WO2005030938A1 - 発酵及び培養方法、植物発酵エキス、植物発酵エキス末並びに該植物発酵エキス配合物 - Google Patents

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Chie Kohchi
Hiroyuki Inagawa
Takashi Nishizawa
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    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Definitions

  • Fermentation and culture method plant fermented extract, plant fermented extract powder, and plant fermented extract blend
  • the present invention relates to mammals including humans (specifically, domestic animals, pets, etc.), birds (specifically, poultry, pets, etc.), amphibians, reptiles, fish (specifically, aquaculture) Fish, pets, etc.), invertebrate drugs, veterinary drugs, quasi-drugs, cosmetics, foods, functional foods, feeds, bath additives, etc. Fermentation and culture method, plant fermentation extract production method, fermented plant-containing extract obtained by fermentation and culture method, immunostimulatory substance-containing powder obtained from the plant fermented extract, and plant fermentation
  • the present invention relates to a fermented plant extract composition containing an extract.
  • fermentation technology using microorganisms is widely used not only in the food field but also in a wide field.
  • wine and other alcoholic beverages, soy sauce and miso, cheese It covers a wide range of fields such as fermented milk products and pharmaceuticals.
  • the microorganisms used in these fermentations are wide-ranging, and representative examples include potato (fungal) yeast and lactic acid bacteria. However, most of those using gram-negative bacteria have been reported.
  • fermentation is a phenomenon in which organic matter is decomposed by the action of microorganisms, and broadly means production of useful substances by microorganisms (Non-patent Document 3).
  • a typical fermentation technology using microorganisms is wine.
  • Wine is a fermentation technique using wine yeast attached to the grape skin, and the product is alcohol.
  • Gram-negative bacteria using methane fermentation using methane bacteria Gram-negative bacteria using methane fermentation using methane bacteria
  • Ryu tongue orchid's rhizome power ethanol fermentation (tequila production) is known, but edible plants are used as raw materials, and fermentation culture using microorganisms characterized by symbiosis exclusively with the plant is mostly known
  • No immunostimulatory substance has been noted as a fermentation product. In fact, fermentation and culture methods aimed at producing immunostimulatory substances have never attracted attention.
  • microorganisms when fermentation is performed with microorganisms, there are generally nutritional conditions that must be satisfied by the fermentation substrate for the growth of microorganisms.
  • the existence of substances that can be used as nutrients by microorganisms such as sufficient monosaccharides such as glucose and fructose, is essential as a carbon source.
  • it can be used as a fermentation substrate without any additional processing, such as fruits that are naturally rich in fructose. Is required.
  • Zymomonasu mobilis is a microorganism that is used in the production of tequila.
  • Non-patent Document 4 there is a document describing that starch cannot be decomposed (Non-patent Document 4).
  • Pantoea agglomerans is a symbiotic bacterium symbiotic to wheat and is considered to be a useful fungus for wheat cultivation because it supplies phosphorus and nitrogen to wheat (Non-patent Document 7).
  • Pantoea agglomerans is attached not only to wheat but also to the skin of pear and apple fruits, and it has been clarified in Europe that mold rot can prevent mold rot.
  • Development is progressing in which fungi are non-toxic and are used as fungicides that are friendly to the natural environment (Non-patent Document 8).
  • the symbiosis is “a phenomenon in which different organisms live together. In this case, a behavior that is mutually active means that a physiologically close connection is constantly maintained!
  • Non-patent Document 9 Non-patent Document 9
  • the low-molecular-weight lipopolysaccharide obtained from this fungus has a preventive effect on various diseases (diabetes, hyperlipidemia, atopic dermatitis, cancer) of human mice, fish, crustaceans and birds. It is found that it is effective in preventing infection (Patent Document 3, Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 3 Non-Patent Document 2.
  • Pantoea agglomerans is cultured at low cost using a medium in which the main component of the protein contained in the culture solution is derived from plants, and the plant components are fermented.
  • Pantoea contained in plants' Agglomerans or materials containing a large amount of fermentation products are prepared and used to make mammals including humans (specifically, domestic animals, pets, etc.), birds (specific , Chickens, pets, etc.), amphibians, reptiles, fish (specifically, aquaculture, pets, etc.), invertebrate drugs, veterinary drugs, quasi drugs, cosmetics, functionalities
  • mammals including humans (specifically, domestic animals, pets, etc.), birds (specific , Chickens, pets, etc.), amphibians, reptiles, fish (specifically, aquaculture, pets, etc.), invertebrate drugs, veterinary drugs, quasi drugs, cosmetics, functionalities
  • wheat flour is a complex organic substance such as starch that exists in wheat grains, but it is separated from the wheat symbiotic microorganism Pantoeia-Agglomerans by the outer skin and has no direct contact.
  • agglomerans can be fermented and cultured with wheat flour cannot be clarified in connection with the fact that microorganisms live together with wheat, and in fact that pantoea agglomerans can assimilate flour Has not been known so far and has never been reported.
  • Pantoea agglomerans cannot use wheat starch as a fermentation substrate.
  • the known technology can be regarded as fermentation, which is simply intended to effectively use the amylase activity of microorganisms, and the growth of microorganisms using starch as a substrate is not planned. Nah ...
  • fermented products are produced in addition to the growth of microorganisms by using starch as the only carbon source, and this example is not a simple fermentation but a fermentation culture. Different.
  • a plant fermented extract containing a large amount of an immunostimulatory substance hereinafter referred to as “pantoair agromerans” and containing flour as a main component
  • Plant fermented extract obtained by fermenting and culturing in a medium is called wheat fermented extract.
  • wheat fermented extract If it can be produced at low cost, as a specific example, human, livestock's aquaculture is safe and environmentally friendly and can prevent infection It should be possible to provide effective medicines, veterinary medicines, quasi drugs, cosmetics, foods, functional foods, feeds and bath preparations.
  • the present invention has been completed by repeating many experiments on the basis of the newly discovered that Pantoea agglomerans grows with flour as a substrate.
  • the plant fermentation extract provided by the present invention is a culture liquid obtained by fermentation and culture, a liquid component obtained by solid-liquid separation, and a solid component obtained by solid-liquid separation. It is a generic name for liquid components obtained by adding a process. That is, the plant fermentation extract is a culture solution itself obtained by the fermentation and culture method according to the present invention, and
  • the plant fermented extract can be dried and used as a plant fermented extract powder, or the plant fermented extract powder can be used by dissolving it in an appropriate solution such as a phosphate buffer containing physiological saline.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 3-218466
  • Patent Document 2 JP-A-8-198902
  • Patent Document 3 WO00 / 57719
  • Patent Document 4 JP-A-6-78756
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 4-187640
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 4-49240
  • Patent Document 7 Japanese Patent Laid-Open No. 4-99481
  • Patent Document 8 JP-A-5-155778
  • Non-Patent Document 1 Hiroyuki Inagawa, 8 people, “Biotherapy”, 1991, No. 5, 4, p617-621 Special ⁇ 12: 3 ⁇ 4oma, u-I., 1 other, Tumor Necrosis Factor: Molecular and ellular
  • Non-Patent Document 3 Tsuneo Yamada and 6 others, “Biological Encyclopedia 3rd Edition", 1983, pl021
  • Non-Patent Document 4 Gavini, F. and 6 others, “Int. J. Syst. BacterioL", 1989, 39th,
  • Non-Patent Document 5 Nishizawa, T. and others, "Chem. Pharm. Bull.”, 1992, No. 40, No. 2, P479-483
  • Non-Patent Document 6 Inagawa, H. and 8 others, "Chem. Pharm. Bull.”, 1992, No. 40, No. 4, P994-997
  • Non-patent literature 7 Neilson, AH ⁇ J. Appl. Bacteriol. ", 1979, 46 ⁇ , 3, p483-491
  • Non-patent literature 8 Nunes, C. et al.,” Int. J. Food Microbiol “, 2001, 70th, 1st, 2nd merger, p53-61
  • Non-Patent Document 9 Tsuneo Yamada and 6 others, “Biological Encyclopedia 3rd Edition”, 1983, p287-288
  • Non-Patent Document 10 Nunes, C. and 4 others, J. Appl. Microbiol ”, 2002, No. 92, No. 2, P247-255
  • Non-patent literature l l Asis, C. A. Jr. and others, "Lett. Appl. Microbiol.” 2004, No. 38, No. 1, pl9-23
  • Non-Patent Document 12 Vanneste, 3 outside JL, “J. Bacteriol.” 1992, No. 174, 9, P2785-2796
  • Non-Patent Document 13 Kearns, 1 outside LP, "Appl Environ Microbiol.” 1998, 64th, No. 5, pl837-1844
  • the immunostimulatory substance is often a constituent component or product of a microbial organism that coexists with a plant itself or a plant. Therefore, if an immunostimulatory substance derived from a natural product that is safe even if ingested is obtained, the ability of the edible plant itself to extract components (for example, Limulus-positive glycolipid, Patent Document 1) It is useful to cultivate efficiently to obtain its constituents or products (for example, low molecular weight lipopolysaccharide, Patent Document 2).
  • the amount of the immunostimulatory substance contained in the edible plant must be very large, and the intake of the immunostimulatory material must be kept appropriate. However, since it is generally not easy, the effect cannot be expected.
  • plant moss is extracted and used as food or medicine, it is expensive and poor in practicality.
  • Pantoea agglomerans a wheat symbiotic bacterium
  • Pantoea agglomerans contains a low-molecular-weight lipopolysaccharide effective for immunostimulation as a constituent component.
  • the main component of the protein contained in the culture medium is animal-derived, such as NZ Aminya tryptone or casamino acid, and pantoea agglomerans is cultured.
  • the present invention provides a fermentation and culture method capable of obtaining an immunostimulatory substance efficiently at low cost using a safe material, a plant fermentation extract obtained by the method, and a plant fermentation extract. It is an object of the present invention to provide a plant fermented extract powder obtained and a plant fermented extract blend blended with the plant fermented extract powder.
  • materials derived from edible plants are exclusively symbiotic to plants. It is characterized by being fermented with facultative anaerobic gram-negative bacteria and simultaneously culturing the facultative anaerobic gram-negative bacteria.
  • Fermentation and culture can be performed in a simple process by fermenting starch as a carbon source with the facultative anaerobic gram-negative bacteria.
  • the facultative anaerobic gram-negative bacterium is facultative anaerobic bacilli.
  • the facultative anaerobic bacilli belong to the genus Pantoea, Serratia, or Enterobacter.
  • the facultative anaerobic bacilli are Pantoea agglomerans, so that starch can be used as a carbon source.
  • the edible plant is preferably cereal, seaweed, legumes, or a mixture thereof.
  • the material derived from the grain is preferably wheat flour, rice flour, wheat bran flour, rice bran, or sake lees.
  • wheat flour contains dartene as a protein source, it can be efficiently fermented and cultured without using animal-derived materials.
  • the material derived from the seaweed is seaweed powder, seaweed powder, or kelp powder.
  • the material derived from the beans is okara, since it contains a large amount of protein, it can be efficiently fermented and cultured without using animal-derived materials.
  • the fermented plant extract of the present invention is obtained by the fermentation and culture method.
  • the plant fermented extract powder of the present invention is characterized in that the plant fermented extract power is also obtained.
  • the plant fermented extract blend of the present invention is characterized in that the plant fermented extract or plant fermented ex-powder is blended.
  • the plant fermented extract blend may be a pharmaceutical, veterinary pharmaceutical, quasi-drug, cosmetic, food, functional food, feed, or bath preparation.
  • the fermented plant extract exhibits the following physical properties. [0030] Even in the presence of polymyxin B, it exhibits macrophage activity. The fermented plant extract has an immunostimulatory effect.
  • culture can be performed in a medium that does not contain animal-derived components, there is no problem of contamination with animal component-derived impurities, so there is a risk of contamination with BSE or unknown harmful substances, for example.
  • a method for producing a plant fermented extract that is highly safe and can be used for various purposes at low cost, and can produce an immunostimulating substance-containing plant fermented extract or plant fermented extract powder safely and inexpensively, Furthermore, the culture solution, immunostimulatory substance and extract and extract powder, as well as pharmaceuticals, veterinary drugs, quasi-drugs, cosmetics, foods, functional foods, feeds and bath preparations containing the extract or extract powder are provided. Can do.
  • TNF-inducing activity TNF-inducing activity
  • the immunostimulatory effect can be quantified by the amount of TNF produced. Therefore, we examined the production of TNF from macrophages using Limulus-positive plant glycolipids derived from wheat flour and low molecular weight lipopolysaccharide derived from Pantoea agglomerans. In all of the examples, the molecular weight lipopolysaccharide has the ability to prevent the production of TNF from macrophages by treatment with polymyxin B.
  • the fermented plant extract of the present invention produces TNF from macrophages even when the same treatment is applied. Indicated. This is because the plant fermentation extract of the present invention obtained as a result of fermentation and culture is qualitatively different from the immunostimulatory effect of the plant itself and the components of the microorganism used for fermentation. It shows having different immunostimulatory effects.
  • FIG. 1 is a diagram showing the effect of suppressing the development of koi herpes by a feed containing fermented wheat extract. is there.
  • macrophage activity was evaluated by TNF production from macrophages as an index of the immunostimulatory action exhibited by the fermented wheat extract.
  • Low molecular weight lipopolysaccharide is extremely safe and superior in biological activity compared to general-purpose high-molecular-weight lipopolysaccharide (hereinafter referred to as normal lipopolysaccharide). ing. Therefore, the low molecular weight lipopolysaccharide content was measured. Low molecular weight lipopolysaccharide is described in detail in Patent Document 2. Although this example relates to fermented wheat extract, the present invention does not mean that the plant is limited to wheat and the immunostimulatory substance is limited to low molecular weight lipopolysaccharide.
  • Pantoea 'agglomerans can be cultured using a known method.
  • Patent Document 2 Non-Patent Document 8
  • the main component of the protein contained in the known culture medium is derived from animals, and the cost of the medium is high.
  • BSE the inclusion of animal-derived impurities becomes a problem from the viewpoint of food safety, as represented by BSE.
  • the manufacturing cost is high and it is not a sufficient method from the practical point of view.
  • the present inventors conducted an example of a fermentation and culture method using pantoea agglomerans to obtain a wheat fermented extract.
  • the main component of the protein contained in the culture medium has been conventionally derived from animals, but the present invention has made it derived from plants.
  • a product obtained by degrading a protein such as casein derived from milk with digestive enzymes is added to the culture solution.
  • the cost per medium 11 is about 250 yen, but if this can be replaced with flour, the cost will be about 16 yen. So far, fermentation has not been carried out for the purpose of synergistic fusion while increasing the immunostimulatory activity of both the plant and the microorganisms that live with it.
  • the present invention provides a large amount of immunostimulatory substances that are not limited to pantoea agglomerans as microorganisms described in the examples, wheat as edible plants or wheat as a material. It can also be applied to ingredients that are obtained from other edible plants, such as seaweed, such as seaweed, and cereals (including wheat flour, rice flour, wheat bran flour, rice bran, sake lees etc. ), Seaweed (including seaweed-derived materials such as wakame flour, mekabu flour, or kelp powder), beans (including okara, etc., derived from beans) are also applicable. These plants are well known to contain proteins and sugars!
  • Non-patent Document 4 Non-patent Document 4
  • the product can also be adapted to facultative anaerobic gram-negative bacteria that coexist with these plants.
  • the wheat fermented extract itself is a novel substance that has an immunostimulatory effect by fusing wheat, its symbiotic bacterium, Pantoea agromerans, and fermented products by combining these yarns.
  • the present invention is not limited to this.
  • Pantoea 'agglomerans is isolated from wheat flour according to a conventional method (Non-patent Document 1). Once isolated and identified, this bacterium can be stored in 50% glycerol or the like.
  • Ferment 9 at 40 ° C. In some cases, it may be shaken if left standing. You can also stir every few hours.
  • the precipitate can be used as a fermented wheat flour, as it is, or as a raw material to be mixed with the feed.
  • the fermented wheat extract produced in 14 can be further refined depending on the application.
  • 14 salts are mixed with salt such as sodium chloride so that the final concentration is 0.05-1 mol / 1, and then a solvent such as ethanol is added in an amount 1 to 13 times that of the extract. Precipitation occurs. You may collect this with a centrifuge. This precipitate may be further washed with a solvent such as ethanol. If this is dried, it can also be made into powder.
  • pantoea agglomerans In order to confirm the ability of pantoea agglomerans, a wheat resident symbiotic bacterium, to grow using wheat flour as a carbon source, the growth of pantoea agglomerans in flour solid media was examined.
  • the wheat flour fermentation solution of 7 was centrifuged (Hitachi, high-speed cooling centrifuge SCR-20B, 5000 rpm, 20 minutes, 4 ° C), and the precipitate was collected.
  • Phosphate buffer solution was added to the precipitate in 8 and suspended to make a total volume of 100 ml, transferred in 33 ml portions to a 50 ml centrifuge tube, and extracted by heating in a boiling water bath for 30 minutes. After completion of heating, the mixture was cooled to room temperature and centrifuged (Hitachi, high-speed cooling centrifuge SCR-20B, 10000 rpm, 20 minutes, 20 ° C). After centrifugation, 82 ml of a pale yellow supernatant was decanted and collected in another container.
  • Iodine starch reaction Iodine reagent 1N (12.7 g iodine, 10 g water in 25 g potassium and 25 ml gale, mix well, then add water to make 100 ml) Dilute it 200 times, and mix well with 0.1 1 ml of fermented wheat extract previously dissolved to a concentration of lmgZml. The fermented wheat extract immediately showed light purple color and dark purple color (positive).
  • Table 6 summarizes the results of Limulus positive glycolipid and low molecular weight lipopolysaccharide.
  • fermented wheat extract is limulus-positive glycolipid
  • low-molecular-weight lipopolysaccharide is protein content, sugar content, nucleic acid content (except for limulus-positive glycolipid because there is no data)
  • limulus activity It is clear that the substance content and iodine starch reaction are all different, and the substance is clear.
  • Table 7 That is, the fermented plant extract of this example is a novel one, unlike the rimlas positive glycolipid and the low molecular weight lipopolysaccharide, in that it exhibits the following respective physical properties. It contains 5-15% protein, 20-45% sugar, 10-35% nucleic acid, and 10-40% Limulus positive substance, is positive for iodine starch reaction, and has macrophage activity even in the presence of polymyxin B. Shows ability.
  • a 48-well plate was charged with TH P-1 (1 ⁇ 10 6 cells / 250 1: 10% urine fetal serum RPMI1640 medium) used as human macrophages and pre-cultured for 30 minutes in advance.
  • Medium 250 1 (final amount 500 ⁇ 1) was added so that the final concentration of each sample was 1 lOOOOngZml.
  • a feed containing 430 gZkg of the fermented wheat extract produced in Example 2 was prepared. Grant As chickens, broiler commercial chickens were used in groups of about 5500-6000 chickens. The control test category does not include fermented wheat extract! /, Feed. Administration of fermented wheat extract was started at 3 weeks after hatching and was administered daily until 7 weeks of age. The number of dead animals was measured daily. Chickens that did not meet the standards at the time of shipment were discarded. The results are shown in Table 9. The removal rate in the test plot (feed with fermented wheat extract) was 1.9%, reaching 3.3% in the low control plot. The breeding rate was 98.1% in the test plot and 96.7% in the control plot, so an improvement of 1.4% was observed.
  • Coy Magoy weighing 70g was used. The test was conducted with 20 animals per group.
  • koi herpesvirus Eat the koi ella lg killed by koi herpes infection, add 10 ml of Hanks balanced salt solution (HBSS) buffer, homogenize, filter through 0.45 micron filter, The filtrate was used as a virus solution.
  • HBSS Hanks balanced salt solution
  • Feeding method Each feed was fed once a day at a weight of 1% per body weight. This corresponds to 0, 50, 100, 200 / z g / kg body weight / day, respectively, when converted to the fermented wheat extract.
  • Example 2 About 10% of the fermented wheat extract produced in Example 2 was added to and mixed with the fat-soluble base material 1 ointment according to the formulation shown in Table 11 to obtain an ointment.
  • Group A was dissolved by heating at 70 ° C, dissolved in 1Z4 amount of purified water and dissolved in B at 70 ° C, and Group B dissolved in 1Z4 amount of purified water and dissolved at 70 ° C by heating. Mix well with a homogenizer, cool to 40 ° C, add group D to adjust the pH to 6.8, add the remaining purified water and the fermented wheat extract produced in Example 2 and mix thoroughly. Get the emulsion.
  • the fermented wheat extract should be dissolved in purified water in advance so as to reach 5 mgZml, and 0.1 ml of the milk lOOg should be added.
  • a questionnaire survey was conducted by 43 men and women using this cream. As a result, 18 respondents answered that the moisturizing effect was indeed effective, 18 responded that the effect was somewhat effective, 2 responded that there was no effect, and 5 respondents left blank (one sample). Sign test: P ⁇ 0.0001). About 6 people who answered that it is effective and good, 13 people answered that it was effective, 0 people answered that there was no effect, and 24 people left blank. there were . (One-sample sign test: P 0. 0001). There were no respondents who answered that there was a bad skin symptom after use. In addition, a questionnaire survey was conducted with four people with mild atopy-like symptoms using this cream. Three people answered that it was indeed effective in improving atopic dermatitis.
  • this cream was used for burn patients.
  • the cream containing the fermented wheat extract produced in Example 2 was applied to one hand, and the wrinkle cream containing no fermented wheat extract was applied to the other hand.
  • the hand that applied the cream containing the fermented extract recovered clearly faster.
  • this topical application was applied to 10 burn patients, the wounds recovered faster when the cream containing the fermented wheat extract was applied externally than when the cream without the fermented wheat extract was applied externally (Fishia's direct Probability: P (0.0001). From the above, this fermented wheat extract was shown to have a therapeutic effect on burns.
  • the ingredients used are shown in Table 13.
  • the fermented wheat extract the fermented wheat wheat prepared in Example 2 is dissolved in purified water in advance to a concentration of 5 mgZml, and 0.1 ml of the lotion is added to lOOg.
  • a bath preparation containing fermented wheat extract was prepared for the purpose of improving biological functions.
  • Table 14 shows the basic components of the bath preparation.
  • a bath containing fermented wheat extract was prepared by adding 110 / z g of the fermented wheat extract produced in Example 2 to the above components. 102 subjects were given a blinded and non-extracted control, and used in a normal bath (160-200 liters) when bathing (1) warming of the body, (2) hot water cooling. Difficulty, (3) fatigue recovery effect, (4) ease of sleep,
  • fermented wheat extract produced in Example 2 was mixed with a commercially available product as an alcohol-degrading function-enhanced food, and the ability to relieve sore throat as a new effect was examined.
  • the current “drink and breath” contains a mixture of green tea extract and green tea extract, but the amount of lipopolysaccharide, one of the active ingredients of plant extract, is only 0.002 g per packet. Degree. Therefore, it is expected to acquire a new function by adding a proper amount of fermented wheat extract with a high lipopolysaccharide content. It is desirable to mix lipopolysaccharide, one of the active ingredients of fermented wheat extract, with 30 g (5 to 150 g of fermented wheat extract) per 1 gram of 2 sachets. First, 50 g of fermented wheat extract per sachet. Manufactured a product containing. In the manufacturing process of drinking and breathing, 2.5 mg of fermented wheat extract produced in Example 2 was prepared per lOOg product. As a result, 50 g of fermented wheat extract per 2 g of product Including new products manufactured.
  • the fermented wheat extract produced in Example 2 was dissolved in distilled water, and 0.2 ml per mouse was orally administered to a mouse using a sonde. Ninety minutes later, 0.7% acetic acid was intraperitoneally administered to the mice, and after 5 minutes, the number of writhing that occurred in 30 minutes was measured. The results are shown in Table 16 as the amount of each sample necessary to inhibit the number of writhing in the control with distilled water by 30%. When the effective activity of low molecular weight lipopolysaccharide derived from Escherichia coli was defined as 1, the fermented wheat extract was 7, indicating that the fermented wheat extract exhibits excellent analgesic activity.
  • a type I allergy model was introduced.
  • a group of 3 to 4 male BALB / c mice were intravenously administered with 1 ⁇ g / mouse of anti-ditropel and mouse monoclonal antibody.
  • the fermented wheat extract (4 g / mouse) produced in Example 2 was administered intraperitoneally or orally (100 g / mouse).
  • 0.25% A dinitrofluorobenzene-containing acetone oliveol mixed solution (4 to 1) was applied as an allergen.
  • the thickness of the pinna at 1, 2, 24, and 48 hours was measured with a thickness gauge, and the difference ( ⁇ ) from the thickness immediately before application was regarded as the degree of edema.
  • the effects of drug administration were evaluated based on the suppression rate obtained by the following formula: early response observed 1 hour after allergen administration and delayed response induced 24 hours later.
  • ⁇ Inhibition rate (1 auricular edema / dose after administration / control auricular edema) X 100 ⁇
  • Table 17 As can be seen, the fermented wheat flour suppressed allergic reactions both intradermally and orally.
  • MRSA mesitylin-resistant Staphylococcus aureus
  • the fermented solution of 5 was extracted by heating in an autoclave at 120 ° C for 20 minutes. This was centrifuged (Kubota 8800, 2000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was collected to obtain Okara fermentation extract.
  • a 48-well plate was filled with THP 1 (1 ⁇ 10 6 cells / 250 1: 10% urine fetal serum RPMI1640 medium) used as human macrophages and pre-cultured for 30 minutes in advance.
  • Medium 250 ⁇ l final amount 500 ⁇ l was added so that the final concentration of each sample was 100-lOOOOngZml.
  • a group containing polymyxin ⁇ (12.5 ⁇ g / ml) was provided in the sample (no group containing only 100 ng / ml polymyxin B). After culturing for 4 hours, the culture supernatant and cells were collected. The TNF activity of the supernatant was measured by L 929 cytotoxicity test. The results are shown in Table 21.
  • Table 2 1 TNF production from macrophages by Okara fermented extract and inhibitory effect by polymyxin B (TNF inducing activity of Okara fermented extract) TNF inducing activity of Okara fermented extract and inhibitory effect by polymyxin B (TNF activity)
  • the rice flour fermentation solution of 5 was extracted by heating in an autoclave at 120 ° C for 20 minutes. This was subjected to centrifugal separation (Kubota 8800, 2000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was collected to obtain a fermented rice flour extract.
  • the Limulus active substance amount was determined by using the Toxicolor System of Seikagaku Corporation and Seikagaku Corporation E t 1 as the standard Limulus active substance.
  • the limulus active substance content in the fermented rice flour extract was measured as 1.7; ⁇ / ⁇ 1.
  • a 48-well plate was filled with ⁇ ⁇ -1 (1X10 6 cells / 2501: 10% urine fetal serum RPMI1640 medium), an acute myeloid leukemia cell line used as human macrophages, and pre-cultured for 30 minutes in advance.
  • Medium 250 1 (final amount 500 ⁇ 1) was added so that the final concentration of each sample was 1 lOOOOngZml.
  • a group containing polymyxin ⁇ (12.5 ⁇ g / ml) was placed in the sample. After culturing for 4 hours, the culture supernatant and cells were collected. After culturing for 4 hours, the culture supernatant and cells were collected. The TNF activity of the supernatant was measured by L 929 cytotoxicity test.
  • the Limulus active substance amount was determined by using the Toxicolor System of Seikagaku Corporation and Seikagaku Corporation E t 1 as the standard Limulus active substance.
  • the limulus active substance content in the seaweed kame fermentation extract was determined to be 132 g / ml.
  • Table 2 TNF production from macrophages by Wakame kame fermentation extract and inhibitory effect by polymyxin B (TNF inducing activity of wakame kame fermentation extract)
  • a plant fermentation extract which is a safe immunostimulatory substance, at low cost
  • the plant fermentation extract thus obtained can be used for mammals including humans (specifically, domestic animals, pets). Animals, etc.), birds (specifically poultry, pets, etc.), amphibians, reptiles, fish (specifically, aquaculture fish, pets, etc.), invertebrate medicines, veterinary medicines, pharmaceuticals It can be used for quasi-drugs, cosmetics, foods, functional foods, feed and bath preparations.

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Abstract

　安全、かつ、安価に高濃度に免疫賦活物質を含む植物発酵エキスを製造する方法を提供することを課題として、本発明の発酵及び培養方法は、小麦やリンゴ等の植物に共生しているグラム陰性菌であるパントエア・アグロメランスを用いて小麦粉等の植物成分を発酵させる。植物の持つ免疫賦活作用を著しく増強することが可能になる。さらに、これらには動物成分由来の不純物の混入の問題がないので安全性が高い。  

Description

明 細 書
発酵及び培養方法、植物発酵エキス、植物発酵エキス末並びに該植物 発酵エキス配合物
技術分野
[0001] 本発明は、ヒトを含む哺乳動物 (具体的には家畜、愛玩動物など)、鳥類 (具体的に は養鶏、愛玩鳥類など）、両生類、は虫類、魚類 (具体的には、水産養殖魚、愛玩魚 類など)、無脊椎動物に及ぶ医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、 機能性食品、飼料及び浴用剤などに添加しても安全な免疫賦活物質を得るための 発酵及び培養方法、植物発酵エキスの製造方法、発酵及び培養方法によって得ら れる免疫賦活物質含有の植物発酵エキス、その植物発酵エキスカゝら得られる免疫賦 活物質含有粉末、及び、その植物発酵エキスを配合した植物発酵エキス配合物に 関する。
背景技術
[0002] ヒトを含む哺乳動物 (具体的には家畜、愛玩動物など)、鳥類 (具体的には養鶏、愛 玩鳥類など)、両生類、は虫類、魚類 (具体的には、水産養殖魚、愛玩魚類など)、無 脊椎動物に関して、感染防除技術を含む疾病予防'治療法を確立することは喫緊の 課題である。しかもこれを達成する上では、化学物質を用いず、環境汚染がなぐ耐 性菌を生ずることなぐ人体に蓄積性がない方法が強く求められている。本発明者ら は如上の課題に関して、すでに小麦水抽出物等の植物由来の免疫賦活物質が疾病 予防'治療効果を安全に達成することを発見した (特許文献 1、非特許文献 1)。また 、以上の目的を達成するために小麦共生細菌であるパントエア 'アグロメランス（ Pantoea agglomerans)力も得た低分子量リポ多糖を用いることができることを発見した 。（非特許文献 2)。一方、近年の研究により、リポ多糖以外の種々の物質が免疫賦 活効果を示すことが明らかにされ、これら複数の免疫賦活物質を含む天然物素材が 注目されている。
[0003] ところで、微生物を用いた発酵技術は食品分野のみならず、広い分野で汎用され ている。例えばワインをはじめとする酒類の製造、醤油や味噌の製造、チーズなど発 酵乳製品の製造、医薬品の製造など極めて広い分野に及んでいる。これら発酵に用 いられる微生物は広範に及んでおり、麹 (真菌)酵母、乳酸菌などが代表的なもので あるが、グラム陰性菌を用いるものは殆ど報告されてこな力つた。一般に発酵とは有 機物が微生物の作用によって分解的に作用する現象であり、広義には微生物による 有用な物質の生産を意味する (非特許文献 3)。微生物を用いた発酵技術としては代 表的なものとしてワインがあげられる。ワインはぶどう果皮に付着しているワイン酵母 を用いた発酵技術であり、生産物はアルコールである。また、微生物を用いる発酵技 術の中にあって、グラム陰性菌を用いたものとしては、メタン菌を用いたメタン発酵、 酢酸菌を用いた酢酸発酵、ザィモモナス'モビリス（Zymomonas mobilis)を用いた竜 舌蘭の根茎力 のエタノール発酵 (テキーラ製造)等が知られて 、るが、食用植物を 素材として、その植物に専ら共生することを特徴とする微生物を用いる発酵培養はほ とんど知られておらず、発酵生産物として免疫賦活物質が注目されたことはない。い わんや免疫賦活物質生産を目的とした発酵及び培養法が注目されたことはな ヽ。
[0004] 一方微生物により発酵を行う場合には一般的には微生物が生育するための発酵基 質が満たすべき栄養条件がある。すなわち炭素源としてはブドウ糖、果糖などの単糖 類を十分に含むことなど微生物が栄養素として利用可能な物質の存在が必須である 。このためにもともと果糖を多く含むブドウのような果実のように、なんら加工を加える ことなく発酵基質として利用できる場合のほかは、加熱あるいは酵素処理を加えるな どして、微生物による発酵の前段階の処理が必要となる。例えば前述のザィモモナス •モビリス（Zymomonasu mobilis)はテキーラ製造に用いられる微生物である力 この 場合には、食用植物ではない竜舌蘭の根茎から得られた多糖類を加熱して発酵性 の単糖に分解し、その後該微生物により発酵して発酵産物としてのアルコールを得る 。従って通常の微生物を用いて発酵培養を行う場合には、澱粉などの多糖類は発酵 基質として適切と 、えるものではな 、。例えばパントエア ·アグロメランス (Pantoea agglomerans)に関しては澱粉を分解できないと記載する文献がある（非特許文献 4)
[0005] 我々は小麦粉の水抽出物には免疫を賦活ィ匕する有効な成分が含まれていることを これまでに明らかにしてきた (非特許文献 5)。また、穀物 (小麦、米）、海草 (わかめ、 昆布、ひじき、のり等）、豆類 (大豆、小豆）にも有効な成分が含まれていることを明ら かにしてきた (非特許文献 6)。この生物活性としては、ヒトゃマウスの諸疾患 (糖尿病 、高脂質血症、アトピー性皮膚炎、がん)等の予防効果があること、魚類や甲殻類、ト リの感染予防に有効であることを見いだしている（特許文献 1、非特許文献 1)。しかし 、小麦粉水抽出物で、上述の効果を期待するためには多量の小麦粉の摂取が必要 になる。
一方、パントエア 'ァグロメランスは小麦に共生する細菌であり、小麦にリン、窒素の 供給を行うことから小麦栽培に有用な菌であると考えられる (非特許文献 7)。また、パ ントエア.アグロメランスは小麦のみならず、梨やリンゴの果実の表皮に付着しており、 この菌が付着しているとカビによる腐れ病が予防できることがヨーロッパにおいて明ら 力にされ、本菌を無毒で、自然環境に優しい防かび剤として利用する開発が進んで いる（非特許文献 8)。なお、共生とは、「異種の生物が一緒に生活している現象。こ の場合、互 ヽに行動的ある ヽは生理的に緊密な結びつきを定常的に保って!/、ること を意味するのが普通である。従って、同じ生息場所に住んでいるだけでは、この概念 には入らない。共生者にとっての生活上の意味'必須性、関係の持続性、共生者の 空間的な位置関係などによって、共生はいろいろに類別'区別されている。ふつうに は、共生者の生活上の利益，不利益の有無に基準を置いて、共生を相利共生、片利 共生、寄生の三つに大きく区分する。」と定義されている (非特許文献 9)。パントエア •アグロメランスの場合、小麦からはその産地、種類を問わず分離されている（非特許 文献 5)こと、また果実からも分離されること (非特許文献 10. 11)がわかっている。パ ントエア'アグロメランスは、抗生物質を産生し (非特許文献 12, 13)カビゃ他の細菌 から植物を保護すること、リン、窒素固定を行うこと (非特許文献 7)が報告されている 。従って、パントエア 'アグロメランスは植物に常在し、植物に益する役割を担うと考え られ、「寄生」ではなく「共生」と捉えられる。さらに、我々はパントエア 'ァグロメランス には免疫を賦活ィ匕する有効な成分が含まれていることをこれまでに明らかにしてきた 。また、この菌カも得た低分子量リポ多糖はヒトゃマウスの諸疾患 (糖尿病、高脂質血 症、アトピー性皮膚炎、がん)等の予防効果があること、魚類や甲殻類、トリの感染予 防に有効であることを見 、だして 、る (特許文献 3、非特許文献 2)。 [0007] この様な状況で我々は、安全かつ安価な免疫賦活物質を製造する方法として、パ ントエア'アグロメランスを用いた植物発酵エキスの製造方法を確立することを着想し た。つまり、（1)培養液に含まれるタンパク質の主成分を植物由来のものにした培地を 用いてパントエア ·アグロメランスを低コストで培養するとともに植物成分を発酵させ、
(2)植物に含まれるパントエア 'アグロメランス或いは発酵による生産物を多く含む素 材を調製し、これを用いることでヒトを含む哺乳動物 (具体的には家畜、愛玩動物など )、鳥類 (具体的には養鶏、愛玩鳥類など)、両生類、は虫類、魚類 (具体的には、水 産養殖魚、愛玩魚類など)、無脊椎動物に及ぶ医薬品、動物用医薬品、医薬部外品 、化粧品、機能性食品、食品、飼料及び浴用剤を開発すること、に着目した。しかし、 植物に共生している微生物が直ちに植物成分例えば食用植物に由来する素材を発 酵基質として利用できることを意味するわけではな 、。例えば小麦粉は小麦粒の中 に存在する澱粉質等の複合有機物質であるが、小麦共生微生物であるパントエア- アグロメランスとは外皮を隔てて隔離されており直接の接点はないのであるから、パン トエア ·アグロメランスを小麦粉を用いて発酵培養できるか否かは単に微生物が小麦 に共生して 、ることとの関連で明らにできるわけではな 、し、事実パントエア ·アグロメ ランスが小麦粉を資化できることはこれまでに知られておらず、全く報告がない。逆に 、これまで公知である事実に基づけばパントエア'アグロメランスは小麦澱粉を発酵基 質として利用できないとされる。
[0008] ところで、植物に含まれて 、る糖質は澱粉の状態で保持される場合が多く、これは 食用植物、特に穀類で顕著である。通常微生物は澱粉を資化する機能は高いもの ではない。この点に関して、一部の通性グラム陰性菌が澱粉を発酵できることが知ら れている。例えば、ェルイ-ァ（Erwinia)は澱粉を資化できることが知られている。し 力しこの発酵技術は、澱粉を発酵するに際し、別に最適培地などで大量に培養した 微生物を加えることによって、微生物の持つアミラーゼ活性を利用することが意図さ れているのであり、培養そのものを澱粉を用いて行うと共に併せて発酵を行う形態は これまでに着想されていない。公知技術は、単に微生物の持つアミラーゼ活性を効 果的に利用することが目的とされる発酵と捉えることができるのであって、澱粉を基質 とした微生物の増殖までが予定されて 、るわけではな 、。一方本発明の実施例では 、澱粉を唯一の炭素源とすることで微生物の増殖に加え発酵産物が産生されること が開示されているのであり、本実施例は単なる発酵ではなく発酵培養である点が公 知技術と大きく異なる。
[0009] 他方、仮に、ある微生物が澱粉を分解する機能を保持していたとしても、これが直 ちに該微生物が澱粉を基質として増殖できることを意味するわけではな 、。培養の際 に、微生物の増殖をも目的とする場合は、培養出発時点に加える微生物量は極めて 少量である。このような場合には仮に微生物がアミラーゼ活性をわずかに持って！/、た としても、この活性は基質を十分に分解するにはあまりに微弱であって、微生物の増 殖は達成されない。事実微生物の多くは澱粉を唯一の炭素源として増殖することは できないと考えられている。
[0010] しかしながらもし、パントエア'アグロメランスを用い、小麦粉を主成分として含む培 地で発酵及び培養させ、免疫賦活物質を多く含む植物発酵エキス (以下、パントエア •アグロメランスを用い、小麦粉を主成分として含む培地で発酵及び培養させて得た 植物発酵エキスを小麦発酵エキスと呼ぶ。）を低コストで製造できれば、具体的な例 としてヒト、畜産'水産養殖の分野で環境に優しぐ安全で感染予防に有効な医薬品 、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料及び浴用剤などを 提供できるはずである。本発明は以上を背景としパントエア ·アグロメランスが小麦粉 を基質として生育することを新たに発見したことを契機として数多くの実験を重ねて完 成されたものである。
[0011] 本発明が提供する植物発酵エキスとは発酵及び培養を行って得られる培養液その もの、これを固液分離して得られる液体成分、及び固液分離して得られる固体成分 に抽出過程を加え得られる液体成分などを総称する名称である。すなわち、植物発 酵エキスは本発明に係る発酵及び培養方法によって得られる培養液そのもの、及び
、その培養液の全部又は一部分を用いて調製することのできるエキスをすベて含ん で 、る。言うまでもな 、が植物発酵エキスは乾燥して植物発酵エキス末として利用す ることもできるし、植物発酵エキス末を任意の濃度に適当な溶液例えば生理食塩水 入りの燐酸緩衝液などに溶解して利用することもできる。 特許文献 1：特開平 3— 218466号公報
特許文献 2 :特開平 8— 198902号公報
特許文献 3： WO00/57719
特許文献 4：特開平 6— 78756号公報
特許文献 5：特開平 4-187640号公報
特許文献 6：特開平 4-49240号公報
特許文献 7：特開平 4-99481号公報
特許文献 8：特開平 5— 155778号公報
非特許文献 1 :稲川 裕之外 8名，〃Biotherapy",1991年，第 5卷， 4号， p617-621 特 §午文献 2 : ¾oma, u-I.外 1名, Tumor Necrosis Factor: Molecular andし ellular
Biology and Clinical Revevance", 1993年 ,p203- 220
非特許文献 3 :山田 常雄 外 6名，"生物学事典 第 3版"， 1983年， pl021 非特許文献 4 : Gavini, F.外 6名， "Int. J. Syst. BacterioL", 1989年，第 39卷，
P337-345
非特許文献 5 : Nishizawa, T.外 7名， "Chem. Pharm. Bull.", 1992年，第 40卷， 2号， P479-483
非特許文献 6 : Inagawa, H.外 8名， "Chem. Pharm. Bull.", 1992年，第 40卷， 4号， P994-997
非特許文献 7 : Neilson, A. H. 〃J. Appl.Bacteriol.", 1979年，第 46卷， 3号， p483-491 非特許文献 8 : Nunes, C.外 3名， "Int. J. Food Microbiol", 2001年,第 70卷, 1,2合併 号， p53-61
非特許文献 9 :山田 常雄 外 6名，"生物学事典 第 3版"， 1983年， p287-288 非特許文献 10 : Nunes, C.外 4名，〃J. Appl. Microbiol", 2002年，第 92卷， 2号， P247-255
非特許文献 l l :Asis, C. A. Jr.外 1名， "Lett. Appl. Microbiol." 2004年，第 38卷， 1 号， pl9-23
非特許文献 12 :Vanneste, J. L.外 3名，〃J. Bacteriol." 1992年，第 174卷， 9号， P2785-2796 非特許文献 13 : Kearns, L. P.外 1名， "Appl Environ Microbiol." 1998年,第 64卷， 5 号， pl837-1844
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0012] 既述したように、免疫賦活物質は植物自身が含有する場合と植物に共生する微生 物の構成成分又は生産物である場合が多い。従って、摂取しても安全な天然物由来 の免疫賦活物質を得ようとすれば、食用植物自身力 成分を抽出する力 (例えばリム ラス陽性糖脂質、特許文献 1)食用植物に共生する微生物を効率よく培養してその構 成成分又は生産物を取得すること (例えば低分子量リポ多糖、特許文献 2)が有用で ある。しかし、食用植物に含まれる免疫賦活物質の含量は少なぐ食により免疫賦活 効果を期待するためには極めて多量の食品を取らなければならず、また免疫賦活物 質の摂取量を適正に保つことが一般的には容易でないために、効果が期待できない 。さらに植物カゝら抽出して食品や薬剤として利用する場合にも多額のコストがかかり 実用性に乏しい。
[0013] 一方植物に共生する微生物に注目すると例えば、小麦共生細菌であるパントエア- アグロメランスは免疫賦活に有効な低分子量リポ多糖を構成成分として含んでいる。 しかしこれまで低分子量リポ多糖を抽出するには、培養液に含まれるタンパク質の主 成分が動物由来のもの、例えば NZアミンゃトリプトンやカザミノ酸など高価な培養液 を用いてパントエア'アグロメランスを培養する必要があった。従って、汎用性の高い 免疫賦活物質として、安価に供給することが困難である、と同時に BSE他動物由来 の未知の有害物質が混在してくる可能性を否定できな力つた。
[0014] 上記問題点に鑑み、本発明は、安全な素材を用いて安価に効率よく免疫賦活物質 を得ることができる発酵及び培養方法、該方法によって得られる植物発酵エキス、該 植物発酵エキスから得られる植物発酵エキス末並びに該植物発酵エキス末が配合さ れて ヽる植物発酵エキス配合物を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0015] 本発明の発酵及び培養方法は、食用植物に由来する素材を専ら植物に共生する 通性嫌気性グラム陰性菌によって発酵させて、同時に該通性嫌気性グラム陰性菌を 培養することを特徴とする。
[0016] また、炭素源として澱粉を前記通性嫌気性グラム陰性菌によって発酵させることで、 単純な過程で発酵及び培養をすることができる。
[0017] 前記通性嫌気性グラム陰性菌は、通性嫌気性桿菌であることが望ま 、。
[0018] 前記通性嫌気性桿菌は、腸内細菌科に属するものであることが望ましい。
[0019] また、前記通性嫌気性桿菌は、パントエア属、セラチア属、又はェンテロバクター属 に属するものであることが望まし 、。
[0020] また、前記通性嫌気性桿菌は、パントエア'アグロメランスであることで、澱粉を炭素 源とすることができる。
[0021] また、前記食用植物は、穀物、海草、豆類、又はこれらの混合物であることが望まし い。
[0022] また、前記穀物に由来する素材は、小麦粉、米粉、小麦ふすま粉、米ぬか、又は酒 かすであることが望ま 、。とくに小麦粉はタンパク質源としてダルテンを含むので、 動物由来の素材を用いなくても効率良く発酵及び培養をすることができる。
[0023] また、前記海草に由来する素材は、わかめ粉、めかぶ粉、又は昆布粉であることが 望ましい。
[0024] また、前記豆類に由来する素材は、おからであることで、タンパク質を多量に含むた め動物由来の素材を用いなくても効率良く発酵及び培養をすることができる。
[0025] また、本発明の植物発酵エキスは、前記発酵及び培養方法によって得られることを 特徴とする。
[0026] また、本発明の植物発酵エキス末は、前記植物発酵エキス力も得られることを特徴 とする。
[0027] また、本発明の植物発酵エキス配合物は、前記植物発酵エキス又は植物発酵ェキ ス末が配合されて 、ることを特徴とする。
[0028] また、前記植物発酵エキス配合物は、医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧 品、食品、機能性食品、飼料、又は浴用剤であってもよい。
[0029] また、前記植物発酵エキスは、以下の理ィ匕学的性質を示すことが望ま 、。 [0030] ポリミキシン B存在下でもマクロファージ活性ィ匕能を示す。また前記植物発酵エキス は免疫賦活効果を持つ。
発明の効果
[0031] 本発明によれば、動物由来の成分を含まない培地で培養することができるので、動 物成分由来の不純物の混入の問題がないので、例えば BSEや未知の有害物質混入 の恐れがなぐ安全性が高ぐ安価に多方面の用途に対応することが可能な植物発 酵エキスの製造方法が提供され、安全、安価に免疫賦活物質含有植物発酵エキス 又は植物発酵エキス末が製造でき、さらに該培養液、免疫賦活物質及びエキス及び エキス末さらに該ェキス又はエキス末を配合した医薬品、動物用医薬品、医薬部外 品、化粧品、食品、機能性食品、飼料及び浴用剤などを提供することができる。
[0032] 食用植物に由来する素材を専ら植物に共生する通性嫌気性グラム陰性菌によって 発酵させて、同時に該通性嫌気性グラム陰性菌を培養すると 、う単純な過程で発酵 及び培養ができることは、これまで着想もされておらず、これまでの発酵技術の知見 から容易に推察される事実ではな 、。
[0033] また、ある物質が免疫賦活効果を示す指標としてマクロファージから TNFが産生さ れるか否か (TNF誘導活性)を用いることができる。さらに TNF産生量によって免疫 賦活効果を定量ィ匕することができる。そこで、小麦粉由来のリムラス陽性植物糖脂質 、パントエア ·アグロメランス由来の低分子量リポ多糖を用 、てマクロファージからの T NF産生を検討すると、小麦粉由来のリムラス陽性植物糖脂質、パントエア'アグロメ ランス由来の低分子量リポ多糖ではいずれもポリミキシン B処理により、マクロファー ジから TNFが産生されなくなる力 本発明の植物発酵エキスでは同上の処理を行つ てもマクロファージから TNFが産生されることを多くの実施例において示した。このこ とは発酵培養を行った結果得られる本発明の植物発酵エキスが、その素材となった 植物自身、及び、発酵に用いた微生物自身の構成成分それぞれによる免疫賦活効 果とは質的に異なる免疫賦活効果を有することを示す。
図面の簡単な説明
[0034] [図 1]図 1は、小麦発酵エキス入り飼料によるコィヘルぺス発症抑制効果を示す図で ある。
発明を実施するための最良の形態
[0035] 以下、本発明の好適な実施の形態について詳細に説明する。
I：パントエア ·アグロメランスを用いた植物発酵エキスの製造方法の骨子 本件において、我々は、パントエア'アグロメランスが澱粉を直接炭素源として生育 可能であることを始めて見出し、パントエア'アグロメランスを用いた発酵及び培養生 産物としての免疫賦活物質を多く含む小麦発酵エキスを安価に製造する方法を発明 した。これにより、具体的な例としてヒト、畜産'水産養殖の分野で環境に優しぐ安全 で感染予防に有効な医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料を提供できる。
[0036] 1 :パントエア'アグロメランスの分離
小麦粉を水に懸濁し、上澄み液を Lブロス寒天培地に塗り広げ培養を行うと、微生 物のコロニーが出現する。これらのコロニーを定法により微生物の同定を行う。例え ば、グラム染色陰性、グルコース嫌気的代謝反応陽性、ォキシダーゼ活性陰性のコ 口-一を選択し、さらに、 IDテスト ·ΕΒ- 20(日水製薬)等を用いて、スタンダードのパ ントエア .ァグロメランスと同じ性質を有するものを選択する。スタンダードとなるパント エア ·アグロメランスは理ィ匕学研究所生物基盤研究部微生物系統保存施設より入手 可能である (非特許文献 4)。以下の説明において、百分率の表示は、特に断りのない 限り、重量による値である。
[0037] 2 :免疫賦活活性評価
本実施の形態では小麦発酵エキスが示す免疫賦活作用の指標として、マクロファ ージ活性ィ匕能をマクロファージからの TNF産生で評価した。
[0038] 3：パントエア ·アグロメランス由来低分子リポ多糖
また、パントエア'アグロメランスを用いた発酵及び培養により、免疫賦活する有効 成分の一つとしてパントエア'アグロメランス由来の低分子量リポ多糖の含有も期待さ れる。低分子量リポ多糖は、汎用されている高分子量型のリポ多糖 (以下通常のリポ 多糖）に比べて極めて安全性が高ぐかつ生物活性も通常のリポ多糖に比して優れ ている。そこで、低分子量リポ多糖含量を測定した。低分子量リポ多糖については特 許文献 2に詳述されている。なお、本実施例は小麦発酵エキスに関するものであるが 、本発明は植物が小麦、免疫賦活物質が低分子量リポ多糖に限定されることを意味 する訳ではない。
[0039] ところでパントエア 'アグロメランスは公知の方法を用いて培養できる。（特許文献 2 、非特許文献 8)しかし公知の培養液に含まれるタンパク質の主成分は動物由来のも のであり、培地のコストが高い。さらに、動物に例えば機能性食品や機能性飼料を与 え、或いは経皮的に用いる場合に、 BSEに代表されるように動物由来の不純物の混 入が食の安全性の点から問題になること、更に製造コストが高額となり実用性の面か ら見ると十分な方法ではない。そこで本発明者らは、安全で、安価な免疫賦活作用 を持つ天然物を得るために鋭意研究を進めた結果、小麦発酵エキスを得るためにパ ントエア ·アグロメランスを用いる発酵及び培養方法を実施例に示すように完成した。 培養液に含まれるタンパク質の主成分は、従来は動物由来のものであつたが、本発 明はこれを植物由来のものにした。通常、培養液には牛乳由来のカゼイン等のタン ノ^質を消化酵素で分解した産物を添加する。この場合には培地 11あたりの原価は 約 250円となるが、これが小麦粉で代替出来れば原価は約 16円となる。これまでに 植物とそれに共生する微生物の両方の免疫賦活活性を高濃度化しつつ相乗的に融 合化する目的での発酵は行われたことがない。
[0040] 以下に実施例として発明内容を詳述するが、本発明は実施例記載の微生物として パントエア .ァグロメランス、食用植物として小麦あるいは素材として小麦粉に限定さ れたものではなぐ免疫賦活物質を多量に含む他の食用植物から通常の工程を経て 得られる素材、例えばわかめにも適応できるし、穀物 (穀物に由来する素材である小 麦粉、米粉、小麦ふすま粉、米ぬか、又は酒かす等を含む)、海草 (海草に由来する 素材であるわかめ粉、めかぶ粉、又は昆布粉等を含む）、豆類 (豆類に由来する素材 であるおから等を含む）〖こも適応できる。これらの植物にはタンパク質、糖類が含まれ て!、ることはよく知られており、パントエア ·アグロメランスを用いる発酵及び培養に適 応できる。また、これらの植物に常在性の細菌、例えばセラチア属、ェンテロパクター 属が共生していることは広く知られたところであり（非特許文献 4)、発酵に用いる微生 物もそれら植物に共生する通性嫌気性グラム陰性菌にも適応できるものであることは 言うまでもない。
[0041] II：発明の重要な点のまとめ
(1)小麦、その共生細菌であるパントエア'アグロメランス、及びそれらの糸且合せによ る発酵産物の融合によってできる免疫賦活作用を持つ物質としての小麦発酵エキス そのものが新規。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
(2)グラム陰性菌のパントエア'アグロメランスを用いて植物発酵エキスを製造するこ とが新しい。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
[0042] III：小麦発酵エキスの具体的製造方法
(1)パントエア'アグロメランスは小麦粉より定法に従い単離する（非特許文献 1)。な お、一度、単離同定すれば、この菌を 50%グリセロール等で保存が可能である。
(2) 0.05— 5%の食塩、 0. 005— 1モルのリン酸緩衝液、または、混合塩類溶液（0. 5— 10%のリン酸第ニナ卜リウム、 0. 05— 5%のリン酸第一カリウム、 0. 05力も 5% の塩ィ匕ナトリウム、 0. 05— 5%の塩ィ匕アンモ-ゥム）等を調製する。
(3) 0.05— 10%の濃度になるように小麦粉を水に懸濁する。
(4) 0. 2— 3モルの塩化マグネシウム溶液を調製する。
(5) 0. 2— 3モルの塩化カルシウム溶液を調製する。
(6) 2から 5を場合によってはオートクレープ等で滅菌操作を行う。
(7) 2から 5を適量混合し、水を加え、 0. 1一 5%の小麦粉を含む懸濁液とする。場合 によってはアルカリ溶液や酸性溶液をカ卩ぇ pHを中性にする。
(8) 7に場合によっては培地 1リットルあたり 10— 50000単位アミラーゼをカ卩えて 10°C 力も 80°Cで 1一 24時間保温して、小麦でんぷんを部分消化させるのもよい。
(9) 7乃至 8に 1で単離したパントエア ·アグロメランスを添加する。
(10) 9を 1一 40°Cで発酵させる。場合によっては静置ゃ震盪してもよい。また、数時 間おきに撹拌を行うことでもよ 、。
(11) 10を 6時間から一週間発酵させる。発酵が進むと小麦粉水溶液が黄色に着色し てくる。
(12) 11の発酵途中に適宜アルカリ溶液をカ卩え、 pHを中性にすることや、小麦粉懸 濁液や無機塩類を添加することもよ 、。
(13)発酵を終了させ、遠心分離（1000— 5000rpm、 10— 60分間）等の操作により 固形分を沈殿物として回収する。沈殿物は小麦粉発酵物として、そのまま飼料として 又は飼料に混ぜる原料として使うこともできる。
(14)小麦発酵エキスを製造する場合は、 13を水または塩類緩衝液等で懸濁し、これ を 80— 140°Cで 10分から 6時間加熱処理する。さらに、これを遠心分離や濾過する ことで、固形分を除去してもよい。除去した沈殿に再度水や緩衝液を加え、加熱抽出 を数回繰り返してもよい。
(15) 14で製造した小麦発酵エキスは用途によってはさらに簡便な精製を追加するこ とが出来る。すなわち、 14のエキスに、最終濃度 0. 05— 1モル /1になるように塩ィ匕ナ トリウム等の塩をカ卩え、その後、エタノール等の溶媒をエキスの 1一 3倍量添加すると 沈殿が生じる。これを遠心分離機等で回収してもよい。この沈殿をさらに、エタノール 等の溶媒で洗浄してもよい。これを乾燥させれば、粉末とすることも出来る。
[0043] A.小麦発酵エキスの製造方法に関連する実施例
実施例 1
[0044] パントエア ·アグロメランスの小麦培地での生育試験
小麦粉を炭素源として小麦常在性の共生細菌であるパントエア ·アグロメランスが増 殖可能である力 確認するために、小麦粉固形培地におけるパントエア 'アグロメラン スの生育を調べた。
(1) 0.5%小麦粉を炭素源として含む M9寒天培地を作成した。
(2) LB寒天培地より、パントエア'アグロメランスのコロニーを 1つかきとり、 PBSlmlに懸 濁した。これをさらに PBSにて 10倍から 10000倍までに段階的に希釈し、それぞれの 0. lmlを 1の M9寒天培地に撒いた。
(3) 37°Cで 6日間培養した後、コロニーの出現を観察した。その結果、 10000倍希釈の 0. lmlを撒いたシャーレで約 300個のコロニーが観察された。
[0045] このこと力ら、パントエア 'ァグロメランスは小麦を炭素源として利用できることが確か められた。 実施例 2
[0046] 小麦発酵エキスの製造
(1)小麦粉 0.5gに蒸留水 5mlをカ卩ぇ懸濁し、上澄みを Lブロス寒天培地に O.lml添 加し、 37°Cでー晚培養した。
(2)黄色のコロニーを単離し、通常の方法で菌を同定し、パントエア 'アグロメランスを 単離し、これを 50%グリセロール溶液に懸濁し、冷凍庫に保存した。このストックの一 部を LB寒天培地にとり、 37°Cに放置してパントエア'アグロメランスの独立コロニーを 作成した。
(3) 2リットルの三角フラスコにリン酸第二ナトリウム · 7結晶水 64g、リン酸第一カリウム 15g、塩ィ匕ナトリウム 2. 5g、塩ィ匕アンモ-ゥム 5gをとり、精製水を加え全量 1リットルと した (無機塩類混合溶液)。塩ィ匕マグネシウム · 2結晶水 13. lgをとり、精製水を加え 全量を 100mlとした (塩ィ匕マグネシウム溶液)。塩ィ匕カルシウム 11. lgをとり、精製水 をカロえ全量を 100mlとした（塩化カルシウム溶液)。 4リットルの精製水を 5リットルの三 角フラスコにいれた (精製水)。上記の溶液、精製水はすべてオートクレープ (TOM Y BS— 325、 120°C、 20分）して滅菌処理を行った。
(4) 1リットルの三角フラスコに小麦粉（日清製粉) 24gをとり、精製水を加え全量 600 mlとした。これを同様にオートクレーブした後、 α—アミラーゼ（SIGMA、 Bacillus, タンパク質 lmg当たり 1500— 3000単位の酵素活性） 3mgを加え、 65°Cの水浴で 4 一 12時間加熱した (小麦粉アミラーゼ処理液)。
(5)調整した溶液等をそれぞれ表 1に示した量を無菌的に滅菌した 3リットルの坂口フ ラスコに入れ小麦粉培地とした。
[0047] [表 1] 材料 用量
無機塩類混合溶液 2 0 0 m l
精製水 5 5 0 m l
小麦粉アミラーゼ処理液 2 0 0 m l
塩化マグネシウム溶液 2 . O m l
塩化カルシウム溶液 0 . 1 m l (6)種菌の調製。前もって同じ組成で調製しておいた 5の小麦粉培地 10mlに、 2で小 麦粉より単離しておいたパントエア'アグロメランスのコロニーを一つ加え 37°Cでー晚 (12— 15時間)緩や力に撹拌し、発酵させて、小麦粉発酵用の種菌を準備した。
(7) 5に 6を全量加え 37°Cで撹拌しながら、 20— 30時間発酵させた。発酵液の PHを 測定し、アンモニア水をカ卩え、 pHを 7に調整した。これに、 150mlの小麦粉アミラー ゼ処理液と無機塩類混合溶液 37. 5mlを無菌的に添加し、同様に発酵を 20— 30時 間行った。同じ操作をさらに、もう一度繰り返し、合計で 65から 80時間発酵させた。
(8) 7の小麦粉発酵溶液を遠心分離（日立、高速冷却遠心機 SCR— 20B、 5000rp m、 20分間、 4°C)し、沈殿を回収した。
(9) 8の沈殿にリン酸緩衝液を加えて懸濁し、全量 100mlとして、 33mlずつ 50ml遠 心管に移し、沸騰水浴中で 30分間加熱抽出した。加熱終了後、室温まで冷却し、本 液を遠心分離（日立、高速冷却遠心機 SCR - 20B、 10000rpm、 20分間、 20°C) した。遠心後、淡黄色の上清 82mlをデカントで別の容器に回収した。
(10) 9の上清 80ml〖こ 8. 9mlの 5モル塩化ナトリウム溶液を加えた。これに 178mlの エタノールを加えると白濁を生じた。これを、冷凍庫 (一 90°C)で一晩放置後、本液を 遠心分離（日立、高速冷却遠心機 SCR - 20B、 10000rpm、 20分間、 4°C)した。上 清を除き沈殿を得た。沈殿に冷やした 10mlの 70%エタノールを加え、懸濁した後、 本液を遠心分離（日立、高速冷却遠心機 SCR - 20B、 10000rpm、 20分間、 20°C )し、沈殿を洗浄した。沈殿を風乾し、蒸留水に溶解し、 11mlの小麦発酵エキス溶液 を得た。
(11)乾燥重量の測定: 0. 3mlを予め秤量した 1. 5mlプラスチックチューブに移し、 凍結後、凍結乾燥機にて、凍結乾燥を行ったところ 7. 45mgで衡量となった。したが つて、 10の小麦発酵エキスの乾燥重量は溶液 lml当たり 24. 8mg、全量 11ml当た り、 273mgであった。
(12)同一の方法で独立に 8回の小麦発酵エキスを製造し、それぞれをブラッドフォー ド法によるタンパク質定量 BSAを標準タンパク質として、各サンプルのタンパク質量 を測定した。比較対象として精製したリムラス陽性糖脂質 (特許文献 1)と低分子リポ 多糖 (特許文献 2)を用いた。測定結果を表 2に示した。表 2— 5、 7の小麦発酵エキス についての数値は上記 10で得られる小麦発酵エキスを乾燥して得られた重量の lg あたりの含有量を mgで表示した。
(13)糖含量の測定:フ ノール硫酸法によりグルコースを標準糖として測定した。測 定結果を表 3に示した。
(14)核酸含有量の測定： 100倍希釈したサンプルの 210— 340nmの吸光度測定を 行った。 260nmの吸光度から 320nmの吸光度を引いた値と、 DNAとしての吸光度 lODあたり、 50 /z gとしての最大含有量を算出した。測定結果を表 4に示した。
(15)リムラスアツセィによるリムラス活性物質含有量の測定:リムラス活性物質量は生 化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業 Et-1を用いた。測定結果を表 5に示した。
(16)ヨウ素でんぷん反応：ヨウ素試薬 1N (ヨウ素 12. 7gにョウイ匕カリウム 25gに水 10 mlをカ卩え、よく混ぜた後、水をカ卩えて 100mlとしたもの）を用時、水で 200倍希釈し、 これを、予め lmgZmlの濃度に溶解させた小麦発酵エキス 0. 1mlに 5 1カ卩えて良 く混ぜる。小麦発酵エキスは直ちに溶液は淡紫色力 濃紫色の発色を示した（陽性） 。リムラス陽性糖脂質、低分子量リポ多糖は同様な操作で発色は認められない (陰性 ) o以上の結果を表 6にまとめた。
[0048] 上記結果から明らかなように、小麦発酵エキスはリムラス陽性糖脂質、低分子量リポ 多糖とはタンパク質含量、糖含量、核酸含量 (リムラス陽性糖脂質はデータが無いの で除く）、リムラス活性物質含量、ヨウ素でんぷん反応のすべての項目で異なることが 明白であり、本物質が新規であることが明らかである。以上の結果を簡単に表 7にまと めた。すなわち、本実施例の植物発酵エキスは以下のそれぞれの理ィ匕学的性質を 示す点で、リムラス陽性糖脂質及び低分子量リポ多糖とは異なり新規なものである。 タンパク質含量 5— 15%、糖含量 20— 45%、核酸含量 10— 35%、及びリムラス陽 性物質含量 10— 40%を含み、ヨウ素でんぷん反応に陽性であり、ポリミキシン B存在 下でもマクロファージ活性ィ匕能を示す。
[0049] [表 2] 表 2 発酵ェ 質含量
Figure imgf000019_0001
[0050] [表 3]
表 3 発酵エキス中の糖含量
Figure imgf000019_0002
[0051] [表 4]
表 4 発酵エキス中の核酸含量
Figure imgf000019_0003
[0052] [表 5] 表 5 発酵エキス中のリムラス活性物質含量
Figure imgf000020_0001
[0053] [表 6]
表 6 発酵エキスのョゥ素でんぷん反応
Figure imgf000020_0002
[0054] [表 7]
表 7 小麦発酵エキス及び類似品との相違のまとめ
Figure imgf000020_0003
過小：小麦発酵エキスの数値の幅 (平均士標準偏差)よりも大幅に少な 、値。 過多：小麦発酵エキスの数値の幅 (平均士標準偏差)よりも大幅に多 、値 実施例 3
[0055] 小麦発酵エキスの免疫賦活作用
48穴プレートにヒトマクロファージとして用いられる急性骨髄性白血病細胞株の TH P-1 (1 X 106個/ 250 1: 10%ゥシ胎児血清入り RPMI1640培地）を入れ、予め 30 分間前培養した。各サンプルの終濃度が 1一 lOOOOngZmlになるように培地 250 1 (最終量 500 μ 1)を加えた。サンプルにポリミキシン Β (12. 5 μ g/ml)を含む群を設 けた。 4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。上清の TNF活性は、 L 929 細胞障害試験により測定した。結果を表 8に示す。小麦発酵エキスはポリミキシン B存 在下でもマクロファージから TNFを産生させた力 低分子量リポ多糖及びリムラス陽 性糖脂質はポリミキシン B存在下ではマクロファージから TNFを産生できな力 た。こ のことから小麦発酵エキスは低分子量リポ多糖やリムラス陽性糖脂質とは異なる生物 活性を持つ事が明らかである。
[0056] [表 8] 表 8 小麦発酵エキスによるマクロファージからの T N F産生とポリミキシン
Bによる阻害効果 （小麦発酵エキスの T N F誘導活性）
Figure imgf000021_0001
[0057] Β.小麦発酵エキスの飼料への応用実施例
実施例 4
[0058] 小麦発酵エキス入り養鶏試料 (大規模試験によるブロイラー飼育における斃死抑制 効果)
実施例 2で製造した小麦発酵エキスを 430 gZkg含有する飼料を作製した。供与 鶏はブロイラーコマーシャル鶏を一群約 5500— 6000羽で用いた。対照試験区分は 小麦発酵エキスを含まな!/、飼料である。孵化後 3週齢で小麦発酵エキス入りエサの 投与を開始し 7週齢まで毎日投与した。死亡匹数を毎日測定した。出荷時に基準に 満たない鶏は廃棄した。結果を表 9に示す。試験区 (小麦発酵エキス入り飼料）は除 去率は 1. 9%と少なぐ対照区では 3. 3%に達した。育成率は試験区で 98. 1%とな り、対照区で 96. 7%となったので、 1. 4%の育成率の向上が見られた。出荷実羽数 と除去羽数を試験区と対照区で有意差検定をしたところ％2検定で P< 0. 0001の有 意差が見られた。上のことから小麦発酵エキス入り飼料のブロイラー飼育における感 染防除効果が示された。
[0059] [表 9]
表 9 小麦発酵エキス入り飼料のブロイラー飼育効果
Figure imgf000022_0001
実施例 5
[0060] 小麦発酵エキス入り養殖魚用飼料 (プリ野外試験による感染防除効果）
実施例 2で製造した小麦発酵エキス入り飼料の感染防御効果を野外試験で一群に つき約 5200尾のブリ^!司育した。結果を表 10に示した。連鎖球菌による死亡は非投 与対照で 4. 8%に達した。小麦発酵エキスを 100 /z g/kg/日（体重 lkg、 1日あたり） を摂取させた群 (試験区)と、非投与群 (対照区)では、小麦発酵エキス投与群が有 意に（Pく 0. 00001)死亡率を低下させることが認められた。
[0061] [表 10]
表 1 0 小麦発酵エキス入り飼料の野外試験におけるプリ感染防除効果
Figure imgf000022_0002
実施例 6 [0062] 小麦発酵エキス入り養殖魚用飼料 (コィヘルぺス症に対する感染防除効果）
(1)コィ:体重 70gのマゴィを使用した。試験は 1群 20匹で行った。
(2)コィヘルぺスウィルスの調整：コィヘルぺス感染で死亡したコィのエラ lgに 10mlの ハンクスバランスドソルトソリューション（HBSS)緩衝液をカ卩えてホモジネートし、 0.45ミ クロンのフィルターでろ過し、そのろ液をウィルス溶液とした。
(3)コィヘルぺスウィルスの感染：上記ろ液を 600 1/100g体重で、コィの腹腔内に注 射した。
(4)小麦発酵エキス含有飼料の作成：巿販飼料に、 0、 5、 10、 20mg/kg飼料の割合 で実施例 2で製造した小麦発酵エキスを混合して、作成した。
(5)給餌方法:体重あたり 1%の重量のそれぞれの飼料を 1日 1回給餌した。これは、 小麦発酵エキス量に換算すると、それぞれ、 0、 50、 100、 200 /z g/kg体重/日に相 当する。
(6)実験:小麦発酵エキス含有飼料を 1週間給餌した後、ウィルスを感染させ、その後 10日間小麦発酵エキス含有飼料を給餌した。ウィルス感染操作後 10日間のコィの生 存率を観察した。その結果を図 1に示す。
[0063] 小麦発酵エキス無添加のコィでは、 6日目までに全てのコィが死亡した。一方小麦 発酵エキス含有飼料を給仕した群では、感染 10日目において、生存率はいずれも有 意に増加することが示された (力プランマイヤー法'ログランク試験で危険率 0.01%以 下)。特に小麦発酵エキスを 100 μ g/kg体重/日で給餌した群では 65%の生存率が 示された。
[0064] C.小麦発酵エキスの化粧品'浴剤への応用実施例
実施例 7
[0065] 小麦発酵エキス入りハンドクリームの製造
表 11に記載した配合にぉ ヽて脂溶性基材 1の軟膏に実施例 2で製造した小麦発 酵エキスを 1割前後添加して混合して軟膏を得た。
[0066] [表 11] 組成 用量
白 ワセリン 2 5 0 ε
ステアリルアルコール 2 0 0 g
プロピレンァノレコーノレ 1 2 0 g
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60 4 0 g
モノステアリン酸ダリセリン 1 0 g
パラォキシ安息香酸メチル 1 g
パラォキシ安息香酸プロピル 1 g
精製水 適量 実施例 8
[0067] 小麦発酵エキス入り保湿クリームの製造
1.小麦発酵エキス入り保湿クリーム処方
使用成分を表 12に示した。 A組を 70°Cで加熱溶解し、これに 1Z4量の精製水で 溶き 70°Cで加熱溶解した B組と、 1Z4量の精製水で溶き 70°Cで加熱溶解した C組 を加え、ホモジナイザーで充分混合した後 40°Cまで冷却し、 D組を加えて pHを 6. 8 まで調整した後、残りの精製水と実施例 2で製造した小麦発酵エキスを適量加え、充 分混合して乳液を得る。なお、小麦発酵エキスは、 5mgZmlになるように予め精製 水に溶解しておき、乳液 lOOgに対しては、その 0. 1mlを添加する。
[0068] [表 12]
表 1 2
Figure imgf000025_0001
2.小麦発酵エキス入り保湿クリームの効果
本クリームを男女 43人に使用してもらいアンケート調査を行った。その結果、保湿 効果について確かに効果ありと答えた者が 18名、やや効果ありと答えた者が 18名、 効果なしと答えたものが 2名、無記入が 5名であった（一標本符号検定: P< 0. 0001 )。あれ肌の改善の防止効果について、確かに効果あり良いと答えた者が 6名、やや 効果ありと答えた者が 13名で、効果なしと答えたものは 0名、無記入が 24名であった 。（一標本符号検定: Pく 0. 0001)。使用後の肌の症状の悪ィ匕について、あると答え た者が 0名であった。また、軽度のアトピー様症状を持つ 4名に本クリームを使用して もらいアンケート調査を行ったところ、アトピー性皮膚炎の改善について、確かに効果 ありと答えた者が 3名、やや効果ありと答えた者が 1名であった (一標本符号検定： P < 0. 125)。その他には、にきび跡の治りが早いという者が 1名いた。また、本タリー ムを 9名の男性に髭剃り後に使用してもらいアンケート調査を行ったところ、 8名が髭 剃り後の痛みの軽減、力さっきの防止、かみそり傷の早期治癒などに効果があつたと 答えた（一標本符号検定: P< 0. 01)。さらに五十肩の症状のある 2名が肩に塗って 痛み軽減効果を試したところ、 1名は効果ありと答えた。
[0070] さらに、このクリームを火傷患者に用いた。両手皮膚を同程度に火傷した患者に、 片手に実施例 2で製造した小麦発酵エキスを含むクリームを、もう片方の手に小麦発 酵エキスを含まな ヽクリームを塗り経過を見たところ、小麦発酵エキスを含むクリーム を外用した手の方が明らかに早く回復した。この例を含み 10名の火傷患者に外用し たところ、いずれも小麦発酵エキスを含むクリームを外用した箇所は小麦発酵エキス を含まないクリームを外用した箇所よりも創傷が早く回復した (フイシヤーの直接確率: Pく 0. 0001)。以上のことから本小麦発酵エキスは火傷に対する治療効果を有する ことが示された。
実施例 9
[0071] 小麦発酵エキス入り化粧水の製造
1.小麦発酵エキス入り化粧水処方
使用成分を表 13に示した。小麦発酵エキスは、実施例 2で製造した小麦発酵ェキ スを 5mgZmlになるように予め精製水に溶解しておき、化粧水 lOOgに対しては、そ の 0. 1mlを添カ卩する。
[0072] [表 13]
表 1 3
Figure imgf000026_0001
[0073] 2.小麦発酵エキス入り化粧水の効果
本ィ匕粧水を 5人の女性に使用してもらいアンケート調査を行った。その結果、保湿 効果について良いと答えた者が 3名、普通と答えた者が 2名であった。いずれも肌の トラブルはなかった。 実施例 10
[0074] 小麦発酵エキス入り入浴剤の製造
生体機能の改善を目的として小麦発酵エキスを加えた入浴剤を作製した。入浴剤 の基本成分を表 14に示した。
[0075] [表 14]
表 1 4
Figure imgf000027_0001
[0076] 小麦発酵エキス入り入浴剤としては実施例 2で製造した小麦発酵エキスの 110 /z g を上記成分に添加して作製した。 102人の被験者にブラインドでエキス入りとエキス の入っていない対照を渡し、通常の浴槽（160— 200リットル）に入浴時に用いてアン ケート ((1)体の温まり具合、（2)湯冷めのしにくさ、（3)疲労回復効果、（4)寝付き易さ、
(5)肩こりの取れ具合、（6)筋肉痛に対する効果、（7)神経痛に対する効果、（8)腰痛に 対する効果、（9)冷え性に対する効果、（10)水虫の改善効果、（11)肌の力さっき改善 効果、（12)アトピー性皮膚炎への効果)を行った。その結果、対照に比べて 7%以上 の改善が見られたのは、（1)体の温まり具合 (10%)、（2)湯冷めのしにくさ（7. 9%)、
(6)筋肉痛に対する効果 (13%)、（8)腰痛に対する効果 (16%)、（9)冷え性 (10%)、 (11)肌のかさつき改善効果（7. 3%)に対する効果であった（Mantel— Haenszel検 定: P< 0. 04)。以上の結果から、小麦発酵エキスを入浴剤として用いることで、痛み に対する緩和効果と、体の温まりぐあ！ヽを改善することが認められた。
[0077] D.小麦発酵エキスの機能性食品への応用実施例
実施例 11
[0078] 小麦発酵エキス入りァメの製造
(1)原材料としてグラニュー糖、水飴、水に実施例 2で製造した小麦発酵エキスをカロ えたものを 5 : 5 : 5 : 1の割合で混合し、加熱して 120°C— 160°Cで煮詰める。
(2) 1で得たものを冷却用鉄板上で冷却し、棒状に引き伸ばして lg前後の粒状に成 型し飴を得た。 [0079] 本ァメ適量を水 20mlに入れ、加熱することで溶解させた。この溶液中の小麦発酵 エキス有効成分としてリポ多糖量を測定したところ、 4. 6 g/gであった。このァメを、 風邪をひいてのどの痛みのある男女 6名に摂取させた。その後、直ちにのどの痛み に対するアンケート調査を行った。のどの痛みについては、 6名とも痛みが軽減したと 感じた (一標本符号検定: P< 0. 03)。
実施例 12
[0080] 小麦発酵エキス入りアルコール分解機能増強食品の製造
現在、アルコール分解機能増強食品として、市販されている製品に実施例 2で製造 した小麦発酵エキスを混合し、新たな効果として咽喉痛の緩和が認められる力否かを 検討した。
市販製品：商標「飲んでお息」
成分を表 15に示した。
[0081] [表 15]
表 1 5
Figure imgf000028_0001
[0082] 現在の「飲んでお息」には、あまちゃずるエキス及び緑茶エキスが含まれているが、 植物エキスの有効成分のひとつであるリポ多糖量はわずかに 1包あたり 0. 002 g 程度である。従ってリポ多糖含有量が多 、小麦発酵エキスを適正量添加することによ り、新たな機能を獲得することが期待される。小麦発酵エキスの有効成分のひとつで あるリポ多糖を 1包 2g当たりに 1一 30 g (小麦発酵エキスとして 5— 150 g)配合す るのが望ましいので、先ず 1包に 50 gの小麦発酵エキスが配合された製品を製造 した。飲んでお息の製造工程において lOOgの製品当たり、実施例 2で製造した小麦 発酵エキス 2. 5mgをカ卩えた。その結果、製品 2gあたり、 50 gの小麦発酵エキスを 含む新 、製品が製造された。
[0083] 飲酒しながらカラオケに興じ咽喉痛を訴える成人男女 20名を対象にして、これまで の「飲んでお息」と小麦発酵エキスを含んだ「飲んでお息」を 10名ずつに服用させ、 公知の効果であるアルコール分解能強化効果、及び咽喉痛緩和効果にっ 、て検討 した。その後、直ちに咽喉痛緩和効果に対するアンケート調査を行った。その結果、
「小麦発酵エキス入り飲んでお息」には咽喉痛の軽減が 10名中 8名認められ、対象 の「飲んでお息」の 10名中 2名の効果と比較して統計的に有意な差 (フイシヤーの直 接確率: P< 0. 012)が認められた。
[0084] E.小麦発酵エキスの薬効実施例
実施例 13
[0085] 小麦発酵エキス入りグリセロール溶液の製造 (アトピー性皮膚炎に対する治療効果） 顔面、手足、体躯、首、腕、背部等に皮疹が観察され、自覚症状が中等度から高度 症状を示す難治性のアトピー性皮膚炎患者男女 9人 (25歳から 34歳）に実施例 2で 製造した小麦発酵エキス 50 g/mlを含む 50%グリセロール溶液を患者に一日 2— 3 回、一回当たり 2— 3mlを服用させた。自覚症状 (搔痒感）は患者の訴えにより、軽度 、中等度、高度に分類した。 2週間力も 2ヶ月使用後に再度受診し、効果を評価した。 結果は著効 (皮疹の著明改善と自覚症状の殆どの消失)が 4名 (44%)、有効 (皮疹 の軽度改善と自覚症状の減少）が 4名（44%)、不変が 1名（11%)で、悪化が 0名で あった (一標本符号検定: P< 0. 03)。以上から有効率 89%と判定された。
実施例 14
[0086] 小麦発酵エキスの鎮痛作用
実施例 2で製造した小麦発酵エキスを蒸留水に溶かし、マウスにゾンデを用いて一 匹当たり、 0. 2mlを経口投与した。 90分後にマウスに 0. 7%の酢酸を腹腔内投与し 、 5分間様子を見た後に、 30分間に起こる身もだえ数を測定した。結果を表 16に蒸 留水投与対照の身もだえ数を 30%阻害するのに必要な各試料の量として示した。大 腸菌由来の低分子量リポ多糖の有効活性を 1とした時に小麦発酵エキスは 7となり、 小麦発酵エキスが優れた鎮痛作用を示すことが認められた。
[0087] [表 16] 表 1 6 小麦発酵エキスのマウス酢酸に対する鎮痛作用
Figure imgf000030_0001
実施例 15
[0088] 小麦発酵エキスのアトピー性皮膚炎抑制効果
小麦発酵エキスのアトピー性皮膚炎に対する効果を調べるために、 I型アレルギー モデルを導入した。一群 3— 4匹の雄性の BALB/cマウスに抗ジ-トロフエ-ル、マウス モノクローナル抗体を 1 μ g/マウスで静脈投与した。一時間後に実施例 2で製造した 小麦発酵エキス (4 g/マウス)を腹部皮内投与または経口投与（100 g/マウス）し、 さらに 1時間後に、マウスの耳介の表裏に 0. 25%ジニトロフルォロベンゼン含有ァセ トン オリーブォィル混合溶液 (4対 1)をアレルゲンとして 20 1塗布した。塗布後、 1 、 2、 24及び 48時間目の耳介の厚さをシクネスゲージで測定し、塗布直前の厚さとの 差 (△)を浮腫の程度とした。薬剤投与の効果は、アレルゲン投与 1時間後に認めら れる早期反応と、 24時間後に誘導される遅発反応、それぞれの抑制を以下の式によ つて求められる抑制率で評価した。 {抑制率 = (1 薬剤投与後の 耳介の浮腫/対 照の 耳介の浮腫） X 100}結果を表 17に示す。表力も明らかなように、小麦発酵ェ キスは皮内投与でも、経口投与でもアレルギー反応を抑制した。
[0089] [表 17]
表 1 7 小麦発酵エキスのアレルギー反応抑制効果
Figure imgf000030_0002
実施例 16
[0090] 小麦発酵エキスの感染予防効果
小麦発酵エキスの感染予防効果を調べるために、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（ MRSA)感染モデルを導入した。一群 10匹の雄性の BALB/cマウス（6— 8週齢）にサ イク口フォスフアミド (CY) 200mg/kgを腹腔内投与し、 5日後に実施例 2で製造した 小麦発酵エキスを皮内投与した。 3時間後に MRSA (3 X 107コロニーフォーミングュ ニット (CFU) )を静脈内投与し、生存日数を調べた。結果を表 18に示した。表から明 らかなように小麦発酵エキスは生理食塩水 (対照)群に比べて統計学的に有意な（％ 2検定、 P< 0. 001)差で MRSAに対する感染予防効果が認められた。
[0091] [表 18]
表 1 8 小麦発酵エキスの MR S A感染予防効果
Figure imgf000031_0001
実施例 17
[0092] 小麦発酵エキスの転移がん治療効果
小麦発酵エキスの転移がん治療効果を調べるために、 MethAがん細胞の肺転移 モデルを導入した。一群 10匹の雄性の BALB/cマウス（6— 8週齢）に MethA細胞を 1 X 105細胞静脈内投与し、 12日後より 4日間連日、実施例 2で製造した小麦発酵ェ キスを皮内投与した。細胞移植 20日後に剖検し、肺を摘出し、ホルマリン固定を行つ た。肺を肉眼で観察し、結節数を測定した。結果を表 19に示した。表力も明らかなよ うに小麦発酵エキスは生理食塩水 (対照)群に比べて統計学的に有意な (t -検定、 P < 0. 001)差で MethAの肺転移癌に対する治療効果が認められた。
[0093] [表 19]
表 1 9 小麦発酵エキスの M e t h A肺転移がん治療効果
Figure imgf000031_0002
[0094] F.お力 発酵エキスに関連する実施例
実施例 18
[0095] おから発酵エキスの製造
(1) 2リットルの三角フラスコに 1.0リットルの水と、リン酸第一カリウム 0.2g、リン酸第二 ナトリウム 1.15g、食塩 8g、塩ィ匕カリウム 0.2gをカ卩えた。
(2) 1に乾燥お力も 20gをカロえた。 (3) 2をオートクレーブで滅菌した。
(4)種菌の調製。前もって同じ組成で調製した 2%お力 培地 5mlに小麦粉より単離 しておいたパントエア'アグロメランスのコロニーを一つ加え 37°Cでー晚（15時間）緩 やかに撹拌し、発酵させて、おから発酵用の種菌を準備した。
(5) 3に 4を全量カ卩ぇ 37°Cで緩やかに撹拌しながら、 48時間発酵させた。
(6) 5のお力も発酵溶液をオートクレープで 120°C20分間の加熱抽出をした。これを 遠心分離 (クボタ 8800、 2000rpm、 10分間）し、上澄みを回収し、おから発酵ェキ スとした。
(7)乾燥重量の測定 0. 3mlを予め秤量した 1. 5mlプラスチックチューブに移し、凍 結後、凍結乾燥機にて、凍結乾燥を行ったところ 5. 97mgで衡量となった。したがつ て、 6のおから発酵エキスの乾燥重量は溶液 lml当たり 19. 9mg、全量 1000ml当た り、 19. 9gであった。
(8)ブラッドフォード法によるタンパク質定量 BSAを標準タンパク質として、 10倍希釈 したサンプルでタンパク質量を測定した。結果を表 15に示した。
(9)核酸含有量の測定 100倍希釈したサンプルの 210— 340nmの吸光度測定を 行った。 260nmの吸光度から 320nmの吸光度を引いた値と、 DNAとしての吸光度 10Dあたり、 50 /z gとしての最大含有量を算出した。
(10)糖含量の測定 フエノール硫酸法によりグルコースを標準糖として測定した。
(11)リムラスアツセィによるリムラス活性物質含有量の測定 リムラス活性物質量は生 化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業 E t 1を用いた。結果を表 20に示した
[表 20]
表 2 0 おから発酵エキス中の成分含量
Figure imgf000032_0001
実施例 19 [0097] おから発酵エキスの免疫賦活作用
48穴プレートにヒトマクロファージとして用いられる急性骨髄性白血病細胞株の THP 1 (1 X 106個/ 250 1: 10%ゥシ胎児血清入り RPMI1640培地）を入れ、予め 30 分間前培養した。各サンプルの終濃度が 100— lOOOOngZmlになるように培地 25 0 μ 1 (最終量 500 μ 1)を加えた。サンプルにポリミキシン Β (12. 5 μ g/ml)を含む群 を設けた（100ng/mlのみポリミキシン Bを含む群なし)。 4時間培養した後、培養上 清と細胞を回収した。上清の TNF活性は、 L 929細胞障害試験により測定した。結 果を表 21に示す。お力 発酵エキスはポリミキシン B存在下でもマクロファージ力 T NFを産生させた力 低分子量リポ多糖はポリミキシン B存在下ではマクロファージか ら TNFを産生できな力つた。このことからお力も発酵エキスは低分子量リポ多糖とは 異なり、小麦発酵エキスと同様の生物活性を持つ事が明らかである。
[0098] [表 21]
表 2 1 おから発酵エキスによるマクロファージからの T N F産生とポリミキシン Bによ る阻害効果 （おから発酵エキスの T N F誘導活性） おから発酵エキスの T N F誘導活性とポリミキシン Bによる阻害効果 （T N F活性）
Figure imgf000033_0001
N. D. ：未測定
[0099] G.米粉発酵エキスの関連する実施例
実施例 20
[0100] 米粉発酵エキスの製造
(1) 2リットルの三角フラスコに 1.0リットルの水と、リン酸第一カリウム 0.2g、リン酸第: ナトリウム 1.15g、食塩 8g、塩ィ匕カリウム 0.2gをカ卩えた。
(2) 1に乾燥米粉 20gを加えた。
(3) 2をオートクレーブで滅菌した。 (4)種菌の調製。前もって同じ組成で調製した 2%米粉培地 5mlに小麦粉より単離し ておいたパントエア'アグロメランスのコロニーを一つ加え 37°Cでー晚（15時間）緩や かに撹拌し、発酵させて、米粉発酵用の種菌を準備した。
(5) 3に 4を全量カ卩ぇ 37°Cで緩やかに撹拌しながら、 72時間発酵させた。
(6) 5の米粉発酵溶液をオートクレープで 120°C20分間の加熱抽出をした。これを遠 心分離 (クボタ 8800、 2000rpm、 10分間）し、上澄みを回収し、米粉発酵エキスと した。
(7)リムラスアツセィによるリムラス活性物質含有量の測定 リムラス活性物質量は生 化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業 E t 1を用いた。米粉発酵エキス中のリムラス活性物質含有量は 1. 7 ;^/πι1と測定さ れた。
実施例 21
[0101] 米粉発酵エキスの免疫賦活作用
48穴プレートにヒトマクロファージとして用いられる急性骨髄性白血病細胞株の ΤΗ Ρ-1 (1 X 106個/ 250 1: 10%ゥシ胎児血清入り RPMI1640培地）を入れ、予め 30 分間前培養した。各サンプルの終濃度が 1一 lOOOOngZmlになるように培地 250 1 (最終量 500 μ 1)を加えた。サンプルにポリミキシン Β (12. 5 μ g/ml)を含む群を設 けた。 4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。 4時間培養した後、培養上清 と細胞を回収した。上清の TNF活性は、 L 929細胞障害試験により測定した。結果 を表 22に示す。米粉発酵エキスはポリミキシン B存在下でもマクロファージカも TNF を産生させた力 低分子量リポ多糖はポリミキシン B存在下ではマクロファージから T NFを産生できな力 た。このことから米粉発酵エキスは低分子量リポ多糖やリムラス 陽性糖脂質とは異なる生物活性を持つ事が明らかである。
[0102] [表 22] 表 2 2 米粉発酵エキスによるマクロファージからの T N F産生とポリミキシン Bによる 阻害効果 （米発酵エキスの T N F誘導活性）
Figure imgf000035_0001
[0103] H.わかめ発酵エキスに関連する実施例
実施例 22
[0104] わかめめかぶ発酵エキスの製造
(1) 2リットルの三角フラスコに 1.0リットルの水と、リン酸第一カリウム 0.2g、リン酸第二 ナトリウム 1.15g、食塩 8g、塩ィ匕カリウム 0.2gをカ卩えた。
(2) 1に乾燥わかめめかぶ 20gをカ卩えた。
(3) 2をオートクレーブで滅菌した。
(4)種菌の調製。前もって同じ組成で調製した 2%わかめめかぶ培地 5mlに小麦粉よ り単離しておいたパントエア'アグロメランスのコロニーを一つ加え 37°Cでー晚（15時 間)緩やかに撹拌し、発酵させて、わかめめかぶ発酵用の種菌を準備した。
(5) 3に 4を全量カ卩ぇ 37°Cで緩やかに撹拌しながら、 72時間発酵させた。
(6) 5のわかめめかぶ発酵溶液をオートクレーブで 120°C20分間の加熱抽出をした。 これを遠心分離（クボタ 8800、 2000rpm、 10分間）し、上澄みを回収し、わかめめ かぶ発酵エキスとした。
(7)リムラスアツセィによるリムラス活性物質含有量の測定 リムラス活性物質量は生 化学工業のトキシカラーシステムを用い、標準リムラス活性物質として、生化学工業 E t 1を用いた。わかめめかぶ発酵エキス中のリムラス活性物質含有量は 132 g/ml と測定された。
実施例 23
[0105] わかめめかぶ発酵エキスの免疫賦活作用 48穴プレートにヒトマクロファージとして用いられる急性骨髄性白血病細胞株の TH P-1 (1 X 106個/ 250 1: 10%ゥシ胎児血清入り RPMI1640培地）を入れ、予め 30 分間前培養した。各サンプルの終濃度が 1一 lOOOOngZmlになるように培地 250 1 (最終量 500 μ 1)を加えた。サンプルにポリミキシン Β (12. 5 μ g/ml)を含む群を設 けた。 4時間培養した後、培養上清と細胞を回収した。 4時間培養した後、培養上清 と細胞を回収した。上清の TNF活性は、 L 929細胞障害試験により測定した。結果 を表 23に示す。わかめめかぶ発酵エキスはポリミキシン B存在下でもマクロファージ から TNFを産生させた力 低分子量リポ多糖はポリミキシン B存在下ではマクロファ ージから TNFを産生できな力つた。このことからわかめめかぶ発酵エキスは低分子量 リポ多糖やリムラス陽性糖脂質とは異なる生物活性を持つ事が明らかである。
[0106] [表 23]
表 2 3 わかめめかぶ発酵エキスによるマクロファージからの T N F産生とポリミキシン Bによる阻害効果 （わかめめかぶ発酵エキスの T N F誘導活性）
Figure imgf000036_0001
産業上の利用可能性
[0107] 本発明により、安全な免疫賦活物質である植物発酵エキスを安価に製造することが 可能となり、こうして得られた植物発酵エキスは、ヒトを含む哺乳動物 (具体的には家 畜、愛玩動物など)、鳥類 (具体的には養鶏、愛玩鳥類など)、両生類、は虫類、魚類 (具体的には、水産養殖魚、愛玩魚類など)、無脊椎動物に及ぶ医薬品、動物用医 薬品、医薬部外品、化粧品、食品、機能性食品、飼料及び浴用剤に利用できる。

Claims

請求の範囲
[I] 食用植物に由来する素材を専ら植物に共生する通性嫌気性グラム陰性菌によって 発酵させて、同時に該通性嫌気性グラム陰性菌を培養することを特徴とする発酵及 び培養方法。
[2] 前記素材は、専ら食用に供されるものであることを特徴とする請求項 1記載の発酵 及び培養方法。
[3] 炭素源として澱粉を発酵させることを特徴とする請求項 1又は 2記載の発酵及び培 養方法。
[4] 前記通性嫌気性グラム陰性菌が桿菌であることを特徴とする請求項 1乃至 3いずれ かに記載の発酵及び培養方法。
[5] 前記通性嫌気性桿菌が腸内細菌科に属するものであることを特徴とする請求項 4 記載の発酵及び培養方法。
[6] 前記通性嫌気性桿菌がパントエア属、セラチア属、又はェンテロパクター属に属す るものであることを特徴とする請求項 4記載の発酵及び培養方法。
[7] 前記通性嫌気性桿菌がパントエア'アグロメランスであることを特徴とする請求項 4 記載の発酵及び培養方法。
[8] 前記食用植物が穀物、海草、若しくは豆類、又はこれらの混合物であることを特徴 とする請求項 1乃至 7いずれかに記載の発酵及び培養方法。
[9] 前記穀物に由来する素材が小麦粉、米粉、小麦ふすま粉、米ぬか、又は酒かすで あることを特徴とする請求項 8記載の発酵及び培養方法。
[10] 前記海草に由来する素材がわかめ粉、めかぶ粉、又は昆布粉であることを特徴と する請求項 8記載の発酵及び培養方法。
[II] 前記豆類に由来する素材がお力 であることを特徴とする請求項 8記載の発酵及 び培養方法。
[12] 請求項 1乃至 11いずれかに記載の発酵及び培養方法で得られることを特徴とする 植物発酵エキス。
[13] 請求項 12記載の植物発酵エキスから得られることを特徴とする植物発酵エキス末。
[14] 請求項 12記載の植物発酵エキス又は請求項 13記載の植物発酵エキス末が配合 されて ヽることを特徴とする植物発酵エキス配合物。
[15] 前記植物発酵エキス配合物が医薬品、動物用医薬品、医薬部外品、化粧品、食品 、機能性食品、飼料、又は浴用剤であることを特徴とする請求項 14記載の植物発酵 エキス配合物。
[16] 以下の理化学的性質を示すことを特徴とする請求項 12記載の植物発酵エキス。
ポリミキシン B存在下でもマクロファージ活性ィ匕能を示す。
[17] 免疫賦活活性を持つことを特徴とする請求項 12又は 16記載の植物発酵エキス。
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