６　　０．１０９従って、ＬＰＳＩの１モル（５，０００と仮定）に含ま
れるＫＤＤのモル数をｙとすると、６％ＲＰＣ乳糖　　
　　　　　１７８ｇステアリン酸タルク　　　　　　　
８ｇバレイショデンブン　　　　　　１４ｇ以上を混和
し、打錠して、０．１ｒｎｇの小麦ＬＰＳを含む０．５
ｇの錠剤４００個を調製した。

実施例３（内用液剤）ＬＰＳ　　１１ｍｇ精製水００ｍ１Ｌ実施例４（軟膏剤）ＬＰＳｌ０．１ｇ精製ラノリン０ｇ以下は、本発明のＬＰＳを含む製剤の処方例である。な
お、ＬＰＳ量は、リムラステストによる大躇曹ＬＰＳ換
算量である。

実施例２（錠剤）ＬＰＳｌ０　、０４ｇ１　０００ｇ実施例５（注射剤）ＬＰＳＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，５ｍ
ｇ注射用蒸留水　　　　　　　　　　適量合計　　　　
　　　　　　１０００ｍ覧実験例１ ■各群２匹又は３匹のマウス（７週齢のオスＣ３Ｈ／Ｈ
ｅ、平均体重２５ｇ、）の尾静脈に、１四半たりリムラ
ス活性量で１．１０、又は１００μｇのＬＰＳ　１、Ｌ
ＰＳ２、ＬＰＳ３を含む生理的食塩水０．２ｍｌを注射
し、その１時閉後に血清を採取し、Ｌ９２９細胞に対す
る毒性に基づいてＴＮＦ活性を測定した。結果を、各群
２匹又は３匹の平均として次表５に示す。

表　　５（）内はマウスの匹敵を表す。

投与量、投与間隔、壽性値本発明のＬＰＳを免疫機能活性化剤として、或いは、動
物用免疫機能活性止剤抗糖尿病剤動物用抗糖尿病剤とし
て投与するさいの量、投与間隔は、当然、担当医師或い
は獣医師の厳重な管理下、投与対象の年齢、症状、体［
投与効果を勘案して個別に決定されるが、人間の成人（
６０ｋ　ｇ）で、経口投与で１ｇｇ〜１００ｍｇ、静脈
投与で１０ｎｇ〜１ｍｇ、経皮投与で１１００ｎ〜１ｍ
ｇが１日１回の投与量の一応の目安となる。なお、動物
では、牛、馬等の大型動物は上記の量の６０分の１を体
重１ｋｇ当たりの量の目安とし、豚、犬、猫等の中型、
小型の動物ではその２倍量を体１１１ｋｇ当たりの量の
目安とし、鶏等の鳥類では更にその２倍量を体重１ｋｇ
当たりの量の目安とし投与できる。

［発明の効果］本発明により新規な細菌、それに由来する新規なＬＰＳ
、及びそれを含む新規な免疫機能活性化剤、動物用免疫
機能活性化剤が提供される。

又、本発明のＬＰＳは、常法により容易に医薬、動物薬
、検査薬、医薬部外昌、化粧品、食品、機能性食品、飲
料、飼料その他の主成分として或は−成分として配合す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のＬＰＳの、ＳＤＳ電気泳動に石ける
パターンを示す図である。図中、１はＬＰＳ　１の、２はＬＰＳ２の、３はＬＰＳ
３のパターンを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の性質を有するＬＰＳ産生グラム陰性短桿菌。（ａ）形態［１］短桿状［２］運動性なし［３］グラム染色性：− （ｂ）生育状態［１］標準寒天培地：黄〜クリーム色で丸形の不透明な
コロニーを形成する。［２］ＳＳ寒天培地：白色で半透明なコロニーを形成す
る。［３］ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層
部は黄変する。ガスを生成する。（ｃ）生理的性質［１］フォーゲス・ブロスカウエル反応：＋［２］イン
ドールの生成：− ［３］硫化水素の生成：− ［４］クエン酸の利用：＋［５］ウレア−ゼ：− ［６］オキシダーゼ：− ［７］Ｏ−Ｆテスト：＋（ｄ）炭素源の利用性［１］ラクトース：＋［２］アドニット：− ［３］ラムノース：＋［４］マンニット：＋［５］エスクリン：＋［６］イノシット：− ［７］ソルビット：＋［８］アラビノース：＋［９］ラフィノース：＋［１０］シュクロース：＋（ｅ）その他［１］リジンの脱炭酸反応：− ［２］マロン酸の利用：− ［３］アルギニンの分解：− ［４］フェニルアラニンの脱アミノ化反応：−［５］オ
ルニチンの脱炭酸反応：−
（２）次の性質を有するＬＰＳ産生グラム陰性短桿菌。（ａ）形態［１］短桿状［２］運動性なし［３］グラム染色性：− （ｂ）生育状態［１］標準寒天培地：クリーム色で不透明なコロニーを
形成する。［２］ＳＳ寒天培地：赤色で不透明なコロニーを形成す
る。［３］ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層
部は黄変する。ガスを生成する。（ｃ）生理的性質［１］フォーゲス・ブロスカウエル反応：＋［２］イン
ドールの生成：− ［３］硫化水素の生成：− ［４］クエン酸の利用：＋［５］ウレアーゼ：− ［６］オキシダーゼ：− ［７］Ｏ−Ｆテスト：＋（ｄ）炭素源の利用性［１］ラクトース：＋［２］アドニット：− ［３］ラムノース：＋［４］マンニット：＋［５］エスクリン：＋［６］イノシット：− ［７］ソルビット：＋［８］アラビノース：＋［９］ラフィノース：＋［１０］シユクロース：＋（ｅ）その他［１］リジンの脱炭酸反応：− ［２］マロン酸の利用：＋［３］アルギニンの分解：＋［４］フェニルアラニンの脱アミノ化反応：−［５］オ
ルニチンの脱炭酸反応：＋
（３）次の性質を有するＬＰＳ産生グラム陰性短桿菌。（ａ）形態［１］短桿状［２］運動性なし［３］グラム染色性：− （ｂ）生育状態［１］標準寒天培地：黄色で丸形の半透明なコロニーを
形成する。［２］ＳＳ寒天培地：コロニーを形成しない。［３］ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層
部は黄変するガスを生成しない。（ｃ）生理的性質［１］フォーゲス・ブロスカウエル反応：＋［２］イン
ドールの生成：− ［３］硫化水素の生成：− ［４］クエン酸の利用：＋［５］ウレアーゼ：− ［６］オキシダーゼ：− ［７］Ｏ−Ｆテスト：＋（ｄ）炭素源の利用性［１］ラクトース：＋［２］アドニット：− ［３］ラムノース：＋［４］マンニット：＋［５］エスクリン：＋［６］イノシット：− ［７］ソルビット：＋［８］アラビノース：＋［９］ラフィノース：＋［１０］シュクロース：＋（ｅ）その他［１］リジンの脱炭酸反応：− ［２］マロン酸の利用：＋［３］アルギニンの分解：− ［４］フェニルアラニンの脱アミノ化反応：−［５］オ
ルニチンの脱炭酸反応：−
（４）次の物性を有する、請求項１記載の細菌に由来す
るＬＰＳ。分子量：５，０００±１，０００（ＳＤＳ電気泳動法）リン数：２±１／分子量５，０００ヘキソサミン数：９±１／分子量５，０００ＫＤＯ数：
２±１／分子量５，０００
（５）次の物性を有する、請求項２記載の細菌に由来す
るＬＰＳ。分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ電気泳動法）リン数：１〜２／分子量５，０００ヘキソサミン数：７±１／分子量５，０００ＫＤＯ数：
１〜２／分子量５，０００
（６）次の物性を有する、請求項３記載の細菌に由来す
るＬＰＳ。分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ電気泳動法）リン数：２±１／分子量５，０００ヘキソサミン数：５±１／分子量５，０００ＫＤＯ数：
２±１／分子量５，０００
（７）請求項４記載のＬＰＳを含む免疫機能活性化剤。
（８）請求項５記載のＬＰＳを含む免疫機能活性化剤。
（９）請求項６記載のＬＰＳを含む免疫機能活性化剤。
（１０）請求項４記載のＬＰＳを含む動物用免疫機能活
性化剤。
（１１）請求項５記載のＬＰＳを含む動物用免疫機能活
性化剤。
（１２）請求項６記載のＬＰＳを含む動物用免疫機能活
性化剤。