본 발명자는 대장균과 살모넬라의 감염을 예방할 수 있는 물질을 개발하기 위하여, 대장균 및 살모넬라에 특이적인 난황항체를 이용하는 방법에 촛점을 맞추어 다양한 연구를 진행하던 중, 한방에서 사용하여온 생약재의 효능에 주목하게 되었다. 동의보감, 한약집성방 등에 기재된 전염병을 예방할 수 있는 다양한 생약재들을 대상으로 대장균과 살모넬라의 감염을 예방할 수 있는 물질을 검색한 결과, 가자, 양제근, 측백엽, 소목, 우슬, 전호, 백모등, 방풍, 형개, 백작약, 금은화, 자초 및 승마가 대장균과 살모넬라의 감염을 예방할 수 있음을 확인하였다.
또한, 이들의 예방효과를 극대화할 수 있는 최적의 조성비를 산출한 결과, 가자 5 내지 25중량%, 양제근 5 내지 25중량%, 측백엽 5 내지 25중량 %, 소목 5 내지 25중량%, 우슬 5 내지 10중량%, 전호 5 내지 10중량%, 백모등 5 내지 10중량%, 방풍 5 내지 10중량%, 형개 5 내지 10중량%, 백작약 5 내지 10중량%, 금은화 5 내지 10중량%, 자초 5 내지 10중량% 및 승마 5 내지 10중량%로 구성된 조성물이 바람직함을 알 수 있었다.
아울러, 상기 조성물과 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum), 살모넬라 플로륨(Salmonella pullorum) 및 병원성 대장균인 O-157(E. coli O-157)에 특이적인 난황항체를 조합할 경우, 상기 예방효과를 더욱 배가시킬 수 있었는 데, 이때 상기 조성물의 함량은 50 내지 70중량%이고 상기 난황항체의 함량은 30 내지 50중량%가 바람직함을 알 수 있었다.
결국, 본 발명의 대장균 및 살모넬라 감염 예방용 조성물은 (i) 가자 5 내지 25중량%, 양제근 5 내지 25중량%, 측백엽 5 내지 25중량 %, 소목 5 내지 25중 량%, 우슬 5 내지 10중량%, 전호 5 내지 10중량%, 백모등 5 내지 10중량%, 방풍 5 내지 10중량%, 형개 5 내지 10중량%, 백작약 5 내지 10중량%, 금은화 5 내지 10중량%, 자초 5 내지 10중량% 및 승마 5 내지 10중량%로 구성된 생약 성분 50 내지 70중량%; 및, (ⅱ) 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum), 살모넬라 플로륨(Salmonella pullorum) 및 병원성 대장균인 O-157(E. coli O-157)에 특이적인 난황항체 30 내지 50중량%를 포함한다. 이때, 생약 성분은 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 각 생약재의 열풍건조분말 또는 동결건조분말을 사용함이 바람직하고, 난황항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 분무건조분말 또는 동결건조분말을 사용함이 바람직하다.
또한, 본 발명의 대장균 및 살모넬라 감염 예방용 조성물의 제조방법은 (ⅰ) 가자 5 내지 25중량%, 양제근 5 내지 25중량%, 측백엽 5 내지 25중량 %, 소목 5 내지 25중량%, 우슬 5 내지 10중량%, 전호 5 내지 10중량%, 백모등 5 내지 10중량%, 방풍 5 내지 10중량%, 형개 5 내지 10중량%, 백작약 5 내지 10중량%, 금은화 5 내지 10중량%, 자초 5 내지 10중량% 및 승마 5 내지 10중량%를 혼합하고, 건조시킨 다음, 이를 마쇄하여 혼합분말을 수득하는 공정; (ⅱ) 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum), 살모넬라 플로륨(Salmonella pullorum) 및 병원성 대장균인 O-157(E. coli O-157)의 사균으로부터 수득한 항원을 산란계에 접종하고, 접종된 산란계로부터 계란을 채란한 다음, 이로부터 난황을 수득하는 공정; (ⅲ) 전기 수득한 난황을 건조시키고, 이를 마쇄하여 분말형태의 난황항체를 수득하는 공정; 및, (ⅳ) 상기 각각 수득한 혼합분말과 분말형태의 난황항체를 50:50 내지 70:30(중량%)의 비율로 혼합하는 공정을 포함한다.
이때, (ⅰ)공정의 건조는 특별히 이에 제한되지 않으나, 열풍건조방법 또는 동결건조방법에 의하여 수행됨이 바람직하고, (ⅰ)공정의 마쇄는 특별히 이에 제한되지 않으나, 30 내지 200메쉬의 크기로 마쇄함이 바람직하며, (ⅲ)공정의 건조는 특별히 이에 제한되지 않으나, 분무건조방법 또는 동결건조방법에 의하여 수행됨이 바람직하고, (ⅲ)공정의 마쇄는 특별히 이에 제한되지 않으나, 30 내지 200메쉬의 크기로 마쇄함이 바람직하다.
본 발명의 대장균 및 살모넬라 감염 예방용 조성물은 가축의 사료 또는 음수에 혼합하고, 이를 섭식시키는 방법을 통하여 투여할 수 있다: 이때, 사료 또는 음수에 혼합되는 형태 또는 혼합량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 가축의 사료에 혼합할 경우 분말형태로 사료 중량의 0.05내지 10중량%, 바람직하게는 0.1 내지 2중량%의 성분비로 혼합하여 투여함이 바람직하고, 가축의 음수에 혼합할 경우에는 액상추출물 형태의 생약재 혼합물과 특이난황항체를 음수의 중량에 대하여 0.1 내지 5 중량%, 바람직하게는 음수 중량의 0.1 내지 2중량%의 성분비로 혼합하여 투여함이 바람직하다.
급성독성실험
본 발명의 조성물은 종래로부터 한방 또는 민간요법에서 사용되고, 금기물질로 분류되지 않은 안전성이 입증된 생약재만을 원료로서 사용하였고, 계란은 태고로부터 섭식하여 그 안전성이 기 입증된 바, 별도의 급성독성실험을 수행하지 않았다.
유효량
본 발명에서 제공하는 조성물의 투여량은 인체의 경우 체중 kg 당 1일 0.1 내지 5 g 을 투여할 수 있고, 가축의 경우, 가축의 종류와 상태에 따라, 가축중량 kg 당 1일 0.1 내지 100g을 투여할 수 있다. 또한, 가축의 상태에 따라 당업자가 투여량을 변화시킬 수 있다.
본 발명의 대장균 및 살모넬라 감염 예방용 조성물은 종래에 사용되어 온 항생제를 대체할 수 있으면서도 안전성을 확보할 수 있으므로, 축산농가의 소득증대에 크게 이바지할 수 있을 것이다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 대장균과 살모넬라의 감염을 예방할 수 있는 생약성분의 검색
실시예 1-1: 생약성분의 검색
전염병의 예방에 효과가 있다고 알려진 산수유, 가자, 복분자, 양제근, 측백엽, 용안육, 소목, 우슬, 삼백초, 전호, 백출, 백모등, 방풍, 백복령, 형개, 백작약, 금은화, 자초 및 승마의 건조분말을 실험동물인 7주령의 특정 병원체 미검출(specific pathogen free, SPF) 하이-라인 백색 산란계에 하루에 200g씩 7일 동안 경구투여하고, 7일이 경과된 시점에서 각 실험동물에 8x107CFU/ml의 대장균, 5x107CFU/ml의 살모넬라 플로륨 및 5x107CFU/ml의 살모넬라 갈리나륨을 각각 경구투여하고 3일 후, 분변에 포함된 세균의 수를 측정한 다음, 대조군의 분변에 포함된 세균수로 나누어 각 분변에 포함된 각 세균수의 상대적인 비율을 비교하였다(참조: 표 1a). 이때, 대조군으로는 생약성분을 투여하지 않고, 대장균 및 살모넬라만을 투여한 산란계를 사용하였다.
각 생약성분이 투여된 산란계의 분변에 포함된 대장균과 살모넬라의 상대적 비율
생약 |
대장균 |
살모넬라 |
생약 |
대장균 |
살모넬라 |
대조군 산수유 가자 복분자 양제근 측백엽 용안육 소목 우슬 삼백초 |
1.0 1.1 0.7 1.0 0.8 0.8 1.2 0.8 0.7 1.0 |
1.0 1.0 0.8 1.3 0.8 0.7 1.4 0.9 0.7 1.1 |
전호 백출 백모등 방풍 백복령 형개 백작약 금은화 자초 승마 |
0.7 1.0 0.9 0.8 1.1 0.7 0.8 0.9 0.7 0.8 |
0.5 1.1 0.8 0.7 1.2 0.8 0.9 0.9 0.8 0.7 |
상기 표 1a에서 보듯이, 가자, 양제근, 측백엽, 소목, 우슬, 전호, 백모등, 방풍, 형개, 백작약, 금은화, 자초 및 승마를 투여한 경우에는 대조군 보다도 적은 수의 세균이 분변에서 발견되었는 바, 상기 생약재가 대장균 및 살모넬라의 감염을 예방할 수 있음을 확인하였다.
실시예 1-2: 생약성분의 최적 조성비 결정
상기 실시예 1-1에서 검색한 생약성분을 혼합하여, 대장균과 살모넬라균의 감염을 예방할 수 있는 최적의 혼합비를 결정하고자 하였다.
구체적으로, 가자(GJ), 양제근(YJ), 측백엽(CB), 소목(SO), 우슬(US), 전호(JH), 백모등(BM), 방풍(BP), 형개(HG), 백작약(BJ), 금은화(GE), 자초(JC) 및 승마(SM)를 하기의 표 1b와 같이 혼합하고, 이를 70℃에서 1시간동안 열풍건조시킨 다음, 100메쉬의 크기로 마쇄하여 수득한 각각의 혼합분말을 하루에 500g씩 산란계에 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법을 수행하여, 각 분변에 포함된 각 세균수의 상대적인 비율을 비교하였다(참조: 표 1c). 이때, 대조군으로는 생약성분을 투여하지 않고, 대장균 및 살모넬라만을 투여한 산란계를 사용하였다.
각 생약재의 혼합비(단위: 중량%)
실험군 |
GJ |
YJ |
CB |
SO |
US |
JH |
BM |
BP |
HG |
BJ |
GE |
JC |
SM |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 |
5 5 5 5 10 5 5 5 10 15 5 5 5 10 10 5 25 5 5 10 |
5 5 5 25 5 5 5 5 15 10 10 5 5 5 10 5 5 5 5 15 |
5 10 5 5 5 5 5 20 5 25 5 5 10 25 10 5 5 5 5 20 |
5 5 5 10 15 5 25 5 5 5 10 5 15 15 5 5 5 5 10 5 |
25 5 5 5 5 5 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 10 5 |
5 25 5 5 5 5 5 5 5 5 10 5 5 5 5 5 10 15 25 5 |
5 5 25 5 5 5 10 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 25 10 5 |
5 10 5 10 25 5 5 5 5 5 5 20 5 5 5 5 5 10 5 5 |
15 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 25 10 5 5 5 |
5 10 5 10 5 25 5 5 5 5 5 5 5 5 25 5 5 5 5 5 |
10 5 5 5 5 10 10 25 5 5 5 5 25 5 5 5 5 5 5 5 |
5 5 20 5 5 10 5 5 25 5 5 25 5 5 5 5 5 5 5 10 |
5 5 5 5 5 10 5 5 5 5 25 5 5 5 5 20 10 5 5 5 |
각 혼합비의 생약성분이 투여된 산란계의 분변에 포함된 대장균과 살모넬라의 상대적 비율
실험군 |
대장균 |
살모넬라 |
실험군 |
대장균 |
살모넬라 |
실험군 |
대장균 |
살모넬라 |
대조군 1 2 3 4 5 6 |
1.0 0.8 0.7 0.8 0.5 0.7 0.8 |
1.0 1.0 0.8 0.9 0.4 0.9 0.7 |
7 8 9 10 11 12 13 |
0.4 0.9 0.8 0.4 0.7 0.7 0.8 |
0.4 0.7 1.0 0.5 0.9 0.8 0.7 |
14 15 16 17 18 19 20 |
0.5 0.7 0.7 0.4 0.8 0.9 0.4 |
0.5 1.0 0.8 0.4 0.7 0.9 0.5 |
상기 표 1c에서 보듯이, 혼합된 생약을 투여한 산란계의 분변에 포함된 대장균 및 살모넬라균의 상대적 비율은 전체적으로 0.4 내지 1.0을 나타내었고, 그 중에서도 실험군 4, 7, 10, 14, 17 및 20은 0.4 내지 0.5의 상대적 비율을 나타낸 반면, 실험군 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 13, 15, 16, 18 및 19는 0.7 내지 1.0의 상대적 비율을 나타내었다.
따라서, 실험군 4, 7, 10, 14, 17 및 20을 구성하는 혼합비의 범위인 가자 5 내지 25중량%, 양제근 5 내지 25중량%, 측백엽 5 내지 25중량 %, 소목 5 내지 25중량%, 우슬 5 내지 10중량%, 전호 5 내지 10중량%, 백모등 5 내지 10중량%, 방풍 5 내지 10중량%, 형개 5 내지 10중량%, 백작약 5 내지 10중량%, 금은화 5 내지 10중량%, 자초 5 내지 10중량% 및 승마 5 내지 10중량%로 구성된 조성물을 사용할 경우, 대장균 및 살모넬라의 감염을 효과적으로 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 2: 대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체의 대장균 및 살모넬라 감염예방효과 확인
실시예 2-1: 대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체의 수득
살모넬라의 종류 중 닭에서 병원성을 유발하는 살모넬라 갈리나륨(Salmonella gallinarum), 살모넬라 플로륨(Salmonella pullorum) 및 병원성 대장균인 O-157(E. coli O-157)을 사용하여 면역형성용 항원을 제조하고, 이를 닭에 주사하여 특이적인 난황항체를 제조하였다.
먼저, 살모넬라 갈리나륨균, 살모넬라 플로륨균 및 O-157균을 각각 5㎖의 트립티카아제 소이 액상배지(Trypticase soy broth, pH 7.4)(Sigma Chem. Co., USA)에 4시간 동안 배양하고, 이를 다시 500㎖의 트립티카아제 소이 액상배지에 접종하여 37℃의 호기조건으로 18시간동안 배양하였다. 상기 배양액에 0.3%(v/v)가 되도록 포르말린을 가하여 실온에서 48시간 동안 방치하여, 각 균을 불활성화시켜 각각의 사균액을 수득하였다. 상기 각각의 사균액을 5,000rpm에서 20분간 원심분리하여 균체를 수득하고, 수득한 각 균체를 PBS로 세척한 다음, 0.3%(v/v) 포르말린을 포함하는 PBS에 현탁시켜서, O.D.410 값이 0.5 내지 1.5가 되도록 조절하였다.
상기 각각의 현탁액을 동일부피로 혼합한 혼합액과 유화제인 ISA70(Sepic, 프랑스)를 3:7(w/w)로 혼합하고, 균질기를 적용하여, 30,000rpm에서 20분간 균질화시켜서 면역형성제를 수득하였다.
전기 수득한 면역형성제를 14주령의 산란계의 흉근에 1㎖씩 접종하여 면역반응을 유도시키고, 산란계의 스트레스를 감소시키기 위하여, 스트레스 감소제인 놉스르레스(DIASHAM RESOURCES, Singapore)가 첨가된 사료를 접종전 3일동안 및 접종후 7일동안 경구투여하였다.
상기 면역반응을 유도시킨 산란계에서 계란을 채란하고, 채란된 계란으로부터 난황을 수득한 다음, 난황을 3배 부피의 PBS에 현탁시키고, 13,000rpm으로 1시간 동안 원심분리하여 상층액인 난황분획을 수득하였다.
상기 난황분획에 각 균체에 대하여 특이적인 항체가 포함되었는지의 여부를 효소면역분석법(ELISA)을 수행하여 확인하였다.
구체적으로, 상기 면역항원으로 사용된 각각의 사균된 균주를 초음파처리하여 분쇄하고, 상기 분쇄물을 흡착용 완충용액(1.59g/L sodium carbonate, 2.93g/L sodium bicarbonate, 0.20g/L sodium azide, pH 9.6)으로 희석하여 효소면역분석용 마이크로플레이트에 가하고, 4℃에서 16시간 반응시켜서, 상기 항원을 플레이트에 흡착시켰다. 상기 항원이 흡착된 플레이트에 상기 수득한 난황분획을 가하고 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후, PBS로 3회 세척하였다. 이어, 페록시다아제가 포함되어있는 닭의 면역항체(IgG)에 대한 항체(anti-chicken IgG HRP labeled)(BioRad Co., Ltd., USA)인 2차 항체를 가하고 37℃에서 1시간동안 반응시킨 다음, 다시 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음, 발색기질인 TMB를 가하고, 3분동안 반응시킨 후, 0.25몰 황산을 가하여 반응을 정지시키고, 분광광도계를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여, 각 균체에 대한 항체가 형성된 난황을 선별하였다.
상기 선별된 난황을 포함하는 계란을 수득할 수 있는 산란계로부터 계란을 채란한 다음, 채란된 계란으로부터 난황을 수득하고, 이를 분무건조시켜서, 분말형태의 대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체를 수득하였다.
실시예 2-2: 대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체의 대장균 및 살모넬라 감염 예방효과 확인
상기 실시예 2-1에서 수득한 각각의 대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체를 하루에 500g씩 산란계에 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법을 수행하여, 각 분변에 포함된 각 세균수의 상대적인 비율을 비교하였다(참조: 표 2). 이때, 대조군으로는 생약성분을 투여하지 않고, 대장균 및 살모넬라만을 투여한 산란계를 사용하였다.
대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체가 투여된 산란계의 분변에 포함된 대장균과 살모넬라의 상대적 비율
|
대장균 |
살모넬라 |
대조군 |
1.0 |
1.0 |
난황항체 투여군 |
0.5 |
0.5 |
상기 표 2에서 보듯이, 대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체가 투여된 산란계의 분변에는 대조군의 분변보다 대장균 및 살모넬라 균체의 수가 현저하게 감소함을 알 수 있었으므로, 대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체를 사용할 경우, 대장균 및 살모넬라의 감염을 효과적으로 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3: 생약성분 및 난황항체를 포함하는 조성물의 대장균 및 살모넬라의 감염예방 효과 확인
상기 실시예 1 및 2의 결과로부터, 생약성분 및 대장균 및 살모넬라 특이적 난황항체가 모두 대장균 및 살모넬라의 감염을 효과적으로 예방할 수 있음을 알 수 있었으므로, 상기 생약성분 및 난황항체를 동시에 투여할 경우, 대장균 및 살모넬라의 감염예방 효과를 증대시킬 수 있는 지의 여부를 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 1-2에서 수득한 실험군 14의 생약성분과 상기 실시예 2-1에서 수득한 난황항체를 다양한 비율로 혼합하여 각각의 혼합 조성물을 수득하고, 상기 수득한 조성물을 하루에 500g씩 산란계에 투여하는 것을 제외하고는, 실시예 1의 방법을 수행하여, 각 분변에 포함된 각 세균수의 상대적인 비율을 비교하였다(참조: 표 3a). 이때, 대조군으로는 생약성분을 투여하지 않고, 대장균 및 살모넬라만을 투여한 산란계를 사용하였다.
생약성분 및 난황항체를 포함하는 조성물이 투여된 산란계의 분변에 포함된 대장균과 살모넬라의 상대적 비율
혼합비(생약성분:난황항체, 중량%) |
대장균 |
살모넬라균 |
대조군 10:0 9:1 8:2 7:3 6:4 5:5 4:6 3:7 2:8 1:9 0:10 |
1.0 0.5 0.5 0.5 0.2 0.1 0.3 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 |
1.0 0.5 0.5 0.5 0.3 0.1 0.2 0.4 0.5 0.5 0.5 0.5 |
상기 표 3a에서 보듯이, 생약성분과 난황항체의 혼합비가 7:3(중량%)인 경우 각 균체의 상대적 비율이 급격히 감소하였고, 4:6(중량%)인 경우에 각 균체의 상대적 비율이 급격히 증가하였으므로, 생약성분과 난황항체가 7:3 내지 5:5(중량%)로 혼합된 조성물이 대장균 및 살모넬라의 감염을 효과적으로 예방할 수 있음을 알 수 있었다.