JPH0678756A - Ｌｐｓ産生菌、ｌｐｓ、ｌｐｓを含む医薬及び動物薬 - Google Patents
Ｌｐｓ産生菌、ｌｐｓ、ｌｐｓを含む医薬及び動物薬Info
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- JPH0678756A JPH0678756A JP3291845A JP29184591A JPH0678756A JP H0678756 A JPH0678756 A JP H0678756A JP 3291845 A JP3291845 A JP 3291845A JP 29184591 A JP29184591 A JP 29184591A JP H0678756 A JPH0678756 A JP H0678756A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 経口、経皮、注射のいずれでも投与可能な新
規な免疫機能活性化剤、鎮痛剤、抗禁断症状剤及びそれ
らの動物薬、それらの活性成分である新規ＬＰＳ、及び
それらＬＰＳを産生する新規な細菌を提供する。 【構成】 次の物性を有する３種のＬＰＳを特徴とす
る。 ＬＰＳ１ 主要分子量：５，０００±１，００
０（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、リン数：２±１／分子量
５，０００、ヘキソサミン数：９±１／分子量５，００
０、ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００、 ＬＰＳ
２ 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ法）、リン数：１〜２／分子量５，０００、ヘキ
ソサミン数：７±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数：１
〜２／分子量５，０００、 ＬＰＳ３ 主要分子量：
６，５００±２，５００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、リン
数：２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数：５±
１／分子量５，０００、ＫＤＯ数：２±１／分子量５，
０００
規な免疫機能活性化剤、鎮痛剤、抗禁断症状剤及びそれ
らの動物薬、それらの活性成分である新規ＬＰＳ、及び
それらＬＰＳを産生する新規な細菌を提供する。 【構成】 次の物性を有する３種のＬＰＳを特徴とす
る。 ＬＰＳ１ 主要分子量：５，０００±１，００
０（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、リン数：２±１／分子量
５，０００、ヘキソサミン数：９±１／分子量５，００
０、ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００、 ＬＰＳ
２ 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ法）、リン数：１〜２／分子量５，０００、ヘキ
ソサミン数：７±１／分子量５，０００、ＫＤＯ数：１
〜２／分子量５，０００、 ＬＰＳ３ 主要分子量：
６，５００±２，５００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）、リン
数：２±１／分子量５，０００、ヘキソサミン数：５±
１／分子量５，０００、ＫＤＯ数：２±１／分子量５，
０００
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なＬＰＳ産生菌、
新規なＬＰＳ、新規なＬＰＳを含む医薬及び動物薬に関
する。より詳細には、本発明は、ＬＰＳを産生する３種
の新規なブドウ糖発酵性のグラム陰性短桿菌、それに由
来する新規なＬＰＳ、及びそれらＬＰＳを含む新規な免
疫機能活性化剤、鎮痛剤、及び抗禁断症状剤、及び動物
用の新規な免疫機能活性化剤、鎮痛剤、抗禁断症状剤に
関する。
新規なＬＰＳ、新規なＬＰＳを含む医薬及び動物薬に関
する。より詳細には、本発明は、ＬＰＳを産生する３種
の新規なブドウ糖発酵性のグラム陰性短桿菌、それに由
来する新規なＬＰＳ、及びそれらＬＰＳを含む新規な免
疫機能活性化剤、鎮痛剤、及び抗禁断症状剤、及び動物
用の新規な免疫機能活性化剤、鎮痛剤、抗禁断症状剤に
関する。
【０００２】
【従来の技術】生物には、生体の内部環境が外来性及び
内因性の異物によって攪乱されるのを防ぎ、生体の恒常
性を維持するための免疫機能が備わっている。従って、
免疫機能の低下は健康の悪化、各種疾病の発病、老化促
進の原因となり、その活性化は健康向上、各種疾病の発
病阻止、治癒、老化防止につながる。このため、免疫機
能を活性化させる物質の提供が要請されており、現在、
ＰＳＫ［別名クレスチン（呉羽化学株式会社の登録商
標）］、レンチナン（味の素株式会社の登録商標）、ベ
スタチン（日本化薬株式会社の登録商標）、ソニフィラ
ン（科研製薬株式会社の登録商標）、ＯＫ−４３２［キ
ャンサー ケモセラピーレポートゥパートゥ １（Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ
Ｐａｒｔ１）、Ｖｏｌ．５８、Ｎｏ．１、１０頁（１
９７２）、別名ピシバニール（中外製薬株式会社の登録
商標）］等が知られている。
内因性の異物によって攪乱されるのを防ぎ、生体の恒常
性を維持するための免疫機能が備わっている。従って、
免疫機能の低下は健康の悪化、各種疾病の発病、老化促
進の原因となり、その活性化は健康向上、各種疾病の発
病阻止、治癒、老化防止につながる。このため、免疫機
能を活性化させる物質の提供が要請されており、現在、
ＰＳＫ［別名クレスチン（呉羽化学株式会社の登録商
標）］、レンチナン（味の素株式会社の登録商標）、ベ
スタチン（日本化薬株式会社の登録商標）、ソニフィラ
ン（科研製薬株式会社の登録商標）、ＯＫ−４３２［キ
ャンサー ケモセラピーレポートゥパートゥ １（Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ
Ｐａｒｔ１）、Ｖｏｌ．５８、Ｎｏ．１、１０頁（１
９７２）、別名ピシバニール（中外製薬株式会社の登録
商標）］等が知られている。
【０００３】鎮痛剤は麻薬系鎮痛剤と非麻薬系鎮痛剤と
に大別される。麻薬系鎮痛剤は、麻薬であることからし
て、投与に際しては最大限の注意が必要とされている。
（昭和５６年に株式会社メヂカルフレンド社が発行した
「痛みの臨床」の７０〜７４頁） 一方、非麻薬系鎮痛剤の鎮痛作用は一般に麻薬系に比べ
て弱く、非習慣性であることが特徴であるが、長期使用
においては耐性、依存性がみられるなど、薬理学的には
麻薬系鎮痛剤と全く同様に取り扱われるべき薬剤である
と考えるべきとされている。（前掲「痛みの臨床」の７
４頁）
に大別される。麻薬系鎮痛剤は、麻薬であることからし
て、投与に際しては最大限の注意が必要とされている。
（昭和５６年に株式会社メヂカルフレンド社が発行した
「痛みの臨床」の７０〜７４頁） 一方、非麻薬系鎮痛剤の鎮痛作用は一般に麻薬系に比べ
て弱く、非習慣性であることが特徴であるが、長期使用
においては耐性、依存性がみられるなど、薬理学的には
麻薬系鎮痛剤と全く同様に取り扱われるべき薬剤である
と考えるべきとされている。（前掲「痛みの臨床」の７
４頁）
【０００４】アルコール、モルフィン系麻薬、ニコチン
等の使用が習慣性になった場合にそれらの摂取を突然禁
じると、いわゆる禁断症状が発生することは一般にもよ
く知られている。そのため、アルコール等の耽溺者の社
会復帰が妨げられ、又、臨床での麻薬の使用が制限され
ていることも周知の事実である。かかる禁断症状を抑制
する薬剤としては、現在、メサドン（ｍｅｔｈａｄｏｎ
ｅ）、クロニジン（ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ）、デイゾシル
ピン（ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅ）等が知られている。し
かし、メサドンはそれ自身が薬物依存性を惹起すると言
われている。［ピー．アー．ドウヘルテイ（Ｐ．Ｒ．Ｄ
ｏｕｇｈｅｒｔｙ）等著、ニューロファーマコロジー
（Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、２６、１５
９５〜１６００頁、１９８７年］。又、クロニジンは、
０．１６ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与で震頭を抑制すると報
告されている。［スチュアート フィールデイング（Ｓ
ｔｕａｒｔ Ｆｉｅｌｄｉｎｇ）等著、ザ ジャーナル
オブファーマコロジー アンド イクスペリメンタル
セラピューテイクス（ＴＨＥＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｐ
ＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＥＸＰＥＲＩＭＥＴ
ＡＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ）、ｖｏｌ．２０７、
Ｎｏ．７、８９９〜９０５頁、１９７８年］ しかし、
本発明者らが０．１〜１０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与して
も、より重篤な禁断症状である跳躍現象を抑制する効果
はなかった。更に、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与で痙攣
を起こした。デイゾシルピンは、毒性値と有効値との差
が極めて小さいため、安全性に欠ける。［ケイス エー
（Ｋｅｉｔｈ Ａ．）等著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、２５１、８５〜８７頁、１９９１年］。
等の使用が習慣性になった場合にそれらの摂取を突然禁
じると、いわゆる禁断症状が発生することは一般にもよ
く知られている。そのため、アルコール等の耽溺者の社
会復帰が妨げられ、又、臨床での麻薬の使用が制限され
ていることも周知の事実である。かかる禁断症状を抑制
する薬剤としては、現在、メサドン（ｍｅｔｈａｄｏｎ
ｅ）、クロニジン（ｃｌｏｎｉｄｉｎｅ）、デイゾシル
ピン（ｄｉｚｏｃｉｌｐｉｎｅ）等が知られている。し
かし、メサドンはそれ自身が薬物依存性を惹起すると言
われている。［ピー．アー．ドウヘルテイ（Ｐ．Ｒ．Ｄ
ｏｕｇｈｅｒｔｙ）等著、ニューロファーマコロジー
（Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、２６、１５
９５〜１６００頁、１９８７年］。又、クロニジンは、
０．１６ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与で震頭を抑制すると報
告されている。［スチュアート フィールデイング（Ｓ
ｔｕａｒｔ Ｆｉｅｌｄｉｎｇ）等著、ザ ジャーナル
オブファーマコロジー アンド イクスペリメンタル
セラピューテイクス（ＴＨＥＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ Ｐ
ＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＥＸＰＥＲＩＭＥＴ
ＡＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ）、ｖｏｌ．２０７、
Ｎｏ．７、８９９〜９０５頁、１９７８年］ しかし、
本発明者らが０．１〜１０ｍｇ／ｋｇを静脈内投与して
も、より重篤な禁断症状である跳躍現象を抑制する効果
はなかった。更に、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与で痙攣
を起こした。デイゾシルピンは、毒性値と有効値との差
が極めて小さいため、安全性に欠ける。［ケイス エー
（Ｋｅｉｔｈ Ａ．）等著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、２５１、８５〜８７頁、１９９１年］。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来の免疫機能活性化
剤のうちで、ＰＳＫ、レンチナン、ベスタチン、ソニフ
ィランはＴＮＦ産生能がないので、それらの免疫機能活
性化能は低い。一方、ＯＫ−４３２にはＴＮＦ産生能が
あるが、大量投与が必要であることから、発熱、悪寒、
血圧低下、血小板減少等の副作用の発生が避けられず、
従って化学療法係数が小さい。更に、簡便な経口投与や
経皮投与では効果がないので、投与上の便宜に欠ける。
ここで、「ＴＮＦ」とは、マクロフアージにより産生さ
れる腫瘍障害因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆ
ａｃｔｏｒ）の総称［ザ ジャーナル オブバイオロジ
カル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６０、２３４５〜２３５４
頁（１９８５年）］であり、マクロファージの活性が高
まるにつれてその産生量は増していく。「マクロファー
ジ」は、免疫担当細胞の一種であり、動物体内のほとん
ど全ての組織に分布し、粒子状の異物や体内の老廃細胞
などを捕食して消化する大型のアメーバ状細胞の総称で
ある。「化学療法係数」は、薬剤に対する宿主の最大耐
量と病原菌に対する薬剤の最小有効濃度の比をいい、こ
の値が大きい程すぐれた化学療法剤とされる。
剤のうちで、ＰＳＫ、レンチナン、ベスタチン、ソニフ
ィランはＴＮＦ産生能がないので、それらの免疫機能活
性化能は低い。一方、ＯＫ−４３２にはＴＮＦ産生能が
あるが、大量投与が必要であることから、発熱、悪寒、
血圧低下、血小板減少等の副作用の発生が避けられず、
従って化学療法係数が小さい。更に、簡便な経口投与や
経皮投与では効果がないので、投与上の便宜に欠ける。
ここで、「ＴＮＦ」とは、マクロフアージにより産生さ
れる腫瘍障害因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆ
ａｃｔｏｒ）の総称［ザ ジャーナル オブバイオロジ
カル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２６０、２３４５〜２３５４
頁（１９８５年）］であり、マクロファージの活性が高
まるにつれてその産生量は増していく。「マクロファー
ジ」は、免疫担当細胞の一種であり、動物体内のほとん
ど全ての組織に分布し、粒子状の異物や体内の老廃細胞
などを捕食して消化する大型のアメーバ状細胞の総称で
ある。「化学療法係数」は、薬剤に対する宿主の最大耐
量と病原菌に対する薬剤の最小有効濃度の比をいい、こ
の値が大きい程すぐれた化学療法剤とされる。
【０００６】又、現在使用されている鎮痛剤には前記の
通り欠点があり、未だ満足すべきものは提供されていな
い。特に、慢性痛に対する鎮痛剤として、安全性が高
く、副作用がなく、安価で投与方法が簡便な薬剤の開発
が強く待たれている。
通り欠点があり、未だ満足すべきものは提供されていな
い。特に、慢性痛に対する鎮痛剤として、安全性が高
く、副作用がなく、安価で投与方法が簡便な薬剤の開発
が強く待たれている。
【０００７】更に、前記通り、未だ満足すべき抗禁断症
状剤は提供されていない。
状剤は提供されていない。
【０００８】本発明は、前記各従来技術の諸欠点が解消
された新規な免疫機能活性化剤、鎮痛剤、及び抗禁断症
状剤、及び動物用の新規な免疫機能活性化剤、鎮痛剤、
抗禁断症状剤を提供すること、それらの活性成分である
新規ＬＰＳを提供すること、及びそれらＬＰＳを産生す
る新規細菌を提供することを技術的課題とするものであ
る。
された新規な免疫機能活性化剤、鎮痛剤、及び抗禁断症
状剤、及び動物用の新規な免疫機能活性化剤、鎮痛剤、
抗禁断症状剤を提供すること、それらの活性成分である
新規ＬＰＳを提供すること、及びそれらＬＰＳを産生す
る新規細菌を提供することを技術的課題とするものであ
る。
【０００９】
【課題を解決するための手段】前記技術的課題は、高い
免疫機能活性化能、鎮痛効果、抗禁断症状効果を有し、
化学治療係数が高く、長期使用が可能であり、経口、経
皮、注射のいずれの経路でも投与可能であり、しかも、
生産コストが安く、大量に供給可能な新規なＬＰＳを提
供すること、及びそれらＬＰＳの供給源となる新規な細
菌を提供することにより達成される。
免疫機能活性化能、鎮痛効果、抗禁断症状効果を有し、
化学治療係数が高く、長期使用が可能であり、経口、経
皮、注射のいずれの経路でも投与可能であり、しかも、
生産コストが安く、大量に供給可能な新規なＬＰＳを提
供すること、及びそれらＬＰＳの供給源となる新規な細
菌を提供することにより達成される。
【００１０】細菌分離源 本発明の３種の細菌は、本発明者等が検討した小麦から
はその産地、種類を問わず分離されている。従って、い
ずれの産地、種類の小麦及びその加工品からも分離され
ると推定される。本発明者等がそれら３種の細菌を分離
できることを確認した小麦粉の産地、種類は次の通りで
ある。 小 麦 粉 の 名 称 産 地 ダーク・ノザン・スプリングス 米国 １・カナディアン・ホイート カナダ ハード・レッド・ウインター・セミハード 米国 オーストラリアン・スタンダード・ホイート オーストラリア ホロシリ 日本
はその産地、種類を問わず分離されている。従って、い
ずれの産地、種類の小麦及びその加工品からも分離され
ると推定される。本発明者等がそれら３種の細菌を分離
できることを確認した小麦粉の産地、種類は次の通りで
ある。 小 麦 粉 の 名 称 産 地 ダーク・ノザン・スプリングス 米国 １・カナディアン・ホイート カナダ ハード・レッド・ウインター・セミハード 米国 オーストラリアン・スタンダード・ホイート オーストラリア ホロシリ 日本
【００１１】ＬＰＳの分離 上記細菌から本発明のＬＰＳを分離するには、ウェスト
ファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）等が「メソッズ イン カ
ーボハイドレート ケミストリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
のｖｏｌ．Ｖ［米国ニューヨークのアカデミック プレ
ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）社が１９６５年に
発行］の８３頁に記載した熱フェノール法を用い、更
に、陰イオン交換樹脂で精製すればよい。即ち、菌体を
蒸留水に懸濁した後、蒸留水と等容量の熱フェノールと
共に攪拌し、次いで、遠心分離により水層を回収し、こ
の水層を透析に付してフェノールを除去し、限外濾過に
より濃縮して粗ＬＰＳ画分を得、この画分を常法に従
い、例えば、ファルマシア社製のＦＰＬＣシステムでフ
ァルマシア社製のモノＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を
使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに付して精製
し、更に、常法に従って脱塩すればよい。以上の操作に
より、純度９６％以上の精製標品が得られる。
ファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）等が「メソッズ イン カ
ーボハイドレート ケミストリー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
のｖｏｌ．Ｖ［米国ニューヨークのアカデミック プレ
ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）社が１９６５年に
発行］の８３頁に記載した熱フェノール法を用い、更
に、陰イオン交換樹脂で精製すればよい。即ち、菌体を
蒸留水に懸濁した後、蒸留水と等容量の熱フェノールと
共に攪拌し、次いで、遠心分離により水層を回収し、こ
の水層を透析に付してフェノールを除去し、限外濾過に
より濃縮して粗ＬＰＳ画分を得、この画分を常法に従
い、例えば、ファルマシア社製のＦＰＬＣシステムでフ
ァルマシア社製のモノＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅ）、Ｑ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を
使用して陰イオン交換クロマトグラフィーに付して精製
し、更に、常法に従って脱塩すればよい。以上の操作に
より、純度９６％以上の精製標品が得られる。
【００１２】ＬＰＳの物性 追って実施例中で詳述する如く、本発明の３種のＬＰＳ
（９６％以上純度標品）の物性は次の通りであった。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は実施例１で定義する） ＬＰＳ１ 主要分子量：５，０００±１，０００（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：９±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００ ＬＰＳ２ 主要分子量：６，５００±２，５００（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法） リン数：１〜２／分子量５，０００ ヘキソサミン数：７±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：１〜２／分子量５，０００ ＬＰＳ３ 主要分子量：６，５００±２，５００（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：５±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００
（９６％以上純度標品）の物性は次の通りであった。
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は実施例１で定義する） ＬＰＳ１ 主要分子量：５，０００±１，０００（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：９±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００ ＬＰＳ２ 主要分子量：６，５００±２，５００（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法） リン数：１〜２／分子量５，０００ ヘキソサミン数：７±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：１〜２／分子量５，０００ ＬＰＳ３ 主要分子量：６，５００±２，５００（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：５±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００
【００１３】提供の形態 本発明のＬＰＳはそのまま、或いは任意の程度に濃縮し
た形で提供できる。又、保存性を高めるために、凍結乾
燥や噴霧乾燥などの任意の手段により乾燥粉末として提
供することもできる。これらはいずれも常法で生産でき
る。
た形で提供できる。又、保存性を高めるために、凍結乾
燥や噴霧乾燥などの任意の手段により乾燥粉末として提
供することもできる。これらはいずれも常法で生産でき
る。
【００１４】免疫活性化能の測定 本発明のＬＰＳの免疫活性化能は、マクロファージ活性
を通じての内因性ＴＮＦ産生能により確認した。動物体
内にＴＮＦを産生させるためには、産生前駆（プライミ
ング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが必要で
あることは、カーズウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）らによ
り、プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
サイエンス オブ ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．）、７２、３６６６〜
３６７０頁（１９７５年）に報告されており、その後、
各段階で使用出来る薬剤の検討もすすめられている。プ
ライミング段階開始のために投与される薬剤が「プライ
マー」（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガリン
グ段階開始のために投与される薬剤が「トリガー」（内
因性ＴＮＦ産生剤）である。ＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９
細胞［プロシーディング オブ ナショナル アカデミ
ー サイエンス オブ ユーエスエー７２、３６６６〜
３６７０頁］に対する細胞毒性を基にして、次のように
して測定する。Ｌ９２９細胞を、５％仔牛胎児血清を加
えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下、ＭＥ
Ｍ培地と表す）で育成し、８×１０４個の細胞が１００
μｌの同上培地に含まれる様にし、９６穴の平底プレー
トで育種する。育種条件は３７℃、２時間、５％Ｃ
Ｏ２、１００％Ｈ２Ｏであり、通常の細胞培養に用いら
れる方法でよい。その後、アクチノマイシンＤを培地中
に終濃度１μｇ／ｍｌとなるように加え、培養液の液量
を１５０μｌとする。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地
で稀釈したものを５０μｌ加える（この際稀釈率を適宜
調製し、ＥＤ５０を求める事ができる）。更に、最終液
量２００μｌとなったＬ９２９細胞を上記条件で１８時
間培養する。細胞障害活性を測定するには、まず全培地
を除去し、ついで０．１％クリスタルバイオレットを含
む１％メチルアルコール溶液を加えて固定染色する。ク
リスタルバイオレットは全有核細胞を染色するが、死細
胞は染色後にプレート底面より水洗で除去されるので、
生存細胞の結果から細胞障害活性を直接測定できる。こ
の染色度をＯＤ（５９０ｎｍ）での吸光度を指標として
測定し、対照群に対する染色度と比較する事で細胞障害
活性を測定する。活性の定義は次の様に行う。Ｌ９２９
細胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）を求める。
対照としてウサギＴＮＳ［腫瘍障害血清（Ｔｕｍｏｒ
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｓｅｒｕｍ）］を使用し、このウサ
ギＴＮＳの活性ｎ（単位／ｍｌ）を２．４×１０８単位
／ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いて決定する。このウサ
ギＴＮＳのＥＤ５０を与える稀釈率（Ｃ）を求める。検
体活性（単位／ｍｌ）はＮ／Ｃ×ｎで計算する。
を通じての内因性ＴＮＦ産生能により確認した。動物体
内にＴＮＦを産生させるためには、産生前駆（プライミ
ング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが必要で
あることは、カーズウェル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）らによ
り、プロシーディング オブ ナショナル アカデミー
サイエンス オブ ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．）、７２、３６６６〜
３６７０頁（１９７５年）に報告されており、その後、
各段階で使用出来る薬剤の検討もすすめられている。プ
ライミング段階開始のために投与される薬剤が「プライ
マー」（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガリン
グ段階開始のために投与される薬剤が「トリガー」（内
因性ＴＮＦ産生剤）である。ＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９
細胞［プロシーディング オブ ナショナル アカデミ
ー サイエンス オブ ユーエスエー７２、３６６６〜
３６７０頁］に対する細胞毒性を基にして、次のように
して測定する。Ｌ９２９細胞を、５％仔牛胎児血清を加
えたイーグルミニマムエッセンシャル培地（以下、ＭＥ
Ｍ培地と表す）で育成し、８×１０４個の細胞が１００
μｌの同上培地に含まれる様にし、９６穴の平底プレー
トで育種する。育種条件は３７℃、２時間、５％Ｃ
Ｏ２、１００％Ｈ２Ｏであり、通常の細胞培養に用いら
れる方法でよい。その後、アクチノマイシンＤを培地中
に終濃度１μｇ／ｍｌとなるように加え、培養液の液量
を１５０μｌとする。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地
で稀釈したものを５０μｌ加える（この際稀釈率を適宜
調製し、ＥＤ５０を求める事ができる）。更に、最終液
量２００μｌとなったＬ９２９細胞を上記条件で１８時
間培養する。細胞障害活性を測定するには、まず全培地
を除去し、ついで０．１％クリスタルバイオレットを含
む１％メチルアルコール溶液を加えて固定染色する。ク
リスタルバイオレットは全有核細胞を染色するが、死細
胞は染色後にプレート底面より水洗で除去されるので、
生存細胞の結果から細胞障害活性を直接測定できる。こ
の染色度をＯＤ（５９０ｎｍ）での吸光度を指標として
測定し、対照群に対する染色度と比較する事で細胞障害
活性を測定する。活性の定義は次の様に行う。Ｌ９２９
細胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）を求める。
対照としてウサギＴＮＳ［腫瘍障害血清（Ｔｕｍｏｒ
Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｓｅｒｕｍ）］を使用し、このウサ
ギＴＮＳの活性ｎ（単位／ｍｌ）を２．４×１０８単位
／ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いて決定する。このウサ
ギＴＮＳのＥＤ５０を与える稀釈率（Ｃ）を求める。検
体活性（単位／ｍｌ）はＮ／Ｃ×ｎで計算する。
【００１５】鎮痛効果の測定 本発明のＬＰＳの鎮痛効果は、非麻薬系鎮痛剤検定法の
１つとして確立されている「酢酸−ライズィング（Ｗｒ
ｉｔｈｉｎｇ）法」（１９８２年に医歯薬出版株式会社
から発行された「炎症と抗炎症療法」の４１５頁）によ
る動物実験により確認した。
１つとして確立されている「酢酸−ライズィング（Ｗｒ
ｉｔｈｉｎｇ）法」（１９８２年に医歯薬出版株式会社
から発行された「炎症と抗炎症療法」の４１５頁）によ
る動物実験により確認した。
【００１６】抗禁断症状効果の測定 本発明のＬＰＳの抗禁断症状効果は、モルフィン耽溺性
マウスにモルフィン拮抗剤として知られているナロキソ
ン［前掲の ザ ジャーナル オブ ファーマコロジー
アンド イクスペリメンタル セラピューテイクス
の９０１頁に掲載されている。又、米国のエンドラブズ
社（Ｅｎｄｏ Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）より入手でき
る］）を投与すると誘発される禁断症状のうちで最も重
篤と思われる「跳躍」現象の発生回数の減少度を指標と
して確認した。
マウスにモルフィン拮抗剤として知られているナロキソ
ン［前掲の ザ ジャーナル オブ ファーマコロジー
アンド イクスペリメンタル セラピューテイクス
の９０１頁に掲載されている。又、米国のエンドラブズ
社（Ｅｎｄｏ Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）より入手でき
る］）を投与すると誘発される禁断症状のうちで最も重
篤と思われる「跳躍」現象の発生回数の減少度を指標と
して確認した。
【００１７】本発明のＬＰＳは各別に使用できることは
もちろん、その意図される用途が阻害されない限り、そ
れらの２種以上を任意に組み合わせて、或いは、更に
は、他のいずれの物質とも組み合わせて使用できる。
又、免疫機能検査薬、動物用免疫機能検査薬、医薬部外
品、化粧品、食品、機能性食品、飲料、飼料等として、
或いはその一成分としても用いることができる。本発明
のＬＰＳを含む免疫機能活性化剤等のいずれもが常法の
製剤技術或は動物薬製造の常法により、経口薬として、
或いは静注薬、筋注薬、経皮薬として単独で、或いは他
薬との配合物として、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、トロ
ーチ剤、カプセル剤、液剤、貼付剤、軟膏剤、リニメン
ト剤、ローション剤、坐剤、注射剤等の形態で提供でき
る。特に、皮膚にはマクロファージが多いので、皮膚塗
布剤として投与するとより高い効果が得られる。又、動
物用としては、更に、飼料添加剤、プレミックス製剤、
飲水添加剤として調製することもできる。飼料添加剤と
する場合には、粉剤か顆粒剤とすることが好ましい。な
お、プレミックス製剤とは、飼料との混合を容易にする
ために澱粉などの飼料成分で希釈されたものを指す。本
発明のＬＰＳを含む飼料添加剤、プレミックス製剤を添
加できる飼料は市販されている飼料のいずれでもよい。
又、ミネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含
む飼料であってもよい。これら製剤には、所望ならば、
保存性、均質性を保持するために、常法に従って、賦形
剤、保存剤、緩衝剤等の添加剤を加えることもできる。
更に、矯味剤、矯臭剤、着色剤を含めることもできる。
賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプンを使用でき
る。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチ
ル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プ
ロピル等のパラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢
酸ナトリウム、フェノール、メチルパラベン、エチルパ
ラベン、プロピルパラベン等を使用できる。緩衝剤とし
ては、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用
できる。以下、実施例、製造例、実験例により、本発明
を更に詳細に説明する。なお、それらで使用された「大
腸菌ＬＰＳ］は、米国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製Ｏ１
２８：Ｂ８である。
もちろん、その意図される用途が阻害されない限り、そ
れらの２種以上を任意に組み合わせて、或いは、更に
は、他のいずれの物質とも組み合わせて使用できる。
又、免疫機能検査薬、動物用免疫機能検査薬、医薬部外
品、化粧品、食品、機能性食品、飲料、飼料等として、
或いはその一成分としても用いることができる。本発明
のＬＰＳを含む免疫機能活性化剤等のいずれもが常法の
製剤技術或は動物薬製造の常法により、経口薬として、
或いは静注薬、筋注薬、経皮薬として単独で、或いは他
薬との配合物として、散剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、トロ
ーチ剤、カプセル剤、液剤、貼付剤、軟膏剤、リニメン
ト剤、ローション剤、坐剤、注射剤等の形態で提供でき
る。特に、皮膚にはマクロファージが多いので、皮膚塗
布剤として投与するとより高い効果が得られる。又、動
物用としては、更に、飼料添加剤、プレミックス製剤、
飲水添加剤として調製することもできる。飼料添加剤と
する場合には、粉剤か顆粒剤とすることが好ましい。な
お、プレミックス製剤とは、飼料との混合を容易にする
ために澱粉などの飼料成分で希釈されたものを指す。本
発明のＬＰＳを含む飼料添加剤、プレミックス製剤を添
加できる飼料は市販されている飼料のいずれでもよい。
又、ミネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含
む飼料であってもよい。これら製剤には、所望ならば、
保存性、均質性を保持するために、常法に従って、賦形
剤、保存剤、緩衝剤等の添加剤を加えることもできる。
更に、矯味剤、矯臭剤、着色剤を含めることもできる。
賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプンを使用でき
る。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチ
ル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プ
ロピル等のパラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢
酸ナトリウム、フェノール、メチルパラベン、エチルパ
ラベン、プロピルパラベン等を使用できる。緩衝剤とし
ては、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用
できる。以下、実施例、製造例、実験例により、本発明
を更に詳細に説明する。なお、それらで使用された「大
腸菌ＬＰＳ］は、米国ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製Ｏ１
２８：Ｂ８である。
【００１８】実施例１ ５０ｍｌ容コーニングチューブに、１．０９％の灰分
を含む硬質小麦粉（カナダ産の１・カナディアン・ホイ
ート）１．０４ｇを秤量して入れ、２０ｍｌの蒸留水を
加えて５０ｍｇ／ｍｌの小麦粉液を調製した。 この液を３７℃の水浴中で振とう培養し、経過時間０
時、１時、２時、３時、４時、６時、８時、１０時、１
２時、２０時、２４時、４５時に各０．５ｍｌを採取
し、１０°〜１０５倍希釈して標準寒天培地（日水製薬
社製培地であり、下記の組成を持つ）に１００μｌ宛を
まき込み、生菌数の測定、コロニーの観察を行った。標準寒天培地（日水製薬社コード番号：０５６１８） １リットル中 酵母エキス ２．５ｇ ペプトン ５．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ ７．１±０．１ 種類が異なると考えられた、培養経過時間８時間目、
１０時間目に認められた黄〜クリーム色不透明コロニー
（コロニー１）、クリーム色不透明コロニー（コロニー
２）、黄色半透明コロニー（コロニー３）、乳白色不透
明コロニー（コロニー４）、白色不透明な小さなコロニ
ー（コロニー５）を上記と同種の別の標準寒天培地にま
き、植え継ぎ、一方で、コロニー１〜５の細菌のグラム
染色性、リムラス活性を調べた。ここで「リムラス活
性」とは、１９６８年にレヴィン（Ｌｅｖｉｎ）により
創案された、カブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用
いたエンドトキシン定量法であるリムラステストで陽性
を示すことをさす。このリムラステストはＬＰＳ検出法
として知られており、例えば、生化学工業株式会社から
トキシカラーシステムという名称で市販されている試薬
セットを使用して実施できる。上記コロニーのうち、コ
ロニー４及びコロニー５（共にグラム染色性＋）のリム
ラス活性はコロニー１〜３（共にグラム染色性−）に比
べて極めて低かったので、以後の検討から除き、日水製
薬社製の培地及びＩＤテスト・ＥＢ−２０を使用し、コ
ロニー１〜３の形態、生化学的性状を観察した。次の結
果が得られた。
を含む硬質小麦粉（カナダ産の１・カナディアン・ホイ
ート）１．０４ｇを秤量して入れ、２０ｍｌの蒸留水を
加えて５０ｍｇ／ｍｌの小麦粉液を調製した。 この液を３７℃の水浴中で振とう培養し、経過時間０
時、１時、２時、３時、４時、６時、８時、１０時、１
２時、２０時、２４時、４５時に各０．５ｍｌを採取
し、１０°〜１０５倍希釈して標準寒天培地（日水製薬
社製培地であり、下記の組成を持つ）に１００μｌ宛を
まき込み、生菌数の測定、コロニーの観察を行った。標準寒天培地（日水製薬社コード番号：０５６１８） １リットル中 酵母エキス ２．５ｇ ペプトン ５．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ ７．１±０．１ 種類が異なると考えられた、培養経過時間８時間目、
１０時間目に認められた黄〜クリーム色不透明コロニー
（コロニー１）、クリーム色不透明コロニー（コロニー
２）、黄色半透明コロニー（コロニー３）、乳白色不透
明コロニー（コロニー４）、白色不透明な小さなコロニ
ー（コロニー５）を上記と同種の別の標準寒天培地にま
き、植え継ぎ、一方で、コロニー１〜５の細菌のグラム
染色性、リムラス活性を調べた。ここで「リムラス活
性」とは、１９６８年にレヴィン（Ｌｅｖｉｎ）により
創案された、カブトガニ血球抽出液と発色合成基質を用
いたエンドトキシン定量法であるリムラステストで陽性
を示すことをさす。このリムラステストはＬＰＳ検出法
として知られており、例えば、生化学工業株式会社から
トキシカラーシステムという名称で市販されている試薬
セットを使用して実施できる。上記コロニーのうち、コ
ロニー４及びコロニー５（共にグラム染色性＋）のリム
ラス活性はコロニー１〜３（共にグラム染色性−）に比
べて極めて低かったので、以後の検討から除き、日水製
薬社製の培地及びＩＤテスト・ＥＢ−２０を使用し、コ
ロニー１〜３の形態、生化学的性状を観察した。次の結
果が得られた。
【００１９】コロニー１を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−１） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６４号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５０
９号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のセラチア属に属すると推定される。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：黄〜クリーム色で丸形の不透明なコロ
ニーを形成する。 ＳＳ寒天培地：白色で半透明なコロニーを形成する。 ［ＳＳ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５０３１］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ 胆汁酸塩 ９．０ｇ ペプトン ７．５ｇ ラクトース １０．０ｇ クエン酸ナトリウム ８．５ｇ チオ硫酸ナトリウム ５．５ｇ クエン酸第二鉄 １．０ｇ ニュートラルレッド ０．０２５ｇ ブリリアントグリン ０．０３３ｇ カンテン １３．５ｇ ｐＨ：７．１±０．１ ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成する。 ［ＴＳＩ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５１０
３］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ ＮａＣｌ ５．０ｇ ペプトン １５．０ｇ ラクトース １０．０ｇ シュクロース １０．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ クエン酸第二鉄 ０．２ｇ チオ硫酸ナトリウム ０．２ｇ フェノールレッド ０．０２ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ：７．６±０．１ （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：＋ ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：− アルギニンの分解：− フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：−
００８１４−１） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６４号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５０
９号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た）以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細
菌は腸内細菌科のセラチア属に属すると推定される。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：黄〜クリーム色で丸形の不透明なコロ
ニーを形成する。 ＳＳ寒天培地：白色で半透明なコロニーを形成する。 ［ＳＳ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５０３１］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ 胆汁酸塩 ９．０ｇ ペプトン ７．５ｇ ラクトース １０．０ｇ クエン酸ナトリウム ８．５ｇ チオ硫酸ナトリウム ５．５ｇ クエン酸第二鉄 １．０ｇ ニュートラルレッド ０．０２５ｇ ブリリアントグリン ０．０３３ｇ カンテン １３．５ｇ ｐＨ：７．１±０．１ ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成する。 ［ＴＳＩ寒天培地：日水製薬社コード番号：０５１０
３］ 組成１リットル中 肉エキス ５．０ｇ ＮａＣｌ ５．０ｇ ペプトン １５．０ｇ ラクトース １０．０ｇ シュクロース １０．０ｇ ブドウ糖 １．０ｇ クエン酸第二鉄 ０．２ｇ チオ硫酸ナトリウム ０．２ｇ フェノールレッド ０．０２ｇ カンテン １５．０ｇ ｐＨ：７．６±０．１ （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：＋ ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：− アルギニンの分解：− フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：−
【００２０】コロニー２を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−２） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６５号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
０号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た） 以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細菌は
腸内細菌科のエンテロバクター属に属すると推定され
る。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：クリーム色で不透明なコロニーを形成
する。 ＳＳ寒天培地：赤色で不透明なコロニーを形成する。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成する。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：＋ ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：＋ アルギニンの分解：＋ フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：＋
００８１４−２） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６５号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
０号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た） 以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細菌は
腸内細菌科のエンテロバクター属に属すると推定され
る。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：クリーム色で不透明なコロニーを形成
する。 ＳＳ寒天培地：赤色で不透明なコロニーを形成する。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成する。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：＋ ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：＋ アルギニンの分解：＋ フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：＋
【００２１】コロニー３を形成する細菌（識別番号：９
００８１４−３） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６６号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
１号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た） 以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細菌は
腸内細菌科のパントエア属に属すると推定される。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：黄色で丸形の半透明なコロニーを形成
する。 ＳＳ寒天培地：コロニーを形成しない。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成しない。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：− ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：＋ アルギニンの分解：− フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：−
００８１４−３） （通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成２
年８月１７日から微工研菌寄第１１６６６号として国内
寄託され、平成３年８月１２日より微工研条寄第３５１
１号としてブダペスト条約に従った国際寄託に移管され
た） 以下に記載する形態、生化学的性状に基づき、本細菌は
腸内細菌科のパントエア属に属すると推定される。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：黄色で丸形の半透明なコロニーを形成
する。 ＳＳ寒天培地：コロニーを形成しない。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成しない。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：− ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：＋ アルギニンの分解：− フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：−
【００２２】コロニー１、２、３をそれぞれ１リット
ルのＬ−肉汁培地に移し、３７℃で一夜振とうし、５，
０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理して集菌した。な
お、このＬ−肉汁培地は、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社の
ポリペプトン１０ｇ、同社の酵母エキス５ｇ、和光純薬
社の特級ＮａＣｌ（５ｇ）を蒸留水に入れ、ＮａＯＨで
ｐＨ７．５に合わせ、オートクレーブし、別途、予め調
製済みの和光純薬社の特級グルコースの４０％溶液を４
００倍に希釈して加えて調製したものである。 各菌体をそれぞれ５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、これに
５０ｍｌの９０％熱フェノールを加えて６５〜７０℃で
２０分間攪拌し、冷却後に、１０，０００Ｇ、 ４℃で
２０分間遠心処理して、水層を回収した。フェノール層
を更に２回上記と同一の操作に付した。３つの水層を合
わせ、一夜透析してフェノールを除去し、内液を、アド
ヴァンテック・トーヨー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＴＯＹ
Ｏ）社のＵＫ−２００を使用して限外濾過に付して分子
量２０万カット−オフにより濃縮した（Ｎ２圧：２気
圧）。 この濃縮サンプルを、ファルマシア社製のＱ−セファ
ロース ファストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ）を使って陰イオン交換クロマトグラ
フィーに付した。即ち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料をカ
ラムに付した後、４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出させ
た。この溶出液を上記と同じ条件で限外濾過に付して脱
塩、濃縮して、純度９６％以上のＬＰＳを得た。なお、
核酸は１ＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）で溶出した。
ルのＬ−肉汁培地に移し、３７℃で一夜振とうし、５，
０００Ｇ、４℃で２０分間遠心処理して集菌した。な
お、このＬ−肉汁培地は、ディフコ（Ｄｉｆｃｏ）社の
ポリペプトン１０ｇ、同社の酵母エキス５ｇ、和光純薬
社の特級ＮａＣｌ（５ｇ）を蒸留水に入れ、ＮａＯＨで
ｐＨ７．５に合わせ、オートクレーブし、別途、予め調
製済みの和光純薬社の特級グルコースの４０％溶液を４
００倍に希釈して加えて調製したものである。 各菌体をそれぞれ５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、これに
５０ｍｌの９０％熱フェノールを加えて６５〜７０℃で
２０分間攪拌し、冷却後に、１０，０００Ｇ、 ４℃で
２０分間遠心処理して、水層を回収した。フェノール層
を更に２回上記と同一の操作に付した。３つの水層を合
わせ、一夜透析してフェノールを除去し、内液を、アド
ヴァンテック・トーヨー（ＡＤＶＡＮＴＥＣ ＴＯＹ
Ｏ）社のＵＫ−２００を使用して限外濾過に付して分子
量２０万カット−オフにより濃縮した（Ｎ２圧：２気
圧）。 この濃縮サンプルを、ファルマシア社製のＱ−セファ
ロース ファストフロー（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ）を使って陰イオン交換クロマトグラ
フィーに付した。即ち、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）と１０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で試料をカ
ラムに付した後、４００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でリムラス活性画分を溶出させ
た。この溶出液を上記と同じ条件で限外濾過に付して脱
塩、濃縮して、純度９６％以上のＬＰＳを得た。なお、
核酸は１ＭＮａＣｌ／１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）で溶出した。
【００２３】各菌体の結果は次表１〜３の通りであっ
た。なお、ＬＰＳ量は、リムラステストによる大腸菌Ｌ
ＰＳ換算値であり、糖はフェノール−硫酸法［エム・デ
ユボイス（Ｍ・Ｄｕｂｏｉｓ）等著、アナリテイカル
ケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、ｖｏｌ．２８、３５０頁、１９５６年］、蛋白は
ローリー法［オー．エイチ．ローリー（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗ
ｒｙ）等著、ジャーナルオブ バイオロジカル ケミス
トリ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）］、Ｖｏｌ．１９３、６５頁、１
９５１年］で測定した。又、核酸量はＯＤ（２６０ｎ
ｍ）での測定値に基づき（１０Ｄ＝５０μｇ）、純度
（％）は次式に基づき計算した。
た。なお、ＬＰＳ量は、リムラステストによる大腸菌Ｌ
ＰＳ換算値であり、糖はフェノール−硫酸法［エム・デ
ユボイス（Ｍ・Ｄｕｂｏｉｓ）等著、アナリテイカル
ケミストリ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）、ｖｏｌ．２８、３５０頁、１９５６年］、蛋白は
ローリー法［オー．エイチ．ローリー（Ｏ．Ｈ．Ｌｏｗ
ｒｙ）等著、ジャーナルオブ バイオロジカル ケミス
トリ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）］、Ｖｏｌ．１９３、６５頁、１
９５１年］で測定した。又、核酸量はＯＤ（２６０ｎ
ｍ）での測定値に基づき（１０Ｄ＝５０μｇ）、純度
（％）は次式に基づき計算した。
【数１】
【００２４】
【表１】
【表２】
【表３】
【００２５】分子量 各菌体から得られたＬＰＳを各々蒸留水に溶解して２ｍ
ｇ／ｍｌ溶液を調製し、その１０μｌを１．５ｍｌ容プ
ラスチックチューブに入れた。これに、別途、１８０μ
ｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの５％β−メル
カプトエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素溶液、１１
２．５μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）及び２
２．５μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤＳ処理液１０
μｌを加えてよく混合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸
した。この加熱後直ちに氷水中に浸して急冷した。１０
ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１７．９ｇのトリシン
及び３．０３ｇのトリスを１リットルの蒸留水に溶解し
て調製した泳動緩衝液をマリソル社製のスラブゲル電気
泳動槽に入れた。２０％ポリアクリルアミドゲルを泳動
槽に固定し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を５０ｖに
１時間、次いで、１５０ｖに固定して、色素がゲルより
溶出するまで泳動を続けた（本明細書でこの泳動法をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法と称する）。泳動終了後に、バイオラ
ッド社の銀染色キット１６１−０４４３を使い銀染色を
室温で行って、挙動を確認した。同時に泳動させた蛋白
分子量マーカー［ファルマシア社製のＬＭＷキットＥ：
ホスホリラーゼｂ（９４ｋ）、アルブミン（６７ｋ）、
オブアルブミン（４３ｋ）、カーボニックアンヒドラー
ゼ（３０ｋ）、トリプシンインヒビター（２０ｋ）、α
−ラクトアルブミン（１４ｋ）］、ペプチド分子量マー
カー［ファルマシア社製の１８６０−１０１分子量マー
カー：ミオグロビン（１６．９ｋ）、ミオグロビンＩ＆
ＩＩ（１４．４ｋ）、ミオグロビンＩ（８．２ｋ）、ミ
オグロビンＩＩ（６．０ｋ）、ミオグロビンＩＶ（２．
５ｋ）］の泳動位置から本発明のＬＰＳの分子量を計算
したら、５，０００±１，０００（菌体９００８１４−
１に由来するＬＰＳ１）、６，５００±２，５００（菌
体９００８１４−２に由来するＬＰＳ２及び菌体９００
８１４−３に由来するＬＰＳ３）であった。同様にして
測定された大腸菌ＬＰＳ（ディフコ社製の大腸菌０１２
７：Ｂ８ＬＰＳ）の分子量は３０，０００±２０，００
０であった。上記銀染色におけるＬＰＳ１、ＬＰＳ２、
ＬＰＳ３の染色帯を図１に示す。図１において、番号１
がＬＰＳ１の、番号２がＬＰＳ２の、番号３がＬＰＳ３
の染色帯である。図１に示されるように、ＬＰＳ１は分
子量３万付近にもややまとまった染色帯を示した。ＬＰ
Ｓ２は３０，０００から４３，０００の間にも染色帯が
認められるが、１４，０００以下の染色帯の染色度と比
較すると、高分子のものは極めて少ないと推定される。
後述する糖量、ヘキソサミン量から判断してもＬＰＳ２
は最も糖含有率が低く、ついでＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順
で高くなり、電気泳動で観察されたパターンと一致する
と考えられる。又、ＬＰＳ量／総乾燥収量の比もＬＰＳ
２、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順に低くなっている。以上の
観察結果から、ＬＰＳ２は比較的低分子のＬＰＳが多
く、次いで、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順にその割合は少な
くなると推定される。
ｇ／ｍｌ溶液を調製し、その１０μｌを１．５ｍｌ容プ
ラスチックチューブに入れた。これに、別途、１８０μ
ｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４５μｌの５％β−メル
カプトエタノール、９０μｌのＣＢＢ色素溶液、１１
２．５μｌの０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ６．８）及び２
２．５μｌの蒸留水を加えて調製したＳＤＳ処理液１０
μｌを加えてよく混合し、次いで５分間沸騰水浴中に浸
した。この加熱後直ちに氷水中に浸して急冷した。１０
ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１７．９ｇのトリシン
及び３．０３ｇのトリスを１リットルの蒸留水に溶解し
て調製した泳動緩衝液をマリソル社製のスラブゲル電気
泳動槽に入れた。２０％ポリアクリルアミドゲルを泳動
槽に固定し、サンプル溝に検体を入れ、電圧を５０ｖに
１時間、次いで、１５０ｖに固定して、色素がゲルより
溶出するまで泳動を続けた（本明細書でこの泳動法をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法と称する）。泳動終了後に、バイオラ
ッド社の銀染色キット１６１−０４４３を使い銀染色を
室温で行って、挙動を確認した。同時に泳動させた蛋白
分子量マーカー［ファルマシア社製のＬＭＷキットＥ：
ホスホリラーゼｂ（９４ｋ）、アルブミン（６７ｋ）、
オブアルブミン（４３ｋ）、カーボニックアンヒドラー
ゼ（３０ｋ）、トリプシンインヒビター（２０ｋ）、α
−ラクトアルブミン（１４ｋ）］、ペプチド分子量マー
カー［ファルマシア社製の１８６０−１０１分子量マー
カー：ミオグロビン（１６．９ｋ）、ミオグロビンＩ＆
ＩＩ（１４．４ｋ）、ミオグロビンＩ（８．２ｋ）、ミ
オグロビンＩＩ（６．０ｋ）、ミオグロビンＩＶ（２．
５ｋ）］の泳動位置から本発明のＬＰＳの分子量を計算
したら、５，０００±１，０００（菌体９００８１４−
１に由来するＬＰＳ１）、６，５００±２，５００（菌
体９００８１４−２に由来するＬＰＳ２及び菌体９００
８１４−３に由来するＬＰＳ３）であった。同様にして
測定された大腸菌ＬＰＳ（ディフコ社製の大腸菌０１２
７：Ｂ８ＬＰＳ）の分子量は３０，０００±２０，００
０であった。上記銀染色におけるＬＰＳ１、ＬＰＳ２、
ＬＰＳ３の染色帯を図１に示す。図１において、番号１
がＬＰＳ１の、番号２がＬＰＳ２の、番号３がＬＰＳ３
の染色帯である。図１に示されるように、ＬＰＳ１は分
子量３万付近にもややまとまった染色帯を示した。ＬＰ
Ｓ２は３０，０００から４３，０００の間にも染色帯が
認められるが、１４，０００以下の染色帯の染色度と比
較すると、高分子のものは極めて少ないと推定される。
後述する糖量、ヘキソサミン量から判断してもＬＰＳ２
は最も糖含有率が低く、ついでＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順
で高くなり、電気泳動で観察されたパターンと一致する
と考えられる。又、ＬＰＳ量／総乾燥収量の比もＬＰＳ
２、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順に低くなっている。以上の
観察結果から、ＬＰＳ２は比較的低分子のＬＰＳが多
く、次いで、ＬＰＳ３、ＬＰＳ１の順にその割合は少な
くなると推定される。
【００２６】リン含有量 チェン−トリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒｉｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル ケミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２
８、１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を各別
に蒸留水に溶解して、それぞれ、３１．６μｇ、５７．
６μｇ、１０３．６μｇのＬＰＳを含む２０μｌの溶液
を調製し、小試験管に入れた。２０μｌの５０ｖ／ｖ％
硫酸を添加し、１６０℃で２時間加熱した。次いで、２
０μｌの１０ｖ／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバー
ナーで１分間加熱して灰化させた。その後に０．５ｍｌ
の蒸留水、次いで０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌの６Ｎ
硫酸、２ｍｌの蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブ
デン酸アンモニウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコ
ルビン酸を混合して調製し、その０．５ｍｌを使用）を
添加して室温で３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの
吸光度ＯＤ（８２０ｎｍ）を測定した。なお、検量線作
成用の試料としては、リン酸二水素カリウム（和光純薬
社製）を蒸留水で希釈し、リン酸重量としてそれぞれ
２．５μｇ、１μｇ、０．２５μｇ、０μｇを含む０．
５ｍｌの溶液を調製して使用した。なお、リン１ｇはリ
ン酸二水素カリウム４．３９ｇに相当する。結果を次表
４に示す。表中、吸光度を示す数値は、無機リンの混入
（例えば、リン酸緩衝液に由来する）による誤差を避け
るために、加熱処理をしていない対照のデータを減じた
値である。リン量（μｇ）は吸光度から計算された値で
ある。リン量（重量％）は、次式により計算した。な
お、式中の「０．６７」は、標準のリン１μｇのＯＤ値
を指し、サンプル濃度は、蒸留水に溶解した各ＬＰＳの
濃度（ｍｇ／ｍｌ）を指す。
［チェン等著、「アナリティカル ケミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ．２
８、１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３を各別
に蒸留水に溶解して、それぞれ、３１．６μｇ、５７．
６μｇ、１０３．６μｇのＬＰＳを含む２０μｌの溶液
を調製し、小試験管に入れた。２０μｌの５０ｖ／ｖ％
硫酸を添加し、１６０℃で２時間加熱した。次いで、２
０μｌの１０ｖ／ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバー
ナーで１分間加熱して灰化させた。その後に０．５ｍｌ
の蒸留水、次いで０．５ｍｌの反応試薬（１ｍｌの６Ｎ
硫酸、２ｍｌの蒸留水、２ｍｌの２．５ｖ／ｗ％モリブ
デン酸アンモニウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％のアスコ
ルビン酸を混合して調製し、その０．５ｍｌを使用）を
添加して室温で３０分間放置した後に、８２０ｎｍでの
吸光度ＯＤ（８２０ｎｍ）を測定した。なお、検量線作
成用の試料としては、リン酸二水素カリウム（和光純薬
社製）を蒸留水で希釈し、リン酸重量としてそれぞれ
２．５μｇ、１μｇ、０．２５μｇ、０μｇを含む０．
５ｍｌの溶液を調製して使用した。なお、リン１ｇはリ
ン酸二水素カリウム４．３９ｇに相当する。結果を次表
４に示す。表中、吸光度を示す数値は、無機リンの混入
（例えば、リン酸緩衝液に由来する）による誤差を避け
るために、加熱処理をしていない対照のデータを減じた
値である。リン量（μｇ）は吸光度から計算された値で
ある。リン量（重量％）は、次式により計算した。な
お、式中の「０．６７」は、標準のリン１μｇのＯＤ値
を指し、サンプル濃度は、蒸留水に溶解した各ＬＰＳの
濃度（ｍｇ／ｍｌ）を指す。
【数２】 リン数は、次式により計算した、分子量５，０００当た
りの換算数である。
りの換算数である。
【数３】
【００２７】
【表４】
【００２８】ヘキソサミン含有量 エルソン−モルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法
（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ．４の３７
７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。ＬＰＳを
蒸留水に溶解して１．５８ｍｇ（ＬＰＳ１）、２．８８
ｍｇ（ＬＰＳ２）、５．１８ｍｇ（ＬＰＳ３）／ｍｌの
溶液を調製し、その１００μｌをスクリューキャップ付
きスピッツ（イワキガラス社製）に入れ、これに１００
μｌの８ＮＨＣｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し
た。４ＮＮａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨ７とし
た。その１００μｌを分取し、別のスクリューキャップ
付きスピッツに入れ、２００μｌの下記試薬Ａを加えた
後に、１０５℃で１．５時間加熱し、次いで流水で冷却
した。次いで、１００μｌを分取し、６７０μｌの９６
％エタノールを加え、更に、６７μｌの下記試薬Ｂを加
えた後に室温で１時間放置し、５３５ｎｍで吸光度を測
定した。検量線作製用試料としては０．２０〜２００μ
ｇ／ｍｌのＮ−アセチル グルコサミン（和光純薬社
製）を使った。 （試薬Ａ）７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製した。 （試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍｌの濃塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合
して調製した。 結果、ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３のヘキソサミン数
は各々９±１／分子量５，０００、７±１／分子量５，
０００、５±１／分子量５，０００だった。
（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ．４の３７
７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。ＬＰＳを
蒸留水に溶解して１．５８ｍｇ（ＬＰＳ１）、２．８８
ｍｇ（ＬＰＳ２）、５．１８ｍｇ（ＬＰＳ３）／ｍｌの
溶液を調製し、その１００μｌをスクリューキャップ付
きスピッツ（イワキガラス社製）に入れ、これに１００
μｌの８ＮＨＣｌを添加して１１０℃で１６時間加熱し
た。４ＮＮａＯＨを約２００μｌ添加してｐＨ７とし
た。その１００μｌを分取し、別のスクリューキャップ
付きスピッツに入れ、２００μｌの下記試薬Ａを加えた
後に、１０５℃で１．５時間加熱し、次いで流水で冷却
した。次いで、１００μｌを分取し、６７０μｌの９６
％エタノールを加え、更に、６７μｌの下記試薬Ｂを加
えた後に室温で１時間放置し、５３５ｎｍで吸光度を測
定した。検量線作製用試料としては０．２０〜２００μ
ｇ／ｍｌのＮ−アセチル グルコサミン（和光純薬社
製）を使った。 （試薬Ａ）７５μｌのアセチルアセトンと２．５ｍｌの
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製した。 （試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍｌの濃塩酸と３０ｍｌの９６％エタノールを混合
して調製した。 結果、ＬＰＳ１、ＬＰＳ２、ＬＰＳ３のヘキソサミン数
は各々９±１／分子量５，０００、７±１／分子量５，
０００、５±１／分子量５，０００だった。
【００２９】ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケトー３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ アール（Ｓｈａｂｙ
Ｒ．）等著、アナリティカル バイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、５８（１）、１２３
〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通りに行っ
た。５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｌのエタノー
ル、４５ｍｌの氷酢酸、５０ｍｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００μｌに、（１）０．５０５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ１を
含む２５０μｌ蒸留水溶液；（２）０．５７６ｍｇ／ｍ
ｌのＬＰＳ２を含む２５０μｌ蒸留水溶液；（３）０．
５１８ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ３を含む２５０μｌ蒸留水溶
液；のいずれかを合わせ、１００℃の沸騰水浴中で３３
分間加熱後に冷水（２４．５℃）中で３０分間冷却し、
ついで日立分光光度計３２０を使い４２０、４７０、６
３０、６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（測定値を
各々Ａ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０とす
る）。標準試料としては、０．５μモル／ｍｌのＫＤＯ
アンモニウム塩［米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を含
む蒸留水２５０μｌを使用した。検体試料、標準試料そ
れぞれについて、次式の値を求めた。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ 検体試料の値（ＳＴ）はＬＰＳ１で０．１０９、ＬＰＳ
２で０．０７８、ＬＰＳ３で０．０９９であった。標準
試料の値（Ｓｓ）は０．２４６であり、蒸留水のみの値
は０．００５であった。この値の比較により、ＬＰＳ１
には２±１／分子量５，０００、ＬＰＳ２には１〜２／
分子量５，０００、ＬＰＳ３には２±１／分子量５，０
００のＫＤＯが含まれると推定された。なお、これらの
値は、ＬＰＳ１を例にとると、次のように計算される。
溶液に含まれるＫＤＤの濃度をｘ（μモル／ｍｌ）とす
ると、
をジフェニルアミン法［シャビ アール（Ｓｈａｂｙ
Ｒ．）等著、アナリティカル バイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、５８（１）、１２３
〜１２９頁（１９７４年）］に準拠して次の通りに行っ
た。５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍｌのエタノー
ル、４５ｍｌの氷酢酸、５０ｍｌの濃塩酸（全て和光純
薬社製）を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５
００μｌに、（１）０．５０５ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ１を
含む２５０μｌ蒸留水溶液；（２）０．５７６ｍｇ／ｍ
ｌのＬＰＳ２を含む２５０μｌ蒸留水溶液；（３）０．
５１８ｍｇ／ｍｌのＬＰＳ３を含む２５０μｌ蒸留水溶
液；のいずれかを合わせ、１００℃の沸騰水浴中で３３
分間加熱後に冷水（２４．５℃）中で３０分間冷却し、
ついで日立分光光度計３２０を使い４２０、４７０、６
３０、６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（測定値を
各々Ａ４２０、Ａ４７０、Ａ６３０、Ａ６５０とす
る）。標準試料としては、０．５μモル／ｍｌのＫＤＯ
アンモニウム塩［米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製］を含
む蒸留水２５０μｌを使用した。検体試料、標準試料そ
れぞれについて、次式の値を求めた。 Ｓ＝Ａ４２０−Ａ４７０＋Ａ６３０−Ａ６５０ 検体試料の値（ＳＴ）はＬＰＳ１で０．１０９、ＬＰＳ
２で０．０７８、ＬＰＳ３で０．０９９であった。標準
試料の値（Ｓｓ）は０．２４６であり、蒸留水のみの値
は０．００５であった。この値の比較により、ＬＰＳ１
には２±１／分子量５，０００、ＬＰＳ２には１〜２／
分子量５，０００、ＬＰＳ３には２±１／分子量５，０
００のＫＤＯが含まれると推定された。なお、これらの
値は、ＬＰＳ１を例にとると、次のように計算される。
溶液に含まれるＫＤＤの濃度をｘ（μモル／ｍｌ）とす
ると、
【数４】 上記式から、ｘ＝０．２２１となる。従って、ＬＰＳ１
の１モル（５，０００と仮定）に含まれるＫＤＤのモル
数をｙとすると、次式により、ｙ＝２．１９となる。
の１モル（５，０００と仮定）に含まれるＫＤＤのモル
数をｙとすると、次式により、ｙ＝２．１９となる。
【数５】
【００３０】以下は、本発明のＬＰＳを含む製剤の処方
例である。なお、実施例２〜５におけるＬＰＳ量は、リ
ムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換算量である。実施例２（錠剤） ＬＰＳ１ ０．０４ｇ ６％ＨＰＣ乳糖 １７８ｇ ステアリン酸タルク ８ｇ バレイショデンプン １４ｇ 以上を混和し、打錠して、０．１ｍｇの小麦ＬＰＳを含
む０．５ｇの錠剤４００個を調製した。実施例３（内用液剤） ＬＰＳ１ １ｍｇ 精製水 １００ｍｌ実施例４（軟膏剤） 実施例５（注射剤） ＬＰＳ１ ０．５ｍｇ注射用蒸留水 適量 合計 １０００ｍｌ
例である。なお、実施例２〜５におけるＬＰＳ量は、リ
ムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換算量である。実施例２（錠剤） ＬＰＳ１ ０．０４ｇ ６％ＨＰＣ乳糖 １７８ｇ ステアリン酸タルク ８ｇ バレイショデンプン １４ｇ 以上を混和し、打錠して、０．１ｍｇの小麦ＬＰＳを含
む０．５ｇの錠剤４００個を調製した。実施例３（内用液剤） ＬＰＳ１ １ｍｇ 精製水 １００ｍｌ実施例４（軟膏剤） 実施例５（注射剤） ＬＰＳ１ ０．５ｍｇ注射用蒸留水 適量 合計 １０００ｍｌ
【００３１】製造例１（百日咳菌ＬＰＳの製造） 千葉県血清研究所から入手した試験用百日咳菌液（２．
０×１０１０ 細胞／ｍｌ）を死菌体として用いた。上
記死菌体を２５ｍｇ（乾燥重量）／ｍｌとなるように滅
菌水に懸濁した。これに等量の９０％熱フェノール液
（６８〜７０℃）を添加し、６８℃で１時間振盪しなが
ら抽出した。８，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離し
て水層を分取した。残りのフェノール層に、上記水層と
等量の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得られた水
層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、ロータ
リーエバポレータで１／１０に濃縮した。これを８，０
００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を分取し、
酢酸ナトリウムを少量加え、０〜４℃の冷エタノールを
６倍量加えて−２０℃で一晩放置した。４，０００Ｇ、
４℃で３０分間遠心分離して回収した沈殿物をエタノー
ルで２回、次いでアセトンで１回遠心洗浄し、アスピレ
ータで乾燥させた。残さを、２０ｍｇ／ｍｌとなるよう
に蒸留水に懸濁し、米国ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）
社製のソニファイア１８５型で超音波処理（出力コント
ロール５、１５分、室温）に付した。次いで２，５００
Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を分取した。この
上清を４℃で、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製の核酸分
解酵素ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ Ａで１５〜１６時間
処理した（最終的には１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ
と、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを使用した）。更
に同じ濃度の核酸分解酵素を加えて３７℃で２時間加温
した。次いで２，５００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離
し、上清を分取した。この上清を米国ゲルマン（Ｇｅｌ
ｍａｎ）社のアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を使
い、孔径０．２μｍで濾過した。濾液を分子篩にかけ
［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、カラムサイ
ズ＝内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ、緩衝液＝１０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、
流速＝約３ｍｌ／ｃｍ２／時）、生化学工業社製のＬＳ
−１キットを用いてリムラス活性陽性画分を調べて合わ
せ、上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、孔径０．
２μｍで濾過した。濾液をイオン交換にかけ［装置：米
国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製ＦＰＬＣ、
樹脂：米国ファルマシア社製モノＱ ＨＲ１０／１０、
緩衝液＝１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ＋１０ｍＭのＮａＣ
ｌ（ｐＨ７．５）で１５分洗浄し、次いで、ＮａＣｌ量
を１６５ｍＭに増加して３０分洗浄し、次いで、２０分
かけて、ＮａＣｌ量が１６５ｍＭから１Ｍの濃度勾配に
なるようにＮａＣｌ量を増加させながら洗浄し、次い
で、１ＭのＮａＣｌ量で３０洗浄する、流速＝２ｍｌ／
分］、生化学工業社製のＬＳ−１キットを用いてリムラ
ス活性陽性画分を調べて合わせた。合わせた画分をカラ
ムで脱塩し［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）社製セファデックスＧ−２５ファイン（ｆｉｎ
ｅ）、カラムサイズ＝内径２ｃｍ×長さ２５ｃｍ、溶出
液＝蒸留水］、次いで凍結乾燥した。この凍結乾燥標品
（４．５０ｍｇ）に混入している可能性の最も高い物質
は核酸である。そこで、紫外吸収曲線（２００〜４００
ｎｍ）をとり、２６０ｎｍでの吸光度を求めた。吸光度
１のときの核酸濃度が５０μｇ／ｍｌであることを用い
て上記吸光度から核酸濃度を算出したら１％以下であっ
た。又、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法では蛋白質は明確には検出
されなかった。従って、検出感度を考慮すると、上記凍
結乾燥標品に混入している蛋白質は高々０〜３％と推定
される。従って、上記凍結乾燥標品の純度は９６％以上
と推定された。実施例１に記載の方法と同様にして測定
されたこの百日咳菌ＬＰＳの物性は次の通りであった。百日咳菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝６，０００±１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法による） リン数＝４／分子量６千 ヘキソサミン数＝１２／分子量６千 脂肪酸数＝４／分子量６千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量６千
０×１０１０ 細胞／ｍｌ）を死菌体として用いた。上
記死菌体を２５ｍｇ（乾燥重量）／ｍｌとなるように滅
菌水に懸濁した。これに等量の９０％熱フェノール液
（６８〜７０℃）を添加し、６８℃で１時間振盪しなが
ら抽出した。８，０００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離し
て水層を分取した。残りのフェノール層に、上記水層と
等量の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得られた水
層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、ロータ
リーエバポレータで１／１０に濃縮した。これを８，０
００Ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を分取し、
酢酸ナトリウムを少量加え、０〜４℃の冷エタノールを
６倍量加えて−２０℃で一晩放置した。４，０００Ｇ、
４℃で３０分間遠心分離して回収した沈殿物をエタノー
ルで２回、次いでアセトンで１回遠心洗浄し、アスピレ
ータで乾燥させた。残さを、２０ｍｇ／ｍｌとなるよう
に蒸留水に懸濁し、米国ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）
社製のソニファイア１８５型で超音波処理（出力コント
ロール５、１５分、室温）に付した。次いで２，５００
Ｇ、４℃で１０分間遠心分離し、上清を分取した。この
上清を４℃で、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製の核酸分
解酵素ＤＮａｓｅＩ、ＲＮａｓｅ Ａで１５〜１６時間
処理した（最終的には１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ
と、２０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａを使用した）。更
に同じ濃度の核酸分解酵素を加えて３７℃で２時間加温
した。次いで２，５００Ｇ、４℃で１０分間遠心分離
し、上清を分取した。この上清を米国ゲルマン（Ｇｅｌ
ｍａｎ）社のアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を使
い、孔径０．２μｍで濾過した。濾液を分子篩にかけ
［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、カラムサイ
ズ＝内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ、緩衝液＝１０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）、
流速＝約３ｍｌ／ｃｍ２／時）、生化学工業社製のＬＳ
−１キットを用いてリムラス活性陽性画分を調べて合わ
せ、上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、孔径０．
２μｍで濾過した。濾液をイオン交換にかけ［装置：米
国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製ＦＰＬＣ、
樹脂：米国ファルマシア社製モノＱ ＨＲ１０／１０、
緩衝液＝１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ＋１０ｍＭのＮａＣ
ｌ（ｐＨ７．５）で１５分洗浄し、次いで、ＮａＣｌ量
を１６５ｍＭに増加して３０分洗浄し、次いで、２０分
かけて、ＮａＣｌ量が１６５ｍＭから１Ｍの濃度勾配に
なるようにＮａＣｌ量を増加させながら洗浄し、次い
で、１ＭのＮａＣｌ量で３０洗浄する、流速＝２ｍｌ／
分］、生化学工業社製のＬＳ−１キットを用いてリムラ
ス活性陽性画分を調べて合わせた。合わせた画分をカラ
ムで脱塩し［樹脂：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）社製セファデックスＧ−２５ファイン（ｆｉｎ
ｅ）、カラムサイズ＝内径２ｃｍ×長さ２５ｃｍ、溶出
液＝蒸留水］、次いで凍結乾燥した。この凍結乾燥標品
（４．５０ｍｇ）に混入している可能性の最も高い物質
は核酸である。そこで、紫外吸収曲線（２００〜４００
ｎｍ）をとり、２６０ｎｍでの吸光度を求めた。吸光度
１のときの核酸濃度が５０μｇ／ｍｌであることを用い
て上記吸光度から核酸濃度を算出したら１％以下であっ
た。又、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法では蛋白質は明確には検出
されなかった。従って、検出感度を考慮すると、上記凍
結乾燥標品に混入している蛋白質は高々０〜３％と推定
される。従って、上記凍結乾燥標品の純度は９６％以上
と推定された。実施例１に記載の方法と同様にして測定
されたこの百日咳菌ＬＰＳの物性は次の通りであった。百日咳菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝６，０００±１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法による） リン数＝４／分子量６千 ヘキソサミン数＝１２／分子量６千 脂肪酸数＝４／分子量６千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量６千
【００３２】又、同様にして測定された大腸菌ＬＰＳの
物性は次の通りであった。大腸菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝４０，０００±１０，０００ ８，０００±４，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によ
る） リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万
物性は次の通りであった。大腸菌ＬＰＳの物性 主要分子量＝４０，０００±１０，０００ ８，０００±４，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によ
る） リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万
【００３３】実験例１（免疫機能活性化効果） 各群２匹又は３匹のマウス（７週齢のオスＣ３Ｈ／Ｈ
ｅ。平均体重２５ｇ。）の尾静脈に、１匹当たりリムラ
ス活性量で１、１０、又は１００μｇのＬＰＳ１、ＬＰ
Ｓ２、ＬＰＳ３を含む生理的食塩水０．２ｍｌを注射
し、その１時間後に血清を採取し、Ｌ９２９細胞に対す
る毒性に基づいてＴＮＦ活性を測定した。結果を、各群
２匹又は３匹の平均として次表５に示す。なお、表中、
（ ）内はマウスの匹数を表す。
ｅ。平均体重２５ｇ。）の尾静脈に、１匹当たりリムラ
ス活性量で１、１０、又は１００μｇのＬＰＳ１、ＬＰ
Ｓ２、ＬＰＳ３を含む生理的食塩水０．２ｍｌを注射
し、その１時間後に血清を採取し、Ｌ９２９細胞に対す
る毒性に基づいてＴＮＦ活性を測定した。結果を、各群
２匹又は３匹の平均として次表５に示す。なお、表中、
（ ）内はマウスの匹数を表す。
【表５】
【００３４】実験例２（鎮痛効果） ７〜１０週齢の各群５匹のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウス（平均
体重約２８ｇ）に、ＬＰＳ換算でそれぞれ０、１、５、
２５、４００μｇ／匹ずつの本発明のＬＰＳ３或は大腸
菌ＬＰＳを含むように調製した２００μｌの蒸留水をゾ
ンデで経口投与した。その１．５時間後に５００μｌの
０．７％酢酸を５分かけて腹腔内投与し、その後３０分
間にわたり、各マウスの身もだえ回数を計数し、表６に
示す結果が得られた（各群５匹の平均）。表中、「−」
は該当量では測定しなかったことを示す。又、「身もだ
え阻止率（％）」は、次式により計算した。
体重約２８ｇ）に、ＬＰＳ換算でそれぞれ０、１、５、
２５、４００μｇ／匹ずつの本発明のＬＰＳ３或は大腸
菌ＬＰＳを含むように調製した２００μｌの蒸留水をゾ
ンデで経口投与した。その１．５時間後に５００μｌの
０．７％酢酸を５分かけて腹腔内投与し、その後３０分
間にわたり、各マウスの身もだえ回数を計数し、表６に
示す結果が得られた（各群５匹の平均）。表中、「−」
は該当量では測定しなかったことを示す。又、「身もだ
え阻止率（％）」は、次式により計算した。
【数６】
【表６】 図２は表６に示した結果をグラフ化したものである。図
２より、ＬＰＳ３の身もだえ阻止率ＥＤ５０は２．８μ
ｇ／匹、大腸菌ＬＰＳのそれは１７μｇ／匹と推定され
た。従って、鎮痛効果に関しては、ＬＰＳ３は大腸菌Ｌ
ＰＳの約６倍の効果があると推定される。
２より、ＬＰＳ３の身もだえ阻止率ＥＤ５０は２．８μ
ｇ／匹、大腸菌ＬＰＳのそれは１７μｇ／匹と推定され
た。従って、鎮痛効果に関しては、ＬＰＳ３は大腸菌Ｌ
ＰＳの約６倍の効果があると推定される。
【００３５】実験例３（抗禁断症状効果−その１） 各群６〜１２匹の４〜５週齢のｄｄＹマウス（体重２０
〜２４ｇ）に、１２．７ｍｇのモルフィンペレット（日
本の武田製薬工業株式会社から入手した塩酸モルフィン
をモレキュラーシーブに含浸させて調製した。以下同様
である。）を背中の首より少し下の皮下に移植し、その
２日後に５０μｇ／ｋｇの大腸菌ＬＰＳ（６匹）、ＬＰ
Ｓ３（７匹）又は製造例１で製造された百日咳菌ＬＰＳ
（６匹）を生理的食塩水に溶解して静注した。対照群に
は生理的食塩水のみを投与した。その１時間後に１０ｍ
ｇ／ｋｇのナロキソンを腹腔内投与し、その直後から４
０分間、マウスの「跳躍」数を計数し、跳躍抑制効果を
判定した。結果を表７に示す。表７において、数値は該
当するマウスの匹数を表す。なお、跳躍抑制効果は次の
通りにして判定した。対照群としての生理的食塩水投与
群（１２匹）での平均跳躍数／匹が６２．７±２５．５
だったので、６２．５−２５．５＝３７ より、跳躍
数３７以上は効果なし、３７回未満は効果ありと判定し
た。
〜２４ｇ）に、１２．７ｍｇのモルフィンペレット（日
本の武田製薬工業株式会社から入手した塩酸モルフィン
をモレキュラーシーブに含浸させて調製した。以下同様
である。）を背中の首より少し下の皮下に移植し、その
２日後に５０μｇ／ｋｇの大腸菌ＬＰＳ（６匹）、ＬＰ
Ｓ３（７匹）又は製造例１で製造された百日咳菌ＬＰＳ
（６匹）を生理的食塩水に溶解して静注した。対照群に
は生理的食塩水のみを投与した。その１時間後に１０ｍ
ｇ／ｋｇのナロキソンを腹腔内投与し、その直後から４
０分間、マウスの「跳躍」数を計数し、跳躍抑制効果を
判定した。結果を表７に示す。表７において、数値は該
当するマウスの匹数を表す。なお、跳躍抑制効果は次の
通りにして判定した。対照群としての生理的食塩水投与
群（１２匹）での平均跳躍数／匹が６２．７±２５．５
だったので、６２．５−２５．５＝３７ より、跳躍
数３７以上は効果なし、３７回未満は効果ありと判定し
た。
【表７】 表７に明らかな通り、抗禁断症状発現率は、対照群でわ
ずか約８％なのに，大腸菌ＬＰＳ投与群で５０％、百日
咳菌ＬＰＳ投与群で約６７％、ＬＰＳ３投与群で１００
％であった。
ずか約８％なのに，大腸菌ＬＰＳ投与群で５０％、百日
咳菌ＬＰＳ投与群で約６７％、ＬＰＳ３投与群で１００
％であった。
【００３６】実験例４（抗禁断症状効果−その２） 本発明のＬＰＳの抗禁断症状効果の静脈投与における用
量依存性を調べるために、４〜５週齢のｄｄＹ雄マウス
（平均体重２０ｇ）に、１２．７ｍｇのモルフィンペレ
ットを背中の首より少し下の皮下に移植し、その２日後
に０．５μｇ／ｋｇ（６匹）、５μｇ／ｋｇ（６匹）、
１５μｇ／ｋｇ（９匹）、５０μｇ／ｋｇ（１２匹）、
又は５００μｇ／ｋｇ（６匹）のＬＰＳ３を生理的食塩
水に溶解して静脈内投与した。対照群（１０匹）には生
理的食塩水のみを投与した。その２時間後に１０ｍｇ／
ｋｇのナロキソンを腹腔内投与し、その直後から４０分
間、マウスの「跳躍」数を計数した。結果を各群の１匹
当たりの平均として表８に示す。
量依存性を調べるために、４〜５週齢のｄｄＹ雄マウス
（平均体重２０ｇ）に、１２．７ｍｇのモルフィンペレ
ットを背中の首より少し下の皮下に移植し、その２日後
に０．５μｇ／ｋｇ（６匹）、５μｇ／ｋｇ（６匹）、
１５μｇ／ｋｇ（９匹）、５０μｇ／ｋｇ（１２匹）、
又は５００μｇ／ｋｇ（６匹）のＬＰＳ３を生理的食塩
水に溶解して静脈内投与した。対照群（１０匹）には生
理的食塩水のみを投与した。その２時間後に１０ｍｇ／
ｋｇのナロキソンを腹腔内投与し、その直後から４０分
間、マウスの「跳躍」数を計数した。結果を各群の１匹
当たりの平均として表８に示す。
【表８】 図３は表８に示した結果をグラフ化したものである。
【００３７】実験例５（抗禁断症状効果−その３） 本発明のＬＰＳの抗禁断症状効果の皮内投与における用
量依存性を調べるために、実験例４を繰り返した。但
し、ＬＰＳ３の量は５０μｇ／ｋｇ（７匹）又は５００
μｇ／ｋｇ（５匹）とし、対照群（生理的食塩水投与
群）は８匹とした。結果を各群の１匹当たりの平均とし
て表９に示す。
量依存性を調べるために、実験例４を繰り返した。但
し、ＬＰＳ３の量は５０μｇ／ｋｇ（７匹）又は５００
μｇ／ｋｇ（５匹）とし、対照群（生理的食塩水投与
群）は８匹とした。結果を各群の１匹当たりの平均とし
て表９に示す。
【表９】 図４は表９に示した結果をグラフ化したものである。図
３及び図４より、本発明のＬＰＳの抗禁断症状効果は用
量に依存することが明白である。
３及び図４より、本発明のＬＰＳの抗禁断症状効果は用
量に依存することが明白である。
【００３８】実験例６（抗禁断症状効果−その４） 本発明のＬＰＳの抗禁断症状効果の投与時期依存性を調
べるため、各群５〜９匹の４〜５週齢のｄｄＹ雄マウス
（体重２０〜２４ｇ）に、１２．７ｍｇのモルフィンペ
レットを背中の首より少し下の皮下に移植し、その２日
後に１０ｍｇ／ｋｇのナロキソンを腹腔内投与し、但
し、ナロキソン投与の１時間前（７匹）、３時間前（８
匹）、８時間前（６匹）、１８時間前（５匹）に５０μ
ｇ／ｋｇ匹のＬＰＳ３を静脈内投与し、ナロキソン投与
直後から４０分間、マウスの「跳躍」数を計数した。な
お、ＬＰＳ３無投与群は９匹であった。結果を各群１匹
当たりの平均として表１０に示す。
べるため、各群５〜９匹の４〜５週齢のｄｄＹ雄マウス
（体重２０〜２４ｇ）に、１２．７ｍｇのモルフィンペ
レットを背中の首より少し下の皮下に移植し、その２日
後に１０ｍｇ／ｋｇのナロキソンを腹腔内投与し、但
し、ナロキソン投与の１時間前（７匹）、３時間前（８
匹）、８時間前（６匹）、１８時間前（５匹）に５０μ
ｇ／ｋｇ匹のＬＰＳ３を静脈内投与し、ナロキソン投与
直後から４０分間、マウスの「跳躍」数を計数した。な
お、ＬＰＳ３無投与群は９匹であった。結果を各群１匹
当たりの平均として表１０に示す。
【表１０】 図５は表１０に示した結果をグラフ化したものである。
図５より、本発明のＬＰＳには禁断症状予防効果がある
こと、そしてその予防効果は禁断症状発現の直前に投与
すると最大限に発揮されることが推定される。
図５より、本発明のＬＰＳには禁断症状予防効果がある
こと、そしてその予防効果は禁断症状発現の直前に投与
すると最大限に発揮されることが推定される。
【００３９】投与量、投与間隔、毒性値 本発明のＬＰＳを免疫機能活性化剤、鎮痛剤或いは抗禁
断症状剤として、或いは、動物用の免疫機能活性化剤、
鎮痛剤或いは抗禁断症状剤として投与するさいの量、投
与間隔は、当然、担当医師或いは獣医師の厳重な管理
下、投与対象の年齢、症状、体重、投与効果を勘案して
個別に決定されるが、人間の成人（６０ｋｇ）で、経口
投与で１μｇ〜１００ｍｇ、静脈投与で１０ｎｇ〜１０
ｍｇ、経皮投与で１００ｎｇ〜１ｍｇが１日１回の投与
量の一応の目安となる。なお、動物では、牛、馬等の大
型動物は上記の量の６０分の１を体重１ｋｇ当たりの量
の目安とし、豚、犬、猫等の中型、小型の動物ではその
２倍量を体重１ｋｇ当たりの量の目安とし、鶏等の鳥類
では更にその２倍量を体重１ｋｇ当たりの量の目安とし
投与できる。なお、ベーレンス ケルバー（Ｂｅｈｒｅ
ｎｓ Ｋ
断症状剤として、或いは、動物用の免疫機能活性化剤、
鎮痛剤或いは抗禁断症状剤として投与するさいの量、投
与間隔は、当然、担当医師或いは獣医師の厳重な管理
下、投与対象の年齢、症状、体重、投与効果を勘案して
個別に決定されるが、人間の成人（６０ｋｇ）で、経口
投与で１μｇ〜１００ｍｇ、静脈投与で１０ｎｇ〜１０
ｍｇ、経皮投与で１００ｎｇ〜１ｍｇが１日１回の投与
量の一応の目安となる。なお、動物では、牛、馬等の大
型動物は上記の量の６０分の１を体重１ｋｇ当たりの量
の目安とし、豚、犬、猫等の中型、小型の動物ではその
２倍量を体重１ｋｇ当たりの量の目安とし、鶏等の鳥類
では更にその２倍量を体重１ｋｇ当たりの量の目安とし
投与できる。なお、ベーレンス ケルバー（Ｂｅｈｒｅ
ｎｓ Ｋ
【外１】 ｒｂｅｒ）法により測定した、７週齢の平均体重２２ｇ
のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスにおけるＬＰＳ１、ＬＰＳ２、
ＬＰＳ３のＬＤ５０はそれぞれ１５０、１８０、１８０
μｇ／匹であり、大腸菌ＬＰＳの値３００μｇ／匹の６
０％以下であった。又、大腸菌ＬＰＳ、百日咳菌ＬＰＳ
（製造例１）の毒性値ＬＤ５０ （１群２匹の雄ＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウス、平均体重４５ｇ、における平均値）は静
脈内投与でそれぞれ３．４、１１ｍｇ／ｋｇであり、皮
内投与でそれぞれ１６、３２ｍｇ／ｋｇだった。
のＣ３Ｈ／Ｈｅ雄マウスにおけるＬＰＳ１、ＬＰＳ２、
ＬＰＳ３のＬＤ５０はそれぞれ１５０、１８０、１８０
μｇ／匹であり、大腸菌ＬＰＳの値３００μｇ／匹の６
０％以下であった。又、大腸菌ＬＰＳ、百日咳菌ＬＰＳ
（製造例１）の毒性値ＬＤ５０ （１群２匹の雄ＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウス、平均体重４５ｇ、における平均値）は静
脈内投与でそれぞれ３．４、１１ｍｇ／ｋｇであり、皮
内投与でそれぞれ１６、３２ｍｇ／ｋｇだった。
【００４０】
【発明の効果】本発明により新規な細菌、それに由来す
る新規なＬＰＳ、及びそれを含む新規な免疫機能活性化
剤、鎮痛剤、抗禁断症状剤、動物用の免疫機能活性化
剤、鎮痛剤、抗禁断症状剤が提供される。又、本発明の
ＬＰＳは、常法により容易に医薬、動物薬、検査薬、医
薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飲料、飼料その
他の主成分として或は一成分として配合することができ
る。
る新規なＬＰＳ、及びそれを含む新規な免疫機能活性化
剤、鎮痛剤、抗禁断症状剤、動物用の免疫機能活性化
剤、鎮痛剤、抗禁断症状剤が提供される。又、本発明の
ＬＰＳは、常法により容易に医薬、動物薬、検査薬、医
薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飲料、飼料その
他の主成分として或は一成分として配合することができ
る。
【図１】本発明のＬＰＳの、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法におけ
るパターンを示す図である。
るパターンを示す図である。
【図２】本発明のＬＰＳの鎮痛効果を、大腸菌ＬＰＳと
の対比で示すグラフである。
の対比で示すグラフである。
【図３】本発明のＬＰＳの抗禁断症状効果の静脈内投与
における用量依存性を示すグラフである。
における用量依存性を示すグラフである。
【図４】本発明のＬＰＳの抗禁断症状効果の皮内投与に
おける用量依存性を示すグラフである。
おける用量依存性を示すグラフである。
【図５】本発明のＬＰＳの抗禁断症状予防効果の投与時
期依存性を示すグラフである。
期依存性を示すグラフである。
図１において、１はＬＰＳ１の、２はＬＰＳ２の、３は
ＬＰＳ３のパターンを示す。図２において、□は本発明
のＬＰＳの、○は大腸菌ＬＰＳのデータを示す。
ＬＰＳ３のパターンを示す。図２において、□は本発明
のＬＰＳの、○は大腸菌ＬＰＳのデータを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成４年１１月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/20 ＡＥＲ Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｐ 7329−4Ｃ Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 月岡 大輔 千葉県千葉市春日１−21−17 (72)発明者 水野 伝一 神奈川県鎌倉市岡本18 (72)発明者 大島 治之 東京都八王子市館町1097館ケ丘団地２−１ −513
Claims (12)
- 【請求項１】 次の性質を有するＬＰＳ産生グラム陰性
短桿菌。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：黄〜クリーム色で丸形の不透明なコロ
ニーを形成する。 ＳＳ寒天培地：白色で半透明なコロニーを形成する。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成する。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：＋ ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：− アルギニンの分解：− フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：− - 【請求項２】 次の性質を有するＬＰＳ産生グラム陰性
短桿菌。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：クリーム色で不透明なコロニーを形成
する。 ＳＳ寒天培地：赤色で不透明なコロニーを形成する。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成する。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：＋ ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：＋ アルギニンの分解：＋ フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：＋ - 【請求項３】 次の性質を有するＬＰＳ産生グラム陰性
短桿菌。 （ａ）形態 短桿状 運動性なし グラム染色性：− （ｂ）生育状態 標準寒天培地：黄色で丸形の半透明なコロニーを形成
する。 ＳＳ寒天培地：コロニーを形成しない。 ＴＳＩ寒天培地：斜面部での変化はないが、高層部は
黄変する。ガスを生成しない。 （ｃ）生理的性質 フォーゲス・プロスカウエル反応：＋ インドールの生成：− 硫化水素の生成：− クエン酸の利用：＋ ウレアーゼ：− オキシダーゼ：− Ｏ−Ｆテスト：＋ （ｄ）炭素源の利用性 ラクトース：＋ アドニット：− ラムノース：＋ マンニット：＋ エスクリン：＋ イノシット：− ソルビット：＋ アラビノース：＋ ラフィノース：− ▲１０▼シュクロース：＋ （ｅ）その他 リジンの脱炭酸反応：− マロン酸の利用：＋ アルギニンの分解：− フェニルアラニンの脱アミノ化反応：− オルニチンの脱炭酸反応：− - 【請求項４】 次の物性を示す、請求項１記載の細菌に
由来するＬＰＳ。 主要分子量：５，０００±１，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法による） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：９±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００ - 【請求項５】 次の物性を示す、請求項２記載の細菌に
由来するＬＰＳ。 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法による） リン数：１〜２／分子量５，０００ ヘキソサミン数：７±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：１〜２／分子量５，０００ - 【請求項６】 次の物性を示す、請求項３記載の細菌に
由来するＬＰＳ。 主要分子量：６，５００±２，５００（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ法による） リン数：２±１／分子量５，０００ ヘキソサミン数：５±１／分子量５，０００ ＫＤＯ数：２±１／分子量５，０００ - 【請求項７】 請求項４〜６のいずれかの項に記載のＬ
ＰＳ及びそれらの混合物からなる群から選択されるＬＰ
Ｓを含む免疫機能活性化剤。 - 【請求項８】 請求項４〜６のいずれかの項に記載のＬ
ＰＳ及びそれらの混合物からなる群から選択されるＬＰ
Ｓを含む鎮痛剤。 - 【請求項９】 請求項４〜６のいずれかの項に記載のＬ
ＰＳ及びそれらの混合物からなる群から選択されるＬＰ
Ｓを含む抗禁断症状剤。 - 【請求項１０】 請求項４〜６のいずれかの項に記載の
ＬＰＳ及びそれらの混合物からなる群から選択されるＬ
ＰＳを含む動物用免疫機能活性化剤。 - 【請求項１１】 請求項４〜６のいずれかの項に記載の
ＬＰＳ及びそれらの混合物からなる群から選択されるＬ
ＰＳを含む動物用鎮痛剤。 - 【請求項１２】 請求項４〜６のいずれかの項に記載の
ＬＰＳ及びそれらの混合物からなる群から選択されるＬ
ＰＳを含む動物用抗禁断症状剤。
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-
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