KR20210051882A

KR20210051882A - 해양 유래 신규 미생물 렌티스페라 아라네오사 및 이를 이용한 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20210051882A
Application number: KR1020190137718A
Authority: KR
Inventors: 심규영; 윤석균; 이동걸; 노윤화; 강승현; 박명삼
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2021-05-10
Also published as: KR102284168B1

Abstract

일 양상에 따른 렌티스파이라 속 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 조성물에 의하면, 상기 균주 또는 이의 배양액은 피부 보습 효과가 우수하고, 피부 장벽을 강화시킬 수 있다. 또한 콜라겐 분해 억제 또는 콜라겐 생성 증가를 통한 항노화 효과, 멜라닌 생성 억제를 통한 미백 효과가 탁월하므로 피부 개선용 화장료 조성물, 피부외용제용 조성물 등에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

해양 유래 신규 미생물 렌티스페라 아라네오사 및 이를 이용한 화장료 조성물{A novel bacterium from marine resources, Lentisphaera araneosa, cosmetic compositions using the same}

신규한 렌티스페라 속 균주 및 이의 배양액을 포함하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.

피부장벽은 죽은 각질세포와 세포 간 지질로 구성되어 있고, 외부 자극으로부터 피부를 보호하며 피부에서 수분이 증발하는 것을 막아주는 피부 보호막이며, 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 보다 구체적으로, 체내에서 지나친 수분 방출을 막고 화학물질이나 미생물처럼 해로운 물질이 우리 몸 안으로 들어오는 것을 막아준다.

이러한 피부장벽은 노화와 같은 요소에 의해 파괴 또는 손상되어 피부에 주름살, 쳐짐 및 수분량 감소로 인한 건조가 유발될 수 있다. 따라서, 피부장벽을 보호하고 노화 및 수분 손실을 방지하는 조성물의 연구가 활발한 실정이다.

피부장벽과 관련하여 중요한 요소들은 다음과 같다.

각질형성세포는 분화를 통해 각질화 과정을 통해 피부 장벽을 만든다. 피부 장벽 기능은 노화가 진행되거나 외부 요소들에 의해 파괴될 수 있으며, 피부 장벽의 손상은 피부 수분량 감소와 주름을 일으킬 수 있다.

또한 최근 피부장벽에 중요한 요소로서 주목받고 있는, 밀착연접(tight junction)은 세포연접의 한 종류로 occludin, claudin, zona occluden(ZO) 등으로 구성되어 있다. 밀착연접은 세포막에 포함된 부분과 세포내 부분으로 나눌 수 있는데, occludin과 claudin은 세포막에 포함된 밀착연접 구성 단백질이다. 이러한 밀착연접은 세포 간의 연결고리로 이웃한 세포와 세포 사이의 간격을 메워주고 작은 물질들의 이동을 조절하는 역할도 담당한다. 이러한 밀착연접은 피부 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있다는 연구결과가 있다(Aileen S. et al., Journal of Cell Science, 122 (9), 1285, 2009).

아쿠아포린은 물 분자만을 선택적으로 통과시키며 모든 세포막에 존재하는 막관통단백질로 피부의 수분 흡수를 증가시키는 기작이 있다. 포유동물에서는 13가지 종류가 알려져 있고, 이들 중 아쿠아포린3은 피부의 각질형성세포에서 발현하며 아쿠아포린3을 통한 물과 글리세롤의 흡수와 이동은 세포의 수분 손실을 방지해 피부 탄력을 증가시킨다. (Ji Li et al., Australasian Journal of Dermatology, 51, 106, 2010)

노화된 피부에서 나타나는 주름살과 피부의 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등은 대부분 진피에 존재하는 기질단백질의 변화 때문이다. 진피는 피부 내에서 피부의 강도와 형태를 지지하는 역할을 하고 있기 때문에 노화가 진행될 때 이 부분에 형태적인 변화가 일어나게 되면 주름 생성 및 피부 쳐짐에 결정적인 역할을 하게 된다. 이러한 기질단백질을 분해하는 효소로 Matrix metalloproteinases (MMPs)가 대표적이며 한 번의 자외선 조사에도 피부 내의 MMPs 활성이 증가 되고, 피부 내의 콜라겐 및 기타 기질단백질을 현저하게 분해시켜 피부 노화를 촉진하는데 주요한 요인으로 작용한다.

사람의 피부색을 결정하는 요인들에는 멜라닌, 각질층의 두께, 말초혈관과 혈색소, 카로틴 등이 있지만 이들 중 피부 색깔을 결정하는 가장 중요한 요인은 멜라닌이다. 멜라닌 색소를 생성하는 멜라닌생성세포의 수는 민족이나 피부색에 관계없이 일정하지만, 멜라닌화의 정도, 멜라닌 소체의 크기와 수 그리고 분포상태, 각질형성 세포 내에서의 멜라닌 소체의 분해능 등이 달라서 피부색의 차이가 나타난다고 알려져 있다(이승헌 등, 피부 장벽학, 여문각, 2010)

'거미줄처럼 생긴 점액성 물질을 분비하는 둥근 모양의 세균'이라는 뜻을 가진 렌티스페라 아라네오사(Lentisphaera araneosa)는 점액성 물질을 생산하는 해양 미생물이다. 이 미생물의 DNA 정보를 분석한 결과 진화의 정도와 계통의 유사도가 기존의 문들과 현저히 달라'렌티스페레(Lentisphaerae)'라는 새로운 문으로 명명되었다. 이처럼 신규성을 갖고 있는 렌티스페라 아라네오사 균주에 대한 연구는 많이 진행되지 않았으며, 특히 렌티스페라 균주를 화장품 등의 피부 미용 개선 용도로 사용한 연구는 전무하다.

이에, 본 발명자들은 상기 신규한 균주 또는 이의 배양액이 피부 보습 효과가 우수하고, 피부 장벽을 강화 효과가 있음을 발견하였다. 보다 구체적으로, 상기 신규한 균주 또는 이의 배양액이 콜라겐 분해 억제 또는 콜라겐 생성 증가를 통한 항노화 효과, 멜라닌 생성 억제를 통한 미백 효과가 탁월함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 렌티스페라 아라네오사(Lentisphaera araneosa) 균주를 제공한다.

다른 양상은 렌티스페라 아라네오사(Lentisphaera araneosa) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부미용 개선용 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 렌티스페라 아라네오사(Lentisphaera araneosa) 균주를 배양하는 단계; 배양 후 얻어진 균체 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 및 회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 제거하는 단 를 포함하는 렌티스페라 아라네오사 균주 배양액을 제조하는 방법을 제공한다.

일 양상은, 본 발명은 수탁번호 KCTC No. 12141로 기탁된 미생물 렌티스페라 아라네오사(Lentisphaera araneosa)를 제공한다.

상기 균주는 태평양 연안의 해역에서 수심 30~50m 부근의 해수 샘플을 채취하여 분리한 것일 수 있다. 상기 균주는 해수 샘플을 Artificial seawater(ASW) artificial seawater medium (ASW; 30 g NaCl, 1.0 g MgCl₂·6H₂O, 4.0 g Na₂SO₄, 0.7 g KCl, 0.15 g CaCl₂·2H₂0, 0.5 g NH₄Cl, 0.2 g NaHCO₃, 0.1 g KBr, 0.27 g KH₂PO₄, 0.04 g SrCl₂·6H₂O, 0.025 g H₃BO₃, 0.001 g NaF, 10 ml Tris-Cl (pH 8.0), and 1 ml of SN trace metal solution (Waterbury et al., 1986) per 1 litre deionized water)에 접종하여 배양된 콜로니를 순수 분리 배양하는 방법에 의해 분리된 균주일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 피부미용 개선은 피부 장벽 강화, 피부 보습, 자외선에 의한 피부 노화 예방 또는 개선용, 피부 주름 예방 또는 개선, 또는 피부 미백 개선을 의미하는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물의 피부보습 및 피부장벽강화 효과를 확인한 결과, 피부 수분 유지 기능을 수행하는 세포외 기질성분인 히알루론산의 합성을 담당하는 유전자인 HAS3 및 피부 표면에서 보습을 담당하는 천연보습 인자의 전구 단백질 유전자인 filaggrin의 발현량을 증가시키는 것을 확인하였다.

용어, "피부 장벽 강화"란 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.

용어, "피부 보습"이란 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.

용어, "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라게나제 활성을 억제하여 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.

용어, “자외선에 의한 피부 노화 예방 또는 개선용”란 자외선에 의한 피부 손상을 억제하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 상기 자외선에 의한 피부 노화 예방 또는 개선 작용에 의해 결과적으로 피부 노화가 예방, 개선, 또는 억제될 수 있다.

용어, "피부 미백"이란 멜라닌의 합성을 저해하여 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.

용어, "개선"이란 상태의 완화 도는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든행위를 의미할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 균주는 렌티스페라 아라네오사(Lentisphaera araneosa) (수탁번호: KCTC No. 12141)일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 것일 수 있다.

상기 배양액은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 15 중량%, 0.01 중량% 내지 13 중량%, 0.01 중량% 내지 12 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.1 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 3 중량%, 0.1 중량% 내지 2중량%로 포함될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 아쿠아포린3, 히알루론산 합성효소(Hualuronic acid synthase-3: HAS3), 필라그린(Filaggrin) 또는 클라우딘의 발현을 증가시켜 피부 미용을 개선하는 것일 수 있다. 예를 들어, 피부 장벽 강화 효과 및 보습 효과 강화를 나타내는 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 COLIA1(collagen type I alpha1) 발현을 증가시켜 피부 미용을 개선하는 것일 수 있다. 예를 들어, 광노화에 의한 피부 노화 예방 또는 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 발현을 감소시켜 피부 미용을 개선하는 것일 수 있다. 예를 들어, 광노화에 의한 피부 노화 예방 또는 개선 효과를 나타내는 것일 수 있다.

일 구체예에 따른 조성물은 상기 배양액을 유효한 양, 또는 유효 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환 내지 상태의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 추출물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 투여 기간, 상기 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 다른 조성물을 포함한 요소 및 기타 생리 내지 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

일 구체예에 따른 피부미용 개선용 조성물은 화장품학적으로, 식품적으로, 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 조성물은 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 또는 피부외용제일 수 있다. 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다.

상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.

상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.

일 구체예에 따른 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 이 경우, 배양액은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물을 포함하는 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 더 포함할 수 있다. 상기 보습제 등의 추가 성분의 배합량은 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 당업자가 용이하게 선정 가능하며, 그 배합량은 조성물 전체 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.

일 구체예에 따른 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 이 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 식품 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 유제, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제 등의 일반적인 제형으로 제조될 수도 있고, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 젤리, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등의 임의의 건강식품 형태로 제조될 수도 있다. 상기 건강식품의 제제화를 위해 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 첨가제로서 각종 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 이외에도 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 첨가제의 비율은 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 5 중량%, 구체적으로 0.01 내지 3 중량%일 수 있다.

상기 식품 조성물 중의 상기 배양액의 함량은 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 10 g, 구체적으로 0.3 내지 1 g의 비율로 함유할 수 있다.

상기 음료는 상기 추출물 이외의 다른 성분을 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 음료에 사용되는 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 더 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물로는 단당류(예: 포도당, 과당 등), 이당류(예: 말토즈, 수크로즈 등), 다당류(예: 덱스트린, 시클로덱스트린 등)와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 함유될 수 있다. 또한, 향미제로서 천연 향미제(예: 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 향미제(예: 사카린, 아스파탐 등)를 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 음료 100 mL 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 구체적으로 약 5 내지 12g으로 함유될 수 있다.

일 구체예에 따른 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은 피부 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약학 조성물일 수 있다. 상기 피부 질환은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증, 아토피 피부염일 수 있다. 용어, “예방”은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, “치료”는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.

상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에 따른 약학 조성물은 아쿠아포린3, 히알루론산 합성효소(Hualuronic acid synthase-3: HAS3), 필라그린(Filaggrin) 또는 클라우딘의 발현을 증가시켜 피부 장벽 기능을 강화하여 피부 장벽 기능 손상을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 구체예에 따른 약학 조성물은 COLIA1(collagen type I alpha1) 발현을 증가시켜 발현을 증가시켜 피부 장벽 기능을 강화하여 피부 장벽 기능 손상을 예방 또는 노화를 개선할 수 있다.

일 구체예에 따른 약학 조성물은 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 발현을 감소시켜 피부 장벽 기능을 강화하여 피부 장벽 기능 손상을 예방 또는 노화를 개선할 수 있다.

상기 피부 노화는 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 상처 치유 능력의 저하, 피부 면역 기능의 저하 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 약학 조성물은 피부 장벽 강화, 피부 수분 유지, 피부 수분 손실 방지, 피부 세포 재생, 항산화 등의 효과에 의해 피부 노화를 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 피부 상처 또는 피부 흉터는 피부 세포가 재생, 분화, 증식되어 잃어버렸던 연속성을 다시 유지하거나, 반흔의 교원질 합성을 방해하고 교원질 분해를 촉진하여 개선 또는 치유될 수 있는 모든 질환을 의미할 수 있다. 예를 들어, 타박상, 찰과상, 열상 등의 상처, 비후성 반흔, 켈로이드 반흔 등의 흉터를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 약학 조성물은 피부 수분 유지, 피부 수분 손실 방지, 피부 세포 재생, 항염증 등의 효과에 의해 피부 상처 또는 피부 흉터를 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 피부 염증 질환은 면역 자극에 의해 유발되는 모든 질환을 의미할 수 있다. 예를 들어, 아토피성 피부염, 습진, 지루성 피부염, 건선, 여드름 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 구체예에 따른 약학 조성물은 피부 장벽 강화, 피부 수분 유지, 피부 수분 손실 방지, 항염증, 항아토피 등의 효과에 의해 피부 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

다른 양상은 상기 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체의 피부미용을 개선시키는 방법을 제공한다. 상기 조성물에 대해서는 상술한 바와 동일하다.

상기 방법은 구체적으로, 개체의 피부 장벽 기능을 강화시키는 방법, 개체의 피부 수분을 유지 또는 수분 손실을 효율적으로 방지하는 방법, 개체의 피부 세포를 재생하는 방법, 개체의 피부 활력을 증가시키는 방법, 개체 내 항산화 작용을 증진시키는 방법, 개체의 염증을 개선 또는 치료하는 방법, 개체의 아토피 피부염을 개선, 치료 또는 예방하는 방법일 수 있다.

용어, "투여하는", "도입하는" 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다. 일 구체예에 따른 조성물의 배양액 또는 배양액 성분의 적어도 일부를 생존하는 개체 내에서 원하는 위치로 전달하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.

투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 세포 재생, 피부 활력 증가, 항산화, 항염증, 또는 항아토피 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.

상기 투여는 상기 균주 배양액을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.

상기 조성물 및 균주에 대해서는 상술한 바와 동일하다.

일 실시예에 있어서, 상기 배양액은 아쿠아포린3, 히알루론산 합성효소(Hualuronic acid synthase-3: HAS3), 필라그린(Filaggrin) 또는 클라우딘(Claudin)의 발현을 증가시키거나, MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 발현을 감소시켜 피부 미용 개선에 도움이 되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법에 의해 제조된 후시디움 코씨네움 균주 배양액은 화장품, 식품, 약학 조성물 등 다양한 용도로 이용되는 것일 수 있다.

도 1는 렌티스피라 배양액 처리 시 AQP3 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 2는 렌티스피라 배양액 처리 시 HAS3 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 3은 렌티스피라 배양액 처리 시 Filaggrin 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 4는 렌티스피라 배양액 처리 시 Claudin 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 5는 UVB 조사 후, 렌티스피라 배양액 처리 시 MMP-1 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 6는 UVB 조사 후, 렌티스피라 배양액 처리 시 Collagen 1 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 7는 렌티스피라 배양액 처리 시 Collagen 1 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 8는 렌티스피라 배양액 처리 시 멜라닌 생성 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예 및 실험예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예 및 실험예에 한정되는 것으로 해석 되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.

실시예 1: 렌티스피라 채취 및 배양액의 제조

1.1 렌티스피라 채취 방법

렌티스피라 균주는 태평양 연안의 해역에서 수심 30~50m 부근의 해수 샘플을 채취하여 분리하여 취득한다. 보다 구체적으로, 상기 균주는 해수 샘플을 Artificial seawater(ASW) artificial seawater medium (ASW; 30 g NaCl, 1.0 g MgCl2·6H2O, 4.0 g Na2SO4, 0.7 g KCl, 0.15 g CaCl2·2H20, 0.5 g NH4Cl, 0.2 g NaHCO3, 0.1 g KBr, 0.27 g KH2PO4, 0.04 g SrCl2·6H2O, 0.025 g H3BO3, 0.001 g NaF, 10 ml Tris-Cl (pH 8.0), and 1 ml of SN trace metal solution (Waterbury et al., 1986) per 1 litre deionized water)에 접종하여 배양하였다.

1.2 렌티스피라 배양액의 제조

렌티스피라 배양액을 만들기 위해 Marine broth 배지를 121℃에서 15분 간 고압멸균을 실시하였다. 다음으로, 28℃에서 냉각시킨 다음, 1.0*10⁴의 세균수가 되도록 1% 접종하였다. 접종 후 100rpm 교반배양을 20일 배양을 실시하였다. 배양을 마친 뒤, pH가 6.5(오차± 0.2)가 형성되는지 확인하였으며, 이 때 육안상 연한 회색임이 확인되면 배양을 마치고 0.2㎛필터(밀리포어) 제균을 실시하였다. 필터가 완료되면 2주간 성상변화를 확인하고 사용하였다.

실시예 2: 인간피부 각질형성세포주 HaCaT 세포 배양

HaCaT는 인간피부의 구성 세포주인 각질형성세포의 일종으로서, 상기 HaCaT는 10% fetal bovine serum (FBS)과 항생제가 들어있는 DMEM 배양액을 사용하여 배양하였다. 배양 용기는 75T-flask와 6 well plate를 사용하였으며 5% CO₂가 공급되는 37℃ 배양기를 이용하여 배양하였다. 배양액은 3~4일마다 교환하였으며, 세포가 과다하게 증식되었을 때는 계대 배양 하였다. 보다 구체적으로, HaCaT(5*10^5/well)을 분주하고 배양 24 시간 후, 인산 완충 식염수 용액(PBS)로 세척하고, 각 웰에 FBS를 넣지 않은 DMEM 배지에 렌티스피라 배양액을 0.1, 1, 10%가 되도록 희석시켜 각 웰에 첨가한 다음, 24 시간 후 cDNA를 합성하고 PCR을 실시하여 유전자 발현 정도를 평가하였다.

실험예 1: Real-time PCR을 이용한 보습 인자, 장벽 개선 인자 유전자 발현 시험

상기 실시예 1에서 제조한 렌티스피라 배양액의 피부 보습 효능, 피부 장벽 강화 효능을 평가하기 위한 실험을 진행하였다.

구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco’smodified Eagle’s Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 양성 대조군으로서, 레티놀을 1mM 용량으로 처리하였다. 렌티스피라 배양액은 0.1, 1, 10%의 농도로 처리하였다.

이후, HaCaT 세포를 24시간 동안 추가로 배양한 후, 회수하여 트리졸 (RNA iso, DAKARA, 일본) 1㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. 또한, RT-PCR을 위해, Nanodrop 2000 (Thermo, USA)을 이용해 RNA를 정량한 후, 42 ℃ 에서 55 분, 70℃에서 15 분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다(Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 피부 장벽 강화 및 보습과 관련된 인자인 아쿠아포린3 (Aquaporin3), HAS3 (hyaluronic acid synthase3), 필라그린(filaggrin), 클라우딘 1(clauadin 1) 유전자의 발현량을 RT-PCR로 확인하였다. Step One Plus(Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고, 사이버그린(SYBR Green supermix,Applied Biosystems, 미국)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 94℃에서 5분 동안 중합효소를 활성화한 후, 95℃ 30초, 54℃ 1분, 72℃ 1분간 40 사이클로 중합반응 하였다. 사용한 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다. 중합 완료 후 아쿠아포린3, HAS3, 클라우딘 1, 필라그린 유전자의 mRNA 발현량을 β-actin의 mRNA 발현량으로 정규화하여 상대적인 발현량을 계산하였다.

프라이머 이름	서열
Aquaporin3	정방향 5'-AGACAGCCCCTTCAGGATTT-3'
Aquaporin3	역방향 5'-TCCCTTGCCCTGAATATCTG-3'
HAS3	정방향 5'-CTTAAGGGTTGCTTGCTTGC-3'
HAS3	역방향 5'-GTTCGTGGGAGATGAAGGAA-3'
Filaggrin	정방향 5'-TAGTGCACTCAGGGGGCTCACA-3'
Filaggrin	역방향 5'-TCCGGCTTGGCCGTAATGTGT-3'
Claudein1	정방향 5'-GCTCTAGAATTCCGAGCGAGTCATGGCCAACGC-3'
Claudein1	역방향 5'-GCTCTAGAATTCTCACACGTAGTCTTTCCCGCT-3'
β-actin	정방향 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
β-actin	역방향 5'-GACACCTTCAACACCCCAGC-3'

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 렌티스피라 배양액 10% 처리에 따라 아쿠아포린3 발현량이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 아쿠아포린3의 증가는 세포간의 부착과 세포주위 공간을 통한 수분 이동의 조절을 더 효과적으로 수행할 수 있음을 나타냄으로써 보습기능을 강화한다는 것을 의미한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 렌티스피라 배양액 10% 처리에 따라 히아루론산 합성효소(HAS3(Hyaluronic acid synthase-3, HAS3) 발현량이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 따라서 렌티스피라 배양액이 히아루론산 합성에 도움을 줘서 피부 보습기능을 강화한 다는 것을 알 수 있다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 렌티스피라 배양액 10% 처리에 따라 필라그린 발현량이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 필라그린의 증가는 표피층의 증식과 분화의 과정을 통해 완전한 각질층을 만듦을 의미한다. 이를 통하여, 본 발명에서는 렌티스피라 배양액이 피부 장벽 개선을 통해 수분보유능력을 증진시켜 피부 보습에 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 렌티스피라 배양액 10% 처리에 따라 클라우딘 발현량이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 클라우딘은 세포와 세포의 간격을 채워주고 물질 이동을 조절하는 밀착구조물 유전자다. 따라서 렌티스피라 배양액이 피부 세포 장벽을 강화하여 수분보유능력을 증진시켜 피부 보습에 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 2: Real-time PCR을 이용한 MMP-1 저해 효과 및 콜라겐 생성 유전자 발현 시험

상기 실시예 1에서 제조한 렌티스피라 배양액의 피부 항노화 효능을 평가하기 위한 실험을 하였다.

구체적으로, 인간 섬유아세포를 6 well 세포 배양 접시에 4x10⁵ 의 밀도로 접종한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. UVB를 15mJ 조사한 후 각 추출물을 첨가하여 24 시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본) 1 ㎖을 첨가하여 RNA를 분리하였다. 자외선 검출기를 이용하여 260㎚에서 RNA를 정량한 후, cDNA를 합성하였다(Reverse Transcriptase Mix, ELPIS biotech, 한국). RT-PCR은 PCR 기계(Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)를 이용하였고 사이버그린(SYBRGreen supermix, Applied Biosystems, 미국)을 MMP-1 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 어세이하였다. 프라이머와 반응 조건은 하기의 표 2와 같았으며, MMP-1 유전자의 발현양은 β-actin 유전자에 대해 보정을 하여 나타내었다.

프라이머 이름	서열
MMP-1	정방향 5’-CGAATTTGCCGACAGAGATGA-3’
MMP-1	역방향 5’-GTCCCTGAACAGCCCAGTACTT-3’
COL1A1	정방향 5'-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3'
COL1A1	역방향 5'-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3'
β-actin	정방향 5'-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3'
β-actin	역방향 5'-GACACCTTCAACACCCCAGC-3'

도 5에 나타낸 바와 같이, 렌티스피라 배양액 0.1, 1% 처리 시 MMP-1 발현량이 유의적으로 감소함을 확인 할 수 있었다. 또한 도 6에 나타낸 바와 같이, 렌티스피라 배양액 0.1, 1% 처리 시, COL1A1 발현량이 유의적으로 증가함을 확인 할 수 있었다. 따라서 광노화에 의한 피부 노화 예방 또는 개선 효과가 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 3: 렌티스피라 배양액에 의한 색소 세포의 멜라닌 생성 억제효과 측정

쥐의 색소세포(B16 melanoma cells)를 이용하여 렌티스피라 배양액에 의한 멜라닌 생성 억제효과를 측정하였으며, 이를 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 알려진 알부틴(100uM)에 의한 멜라닌 생성 억제효과와 비교하였다.

보다 구체적으로, murine melanoma(B16 F10) 세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM에 현탁시켜 well당 1 × 10⁵ cells 으로 6-well plate에 접종하여 well 바닥에 부착될 때까지 배양한다. 멜라닌 생성 유도를 위하여, 0.1uMα-MSH를 처리하고, 이후 시료를 농도별로 첨가한 후 3일간 배양하였다. 물질 처리의 농도범위는 0.1%, 1%, 10% 로 설정하였다. 멜라닌 생성능 실험의 양성대조군으로 알부틴 100 ppm을 처리하였다. 배양한 세포는 phosphate buffered saline(PBS)으로 씻고 트립신(trypsin)으로 회수하였다. 회수한 세포를 혈구계(hematocytometer)로 계수하여 각 처리 그룹별로 1×10⁶cells/mL로 동일한 세포수가 되도록 모아 1000rpm, 10분간 원심분리하여 세포만을 얻었다. 회수된 세포를 60℃에서 1시간 건조시켜 10% DMSO가 포함된 1M NaOH용액 100 ㎕을 넣어 세포내의 멜라닌을 얻었다. 이 멜라닌 액을 Microplate reader로 490nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성 저해율을 평가하였다.

그 결과를 하기 도 8에 나타내었다. 도 8에서 나타나는 바와 같이, 렌티스피라 배양액 10% 처리시에 멜라닌 양이 감소함을 관찰하였고 미백 효능을 가지고 있음을 증명하였다.

Korean Collection for Type Cultures(KCTC)

KCTC12141

20191029

<110> Cosmax INC. <120> A novel bacterium from marine resources, Lentisphaera araneosa, cosmetic compositions using the same <130> PN129779 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. Aquaporin3. forward <400> 1 agacagcccc ttcaggattt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. Aquaporin3. reverse <400> 2 tcccttgccc tgaatatctg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. HAS3 <400> 3 cttaagggtt gcttgcttgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. HAS3. reverse. <400> 4 gttcgtggga gatgaaggaa 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. Filaggrin, forward <400> 5 tagtgcactc agggggctca ca 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. Filaggrin, reverse <400> 6 tccggcttgg ccgtaatgtg t 21 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. Claudein1, reverse <400> 7 gctctagaat tccgagcgag tcatggccaa cgc 33 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. Claudein1, forward <400> 8 gctctagaat tctcacacgt agtctttccc gct 33 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression.bata-actin. reverse <400> 9 ggccatctct tgctcgaagt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression.bata-actin. reverse <400> 10 gacaccttca acaccccagc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. MMP-1. forward <400> 11 cgaatttgcc gacagagatg a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. MMP-1. reverse <400> 12 gtccctgaac agcccagtac tt 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. COL1A1. forward <400> 13 gagggccaag acgaagacat c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression. COL1A1. reverse <400> 14 cagatcacgt catcgcacaa c 21 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression.bata-actin. reverse <400> 15 ggccatctct tgctcgaagt 20 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primers for measuring gene expression.bata-actin. reverse <400> 16 gctctagaat tctcacacgt agtctttccc gct 33

Claims

렌티스페라 아라네오사(Lentisphaera araneosa) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 피부미용 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 피부미용 개선은 피부 장벽 강화, 피부 보습, 자외선에 의한 피부 노화 예방 또는 개선용, 피부 주름 예방 또는 개선, 또는 피부 미백 개선인 피부미용 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 균주 또는 상기 배양액은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 15 중량%로 포함되는 것인 피부미용 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 아쿠아포린3, 히알루론산 합성효소(Hualuronic acid synthase-3: HAS3), 필라그린(Filaggrin) 또는 클라우딘의 발현을 증가시키는 것인 피부미용 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, COL1A1 발현을 증가시키는 것인 피부미용 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, MMP-1 발현을 감소시키는 것인 피부미용 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 화장품학적으로, 식품적으로, 또는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는 것인 피부미용 개선용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 화장료, 식품, 또는 약학 조성물인 것인 피부미용 개선용 조성물.
렌티스페라 아라네오사(Lentisphaera araneosa) 균주를 배양하는 단계;
배양 후 얻어진 균체 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하는 단계; 및
회수한 상등액을 여과하여 잔존 균체를 제거하는 단계;를 포함하는 렌티스페라 아라네오사 균주 배양액을 제조하는 방법.