JP2018044038A - リポ多糖、リポ多糖製造方法及びリポ多糖配合物 - Google Patents

Abstract

【課題】従来のリポ多糖と異なる性格を有する優れたリポ多糖、及び該リポ多糖配合物を提供すること。【解決手段】パントエア・バガンスから得られるリポ多糖、パントエア・バガンスからリポ多糖を得るリポ多糖製造方法、及び前記リポ多糖が配合されている医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、又は浴用剤。【選択図】図１

Description

本発明は、リポ多糖、リポ多糖製造方法及びリポ多糖配合物に関する。

リポ多糖はグラム陰性菌の細胞壁の外膜成分のひとつである。最も初めはコレラ菌から発見され、強い炎症を誘導するエンドトキシンとして知られてきた（非特許文献１）。しかし近年、リポ多糖は、環境中にも普遍的に存在し、経口・経皮の自然摂取により、免疫の活性化ひいては、種々の疾患の予防改善効果があることが明らかとなった（非特許文献２）。このため健康食品や化粧品に配合するための、小麦から単離されたパントエア・アグロメランスのリポ多糖（特許文献１）、稲から単離されたエンテロバクター・アスブリエ（古くはパントエア属に分類）のリポ多糖（特許文献２）、柿から単離されたアセトバクター・オキシダンス由来のリポ多糖（特許文献３）が産業化されている。

ところで、リポ多糖はリピドＡと呼ばれる脂質に糖鎖（コア多糖、Ｏ抗原多糖等）が結合した基本構造を持つ。リポ多糖の生物活性は、免疫系細胞等の膜表面にあるリポ多糖受容体であるＴＬＲ４にリピドＡ部分が結合することで起こる。リピドＡや糖鎖の構造は、ＴＬＲ４に結合できる程度には保存されているが、由来する菌の種類により、少しずつ異なる。

リピドＡや糖鎖構造が異なることで化学的性質や体内での動態も違ってくるため、異なる菌由来の新たなＬＰＳ（リポ多糖）は、特徴を持つ食品や化粧品の開発に有益である。

特許第４０２６７２２号公報 特許第５４４９８３４号公報 特許第５６０３５３７号公報

Katsuya INADA、"◆エンドトキシンとは？"、[online]、［平成28年9月10日検索］、インターネット<http://www.asahi-net.or.jp/~CP6K-IND/whatendotoxin.html#label1> C Kohchi、外５名、"Applications of lipopolysaccharide derived from Pantoea agglomerans(IP-PA1) for health care based on macrophage network theory"、Journal of Bioscience and Bioengineering、2006年12月、102(6)、p.485-496

本発明は、新たなリポ多糖を見出し、食品や化粧品などに使用可能な原料として提供することを目的とする。

請求項１に係る本発明のリポ多糖は、パントエア・バガンスから得られることを特徴とする。

請求項２に係る本発明のリポ多糖製造方法は、パントエア・バガンスからリポ多糖を得ることを特徴とする。

請求項３に係る本発明のリポ多糖配合物は、請求項１記載のリポ多糖が配合されていることを特徴とする。

請求項４に係る本発明のリポ多糖配合物は、前記リポ多糖配合物が医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、又は浴用剤であることを特徴とする。

本発明によれば、従来のリポ多糖と異なる性格を有する優れたリポ多糖、及び該リポ多糖配合物を提供することができるので、食品、化粧品分野等において健康に寄与する商品を提供することができる。

図１は、林檎から単離したグラム陰性細菌からの抽出ＬＰＳのＳＤＳ電気泳動を示す図である。 図２は、林檎から単離したグラム陰性細菌ＬＰＳのマクロファージ活性化能を示す図である。

無農薬・無肥料栽培の林檎からのグラム陰性細菌の単離
無農薬・無肥料栽培された林檎の果皮表面を生理食塩水で湿らせた綿棒でこすり、この綿棒を３ｍｌの生理食塩水に浸して撹拌後、１００μｌを寒天培地に塗布した。菌溶液を塗布した寒天培地を、３７℃で１日培養した。

寒天培地に出現した菌コロニーについて、劉の反応、ブドウ糖発酵試験、オキシダーゼ（酸化酵素）活性試験、ＩＤテスト・ＥＢ−２０「ニッスイ」（日水製薬社）を用いて、異なる種類のグラム陰性菌を選択し、１６Ｓ遺伝子配列解析を行って菌の同定を行った。同定の結果、パントエア属菌、シュードモナス属菌、カルトバクテリウム属菌の４種類の菌が確認された。

林檎から単離したグラム陰性細菌からのＬＰＳ抽出
実施例１で同定したうちの４菌株を液体培地に植菌してから、３７℃で培養した。培養後、１．５ｍｌの培養液を遠心分離し、沈殿を回収。沈殿物にＴＡＥ（０．０４Ｍ：Ｔｒｉｓ・ａｃｅｔａｔｅ、０．００１Ｍ：ＥＤＴＡ）、アルカリ溶液を添加し６０℃で７０分処理した。熱処理後、フェノールクロロホルム溶液を加えてから、再度６０℃で１５分処理し、遠心分離してから、上清を回収、プロテイナーゼＫを加えて６０℃で６０分処理した。その後、水、酢酸ナトリウム、エタノールを加え、遠心分離後、沈殿を回収し、水を加えてＬＰＳ簡易精製サンプルを調製した。抽出・簡易精製したＬＰＳを電気泳動で確認した。図１は、ＳＤＳ電気泳動後のゲルを銀染色した後の写真である。レーンＭは分子量マーカー、レーン○1、○8は精製した小麦から単離したグラム陰性細菌ＬＰＳ、レーン○2から○7は、小麦、林檎、柚子から単離したグラム陰性細菌から簡易精製した６種のＬＰＳを電気泳動している。この結果、レーン○5の林檎から単離したグラム陰性細菌３−４株（パントエア・バガンスと同定）由来のＬＰＳが、その他のＬＰＳに比較して、高分子量側ＬＰＳのサイズが小さいことがわかった。

林檎から単離したグラム陰性細菌ＬＰＳのマクロファージ活性化能
ＬＰＳはマクロファージ細胞に働きかける事で、体の免疫力を活性化する。そこで、実施例２と同様の４菌株のＬＰＳについて、ＮＯ産生量を指標として、マクロファージ細胞の活性化能を評価した。

マクロファージ細胞を、９６穴平底プレートに８×１０^４細胞／プレートになるように播種し、３７℃で７時間インキュベートし細胞を接着させた。続いて、各ウエルに２倍用量のＬＰＳ簡易精製サンプルを加え、２４時間３７℃でインキュベートした。培養後、培養上清を別のプレートに移し、グリース試薬を加え、室温で１０分インキュベートし、吸光度計で、ＮＯ産生量を計測した。図２は、その結果を示す。被検ＬＰＳは小麦または林檎から単離したグラム陰性細菌から簡易精製した５種のＬＰＳで、縦軸はそれらのＬＰＳの刺激によりマクロファージから分泌されたＮＯの量を示す。

この結果、林檎から単離したグラム陰性細菌由来のＬＰＳはいずれもＮＯ誘導能をもち、マクロファージ活性化能を持つことが示された。このうち、林檎菌３−４株（パントエア・バガンス）は、すでに産業化されている小麦由来パントエア・アグロメランスと同程度の活性化能を示した。

林檎から単離したグラム陰性細菌ＬＰＳの原料化
実施例２において、分子量分布が、従来のＬＰＳと異なっていたパントエア・バガンス３−４株を選び、２０Ｌジャーファンメンターで培養した。培地（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、酵母エキス、ＮＨ４Ｃｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）１０Ｌに、パントエア・バガンスの前培養液を５％添加し、３０℃、ｐＨ６．５〜７．０、２００〜３００ｒｐｍ、通気量２０Ｌ／ｍｉｎで、４８時間培養した。培養液を加熱処理し、遠心分離した上清から徐々にＬＰＳを精製した。具体的には、上清に活性炭を混和し、遠心分離で活性炭を除去した後に、さらにセライトろ過、膜ろ過を行って食品用ＬＰＳ素材（ＦＬ）を調整した。さらにＦＬからエタノール沈殿を行い、沈殿物を回収、凍結乾燥を経て、化粧品用ＬＰＳ素材（ＣＬ）を得た。

パントエア・バガンスＬＰＳ原料を配合した化粧水の製造
実施例４のように調整したパントエア・バガンスＬＰＳ化粧品用原料を１％配合した化粧水を製造した。全成分は下記のとおりである。

水、BG、グリセリン、ジグリセリン、パントエア/コメヌカ発酵エキス液、ヒアルロン酸Na、シロキクラゲ多糖体、ソルビトール、セリン、グリシン、グルタミン酸、アラニン、リシン、アルギニン、トレオニン、プロリン、ベタイン、PCA-Na、ポリオクタニウム-51、ポリソルベート-20、セルロースガム、PEG-150、1,2-ヘキサンジオール、クエン酸、クエン酸Na、乳酸Na、メチルパラベン、プロピルパラベン

この化粧水について１００人の女性にモニタ試験を行ったところ、半数以上の女性が肌の保湿感が高まり、肌が柔らかくなったと回答し、スキンケア製品に対する有用性が示された。

Claims (4)

1. パントエア・バガンスから得られることを特徴とするリポ多糖。
2. パントエア・バガンスからリポ多糖を得ることを特徴とするリポ多糖製造方法。
3. 請求項１記載のリポ多糖が配合されていることを特徴とするリポ多糖配合物。
4. 前記リポ多糖配合物が医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料、又は浴用剤であることを特徴とする請求項３記載のリポ多糖配合物。