KR102174525B1 - 신규한 판토에아 왈리시 루미테리아 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 미용 개선용 조성물 - Google Patents
신규한 판토에아 왈리시 루미테리아 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 미용 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
신규한 판토에아 왈리시 루미테리아(Pantoea wallisii Lumiteria) 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 미용 개선용 조성물에 관한 것이다.
Description
신규한 판토에아 왈리시 루미테리아(Pantoea wallisii Lumiteria) 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 피부 미용 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부의 색은 주로 피부 속에 존재하는 멜라닌(melanin)이라는 색소의 함량에 의해 결정된다. 멜라닌은 피부의 기저층에 존재하는 멜라닌 생성세포인 멜라노사이트(melanocyte)에 의해 생합성된다. 흑자, 주근깨, 기미, 노인성 각화증 등을 포함하는 과색소침착 장애는 멜라닌 색소의 비정상적 축적과 관련되어 있으며, 이러한 장애를 개선하기 위한 피부 미백제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
멜라닌을 형성하는 주효소인 티로시나아제(tyrosinase)는 티로신(tyrosine)에서 디하이드록시페닐알라닌(3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA, 도파)으로의 전환단계와 이후 단계인 도파(DOPA)에서 도파퀴논(DOPA quinone)으로의 전환단계를 매개한다. 따라서, 티로시나아제의 발현이 증가하면 멜라닌 생성도 증가하게 된다. 반대로 티로시나아제 효소의 활성을 저해하면 멜라닌 생성이 억제되어 피부 미백 효과를 확인할 수 있다. 코직산, 알부틴(arbutin) 및 하이드로퀴논(hydroquinone)과 같은 몇몇 물질이 티로시나아제 억제 활성을 가진 것으로 알려져 있다. 미백제로 가장 많이 사용되는 알부틴은 L-티로신과 경쟁적으로 작용하는 저해제이다. 하지만, 이들은 처방계 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 단점이 있다.
한편, 피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 인간은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충 등을 포함한 다양한 미생물들의 집합소이기도 하다. 미생물들은 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 이들 중, 프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 용어로서 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있으며, 이들은 인체에 다양한 유익한 효능을 나타내는 것으로 보고된 바 있으나, 구체적으로 피부상재균과 피부의 상호관계에 대한 연구는 미비한 실정이다
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 피부생재균인 루미테리아 배양액을 유효성분으로 함유하는 경우보다 피부 미백 및 보습 개선에 더욱 탁월한 효능을 나타냄을 확인하였다.
일 양상은 판토에아 왈리시 루미테리아(Pantoea wallisii Lumiteria) 균주를 제공한다.
다른 양상은 판토에아 왈리시 루미테리아 균주, 그의 파쇄액 또는 그의 배양액을 포함하는 피부 미용 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
일 양상은 판토에아 왈리시 루미테리아(Pantoea wallisii Lumiteria) 균주를 제공한다.
상기 판토에아 왈리시 루미테리아 균주는 2019년 6월 11일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁된 수탁번호 KCCM12560P의 균주일 수 있다.
상기 판토에아 왈리시 루미테리아 균주는 서열번호 1의 16s rRNA를 포함하는 균주일 수 있다.
상기 "판토에아 왈리시 루미테리아"는 세척 및 멸균된 피부 샘플로부터 분리한 것일 수 있다. 상기 균주는 고체배지에서 배양시 연한 노란색의 둥근 콜로니 집락을 형성하며 생장하는 것일 수 있다. 상기 균주를 현미경으로 관찰시 막대 형태의 간균 형태를 나타내고, 비운동성임을 확인한 바 있다.
다른 양상은 상기 판토에아 왈리시 루미테리아 균주의 배양액을 제공한다.
또 다른 양상은 판토에아 왈리시 루미테리아 균주, 그의 파쇄액 또는 그의 배양액을 포함하는 피부 미용 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 판토에아 왈리시 루미테리아 균주, 그의 파쇄액 또는 그의 배양액을 포함하는 피부 미용 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 상술한 바와 동일하다.
본 명세서에서 사용된 용어 "배양액"은 판토에아 왈리시 루미테리아 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 한편, 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의 균주 자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한 균주 자체 또는 상기 균주를 배양하여 배양액으로부터 분리한 균주를 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해 배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
상기 조성물은 판토에아 왈리시 루미테리아 균주의 배양액을 조성물 총 중량에 대하여 0.1 중량% 내지 30 중량%, 예를 들어, 0.1 중량% 내지 25 중량%, 예를 들어, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 예를 들어, 0.1 중량% 내지 18 중량%, 예를 들어, 0.1 중량% 내지 16 중량%, 예를 들어, 0.1 중량% 내지 14 중량%, 예를 들어, 0.5 내지 20 중량%, 예를 들어, 0.5 중량% 내지 18 중량%, 예를 들어, 0.5 중량% 내지 16 중량%, 예를 들어, 0.5 중량% 내지 14 중량%, 예를 들어, 1 중량% 내지 20 중량%, 예를 들어, 1 중량% 내지 18 중량%, 예를 들어, 1 중량% 내지 16 중량%, 예를 들어, 1 중량% 내지 14 중량%, 예를 들어, 예를 들어, 3 중량% 내지 20 중량%, 예를 들어, 3 중량% 내지 18 중량%, 예를 들어, 예를 들어, 3 중량% 내지 16 중량%, 예를 들어, 3 중량% 내지 14 중량%로 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 티로시나아제 활성 또는 발현을 억제시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 티로시나아제 활성 또는 발현을 억제시켜 피부 미백 효과를 나타내는 것일 수 있다.
상기 조성물은 히알루론산 합성 효소 3(HAS3: Hyaluronan synthase 3), 필라그린(filaggrin) 및 클라우딘 1(Claudin 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 히알루론산 합성 효소 3, 필라그린 또는 클라우딘 1의 발현을 증가시켜 피부 장벽 강화 효과 및 피부 보습 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피부 미용 개선"은 피부 미백, 피부 장벽 강화, 또는 피부 보습일 수 있다. 판토에아 왈리시 루미테리아 균주의 배양액은 일반적으로 알려진 미백 성분(예를 들어, 알부틴)에 비해 피부 미백, 피부 장벽 강화 또는 피부 보습 효과가 더 우수하므로, 상기 판토에아 왈리시 루미테리아 균주의 배양액을 포함하는 조성물은 피부 미백, 피부 장벽 강화, 또는 피부 보습용 조성물로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피부 미백"은 멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 조성물은 상기 배양액을 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 추출물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
상기 조성물은 화장품학적으로 또는 식품적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨 토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물을 포함하는 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하다.
상기 식품 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 식품 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부 미용을 개선시키는 방법을 제공한다. 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다.
상기 방법은 구체적으로, 개체의 피부를 미백시키는 방법, 개체의 피부 장벽 기능을 강화시키는 방법, 개체의 피부 수분을 유지 또는 수분 손실을 효율적으로 방지하는 방법일 수 있다.
상기 용어, "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 배양액 또는 배양액 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
상기 투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 균주 배양액의 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 개체의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다.
일 양상에 따른 신규한 판토에아 왈리시 루미테리아(Pantoea wallisii Lumiteria) 균주에 의하면, 균주의 다양한 활성을 응용하여 상기 균주를 피부 미용 개선 용도로 사용할 수 있다.
다른 양상에 따른 피부 미용 개선용 조성물은 상기 판토에아 왈리시 루미테리아 균주의 배양액을 유효 성분으로 포함함으로써 현저히 개선된 피부 미백 및 피부 보습 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 루미테리아 배양액의 멜라닌 생합성 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 2는 루미테리아 배양액의 멜라닌 생합성 억제 효과를 육안으로 확인한 도면이다.
도 3은 루미테리아 배양액의 티로시나아제 활성 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 4는 루미테리아 배양액의 티로시나아제 발현 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 5는 루미테리아 배양액의 보습 인자인 히알루론산 합성 효소 3(HAS3)의 발현 증가 효과를 확인한 도면이다.
도 6는 루미테리아 배양액의 보습 인자인 필라그린(FLG)의 발현 증가 효과를 확인한 도면이다.
도 7는 루미테리아 배양액의 보습 인자인 클라우딘 1(CLD)의 발현 증가 효과를 확인한 도면이다.
도 2는 루미테리아 배양액의 멜라닌 생합성 억제 효과를 육안으로 확인한 도면이다.
도 3은 루미테리아 배양액의 티로시나아제 활성 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 4는 루미테리아 배양액의 티로시나아제 발현 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 5는 루미테리아 배양액의 보습 인자인 히알루론산 합성 효소 3(HAS3)의 발현 증가 효과를 확인한 도면이다.
도 6는 루미테리아 배양액의 보습 인자인 필라그린(FLG)의 발현 증가 효과를 확인한 도면이다.
도 7는 루미테리아 배양액의 보습 인자인 클라우딘 1(CLD)의 발현 증가 효과를 확인한 도면이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 루미테리아 균주의 분리
건강한 여성의 피부를 멸균 증류수로 세척하여 확보된 샘플(human epidermal keratinocyte)을 R2A(Reasoner's 2A) 배지(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종하였다. 접종 후 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 배양한 뒤 형성된 집락 100개를 순수 분리 배양하여, 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 재배양 하였다. 배양이 완료된 집락은 16s rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도록 고안(27F-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG,1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT)되었다. PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다. 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석 하였다. 상동성 97% 이하의 신규성이 있는 종들만 선별하여 사용하였고, 그 중 상동성 94% 이하의 신규 미생물(이하 "루미테리아"라 함)을 선별하였다. 선별된 루미테리아 균주를 2019년 6월 11일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM12560P를 부여받았고, 선별된 루미테리아 균주는 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 서열을 갖는다.
| 균주명 | 16s rRNA 서열 | 서열번호 |
| Pantoea wallisii Lumiteria (KCCM12560P) | GCCGCTTCGCGCGCTACACATGCAGTCGACGGCAGCACAGAAGAGCTTGCTCTTTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCCGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACACCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAGGTTAATAACCTCGCCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGAAACTGGCAGGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATCCAGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTTCGGGAGGGCGCTACCACTTTTGATCAAGTGGTC | 1 |
실시예 2. 선별된 루미테리아 균주의 분류학적 성질 및 균학적 성질 확인
상기 실시예 1에서 선별된 루미테리아 균주는 고체배지에 배양시 연한 노란색상의 둥근 콜로니 집락을 형성하고, 형성된 집락 주변에 점성이있는 물질을 다량 형성하는 것으로 관찰되고, 점액성 물질 생성은 72시간이 되었을 때 최대가 됨을 확인하였다. 또한, 루미테리아 균주는 현미경 관찰시 막대형태의 간균 형태를 띄고 있고, 비운동성인 것을 확인하였다.
실시예 3. 루미테리아 배양액의 제조
루미테리아 균주 배양액은 TSA 배지를 사용하여 50 ml 튜브에 증균 배양을 실시함으로써 제조하였다. 이때 증균 배양은 100 rpm/분으로 균주를 현탁하여 배양하였으며, 암 조건이 지속되는 조건 하에서 배양이 진행되었다. 상기 배양기간 동안의 온도는 약 35℃로 유지하였으며, 약 72시간 배양 후, 배양을 종료하였다. 이후, 상기 배양액은 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 필터 멸균을 실시하여 루미테리아 배양액을 제조하였다.
실험예 1. 루미테리아 배양액의 멜라닌 생합성 억제 효과 확인
쥐의 색소 세포인 B16-F10(Murine Melanoma) 세포(ATCC)를 10% FBS를 포함하는 DMEM(HYCLONE) 2 ml에 현탁시켜 웰당 1×105 세포로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 세포가 웰 바닥에 40~50% 부착될 때까지, 5% CO2, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH: α-melanocyte stimulating hormone)을 0.1 μM 농도로 처리하여 멜라닌 생성을 유도하고, 루미테리아 배양액을 1% 또는 10% 농도로 첨가한 후, 37 ℃에서 72시간 동안 배양하였다. 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴(100 ppm, Sigma aldrich)을 양성 대조군으로 사용하였다. 추가 배양 후, 인산완충생리식염수(PBS: phosphate buffered saline, WELGENE)로 세척하고, 트립신(trypsin, Gibco)으로 회수하였다. 그 다음, 혈구계(hematocytometer, MARIENFELD)로 계수하여, 각 처리 그룹별로 동일한 세포 수(1×106 세포/mL)를 모아 1000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 세포만 얻었다. 회수된 세포를 60 ℃에서 1 시간 건조시킨 후, 10% DMSO가 포함된 1M NaOH 용액(Sigma aldrich) 100 μL를 넣어 세포 내의 멜라닌을 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액을 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, victor3)로 490 nm에서 흡광도를 측정하여, 멜라닌 생성 저해율을 평가하였다. 평가식은 하기 계산식 1과 같으며, 그 결과는 하기 표 2 및 도 1 및 도 2에 나타내었다.
[계산식 1]
Melanin contents(%)=(각 시료 처리군의 흡광도)/(α-MSH 처리군의 흡광도)×100(%)
| α-MSH 0.1 μM | |||
| 대조군 | 알부틴 | 루미테리아 1% | 루미테리아 10% |
| 100% | 53.25% | 43.54% | 46.05% |
그 결과, 도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, α-MSH만이 처리된 대조군의 멜라닌 생성량을 100%로 하였을 때, 루미테리아 배양액을 1% 및 10% 농도로 처리한 경우, 기존에 멜라닌 생성 억제 물질로 알려진 알부틴 보다 멜라닌 생성 억제 효과가 더 우수함을 확인하였다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 원심분리하여 수득된 세포의 색 변화를 육안으로 관찰한 결과, α-MSH만이 처리된 대조군과 비교하여, 루미테리아 배양액을 1% 및 10% 농도로 처리한 경우 확연한 색 감소를 나타내며, 양성 대조군인 알부틴 보다도 옅은 색을 나타냄을 확인하였다.
실험예 2. 루미테리아 배양액의 티로시나아제 활성 억제 효과 확인
쥐의 색소 세포인 B16-F10 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 2 ml에 현탁시켜 웰당 1×105 세포로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 세포가 웰 바닥에 40~50% 부착될 때까지, 5% CO2, 37 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, α-MSH를 0.1 μM 농도로 처리하고 루미테리아 배양액을 1% 또는 10% 농도로 첨가한 후, 37 ℃에서 72시간 동안 배양하였다. 알부틴을 양성 대조군으로 사용하였다. 추가 배양 후, 인산완충생리식염수로 세척하고, 트립신으로 회수하였다. 그 다음, 10000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 회수된 세포를 프로테아제 억제제(protease inhibitor, Sigma aldrich)가 포함된 RIPA 완충액(Radioimmunoprecipitation assay buffer)으로 37 ℃에서 1시간 세포를 용해하였다. 다시 한번 10000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상층액을 취하고, Brad Ford(Biorad)를 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 각 샘플 별 20 μg의 단백질과 2 mM L-DOPA(sigma) 180 μL를 혼합하고 인산완충생리식염수으로 총 200 μL가 되도록 최종 용량을 맞춰 96-웰 마이크로플레이트(96-well microplate)에 넣은 후 37 ℃에서 90분 동안 반응시켰다. 반응 후, 티로시나제 활성을 490 nm에서 흡광도를 측정하여, 티로시나아제 활성 저해율을 평가하였다. 평가식은 하기 계산식 2와 같으며, 그 결과는 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.
[계산식 2]
티로시나아제 활성(%)=(각 시료 처리군의 흡광도)/(α-MSH 처리군의 흡광도)×100(%)
| α-MSH 0.1 μM | |||
| 대조군 | 알부틴 | 루미테리아 1% | 루미테리아 10% |
| 100% | 70.13% | 37.71% | 18.62% |
그 결과, 도 3 및 표 3에 나타낸 바와 같이, α-MSH만이 처리된 대조군의 티로시나아제 활성을 100%로 하였을 때, 루미테리아 배양액을 1% 및 10% 농도로 처리한 경우 티로시나아제 활성을 유의적으로 억제하였으며, 이는 양성 대조군인 알부틴 훨씬 더 우수한 효과임을 확인하였다.
실험예 3. 루미테리아 배양액의 티로시나아제 발현 억제 효과 확인
루미테리아 배양액의 티로시나아제 유전자 발현 억제 효과를 측정하기 위하여, 쥐의 색소 세포인 B16-F10 세포에서 다음과 같은 조건으로 실험하였다. 쥐의 색소 세포인 B16-F10 세포를 10 % FBS를 포함하는 DMEM 2 ml에 현탁시켜 웰당 1Х105 세포로 6-웰 플레이트에 접종한 후, 세포가 웰 바닥에 40~50 % 부착될 때까지, 5% CO2, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양 후, α-MSH를 0.1 μM 농도로 처리하고 루미테리아 배양액을 1% 또는 10% 농도로 첨가한 후, 37 ℃에서 72 시간 동안 배양하였다. 알부틴을 양성 대조군으로 사용하였다. 그 후 각 시료의 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 나노드랍(nanodrop)으로 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad). 합성된 cDNA에 타겟 유전자인 티로시나아제 프라이머와 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermix, Applied Biosystems)을 첨가한 혼합물을 이용하여 실시간 PCR(RT-PCR) 기기에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 티로시아나제 유전자의 발현 정도를 확인하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하고 분석 결과를 도 3에 나타내었다. 상기 실험에서 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 4에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 방향 | 프라이머 서열 | 서열번호 |
| Tyrosinase | 정방향 | TTACAGCTGACAAGGGTCTT | 2 |
| 역방향 | ACATACCTTGAACCGCTAGA | 3 | |
| β-actin | 정방향 | CGGTTCCGATGCCCTGAGGC | 4 |
| 역방향 | CGTCACACTTCATGATGGAA | 5 |
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, α-MSH만이 처리된 대조군의 티로시나아제의 상대적인 발현 수준을 1.0로 하였을 때, 루미테리아 배양액을 1% 및 10% 농도로 처리한 경우 티로시나아제의 상대적인 발현 수준은 0.1 미만으로 티로시나아제 발현을 유의적으로 억제하였으며, 이는 양성 대조군인 알부틴 보다 더 효과적으로 티로시나아제의 발현을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실험예 4. 루미테리아 배양액의 보습 인자 발현 촉진 효과 확인
루미테리아 배양액의 보습 인자 유전자의 발현 촉진 효과를 측정하기 위하여, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃ 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 루미테리아 배양액 1 % 또는 10 % 농도로 처리하였다. 보습 인자인 HAS3(hyaluronic acid synthase 3)의 발현 증가를 유도하는 양성 대조군으로 레티놀을 1 Μm을 처리하였다. 이후, HaCaT 세포를 24시간 동안 추가로 배양한 후, 각 시료의 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 나노드랍으로 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad). 합성된 cDNA에 피부 장벽 강화 및 보습과 관련된 인자인 HAS3, 필라그린(FLG: filaggrin), 클라우딘 1(CLD: clauadin 1) 프라이머와 시아닌 염료인 사이버그린을 첨가한 혼합물을 이용하여 RT-PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 HAS3, FLG 및 CLD 유전자의 발현 정도를 확인하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하고 분석 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다. 사용한 프라이머는 하기 표 5에 나타내었다.
| 유전자 | 프라이머 방향 | 프라이머 서열 | 서열번호 | |
| HAS3 | 정방향 | CTTAAGGGTTGCTTGCTTGC | 6 | |
| 역방향 | GTTCGTGGGAGATGAAGGAA | 7 | ||
| Filaggrin | 정방향 | AGTGCACTCAGGGGGCTCACA | 8 | |
| 역방향 | CCGGCTTGGCCGTAATGTGT | 9 | ||
| Claudin 1 | 정방향 | GCTCTAGAATTCCGAGCGAGTCATGGCCAACGC | 10 | |
| 역방향 | GCTCTAGAATTCTCACACGTAGTCTTTCCCGCT | 11 | ||
| β-Actin | 정방향 | GGCCATCTCTTGCTCGAAGT | 12 | |
| 역방향 | GACACCTTCAACACCCCAGC | 13 | ||
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, α-MSH만이 처리된 대조군의 HAS3의 상대적인 발현 수준을 1.0로 하였을 때, 루미테리아 배양액을 1% 농도로 처리한 경우 약 2.5배로 HAS3 발현을 증가시켰으며, 특히 루미테리아 배양액을 10% 농도로 처리한 경우 약 5배로 HAS3 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, α-MSH만이 처리된 대조군의 FLG의 상대적인 발현 수준을 1.0로 하였을 때, 루미테리아 배양액을 10% 농도로 처리한 경우 약 25배로 FLG 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인하였다.
또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, α-MSH만이 처리된 대조군의 CLD의 상대적인 발현 수준을 1.0로 하였을 때, 루미테리아 배양액을 1% 농도로 처리한 경우 약 2배로 CLD 발현을 증가시켰으며, 특히 루미테리아 배양액을 10% 농도로 처리한 경우 약 4배로 CLD 발현을 유의적으로 증가시켰음을 확인하였다.
상기 결과로부터, 루미테리아 배양액은 피부 보습 주요 인자인 HAS3, 필라그린, 클라우딘 1 유전자의 발현을 유의적으로 증가시킴으로써, 우수한 피부 보습 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
이상의 결과로부터, 상기 화장료 조성물은 루미테리아 배양액을 유효성분으로 포함함으로써, 현저히 증가된 피부 미백 효과 및 피부 보습 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
<110> Cosmax INC.
<120> Novel strain of Pantoea wallisii Lumiteria, and composition for
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<211> 1447
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pantoea wallisii Lumiteria (KCCM12560P) 16s rRNA
<400> 1
gccgcttcgc gcgctacaca tgcagtcgac ggcagcacag aagagcttgc tctttgggtg 60
gcgagtggcg gacgggtgag taatgtctgg gaaactgccc gatggagggg gataactact 120
ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gtgggggacc ttcgggcctc 180
acaccatcgg atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaatggc tcacctaggc 240
gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga cacggtccag 300
actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct gatgcagcca 360
tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg aggaaggcgg 420
tgaggttaat aacctcgccg attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc taactccgtg 480
ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg 540
cacgcaggcg gtctgttaag tcagatgtga aatccccggg cttaacctgg gaactgcatt 600
tgaaactggc aggcttgagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat 660
gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa gactgacgct 720
caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780
gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg cgtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg 840
accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca 900
agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttacctg gccttgacat 960
ccagagaact tagcagagat gctttggtgc cttcgggaac tctgagacag gtgctgcatg 1020
gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta 1080
tcctttgttg ccagcgattc ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga taaaccggag 1140
gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacggc cagggctaca cacgtgctac 1200
aatggcgcat acaaagagaa gcgacctcgc gagagcaagc ggacctcata aagtgcgtcg 1260
tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag taatcgtaga 1320
tcagaatgct acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1380
agtgggtgca aaagaagtag gtagcttaac ctttcgggag ggcgctacca cttttgatca 1440
agtggtc 1447
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyrosinase primer_forward
<400> 2
ttacagctga caagggtctt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tyrosinase primer_reverse
<400> 3
acataccttg aaccgctaga 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin primer_forward
<400> 4
cggttccgat gccctgaggc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta-actin primer_reverse
<400> 5
cgtcacactt catgatggaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAS3 primer_forward
<400> 6
cttaagggtt gcttgcttgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HAS3 primer_reverse
<400> 7
gttcgtggga gatgaaggaa 20
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<212> DNA
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<220>
<223> filaggrin primer_forward
<400> 8
agtgcactca gggggctcac a 21
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<220>
<223> filaggrin primer_reverse
<400> 9
ccggcttggc cgtaatgtgt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Claudin 1 primer_forward
<400> 10
gctctagaat tccgagcgag tcatggccaa cgc 33
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<212> DNA
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<220>
<223> Claudin 1 primer_reverse
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gctctagaat tctcacacgt agtctttccc gct 33
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ggccatctct tgctcgaagt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> beta actin primer_reverse
<400> 13
gacaccttca acaccccagc 20
Claims (9)
- 판토에아 왈리시 루미테리아(Pantoea wallisii Lumiteria) 균주로서 수탁번호 KCCM12560P로 기탁된 균주.
- 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 유전자를 갖는 것인 균주.
- 청구항 1의 균주의 배양액.
- 판토에아 왈리시 루미테리아 균주로서 수탁번호 KCCM12560P로 기탁된 균주, 그의 파쇄액, 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 미용 개선용 화장료 조성물.
- 삭제
- 청구항 4에 있어서, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 것인 피부 미용 개선용 화장료 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 조성물은 히알루론산 합성 효소 3(HAS3: Hyaluronan synthase 3), 필라그린(filaggrin) 및 클라우딘 1(Claudin 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자 발현을 증가시키는 것이거나, 티로시나아제(tyrosinase)의 활성 또는 발현을 억제시키는 것인 피부 미용 개선용 화장료 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 피부 미용 개선은 피부 장벽 강화, 피부 보습 또는 피부 미백인 것인 피부 미용 개선용 화장료 조성물.
- 판토에아 왈리시 루미테리아 균주로서 수탁번호 KCCM12560P로 기탁된 균주, 그의 파쇄액, 또는 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부 미용 개선용 식품 조성물.
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