NO342031B1

NO342031B1 - Fremgangsmåte for fermentering og dyrking, fermentert planteekstrakt, fermentert planteekstraktpulver og blanding inneholdende det fermenterte planteekstraktet

Info

Publication number: NO342031B1
Application number: NO20170687A
Authority: NO
Inventors: Chie Kohchi; Hiroyuki Inagawa; Takashi Nishizawa; Yukinori Takahashi; Gen-Ichiro Soma
Original assignee: Biomedical Res Group Inc; Soma Genichiro
Priority date: 2003-09-26
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2018-03-12
Also published as: NO20061742L; NO340880B1; ES2599830T3; US20070172492A1; NO20170687A1; RU2006114032A; IL174166A0; ES2542986T3; EP1676908A1; US8075928B2; NZ586941A; JP4026722B2; CA2537890C; EP1676908B1; KR101228993B1; JP2011193877A; JP5517215B2; IL174166A; AU2004276123B2; KR20120031522A

Abstract

Det beskrives en fremgangsmåte for trygg og økonomisk fremstilling av et fermentert planteekstrakt som inneholder et immunpotenserende middel i en høy konsentrasjon, hvor fremgangsmåten for fermentering og dyrkning ifølge foreliggende oppfinnelse fermenterer en plantekomponent så som hvetemel, ved bruk av Pantoea agglomerans, som er en gram negativ bakterie som lever i symbiose med en plante, så om hvete og eple. Det blir herved mulig bemerkelsesverdig å øke en immunpotenserende virkning som planten har. Dessuten er disse ikke kontaminert med forurensninger som skriver seg fra animalske komponenter, og disse er således i høy grad trygge.

Description

Oppfinnelsesområde

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fermentering og dyrkning for å oppnå et immunpotenserende middel som er trygt når det tilsettes i farmasøytika, farmasøytika for dyr, kvasi-medikamenter, kosmetikk, næringsmidler, funksjonell mat, fôr og bademidler for pattedyr, inklusivt mennesket (nærmere bestemt husdyr, kjæledyr, etc), fugler (nærmere bestemt burhøns, selskapsfugler, etc.) amfibier, reptiler, fisk (nærmere bestemt oppdrettsfisk, gullfisk, etc.) og invertebrater, en fremgangsmåte for fremstilling av et fermentert planteekstrakt, et fermentert planteekstrakt som inneholder det immunpotenserende middel oppnådd etter fremgangsmåten for fermentering og dyrkning, pulver som inneholder det immunpotenserende middel oppnådd fra det fermenterte planteekstrakt, og en fermentert planteekstraktblanding som inneholder det fermenterte planteekstrakt.

Teknikkens stand

Det er et påtrengende problem å etablere sykdomsforhindrende og terapeutiske metoder som inkluderer infeksjonsforhindrende teknologi for pattedyr, inklusivt mennesker (nærmere bestemt husdyr, kjæledyr, etc.), fugler (nærmere bestemt burhøns, selskapsfugler, etc.) amfibier, reptiler, fisk (nærmere bestemt oppdrettsfisk, gullfisk, etc.) og invertebrater. For å oppnå dette er det et sterkt behov for fremgangsmåter som ikke benytter kjemikalier, er uten miljøforurensende virkning, uten å produsere resistente bakterier og uten akkumulering i menneskekroppen. Oppfinnerne har allerede for ovennevnte problemer funnet at de immunpotenserende midlene avledet fra planter, så som vannekstrakt av hvete, sikkert fører til sykdomsforhindring og terapeutiske effekter (patentdokument 1, ikke-patent-dokument 1). For å oppnå ovennevnte har oppfinnerne også funnet det mulig å benytte lavmolekylære lipopolysakkarider oppnådd fra Pantoea agglomerans, som er en bakterie i symbiose med hvete (ikke-patentdokument 2). Imidlertid har nylige studier vist at forskjellige substanser utenom lipopolysakkarider oppviser den immunpotenserende effekt, og flere av disse naturlige materialene som inneholder det immunpotenserende middel har tiltrukket seg oppmerksomhet.

Fermenteringsteknikk hvor det benyttes mikrober har vært vanlig benyttet ikke bare innen næringsmiddelområdet, men også på bredere felt. Fermentering har vært utstrakt anvendt for fremstillingen av alkoholer, inklusivt viner, fremstillingen av soyasauser og soyabønnepastaer, fremstillingen av fermenterte melkeprodukter, som f.eks. ost, og fremstillingen av farmasøytika. Mikrobene benyttet for disse fermenteringene er mange, og rismalt (sopp), gjær og melkesyrebakterier er representative, men bruk av gramnegative bakterier har sjelden vært rapportert. Generelt er fermentering det fenomen at organisk materiale dekomponeres ved mikrobiell virkning, og betyr i videre betydning at en anvendelig substans produseres av mikroben (ikke-patent-dokument 3).

Representativt for fermentering ved bruk av mikrober er vinfremstilling. Vinfremstillingen er den fermenteringsteknikk hvor det benyttes vingjær som kleber til drueskinnet, og produktet er alkohol. I fermenteringsteknologi hvor det benyttes mikrober, som de som gjør bruk av gramnegative bakterier, metanfermentering som gjør bruk av metanbakterier, eddiksyrefermentering som gjør bruk av eddiksyrebakterier og etanolfermentering (tequila-fermentering) fra rotstokker fra meksikansk agave ved å benytte Zymomonas mobilis, har vært kjent, men fermenteringskultur ved bruk av en spiselig plante som materiale og ved bruk en mikrobe som kjennetegnes ved å leve i symbiose med plante, har vært lite kjent, og det immunpotenserende middel har aldri tiltrukket seg oppmerksomhet som et fermentert produkt. Dessuten har fremgangsmåten for fermentering og dyrkning med det formål å fremstille det immunpotenserende middel aldri tiltrukket seg oppmerksomhet.

Når fermentering foretas av mikroben er det i alminnelighet næringsbetingelser som et fermenteringssubstrat må oppfylle for mikrobiell vekst. Det vil si at forekomsten av tilgjengelige substanser som næringsstoffer for mikroben er essensielle, dvs. med et tilstrekkelig innhold av monosakkarider som glukose og fruktose som karbonkilder. Frukt som f.eks. druer som inneholder rikelig med fruktose kan derfor utnyttes som fermenteringssubstrat uten noen prosessering. I andre tilfeller derimot fordres en forbehandling, så som oppvarming og enzymbehandling for fermentering ved hjelp av mikroben. For eksempel er ovennevnte Zymomonas mobilis en mikrobe som benyttes for tequila-fermenteringen. I dette tilfellet dekomponeres polysakkarider oppnådd fra rotstokken av meksikansk agave, som ikke er en spiselig plante, til fermenterbare monosakkarider ved oppvarming, hvorpå monosakkaridene fermenteres av mikroben for å gi alkoholen som fermenteringsproduktet. Når det for fermenteringskulturen benyttes en typisk mikrobe, er polysakkarider som sådanne derfor ikke egnet som fermenteringssubstrat. For eksempel har det vært beskrevet at Pantoea agglomerans ikke kan dekomponere stivelse (ikke-patent-dokument 4).

Vi har vist at en aktiv komponent for potensering av immuniteten inngår i et vandig ekstrakt av hvetemel (ikke-patent-dokument 5). Vi har også vist at den aktive komponent inngår i matkorn (hvete, ris), alger (brunalger, tang, hijiki (brunalge) og rødalg) og bønner (soyabønne og adzukibønne) (ikke-patentdokument 6). Denne biologiske aktivitet har vist seg å ha forebyggende effekter på sykdommer hos menneske og mus (diabetes, hyperlipemi, atopisk dermatitt, cancer) og kan være effektive til å forhindre infeksjon hos fisk, skalldyr og høns (patent-dokument 1, ikke-patent-dokument 1). For å forvente nevnte effekt av den vandige ekstrakt av hvetemel er det imidlertid nødvendig å innta hvetemelet i store mengder.

Imidlertid er Pantoea agglomerans en bakterie som lever i symbiose med hvete, og som anses å være nyttig ved dyrkning av hvete, siden bakterien tilfører hveten fosfor og nitrogen (ikke-patent-dokument 7). Pantoea agglomerans avsetter seg ikke bare på hvete, men også på epidermis av pærer og epler. Det har i Europa vært demonstrert at rotsykdommer som følge av sopp kan forhindres når denne bakterie ”deposits”, og utvikling av utnyttelse av denne bakterie som et miljøvennlig fungicid uten noen toksisitet er i gang (ikke-patent-dokument 8).

Symbiose er blitt definert som ”et fenomen hvor xenogene organismer lever sammen. I dette tilfellet betyr det vanligvis konstant å holde et adferdsmessig eller fysiologisk nært forhold. Det faller således ikke inn under dette konsept bare å leve i det samme habitat. Symbiose klassifiseres og inndeles i forskjellige kategorier avhengig av meningen og livsnødvendigheten av symbiosepartneren, bærekraften av forholdet og den romlige posisjonering av symbiosepartneren. Generelt er symbiose bredt inndelt i tre, mutualisme, kommensalisme og parasittisme, på grunnlag av forekomst eller fravær av levefordeler/ulemper hos symbiosepartnerne”. (Ikke-patent-dokument 9). Det har vært kjent at Pantoea agglomerans er separert fra hvete i hver region og hver type (ikke-patent-dokument 5) og også separert fra frukt (ikke-patent-dokument 10, 11). Det har vært rapportert at Pantoea agglomerans beskytter planter mot sopp eller andre bakterier ved å produsere antibiotika (ikke-patent-dokument 12, 13) og foretar fosfor- og nitrogenfiksering (ikke-patent-dokument 7). Pantoea agglomerans anses derfor alltid å være tilstede i planter og spille en rolle til planters fordel. Dets levemåte anses som ”symbiose” men ikke som ”parasittisme”. Dessuten har vi vist at den aktive komponent for potensering av immunitet inngår i Pantoea agglomerans. Vi har også funnet at det lavmolekylære lipopolysakkarid oppnådd fra denne bakterie har forebyggende virkninger på human- og musesykdommer (diabetes, hyperlipemi, atopisk dermatitt, cancer) og er effektiv til forhindring av infeksjon av fisk, skalldyr og høns (patent-dokument 3, ikke-patent-dokument 2).

I denne sammenheng har vi utviklet den idé å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av et fermentert planteekstrakt ved å benytte Pantoea agglomerans som en fremgangsmåte for fremstilling av et trygt og billig immunpotenserende middel. Det vil si at vi har fokusert på (1) dyrkning av Pantoea agglomerans til lave omkostninger ved å benytte et medium inneholdende hovedproteinkomponenter inkludert i en dyrkningsløsning avledet fra planter så vel som fermentering av en plantekomponent og (2) fremstilling av materialer som inneholder rikelige mengder Pantoea agglomerans i planten eller et fermenteringsprodukt, for derved å utvikle farmasøytika, farmasøytika for dyr, kvasimedikamenter, kosmetika, funksjonell mat, næringsmidler, fôr og bademidler, for pattedyr, inklusivt mennesker (nærmere bestemt husdyr, kjæledyr, etc.), fugler (nærmere bestemt burhøns, selskapsfugler, etc.), amfibier, reptiler, fisk (nærmere bestemt oppdrettsfisk, gullfisk, etc.) og invertebrater. Dette betyr imidlertid ikke at mikroben som lever i symbiose med en plante, direkte kan utnytte plantekomponentene, f.eks. materialet avledet fra en spiselig plante, som et fermenteringssubstrat. For eksempel er hvetemel en sammensatt organisk substans av stivelse som er tilstede i hvetekorn, men isolert fra Pantoea agglomerans som er en symbiotisk mikrobe med hvete via det ytre skall og som ikke er i direkte kontakt. Det kan derfor ikke demonstreres ved et symbiotisk forhold mellom mikroben og hvete om Pantoea agglomerans kan fermentere og dyrkes ved å benytte hvetemel eller ikke. Det har faktisk ikke i det hele tatt vært kjent og rapportert at Pantoea agglomerans kan assimilere hvetemel. På grunnlag av offentlig kjente fakta har det derimot vært beskrevet at Pantoea agglomerans ikke kan utnytte hvetestivelse som fermenteringssubstratet.

Glucider som planter inneholder foreligger ofte som stivelse, og dette er bemerkelsesverdig i spiselige planter, særlig matkorn. Vanligvis har mikrober ikke en funksjon hvor stivelse sterkt assimileres. I denne henseende er det kjent at en del av fakultative gramnegative bakterier kan fermentere stivelse. For eksempel er Erwinia kjent å være i stand til å assimilere stivelse. Ved denne fermentering, hvor stivelse fermenteres, er det imidlertid meningen å utnytte mikrobens amylaseaktivitet ved å tilsette mikroben dyrket i store mengder i et annet optimalt medium, og det har aldri vært tanken at selve dyrkningen foretas ved å benytte stivelse og at fermentering skjer i denne sammenheng. Ved den konvensjonelle teknologi anses det som fermenteringsformålet bare effektivt å utnytte amalyseaktiviteten til mikroben, og det er ikke planlagt å dyrke mikroben ved å benytte stivelse som substratet. I eksemplene i henhold til foreliggende oppfinnelse er det imidlertid angitt at det produseres et fermentert produkt i tillegg til veksten av mikroben, ved å benytte stivelse som eneste karbonkilde, og foreliggende oppfinnelse er vesentlig forskjellig fra den konvensjonelle teknologi ved at det i henhold til foreliggende eksempel ikke bare er fermentering, men også fermentering og dyrkning.

Dersom på den annen side, en viss mikrobe bibeholder evnen til å dekomponere stivelse, betyr ikke dette direkte at mikroben kan vokse ved å benytte stivelse som substratet. Etter dyrkningen er, dersom det også siktes mot vekst av mikroben, mengden av den tilsatte mikrobe ved start av kulturen, ekstremt liten. I så fall er denne aktivitet, selv om mikroben har en viss amylaseaktivitet, for svak til tilstrekkelig å dekomponere substratet, og veksten av mikroben oppnås ikke. Det har faktisk vært antatt at mange mikrober ikke kan vokse ved å benytte stivelse som eneste karbonkilde.

Dersom imidlertid fermenteringen og dyrkningen kan foretas ved å benytte Pantoea agglomerans i mediet som inneholder hvetemel som hovedkomponent, for å fremstille et fermentert planteekstrakt (heretter refereres det fermenterte planteekstrakt oppnådd ved fermentering og dyrkning under bruk av Pantoea agglomerans i mediet som inneholder hvetemel som hovedkomponent, som et fermentert hveteekstrakt) som er rikholdig på et immunpotenserende middel, til lave omkostninger. Som eksempler burde det være mulig å tilveiebringe farmasøytika, farmasøytika for dyr, kvasi-medikamenter, kosmetika, næringsmidler, funksjonell mat, fôrstoff, og bademidler, som er miljøvennlige, sikre og effektive for forhindring av infeksjon hos mennesker og på områdene feavl og akvakultur. Foreliggende oppfinnelse er gjennomført ved å benytte den mulighet som ble oppdaget ved at Pantoea agglomerans vokste under bruk av hvetemel som substratet og ved en gjennomføring av omfattende forsøk i denne sammenheng.

Det fermenterte planteekstrakt som tilveiebringes gjennom foreliggende oppfinnelse, er en generisk betegnelse som omfatter en kulturløsning som selv er oppnådd ved fermentering og dyrkning, en væskekomponent oppnådd ved faststoff/væskeseparasjon av denne kulturløsningen, og en væskekomponent oppnådd ved å foreta en ekstraksjonsprosess på en fast komponent oppnådd ved bruk av faststoff/væskeseparasjonen. Det vil si at det fermenterte planteekstrakt omfatter selve kulturløsningen som er oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten for fermentering og dyrkning i henhold til foreliggende oppfinnelse og alle ekstrakter som kan fremstilles ved å benytte hele eller en del av kulturløsningen. Selvsagt kan det fermenterte planteekstrakt benyttes som tørket fermentert planteekstraktpulver eller oppløst fermentert planteekstraktpulver ved en passende konsentrasjon i et riktig løsningsmiddel, f.eks. som fosfatbufferløsning, inklusivt normal saltløsning.

[Patent-dokument 1] Japanese Unexamined Patent Application Publication No. H3-218466.

[Patent-dokument 2] Japanese Unexamined Patent Application Publication No. H8-198902.

[Patent-dokument 3] WO 00/57719

[Patent-dokument 4] Japanese Unexamined Patent Application Publication No. H6-78756.

[Patent-dokument 5] Japanese Unexamined Patent Application Publication No. H4-187640.

[Patent-dokument 6] Japanese Unexamined Patent Application Publication No. H4-49240.

[Patent-dokument 7] Japanese Unexamined Patent Application Publication No. H4-99481.

[Patent-dokument 8] Japanese Unexamined Patent Application Publication No. H5-155778.

[Ikke-patent-dokument 1] Inagawa, H et al., Biotherapy 5 (4), s.617-621, 1991.

[Ikke-patent-dokument 2] Soma G, et al., ”Tumor necrosis Factor: Molecular and Cellular Biology and Clinical Relevance”, s.203-220, 1993.

[Ikke-patent-dokument 3] Yamada T. et al., ”Seibutsugaku Jiten” 3. utg., s.1021, 1983.

[Ikke-patent-dokument 4] Gavini, F. et al., Int. J. Syst. Bacteriol., 39, s.337-345, 1989.

[Ikke-patent-dokument 5] Nishizawa T. et al., Chem. Pharm. Bull., 40 (2), s.

479-483, 1992.

[Ikke-patent-dokument 6] Inagawa H et al., Chem. Pharm. Bull., 40 (4), s.

994-997, 1992.

[Ikke-patent-dokument 7] Neilson A. H., J. Appl. Bacteriol., 46 (3), s.483-491, 1979.

[Ikke-patent-dokument 8] Nunes C. et al., Int. J. Food Microbiol., 70 (1-2), s.

53-61, 2001.

[Ikke-patent-dokument 9] Yamada T. et al., ”Seibutsugaku Jiten”, 3. utg, s.

287-288, 1983.

[Ikke-patent-dokument 10] Nunes C. et al., J. Appl. Microbiol., 92 (2), s. 247-255, 2002.

[Ikke-patent-dokument 11] Asis C. A. Jr. et al., Lett. Appl. Microbiol., 38 (1), s. 19-23, 2004.

[Ikke-patent-dokument 12] Vanneste J.L. et al., J. Bacteriol., 174 (9), s. 2785-2796, 1992.

[Ikke-patent-dokument 13] Kearns L.P. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64 (5), s.1837-1844, 1998.

JP H0678756 A, EP 0472467 A2 og US 5494819 A beskriver blant annet en metode for isolering og etterfølgende dyrking av bakterier fra slektene Serratia, Enterobacter og/eller Pantoea.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Problem som oppfinnelsen skal løse

Som allerede beskrevet innholder plantene selv ofte de immunpotenserende midler, og disse er ofte komponenter eller produkter av mikrober som lever i symbiose med plantene. For å oppnå et immunpotenserende middel fra et naturprodukt som er trygt ved inntak kan komponenten derfor ekstraheres fra spiselige planter som sådanne (f.eks. limulus-positivt glykolipid, patentdokument 1) eller effektivt dyrke mikroben som lever i symbiose med den spiselige plante for å oppnå dens komponent eller produkt (lavmolekylære lipopolysakkarider, patent-dokument 2). Innholdet av immunpotenserende middel i den spiselige planten er imidlertid ekstremt lavt, og det må derfor inntas mat i ekstremt store mengder for å forvente den immunpotenserende effekt gjennom spising, og det er i alminnelighet ikke lett å holde den inntatte mengde av det immunpotenserende middel på riktig nivå. Dets effekt kan derfor ikke forventes. Når det immunpotenserende middel ekstraheres fra planten og benyttes som næringsmiddel eller medikament, er dette dessuten dyrt og lite praktisk anvendelig.

Ved å fokusere på de mikrober som lever i symbiose med en plante, inneholder imidlertid Pantoea agglomerans som er en bakterie i symbiose med hvete, et lavmolekylært lipopolysakkarid som en komponent effektiv for immunstimulering. For å ekstrahere det lavmolekylære lipopolysakkarid har det imidlertid hittil vært nødvendig å dyrke Pantoea agglomerans ved å benytte et kostbart medium, hvor det hovedprotein som inngår i mediet, f. eks. NZ-amin, trypton eller kasaminosyrer, skriver seg fra et dyr. Det har derfor vært vanskelig å billig oppnå dette som et meget vanlig immunpotentenserende middel. Samtidig kunne det ikke ses bort fra muligheten for ukjente skadelige substanser, så som de avledet fra BSE-kontaminerte dyr.

I betraktning av ovennevnte problemer er foreliggende oppfinnelse rettet mot en fremgangsmåte for fermentering og dyrkning, hvor et immunpotenserende middel kan oppnås rimelig og effektivt ved å benytte trygge materialer, et fermentert planteekstrakt oppnådd etter fremgangsmåten, fermentert planteekstraktpulver oppnådd fra det fermenterte planteekstrakt og en fermentert planteekstraktblanding som inneholder det fermenterte planteekstraktpulver.

Midler til løsning av problemet

Foreliggende oppfinnelse angår en metode for fermentering og dyrkning i henhold til hvilket som helst av kravene 1-4 og et fermentert planteekstrakt oppnådd gjennom slike metoder i henhold til hvilket som helst av kravene 5-9.

Fremgangsmåten for fermentering og dyrkning ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fermentering av et materiale avledet fra en spiselig plante, inneholdende glucider hvis hovedkomponent er et polysakkarid, med en fakultativ anaerob gramnegativ bakterie som lever i symbiose utelukkende med en plante, og samtidig dyrkning av den fakultativt anaerobe gramnegative bakterie i henhold til vedlagte krav.

Den fakultative anaerobe gramnegative bakterien er Pantoea agglomerans. .

Ved å benytte den fakultative anaerobe basill Pantoea agglomerans, er det mulig å benytte stivelse som karbonkilde.

Det er også ønskelig at den spiselige plante velges blant matkorn, algevekster, bønner og en blanding derav.

Det er også ønskelig at den spiselige plante er et matkorn og at materialet avledet fra matkornet er valgt fra hvetemel, rispulver, hvetekli-pulver, riskli og sake-berme. Siden hvetemel inneholder gluten som proteinkilde, er det mulig å effektivt fermentere og dyrke selv uten å benytte materiale som skriver seg fra et dyr.

Det er ønskelig at den spiselige plante er algevekster og at materialet avledet fra algevekster er valgt fra brunalger-pulver, ”mekabu”- (sporofyll av Undaria pinnatifida) pulver og tang-pulver.

Når den spiselige plante er bønne og materialet avledet fra bønne er soyabønnemelk-myse, inneholder det rikelig med protein. Det er derfor mulig effektivt å fermentere og dyrke uten bruk av materiale som skriver seg fra dyr.

Det fermenterte planteekstrakt ifølge oppfinnelsen oppnås gjennom en fremgangsmåte for fermentering og dyrkning.

Det fermenterte planteekstraktpulver ifølge oppfinnelsen oppnås fra det fermenterte planteekstrakt.

Den fermenterte planteekstraktblanding ifølge oppfinnelsen inneholder fermentert planteekstrakt eller fermentert planteekstraktpulver.

Den fermenterte planteekstraktblandingen kan velges fra farmasøytika, farmasøytika for dyr, kvasi-medikamenter, kosmetika, næringsmidler, funksjonell mat, fôr, og et bademiddel.

Det er ønskelig at det fermenterte planteekstrakt har følgende fysikalskkjemiske egenskaper.

Det fermenterte planteekstrakt har evne til makrofag-aktivering selv i nærvær av polymyksin B. Det fermenterte planteekstrakt har den immunpotenserende effekt.

Den fakultative anaerobe gramnegative bakterie er Pantoea agglomerans og den spiselige plante er valgt fra matkorn, algevekster, bønner og en blanding derav.

Det er ønskelig at den fakultativt anaerobe gramnegative bakterie er Pantoea agglomerans og den spiselige plante er valgt fra matkorn, algevekster, bønner og en blanding derav.

Det er ønskelig at materialet avledet fra matkorn er valgt fra hvetemel, rispulver, hvetekli-pulver, hvetekli og sake-berme.

Det er ønskelig at materialet avledet fra algevekster er valgt fra brunalgepulver, makabu-pulver og tang-pulver.

Effekt av oppfinnelsen

Siden dyrkningen foretas i medium som ikke inneholder noen komponent avledet fra et dyr, er det i henhold til foreliggende oppfinnelse ingen kontaminering med forurensninger fra dyrekomponenter. Det er derfor ingen mulighet for ukjente skadelige substanser som de som er avledet fra BSE-kontaminanter, og det er mulig å frembringe en meget trygg og billig fremgangsmåte for fremstilling av fermentert planteekstrakt egnet for forskjellige tiltenkte anvendelser, og trygt og rimelig gi fermentert planteekstrakt eller fermentert planteekstraktpulver inneholdende det immunpotenserende middel. Det er dessuten mulig å tilveiebringe kulturløsningen, det immunpotenserende middel og ekstraktet og ekstraktpulveret og ytterligere farmasøytika, farmasøytika for dyr, kvasi-medikamenter, kosmetika, næringsmidler, funksjonell mat”, fôrstoff, og bademidler, som inneholder ekstraktet eller ekstraktpulveret.

Det har ikke tidligere vært antydet og det foreligger ikke fakta i det som finnes angående konvensjonell fermenteringsteknikk slik at fermenteringen og dyrkningen kan foretas etter en enkel prosess hvor materialet avledet fra en spiselig plante fermenteres utelukkende med den fakultativt anaerobe gramnegative bakterie som lever i symbiose med en plante, samtidig som den fakultativt anaerobe gramnegative bakterie dyrkes.

Denne kan benyttes enten TNF produseres fra makrofager eller ikke (TNF induksjonsaktivitet) som en indikator på at en viss substans oppviser den immunpotenserende effekt. Den immunpotenserende effekt kan dessuten kvantifiseres ut fra mengden produsert TNF. TNF-produksjonen fra makrofager ble undersøkt ved å benytte et limulus-positivt planteglykolipid avledet fra hvetemel og et lavmolekylært lipopolysakkarid avledet fra Pantoea agglomerans. TNF-produksjonen fra makrofagene ble stanset ved behandling med polymyksin B både i det limuluspositive planteglykolipid avledet fra hvetemel, og lavmolekylært lipopolysakkarid avledet fra Pantoea agglomerans. Det ble imidlertid under Eksempler vist at når det fermenterte planteekstrakt ifølge foreliggende oppfinnelse ble behandlet med polymyksin B, ble TNF produsert av makrofagene. Dette tyder på at det fermenterte planteekstrakt oppnådd ved fermentering og dyrkning, har en immunpotenserende effekt som er kvalitativt forskjellig fra de immunpotenserende effekter som følge av komponentene i selve planten som har vært materialet, og selve mikroben benyttet for fermenteringen.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et diagram som viser den inhiberende effekt av koi herpes forekomst i fôrstoff som inneholder et fermentert hveteekstrakt.

[Foretrukne utførelsesformer]

Egnede utførelsesformer ifølge foreliggende oppfinnelse vil bli beskrevet detaljert nedenfor.

I. Essensielle trekk ved fremgangsmåten for fremstilling av fermentert planteekstrakt ved bruk av Pantoea agglomerans.

I sammenheng med foreliggende oppfinnelse har vi for første gang funnet at Pantoea agglomerans kan vokse direkte ved å benytte stivelse som karbonkilde, og vi har funnet en fremgangsmåte for rimelig å produsere fermentert hveteekstrakt som rikelig inneholder det immunpotenserende middel som et fermentert produkt og et dyrket produkt ved å benytte Pantoea agglomerans. Dette kan føre til miljøvennlige og trygge kvasi-medikamenter, kosmetika, næringsmidler, funksjonell mat” og fôrstoffer, som er effektive til forhindring av infeksjon hos mennesker og innen feltet feavl og akvakultur.

1: Isolering av Pantoea agglomerans

Når hvetemel suspenderes i vann og supernatanten påføres på L-buljongagarmedium og dyrkes, kommer mikrobekolonier til syne. I disse koloniene identifiseres mikrobene etter standardmetoder. For eksempel selekteres de som har samme egenskaper som standard Pantoea agglomerans ved å selektere de kolonier som gir negativ gramfarging, positiv anaerob glukosemetabolismereaksjon og negativ oksydaseaktivitet ved bruk av ID-test/EB-20 (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.). Standard Pantoea agglomerans er tilgjengelig fra Institute of Physical and Chemical Research, Bioresource Center (ikke-patentdokument 4). I den etterfølgende beskrivelse er prosentangivelse vektprosent om intet annet er angitt.

2: Evaluering av immunpotenserende aktivitet

I foreliggende utførelsesformer ble det som indikator på den immunpotenserende effekt som det fermenterte hveteekstrakt oppviser, evnen til makrofagaktivering evaluert ved TNF-produksjon fra makrofagene.

3: Lavmolekylært lipopolysakkarid avledet fra Pantoea agglomerans

Som en av de aktive komponentene som immunpotenseres ved fermenteringen og dyrkning ved bruk av Pantoea agglomerans, forventes den å inneholde lavmolekylære lipopolysakkarider avledet fra Pantoea agglomerans. De lavmolekylære lipopolysakkaridene har en bemerkelsesverdig høyere sikkerhet og overlegen biologisk aktivitet enn høymolekylære lipopolysakkaridtyper (typiske lipopolysakkarider) som vanligvis benyttes, innholdet av det lavmolekylære lipopolysakkarid ble derfor målt. Lavmolekylære lipopolysakkarider er detaljert beskrevet i Patentdokument 2. Foreliggende Eksempel vedrører fermentert hveteekstrakt, men foreliggende oppfinnelse innebærer ikke at plantene er begrenset til hvete og at det immunpotenserende middel er begrenset til lavmolekylære lipopolysakkarider.

Pantoea agglomerans kan dyrkes ved å benytte en alminnelig kjent metode (patent-dokument 2, ikke-patent-dokument 8), men hovedkomponenter i proteinet som kulturmediet inneholder, er avledet fra dyr og mediet er kostbart. Når det funksjonelle ernæringsmiddel og funksjonelle fôrstoff gis til dyr, eller benyttes perkutant, er kontaminering med forurensninger som skriver seg fra dyrene, typisk med BSE, problematisk med henblikk på matsikkerhet, og dessuten blir produksjonsomkostningene høye og metoden lite praktisk. Som resultat av en omfattende studie for å komme frem til et trygt og billig naturprodukt som har den immunpotenserende virkning, har oppfinnerne kommet frem til denne fremgangsmåte for fermentering og dyrkning ved bruk av Pantoea agglomerans for oppnåelse av det fermenterte hveteekstrakt som vist under Eksempler. Hovedkomponenten av det protein som kulturmediet inneholdt har konvensjonelt vært avledet fra dyr, men i henhold til foreliggende oppfinnelse er dette avledet fra planter. Produkt oppnådd ved dekomponering av proteinet, som f.eks. kasein avledet fra kumelk med et oppsluttende enzym, tilsettes typisk til kulturløsningen. I dette tilfellet er prisen per liter medium ca.250 yen, men dersom dette kan erstattes med hvetemel blir prisen ca.16 yen. For det formål sterkt å konsentrere og synergistisk fusjonere den immunpotenserende aktivitet oppnådd fra både planten og mikroben som lever i symbiose med denne, har fermentering aldri vært foretatt.

Oppfinnelsens innhold vil bli beskrevet nedenfor under Eksempler.

Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes på et materiale oppnådd gjennom en typisk prosess fra andre spiselige planter som inneholder rikelige mengder av det immunpotenserende middel, f.eks. brunalger, matkorn (inneholdende hvetemel, ris-pulver, hvetekli-pulver, riskli eller sake-berme, som er materialer avledet fra matkorn), algevekster (inneholdende brunalge-pulver, mekabu-pulver eller tang-pulver som er et materiale avledet fra algevekster) og bønner (inneholdende soyabønnemelk-myse, som er et materiale avledet fra bønner). Det er velkjent at proteiner og sukkere inngår i disse plantene. Disse plantene kan anvendes til fermentering og dyrkning ved å benytte Pantoea agglomerans. Det er alminnelig kjent at naturlige bakterier, f.eks. bakterier tilhørende slekten Serratia eller Enterobacter lever i symbiose med disse plantene (ikke-patent-dokument 4). Mikrobene benyttet for fermentering omfatter fakultative anaerobe gramnegative bakterier som lever i symbiose med disse plantene.

II: Sammenfatning av viktige punkter i foreliggende oppfinnelse

(1) Det fermenterte hveteekstrakt som sådant, som den substans som har den immunpotenserende virkning produsert ved fusjon av hvete, Pantoea agglomerans, som er bakterien i symbiose med denne, og de fermenterte produktene gjennom en kombinasjon av disse.

(2) Det er nytt å produsere det fermenterte planteekstrakt ved å benytte Pantoea agglomerans som er den gramnegative bakterien.

III: Spesifikk metode for fremstilling av fermentert hvetekstrakt

(1) Pantoea agglomerans isoleres fra hvetemel ved standardmetoden (ikkepatent-dokument 1). Etter at den er isolert og identifisert, kan denne bakterien oppbevares i 50% glycerol.

(2) 0,05 til 5% salt, 0,005 til 1 mol fosfatbuffer, eller en blandet saltløsning (0,5 til 10% natrium(II)fosfat, 0,05 til 5% kalium(I)fosfat, 0,05 til 5% natriumklorid, 0,05 til 5% ammoniumklorid) tilberedes.

(3) Hvetemelet suspenderes til en konsentrasjon på 0,05 til 10% i vann. (4) En løsning av 0,2 til 3 mol magnesiumklorid tilberedes.

(5) En løsning av 0,2 til 3 mol kalsiumklorid tilberedes.

(6) Løsninger av (2) til (5) steriliseres ved autoklavering etc., i enkelte tilfeller.

(7) Løsningene av (2) til (5) blandes i passende mengder, og vann tilsettes for å fremstille en suspensjon inneholdende 0,1 til 5% hvetemel. I enkelte tilfeller nøytraliseres pH ved tilsetning av en alkalisk løsning eller en sur løsning.

(8) I enkelte tilfeller kan hvetestivelse delvis oppsluttes ved tilsetning av 10 til 50.000 enheter amylase per liter av mediet til (7) og inkubering ved 10 til 80 ºC i 1 til 24 timer.

(9) Pantoea agglomerans isolert i (1) tilsettes til (7) eller (8).

(10) (9) fermenteres ved 1 til 40 ºC. I enkelte tilfeller kan fermenteringsbeholderen settes til side eller ristes. Alternativt kan omrøring foretas med noen timers mellomrom.

(11) (10) fermenteres i 6 timer opptil 1 uke. Når fermenteringen er under utvikling, utvikler hvetemel-løsningen en gul farge.

(12) Den alkaliske løsningen kan eventuelt tilsettes under fermenteringen av (11) for å nøytralisere pH, eller hvetemel-suspensjonen eller uorganiske salter kan tilsettes.

(13) Fermenteringen avsluttes, og en fast komponent oppsamles som bunnfall ved sentrifugering (1000 til 5000 rpm., 10 til 60 minutter). Bunnfallet kan benyttes direkte som et fermentert hvetemelprodukt for fôrstoffet eller som råmaterialet for blanding med fôrstoffet.

(14) Ved fremstilling av den fermenterte hveteekstrakt suspenderes (13) i vann eller saltbuffer, som deretter oppvarmes til 80 til 140 ºC i 10 minutter til 6 timer. Den faste komponenten kan fjernes ved sentrifugering eller ved filtrering. Vann eller buffer kan på nytt tilsettes til det uttatte bunnfall for å gjenta varm ekstraksjon flere ganger.

(15) Det fermenterte hveteekstrakt produsert under (14) kan enkelt renses videre avhengig av de tiltenkte anvendelser. Når saltet, så som natriumklorid, i en sluttkonsentrasjon på 0,05 til 1 mol/L tilsettes til ekstraktet av (14) og løsningsmidlet, som f.eks. etanol, deretter tilsettes i én til tre ganger mengden av ekstraktet, dannes således et bunnfall. Dette kan oppsamles ved sentrifugering. Dette bunnfall kan vaskes ytterligere med et løsningsmiddel, som f.eks. etanol. Når dette er tørket kan det dannes et pulver.

A. Eksempler med relasjon til fremgangsmåten for fremstilling av fermentert hveteekstrakt.

Eksempel 1

Studie over veksten av Pantoea agglomerans i hvetemelmedium.

For å bekrefte om Pantoea agglomerans som er den naturlige symbiotiske bakterie med hvete, kan vokse ved å benytte hvetemel som karbonkilde, ble veksten av Pantoea agglomerans i et fast hvetemelmedium undersøkt.

(1) M9-agarmedium inneholdende 0,5% hvetemel som karbonkilden ble fremstilt.

(2) En koloni av Pantoea agglomerans ble plukket fra LB-agarmediet og suspendert i 1 mL PBS. Denne ble fortynnet suksessivt 10 ganger til 10.000 ganger, og 0,1 mL av hver alikvot ble utsådd på M9-agarmediet av (1).

(3) Etter dyrkning ved 37 ºC i 6 dager ble utseende av koloniene observert. Som resultat ble ca.300 kolonier observert i en petriskål, hvor 0,1 mL av fortynningen 10.000 ganger var utsådd.

Dette har bekreftet at Pantoea agglomerans kan utnytte hvetemel som karbonkilden.

Eksempel 2

Fremstilling av fermentert hveteekstrakt

(1) Destillert vann (5 mL) ble tilsatt til 0,5 g hvetemel for å suspendere 0,1 mL av supernatanten som var tilsatt til L-buljong-agarmediet, og dyrket ved 37 ºC over natten.

(2) En gul koloni ble isolert, en bakterie ble identifisert etter standardmetoder, Pantoea agglomerans ble isolert og suspendert i 50% glycerolløsning og oppbevart i en fryser. En del av denne stamløsningen ble påsatt på LB-agarmediet, og fikk stå ved 37 ºC for å danne en uavhengig koloni av Pantoea agglomerans.

(3) I en 2 liter flaske ble 64 g natrium(II)fosfat-heptahydrat, 15 g kalium(I)fosfat, 2,5 g natriumklorid og 5 g ammoniumklorid tilsatt, hvorpå renset vann ble tilsatt til et totalvolum på 1 liter (uorganisk saltblandet løsning). Det rensede vann ble tilsatt til 13,1 g magnesiumklorid-dihydrat, slik at totalvolumet utgjorde 100 mL (magnesiumkloridløsning). Det rensede vannet ble tilsatt til 11,1 g kalsiumklorid for å gi et totalvolum på 100 mL (kalsiumkloridløsning). Det rensede vann (4 L) ble tilsatt til en 5 L konisk kolbe (renset vann). Ovennevnte løsninger og det rensede vann ble alle sterilisert ved autoklavering (TOMY BS-325, 120 ºC i 20 minutter).

(4) Hvetemel (24 g) (Nisshin Flour Milling Co, Ltd) ble tilsatt til 1 L kolbe og renset vann ble tilsatt for å bringe totalvolumet til 600 mL. Etter tilsvarende autoklavering av dette ble 3 mg av α-amylase (SIGMA, Bacillus, enzymaktivitet på fra 1500 til 3000 enheter per mg av proteinet) tilsatt og blandingen oppvarmet i et vannbad til 65 ºC i 12 timer (løsning av hvetemel behandlet med amylase).

(5) De tilberedte løsningene og lignende i mengder vist i Tabell 1, ble anbrakt i en 3 L sterilisert Sakaguchi kolbe for å danne et hvetemelmedium.

Tabell 1

_________________________________________________

Materialer Dose__

Blandet uorganisk saltløsning 200 mL

Renset vann 550 mL

Løsning av hvetemel behandlet med amylase 200 mL Magnesiumkloridløsning 2,0 mL Kalsiumkloridløsning 0,1 mL _________________________________________________

(6) Fremstilling av inokulum: En koloni av Pantoea agglomerans isolert fra hvetemelet i (2) ble tilsatt til 10 mL av hvetemelmediet fra (5) tidligere fremstilt i den samme blanding, og fermentert ved forsiktig omrøring ved 37 ºC over natten (12 til 15 timer) for å fremstille et inokulum for hvetemel-fermentering.

(7) Den totale mengde av (6) ble tilsatt til (5) og fermentert ved 37 ºC i 20 til 30 timer under omrøring. Den fermenterte løsningens pH ble målt og justert til pH 7 ved tilsetning av ammoniakkvann.150 mL av løsningen av hvetemel behandlet med amylase, og 37,5 mL av den uorganiske saltløsningen ble deretter tilsatt sterilt og fermentert på tilsvarende måte i 20 til 30 timer. Den samme behandling ble gjentatt for fermentering i totalt 65 til 80 timer.

(8) Den fermenterte hvetemel-løsningen ble sentrifugert (Hitachi, høyhastighets kjølesentrifuge, SCR-20B, 5000 rpm., 20 minutter, 4 ºC), og bunnfallet oppsamlet.

(9) Fosfatbuffer ble tilsatt til bunnfallet fra (8), deretter suspendert for å bringe totalvolumet til 100 mL, hvorpå 33 mL alikvoter ble overført til et 50 mL sentrifugerør og varmeekstrahert i kokende vannbad i 30 minutter. Etter avsluttet oppvarming ble løsningen avkjølt til romtemperatur og sentrifugert (Hitachi, høyhastighets kjølesentrifuge, SCR-20B, 10.000 rpm., 20 minutter, 20 ºC). Etter sentrifugeringen ble 82 mL av den blekgule supernatanten overført til en annen beholder ved dekantering.

(10) Natriumkloridløsningen (8,9 mL, 5 mol) ble tilsatt til 80 mL av supernatanten fra (9). Når 178 mL etanol ble tilsatt til denne inntraff det en hvit blakking. Blandingen fikk stå i fryseboks (-90 ºC) over natten, hvorpå løsningen ble sentrifugert (Hitachi, høyhastighets kjølesentrifuge, SCR-20B, 10.000 rpm., 20 minutter, 4 ºC). Bunnfallet ble oppnådd ved å fjerne supernatanten. Etter tilsetning av 10 mL 70% avkjølt etanol til bunnfallet, som deretter ble suspendert, ble løsningen sentrifugert (Hitachi, høyhastighets kjølesentrifuge, SCR-20B, 10.000 rpm., 20 minutter, 20 ºC) og bunnfallet deretter vasket. Bunnfallet ble lufttørket og oppløst i destillert vann for å gi 11 mL av det fermenterte hveteekstrakt.

(11) Måling av tørrvekt: 0,3 mL ble overført til et 1,5 mL plastrør som på forhånd var veid, og etter frysing ble lyofilisering foretatt med en frysetørker, hvoretter vekten var 7,45 mg. Tørrvekten av det fermenterte hveteekstrakt i (10) var derfor 24,8 mg per 1 mL av løsningen og 273 mg per total mengde på 11 mL.

(12) Det fermenterte hveteekstrakt ble fremstilt åtte ganger etter samme fremgangsmåte, og proteinmengden i hver prøve ble målt ved Bradfords metode ved bruk av proteinkvantifisering med BSA som standardproteinet. Til sammenligning ble det rensede limulus-positive glykolipid (patent-dokument 1) og lavmolekylært lipopolysakkarid (patent-dokument 2) benyttet. Måleresultatene er vist i Tabell 2. I Tabell 2 til 5 og 7 er en numerisk verdi for fermentert hveteekstrakt angitt som innholdet i mg per 1 g av den vekt som ble oppnådd ved tørking av det fermentert hveteekstrakt oppnådd ovenfor under (10).

(13) Måling av sukkerinnhold: Sukkerinnholdet ble målt ved hjelp av en fenolsulfatmetode ved bruk av glukose som standardsukkeret. Måleresultatene er vist i Tabell 3.

(14) Måling av nukleinsyreinnhold: Absorbansen ved 210 til 340 nm av prøven fortynnet 100 ganger, ble målt. Maksimalinnhold ble beregnet ved å benytte en verdi oppnådd ved å subtrahere absorbansen ved 320 nm fra absorbansen ved 260 nm og 50 μg per 10D av absorbans som DNA. Måleresultatene er vist i Tabell 4.

(15) Måling av innhold av limulus-aktiv substans ved limulusbestemmelse: For måling ble det benyttet et Toxi-color system levert av Seikagaku Corporation, og Seikagaku Corporation Et-1 ble benyttet som en standard limulusaktiv substans. Måleresultatene er vist i Tabell 5.

(16) Jod/stivelses-reaksjon: Et jodreagens 1N (10 mL vann ble tilsatt til 12,7 g jod og 25 g kaliumjodid, som ble grundig blandet, hvorpå vann ble tilsatt til 100 mL) ble fortynnet 200 ganger med vann ved bruk. Dette (5 μL) ble tilsatt til 0,1 mL av det fermenterte hveteekstrakt som tidligere var oppløst til en konsentrasjon på 1 mg/mL og grundig blandet. I det fermenterte hveteekstrakt utviklet løsningen umiddelbart en lys purpur til mørk purpur farge (positiv). I det limulus-positive glykolipid og det lavmolekylære lipopolysakkarid induserte ikke denne behandling slik fargeutvikling (negativ). Resultatene fra ovennevnte er sammenfattet i Tabell 6.

Som det fremgår av resultatene ovenfor er det klart at det fermenterte hveteekstrakt er forskjellig fra det limulus-positive glykolipid og det lavmolekylære lipopolysakkarid med hensyn til proteininnhold, sukkerinnhold, nukleinsyreinnhold (unntatt det limulus-positive glykolipid på grunn av manglende data), innholdet av limulus-positiv substans og jod/stivelse-reaksjon, og det er klart at foreliggende substans er ny. Resultatene ovenfor er sammenfattet i Tabell 7. Det fermenterte planteekstrakt i de foreliggende eksempler er nytt og er forskjellig fra det limuluspositive glykolipid og det lavmolekylære lipopolysakkarid ved at det har følgende fysikalsk-kjemiske egenskaper. Det fermenterte hveteekstrakt har proteininnhold på 5 til 15%, sukkerinnhold på 20 til 45%, nukleinsyreinnhold på 10 til 35% og innhold av limulus-positiv substans på fra 10 til 40%, og gir positiv jod/stivelsereaksjon og har evne til makrofag aktivering selv i nærvær av polymyksin B.

Tabell 2

Proteininnhold i fermentert ekstrakt ____________________________________________________________ Prøve__________________________________ Proteininnhold (mg/g) Fermentert hveteekstrakt 1 60

Fermentert hveteekstrakt 2 71

Fermentert hveteekstrakt 3 90

Fermentert hveteekstrakt 4 105

Fermentert hveteekstrakt 5 103

Fermentert hveteekstrakt 6 82

Fermentert hveteekstrakt 7 88

Fermentert hveteekstrakt 8 88

Limulus-positivt glykolipid 40 Lavmolekylært lipopolysakkarid 3,8 eller mindre ____________________________________________________________

Tabell 3

Sukkerinnhold i fermentert ekstrakt ______________________________________________________ Prøve_______________________________ Sukkerinnhold (mg/g) Fermentert hveteekstrakt 1 318

Fermentert hveteekstrakt 2 428

Fermentert hveteekstrakt 3 313

Fermentert hveteekstrakt 4 232

Fermentert hveteekstrakt 5 372

Fermentert hveteekstrakt 6 324

Fermentert hveteekstrakt 7 298

Fermentert hveteekstrakt 8 329

Limulus-positivt glykolipid 133 Lavmolekylært lipopolysakkarid 668

____________________________________________________ Tabell 4

Nukleinsyreinnhold i fermentert ekstrakt __________________________________________________________ Prøve________________________________ Nukleinsyreinnhold (mg/g) Fermentert hveteekstrakt 1 102

Fermentert hveteekstrakt 2 102

Fermentert hveteekstrakt 3 226

Fermentert hveteekstrakt 4 291

Fermentert hveteekstrakt 5 302

Fermentert hveteekstrakt 6 240

Fermentert hveteekstrakt 7 218

Fermentert hveteekstrakt 8 216

Limulus-positivt glykolipid manglende data Lavmolekylært lipopolysakkarid 2,8 __________________________________________________________

Tabell 5

Innhold av limulus-aktiv substans i fermentert ekstrakt _______________________________________________________________ Prøve___________________________Innhold av limulus-aktiv substans(mg/g) Fermentert hveteekstrakt 1 242

Fermentert hveteekstrakt 2 118

Fermentert hveteekstrakt 3 125

Fermentert hveteekstrakt 4 458

Fermentert hveteekstrakt 5 224

Fermentert hveteekstrakt 6 231

Fermentert hveteekstrakt 7 356

Fermentert hveteekstrakt 8 289

Limulus-positivt glykolipid 970

Lavmolekylært lipopolysakkarid 993

________________________________________________________________ Tabell 6

Jod-stivelsesreaksjon av fermentert ekstrakt _________________________________________________ Prøve_______________________________Bestemmelse__

Fermentert hveteekstrakt 1 Positiv

Fermentert hveteekstrakt 2 Positiv

Fermentert hveteekstrakt 3 Positiv

Fermentert hveteekstrakt 4 Positiv

Fermentert hveteekstrakt 5 Positiv

Fermentert hveteekstrakt 6 Positiv

Fermentert hveteekstrakt 7 Positiv

Fermentert hveteekstrakt 8 Positiv

Limulus-positivt glykolipid Negativ

Lavmolekylært lipopolysakkarid Negativ _________________________________________________

Tabell 7

Sammenfatning av forskjeller mellom fermentert hveteekstrakt og lignende produkter _________________________________________________________________ Prøve Protein Sukker Nukleinsyre Innhold av limulus Jod/stivelseinnhold innhold innhold aktiv substans reaksjon ______________________________________________________________________________ Fermentert hveteekstrakt (middel� 86�15mg/g 327�57mg/g 212�75mg/g 255�113mg/g Positiv standardavvik)

Limulus-positivt Underminus Underminus Ikke målt Overpluss Negativ glykolipid

Lavmolekylært Underminus Overpluss Underminus Overpluss Negativ lipopolysakkarid ______________________________________________________________________________ Underminus: betydelig lavere verdier enn verdiområdet for det fermenterte hveteekstrakt (middel� standardavvik).

Overpluss: betydelig høyere verdier enn verdiområdet i det fermenterte hveteekstrakt (middel� standardavvik).

Eksempel 3

Immunpotenserende virkning av fermentert hveteekstrakt

En akutt myelogen leukemicellelinje, THP-1 (1x10<6>/250 μL, RPMI1640 medium inneholdende 10% føtalt kalveserum) benyttet som humane makrofager, ble anbrakt i en 48-brønns plate og dyrket i forkultur i 30 minutter. Deretter ble 250 μL av mediet (sluttvolum 500 μL) tilsatt slik at sluttkonsentrasjonen i hver prøve var 1 til 10.000 ng/mL. Prøvene ble forsynt med en gruppe inneholdende polymyksin B (12,5 μg/mL). Etter dyrkning i 4 timer ble kultursupernatanter og cellene oppsamlet. TNF-aktiviteten i supernatanten ble målt med en cytotoksisitets-test ved bruk av L-929. Resultatene er vist i Tabell 8. Makrofagene produserte TNF selv i nærvær av polymyksin B i det fermenterte hveteekstrakt, men ved nærvær av polymyksin B kunne makrofagene ikke produsere TNF med det lavmolekylære lipopolysakkarid og det limulus-positive glykolipid. Ut fra dette er det åpenbart at det fermenterte hveteekstrakt har en biologisk aktivitet som er forskjellig fra den for det lavmolekylære lipopolysakkarid og det limulus-positive glykolipid.

Tabell 8

TNF-produksjon fra makrofager med fermentert hveteekstrakt og inhiberende effekt av polymyksin B (TNF-induksjonsaktivitet av fermentert hvetekstrakt) _____________________________________________________________________________ Prøve- Fermentert Fermentert Lavmolekylær Lavmolekylær Limulus- Limuluskons.(ng/mL) hveteekstrakt hveteekstrakt lipopoly- lipopoly- positivt positivt med tilsetning uten tilsetning sakkarid sakkarid uten glykolipd glykolipid av poly- av poly- med tilsetning tilsetning av med tilsetning uten tilmyksin B myksin B av poly- poly- av poly- setning av myksin B myksin B myksin B polymyksin B ______________________________________________________________________________ 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0,64 0 1,2 10 0 1,2 0 6,3 0 4,2 100 0 8,7 0 10,2 0 14,2 1000 1,7 28,3 0 6,3 0 26,2 10000 26 50,4 0 3,8 0 13,2 _________________________________________________________________ B. Eksempel på anvendelse av fermentert hveteekstrakt til fôrstoff

Eksempel 4

Burhønsfôr inneholdende fermentert hveteekstrakt (inhiberende effekt på mortalitet ved broileroppdrett i storskala-studie)

Et fôrstoff inneholdende 430 μg/kg av det fermenterte hveteekstrakt produsert i Eksempel 2 ble fremstilt. Kommersielle broilerkyllinger ble benyttet med ca.5500 til 6000 kyllinger per gruppe. I testkontrollgruppen ble det gitt fôrstoff som ikke inneholdt fermentert hveteekstrakt. Fôrstoff inneholdende fermentert hveteekstrakt ble gitt til kyllinger tre uker etter klekking, og ble administrert daglig inntil syv ukers alder. Antall døde kyllinger ble tellet daglig. Kyllinger som ikke oppfylte standarden ved avlevering ble kassert. Resultatene er vist i Tabell 9. Kassasjonsraten var 1,9% i testgruppen (fôrstoff som inneholdt det fermenterte hveteekstrakt) hvilket var lavt, og 3,3% i kontrollgruppen. Oppdrettsraten var 98,1 i testgruppen og 96,7% i kontrollgruppen. En 1,4% økning i oppdrettsraten ble således observert. En signifikant differansetest i antallet faktisk leverte kyllinger og antallet kasserte kyllinger mellom testgruppen og kontrollgruppen ble foretatt, og den signifikante forskjell med p<0,0001 ble observert i X<2>testen. Ovennevnte viser infeksjonsbeskyttelseseffekten av fôrstoffet inneholdende det fermenterte hveteekstrakt ved broileroppdrett.

Tabell 9

Effekter av fôrstoff inneholdende fermentert hveteekstrakt på broileroppdrett ______________________________________________________________ ____________________ Testgruppe Kontrollgruppe________ Antall kyllinger 5906 5525

Antall faktisk leverte kyllinger 5792 5345

Antall kasserte kyllinger 114 180 Kassasjonsrate 1,9% 3,3% Oppdrettsrate 98,1% 96,7%

______________________________________________________________ Eksempel 5

Fôrstoff for oppdrettsfisk som inneholdt fermentert hveteekstrakt (infeksjonsforhindrende effekt på yellowtail utendørstest)

For å undersøke den infeksjonsforhindrende effekt ble ca.5200 yellowtail per gruppe oppdrettet i en utendørstest med fôrstoff inneholdende det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2. Resultatene er vist i Tabell 10. Mortaliteten som følge av Streptococcus i en ikke-administrert kontrollgruppe nådde 4,8%. I gruppen som inntok 100 μg/kg/dag (per kilo kroppsvekt og per dag) (testgruppe), ble mortaliteten observert å være signifikant redusert (p<0,00001) sammenlignet med ikke-administrasjonsgruppen (kontrollgruppen).

Tabell 10

Infeksjonsforhindrende effekt av fôrstoff inneholdende fermentert hveteekstrakt på yellowtail i utendørstest ______________________________________________________________ Behandling Antall oppdrettet fisk Antall døde fisk Mortalitet Signifikant differansetest (X<2>-test) ______________________________________________________________ Kontroll- 5201 249 4,79

gruppe

Testgruppe 5193 101 1,94 (p<0,00001) ______________________________________________________________

Eksempel 6

Fôrstoff for oppdrettsfisk inneholdende fermentert hveteekstrakt (infeksjonsforhindrende effekt på koi herpes)

(1) Karpe: Det ble benyttet sort karpe (black carp) med en kroppsvekt på 70 g. Testen ble foretatt ved bruk av 20 karper per gruppe.

(2) Fremstilling av koi herpesvirus: 10 mL Hanks balanserte saltløsning (HBSS) buffer ble tilsatt til 1 g gjeller fra karpen, som døde av infeksjon med koi herpes, og homogenisert, filtrert med et filter på 0,45 μm og filtratet benyttet som virusløsning.

(3) Infeksjon med koi herpesvirus: Ovennevnte filtrat (600 μL/100 g kroppsvekt) ble injisert intraperitonealt.

(4) Fremstilling av fôrstoff inneholdende fermentert hveteekstrakt: 0, 5, 10 og 20 mg/kg av de fermenterte hveteekstraktene produsert i Eksempel 2, ble blandet med det kommersielt tilgjengelige fôrstoff.

(5) Fôringsmetode: Hvert fôr på 1% per kroppsvekt ble gitt en gang daglig. Dette tilsvarer 0, 50, 100 eller 200 μg/kroppsvekt/dag med hensyn til det fermenterte hveteekstrakt.

(6) Forsøk: Fôrstoffet inneholdende det fermenterte hveteekstrakt ble gitt i en uke hvorpå karpen ble infisert med viruset, og deretter ble fôrstoffet inneholdende det fermenterte hveteekstrakt gitt i 10 dager. En overlevelsesrate for karpen i 10 dager etter infeksjonen med viruset ble registrert. Resultatene er vist i FIG 1.

Alle karpene døde innen slutten av den sjette dag i den gruppe som ikke var blitt gitt det fermenterte hveteekstrakt. Derimot ble det vist at overlevelsesraten i den gruppe som var blitt gitt det fermenterte hveteekstrakt, signifikant økte på dag 10 etter infeksjon (Kaplan Meyer metode, log-rangeringstest, risikoprosent var 0,01% eller mindre). Overlevelsesraten utgjorde 65% i gruppen som var gitt 100 μg/kg kroppsvekt/dag av det fermenterte hveteekstrakt.

C. Eksempler på anvendelse av fermentert hveteekstrakt til kosmetika og bademidler

Eksempel 7

Produksjon av håndkrem inneholdende fermentert hveteekstrakt.

Det fermenterte hveteekstrakt på ca.10% produsert i Eksempel 2, ble blandet med en salve av et fettløselig substrat 1 i en formulering beskrevet i Tabell 11, for å oppnå salven.

Tabell 11 ________________________________________________________ Sammensetning_________________________ Dose _________

Hvit vaselin 250 g

Stearylalkohol 200 g

Propylenalkohol 120 g

Polyoksyetylen herdet ricinusolje 60 40 g

Glycerol-monostearat 10 g

Metyl-paraoksybenzoat 1 g

Propyl-paraoksybenzoat 1 g

Renset vann Passende mengde _________________________________________________________

Eksempel 8

Fremstilling av bløtgjøringskrem inneholdende fermentert hveteekstrakt

1. Formulering for bløtgjøringskrem inneholdende fermentert hveteekstrakt Anvendte komponenter er vist i Tabell 12. Kombinasjon A ble oppvarmet og oppløst ved 70 ºC, og kombinasjon B blandet i renset vann i en 1⁄4 mengde og oppvarmet/oppløst ved 70 ºC, og kombinasjon C, blandet i renset vann i en 1⁄4 mengde og oppvarmet/oppløst ved 70 ºC, ble tilsatt til denne. Blandingen ble grundig blandet med en homogenisator og deretter avkjølt til 40 ºC. Kombinasjon D ble tilsatt og pH justert til 6,8. Deretter ble gjenværende renset vann og fermentert hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, tilsatt i passende mengde og grundig blandet for å oppnå en melkeaktig lotion. Det fermenterte hveteekstraktet var tidligere løst i renset vann til 5 mg/mL, og 0,1 mL av dette ble tilsatt til 100 g av den melkeaktige lotion.

Tabell 12 ____________________________________________________________ Komponenter vekt% Kombinasjon Skvalan 5,0 A Olivenolje 10,0 A Jojobaolje 5,0 A Stearinsyre 4,0 A Polyoksyetylen-sorbitan-monostearat (20E.O.) 1,8 A

Metyl-polysiloksan 0,3 A

Sorbitan-monostearat 0,5 B Glycerol-monostearat av selv-emulgerende type 3,0 B

Propyl-paraoksybenzoat 0,2 B

Metyl-paraoksybenzoat 0,2 B

1,3-butylenglykol 5,0 B Konsentrert glycerol 6,0 B Karboksyvinylpolymer 0,22 C Kaliumhydroksyd Passende mengde D Fermentert hveteekstrakt (5 mg/mL) 0,1

Renset vann Passende mengde

Total mengde 100,00 ___________________________________________________________

2. Effekt av bløtgjøringskrem inneholdende fermentert hveteekstrakt Denne kremen ble benyttet av 43 menn og kvinner og en spørreundersøkelse foretatt. Angående den bløtgjørende effekt svarte 18 personer at den klart hadde en bløtgjørende effekt, 18 svarte at den hadde en svakt bløtgjørende effekt og 2 personer svarte at den ikke hadde noen bløtgjørende effekt, mens 5 personer unnlot å svare (”one specimen sign test”: p<0,0001). Angående en forbedrende effekt på ru hud svarte 6 personer at den klart hadde vært effektiv, 13 personer svarte at den hadde vært litt effektiv og ingen svarte at den ikke hadde hatt effekt, mens 24 personer ikke svarte (”one specimen sign test”: p<0,0001). Angående forverring av hudtilstanden etter bruk, svarte ingen personer at det hadde vært noen forverring. Denne kremen ble benyttet av fire personer med milde atopiske symptomer før spørreundersøkelsen ble foretatt. Angående forbedring av atopisk dermatitt svarte 3 personer at den klart hadde vært effektiv og én svarte at den hadde vært litt effektiv (”one specimen sign test”: p<0,125). Dessuten svarte en person at akne-arr hurtig var tilhelet. Denne kremen ble benyttet av 9 menn etter barbering, før spørreundersøkelsen. (8 menn svarte at den hadde vært effektiv til å redusere smerte etter barbering, forhindring av tørrhet og hurtig tilheling av barberknivsnitt (”one specimen sign test”: p<0,01). Dessuten ble denne kremen benyttet av to personer som hadde symptomer på frossen skulder som følge av alder, ved påføring på skulderen for å redusere smerte. En person svarte at den hadde vært effektiv.

Dessuten ble denne kremen benyttet av pasienter med brannskader. Til pasienter som hadde brannskader av samme grad på huden av begge hender ble kremen inneholdende det fermenterte hveteekstrakt, fremstilt i Eksempel 2, påført på den ene hånden, og kremen som ikke inneholdt fermentert hveteekstrakt påført på den andre hånden. Hånden behandlet med kremen inneholdende det fermenterte hveteekstrakt kom seg klart hurtigere. Denne kremen ble benyttet til 10 pasienter med brannskader, inklusivt nevnte tilfelle. På alle steder kom sår behandlet med kremen inneholdende det fermenterte hveteekstrakt seg hurtigere enn steder behandlet med kremen som ikke innholdt fermentert hveteekstrakt (Fishers eksakt-test: p<0,0001). Gjennom ovennevnte ble det vist at det fermenterte hveteekstrakt oppviste en terapeutisk effekt på brannskadene.

Eksempel 9

Fremstilling av hudlotion inneholdende fermentert hveteekstrakt

1. Formulering av hudlotion inneholdende fermentert hveteekstrakt Anvendte komponenter er vist i Tabell 13. Det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, ble oppløst i renset vann til 5 mg/mL, og av dette ble 0,1 mL tilsatt til 100 g hudlotion.

Tabell 13 ______________________________________________________________ Komponenter % ____ Natriumcitrat 0,1 Pyrrolidon-natriumkarboksylat 1,0

1,3-butylenglykol 5,0

POE (30) POP (6) decyl-tetradecyl-eter 0,6 Renset vann Passende mengde Fermentert hveteekstrakt (5 mg/mL) 0,1 Konserveringsmidler Passende mengde Etanol 10,0 Total mengde 100,0 _______________________________________________________________

2. Virkninger av hudlotion inneholdende fermentert hveteekstrakt Denne hudlotion ble benyttet av 5 kvinner og spørreundersøkelsen foretatt. Som resultat svarte 3 kvinner at den hadde hatt god bløtgjørende virkning og 2 kvinner svarte at den hadde hatt den vanlige bløtgjørende virkning. Ingen av kvinnene hadde hudproblemer.

Eksempel 10

Fremstilling av badesalt inneholdende fermentert hveteekstrakt

Et badesalt inneholdende det fermenterte hveteekstrakt ble fremstilt med det formål å forbedre kroppsfunksjoner. Hovedkomponentene i badesaltet er vist i Tabell 14.

Tabell 14 _______________________________________________________ Komponent Innhold_ Natriumsulfat 25,0 g Kalsiumsilikat 0,26 g

Parfyme (yuzu (citrus junos)) 0,5 g

_______________________________________________________

Badesaltet innholdende det fermenterte hveteekstrakt ble fremstilt ved tilsetning av 110 μg av det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, til ovennevnte komponenter. Badesaltet inneholdende ekstraktet og badesaltet som ikke inneholdt noe ekstrakt ble gitt blindt til 102 personer som deretter benyttet dette i et badekar (160 til 200 L) ved bading, og spørreundersøkelsen [(1) oppvarmingsgrad av kroppen, (2) vansker med å føle kulde etter badet, (3) restitueringseffekt ved tretthet, (4) lett innsovning, (5) grad av restituering ved stivhet i skulderen, (6) effekt på muskelsmerter, (7) effekt på nervesmerte, (8) effekt på nedre ryggsmerte, (9) effekt på ømfintlighet overfor lave temperaturer, (10) forbedrende effekt på ringorm på føtter, (11) bedrende effekt på tørr hud, (12) effekt på atopisk dermatitt] ble foretatt. Som resultat ble det observert en forbedring på 7% eller mer sammenlignet med kontrollen i (1) oppvarmingsgrad av kroppen (10%), (2) vansker med å føle kulde etter badet (7,9%), (6) effekt på muskelsmerter (13%), (8) effekt på nedre ryggsmerte (16%), (9) effekt på ømfintlighet overfor lave temperaturer (10%), (11) bedret effekt på tørr hud (7,3%) (Mantel-Haenszel-test: p<0,04). Resultatene ovenfor viser lindrende effekter på smerter og forbedring i oppvarmingen av kroppen ved å benytte det fermenterte hveteekstrakt som badesalt.

D. Eksempel på anvendelse av fermentert hveteekstrakt på funksjonell mat

Eksempel 11

Fremstilling av sukkertøy inneholdende fermentert hveteekstrakt

(1) Som råmaterialer ble granulert sukker, stivelsessirup, en blanding av vann og det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, blandet i forholdet 5:5:5:1 og kokt ned ved oppvarming til 120 til 160 ºC.

(2) Sukkertøyet ble oppnådd ved avkjøling av (1) på en stålplate, trukket ut til en stavform og støpt til kuleform på ca.1 g. Sukkertøyet, i passende mengde, ble anbrakt i 20 mL vann og oppløst ved oppvarming. Mengde lipopolysakkarid som virkestoffet i det fermenterte hveteekstrakt, ble målt i løsningen og fastslått til 4,6 μg/g. Dette sukkertøyet ble inntatt av 6 menn og kvinner som var forkjølet og hadde en sår hals. Deretter ble spørreundersøkelsen angående sår hals foretatt.

Når det gjaldt den såre hals følte alle 6 personene en redusert sår hals (”one specimen sign test”: p<0,03).

Eksempel 12

Fremstilling av ”alcohol decomposition functional food” inneholdende fermentert hveteekstrakt

Det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, ble blandet med et kommersielt tilgjengelig produkt som en alkohol ”decomposition functional food”, og ble undersøkt på om det lindret faryngodyni, som en ny virkning.

Kommersielt tilgjengelig produkt: varemerke ”Nonde oiki” Komponentene er vist i Tabell 15.

Tabell 15 __________________________________________________________ Komponenter Komponentinnhold Puddersukker 78,98%

Vitamin C 10,00%

Toyoriden-P 5,00%

Vitamin B2 0,02%

Parfyme (mentol) 0,50%

Amachazuru (Gynostemma pentaphylla) (saponin) 3,50%

T-Flavor Conc 13189B (flavonoid) 2,00% _________________________________________________________

Dagens “Nonde oiki” inneholder ekstrakter fra amachazuru (Gynostemma pentaphylla) og ekstraktet av grønn te, men inneholder bare ca.0,002 μg per pakke av det lipopolysakkarid som er ett av virkestoffene i planteekstraktet. Det forventes derfor å få en ny funksjon ved å tilsette den riktige mengde fermentert hveteekstrakt som i rikelig grad inneholder lipopolysakkarid. Det er ønskelig å kombinere 1 til 30 μg per 2 g pakke lipopolysakkarid som er ett av virkestoffene i det fermenterte hveteekstrakt (5 til 150 μg som det fermenterte hveteekstrakt). Først ble derfor produktet som var kombinert med 50 μg av det fermenterte hveteekstrakt fremstilt som én pakke. I produksjonsprosessen av Nonde oiki ble 2,5 mg av det fermenterte hveteekstrakt tilsatt per 100 g av produktet. Som resultat ble det fremstilt et nytt produkt som inneholdt 50 μg av det fermenterte hveteekstrakt per 2 g produkt.

20 voksne menn og kvinner som klaget over faryngodyni etter å ha drukket og nytt karaoke, ble konvensjonell henholdsvis ”Nonde oiki” og ”Nonde oiki” inneholdende det fermenterte hveteekstrakt, gitt til 10 personer, og en forbedret virkning av en alkohol-dekomponerende evne som var den offentlig kjente virkning, og en lindrende effekt på faryngodyni, undersøkt. Umiddelbart deretter ble spørreundersøkelsen angående lindrende effekt på faryngodyni foretatt. Som resultat ble det observert en reduksjon av faryngodyni hos 8 av 10 personer som hadde fått ”Nonde oiki” inneholdende det fermenterte hveteekstrakt, men bare hos 2 av de 10 personer som hadde fått konvensjonelt ”Nonde oiki”. En statistisk signifikant forskjell (Fishers eksakt-test: p<0,012) sammenlignet med kontrollen ble således observert.

E. Eksempel med relasjon til medisinske fordeler ved fermentert hveteekstrakt

Eksempel 13

Fremstilling av glycerolløsning inneholdende fermentert hveteekstrakt (terapeutisk effekt på atopisk dermatitt)

En 50% glycerolløsning inneholdende 50 μg/mL av det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, ble gitt to eller tre ganger daglig med en dosering på 2 til 3 mL per administrering til 9 mannlige og kvinnelige pasienter med refraktær atopisk dermatitt (alder 25 til 34 år) hvor utslett ble observert i ansikt, på hender og legger, torso, skulder, armer og rygg, og hvor subjektive symptomer var moderate til alvorlige. De subjektive symptomene (pruritus) ble ut fra pasientenes klager klassifisert i mild, moderat og alvorlig grad. To uker til to måneder etter start av anvendelsen kom pasientene igjen, og effektene ble vurdert. Resultatene var at tilfeller med fullstendig respons (bemerkelsesverdig forbedring av utslett og nesten fravær av de subjektive symptomene) var 4 (44%), tilfellene med delvis respons (svak forbedring av utslett og reduksjon av subjektive symptomer) var 4 (44%), tilfeller uten endring var 1 (11%) og tilfeller med forverring var 0 (”one specimen sign test”: p<0,03). Fra resultatene ovenfor ble effektivitetsraten bestemt til 89%.

Eksempel 14

Analgetisk effekt av fermentert hveteekstrakt

Det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, ble løst i destillert vann, og 0,2 mL ble med en sonde administrert peroralt til hver mus. Etter 90 minutter ble 0,7% eddiksyre administrert intraperitonealt til musene. Etter observasjon av musene i fem minutter ble antallet vridninger i løpet av 30 minutter tellet. Resultatene er vist i Tabell 16 som den mengde av hver prøve som var nødvendig for å inhibere 30% av antall vridninger i forhold til kontrollen med destillert vann. Når den effektive virkning av det lavmolekylære lipopolysakkarid avledet fra Escherichia coli var 1, var den effektive aktivitet av det fermenterte hveteekstrakt 7, hvilket viser at det fermenterte hveteekstrakt oppviste en fremragende analgetisk effekt.

Tabell 16

Analgetisk effekt av fermentert hveteekstrakt på smerte hos mus indusert eddiksyre _______________________________________________________________ Behandling Mengde for induksjon av 30% inhibering Relativ aktivitet Destillert vann 230±190 mg 1 Fermentert

hvetekstrakt 33±35 mg 7,0 _______________________________________________________________

Eksempel 15

Inhiberende effekt av fermentert hveteekstrakt på atopisk dermatitt

For å undersøke effekten av det fermenterte hveteekstrakt på atopisk dermatitt, ble en I type allergimodell innført. Anti-dinitrofenyl monoklonalt antistoff (1 μg/mus) ble administrert intravenøst til BALB/c hannmus (3 til 4 per gruppe). Etter én time ble det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, administrert intrakutant (på abdomen) (4 μg/mus) eller peroralt (100 μg/mus). Etter ytterligere én time ble 20 μL av en løsning i aceton-olivenolje (4:1) inneholdende 0,25% dinitrofluorbenzen, påført som et allergen på overflaten og baksiden av en øremusling hos en mus. Tykkelsen av øremuslingen ble målt ved å benytte en følelære 1, 2, 24 og 48 timer etter påføring. Verdien (Δ) oppnådd ved å subtrahere tykkelsen umiddelbart før påføring utgjorde graden av ødem. Effekten av medikamentadministrering ble evaluert gjennom den inhiberende grad som ble oppnådd med følgende formel ved inhiberingen i en tidlig fasereaksjon observert en time etter allergenadministreringen og en forsinket reaksjon indusert etter 24 timer. Inhiberende rate = (1 – Δ ødem av øremusling etter medikamentadministrering/Δ ødem av øremusling i kontroll) x 100. Resultatene er vist i Tabell 17. Som det klart fremgår fra tabellen inhiberte det fermenterte hveteekstrakt en allergisk reaksjon både ved intrakutan og peroral administrering.

Tabell 17

Inhiberende effekt av fermentert hveteekstrakt på allergisk reaksjon _____________________________________________________________ Administrasjons- Inhiberingsrate Inhiberingsrate måte for fermentert Dosering (%) (etter en (%) (etter 24 hveteekstrakt /mus time) timer)________ Intrakutan 4 μg 81,0 102,1 administrering

Peroral 100 μg 41,3 60,8 administrering ____________________________________________________________

Eksempel 16

Infeksjonsforhindrende effekt av fermentert hveteekstrakt

For å undersøke den infeksjonsforhindrende effekt av det fermenterte hveteekstrakt, ble det benyttet en meticillin-resistent Staphylococcus aureus (MRSA) infeksjonsmodell. Cyklofosfamid (CY, 200 mg/kg) ble intraperitonealt administrert til BALB/c hannrotter (6 til 8 uker gamle) (10 per gruppe), og etter 5 dager ble det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, administrert intrakutant. Etter 3 timer ble MRSA (3 x 10<7>CFU (colony forming units)) administrert intravenøst, og antall overlevelsesdager fastslått. Resultatene er vist i Tabell 18. Som det klart fremgår av tabellen, oppviste det fermenterte hveteekstrakt en infeksjonsforhindrende effekt på MRSA med statistisk signifikant forskjell (X<2>test: p<0,001) sammenlignet med saltvanngruppen (kontroll).

Tabell 18

Fermentert hveteekstrakt-forhindrende effekt på MRSA-infeksjon _____________________________________________________ Administrert medikament Overlevelsesrate Risikorate

Saltvann 0/10

Fermentert hveteekstrakt 9/10 P<0,001

(0,004 μg)

Fermentert hveteekstrakt 6/10 P>0,005

(0,04) μg) ______________________________________________________

Eksempel 17

Terapeutisk effekt av fermentert hveteekstrakt på metastatisk cancer

For å undersøke den terapeutisk effekt av det fermenterte hveteekstrakt på metastatisk cancer ble det innført en lungemetastasemodell av Meth A celler. Meth A cancercellene (1 x 10<5>celler) ble administrert intravenøst til BALB/c hannmus (6 til 8 uker gamle) (10 per gruppe), og etter 12 dager ble det fermenterte hveteekstrakt fremstilt i Eksempel 2, administrert intrakutant i 4 påfølgende dager. 20 dager etter transplantering av cellene ble det foretatt en autopsi og lungene tatt ut og fiksert med formalin. Lungene ble iakttatt med det blotte øye og antall knuter tellet. Resultatene er vist i Tabell 19. Som det fremgår klart fra tabellen oppviste det fermenterte hveteekstrakt en terapeutisk effekt på Meth A lungemetastatisk cancer med en statistisk signifikant forskjell

(t-test: p<0,001) sammenlignet med saltvanngruppen (kontroll).

Tabell 19

Terapeutisk effekt av fermentert hveteekstrakt på Meth A lungemetastatisk cancer _______________________________________________________________ Administrert medikament Antall knuter Risikorate (middel±standardavvik) _______________________________________________________________ Saltvann 60±11

Fermentert hveteekstrakt 33±8 P<0,001 (40 μg/kg)

Fermentert hveteekstrakt 19±6 P<0,001 (400 μg/kg) _______________________________________________________________

F. Eksempler relatert til fermentert soyabønnemelk-myseekstrakt

Eksempel 18

Fremstilling av fermentert soyabønnemelk-myseekstrakt

(1) 1,0 L vann, 0,2 g kalium(I)fosfat, 1,15 g natrium(II)fosfat, 8 g natriumklorid og 0,2 g kaliumklorid ble tilsatt til en 2 liter konisk flaske.

(2) Tørket soyabønnemelk-myse (20 g) ble tilsatt til (1).

(3) (2) ble sterilisert ved autoklavering.

(4) Fremstilling av inokulum: En koloni Pantoea agglomerans isolert fra hvetemel ble tilsatt til 5 mL 2% soyabønnemelk-mysemedium på forhånd fremstilt med samme sammensetning, og fermentert ved 37 ºC over natten (15 timer) ved forsiktig omrøring for å fremstille podematerialet for fermentering av soyabønnemelk-mysen.

(5) Den totale mengde (4) ble tilsatt til (3) og fermentert ved 37 ºC i 48 timer ved forsiktig omrøring.

(6) Løsningen av fermentert soyabønnemelk-myse (5) ble ekstrahert ved oppvarming til 120 ºC i 20 minutter i autoklav. Denne ble sentrifugert (Kubota 8800, 2000 rpm, 10 minutter), og supernatanten ble oppsamlet for å oppnå et fermentert soyabønnemelk-myseekstrakt.

(7) Måling av tørrvekt: 0,3 mL ble overført til et 1,5 mL plastrør som på forhånd var veid, og etter frysing ble det foretatt lyofilisering i frysetørkeren, hvorpå vekten var 5,97 mg. Tørrvekten av det fermenterte soyabønnemelkmyseekstraktet (6) var derfor 19,9 mg per 1 mL av løsningen, og 19,9 g for en total mengde på 1000 mL.

(8) Proteinmengden ble målt i prøven fortynnet 10 ganger etter Bradfords metode under bruk av proteinkvantifisering med BSA som standardproteinet.

Resultatene er vist i Tabell 15.

(9) Måling av nukleinsyreinnhold: Absorbans ved 210 til 340 nm av prøven fortynnet 100 ganger ble målt. Det maksimale innhold ble beregnet ved å benytte en verdi oppnådd ved å subtrahere absorbansen ved 320 nm fra absorbansen ved 260 nm og 50 μg per 1 OD absorbans som DNA.

(10) Måling av sukkerinnhold: Sukkerinnholdet ble målt ved fenolsulfatmetoden ved bruk av glukose som standardsukkeret.

(11) Måling av innhold av limulus-aktiv substans ved limulus-test: For måling ble det benyttet et Toxi-color system levert av Seikagaku Corporation, og Seikagaku Corporation Et-1 ble benyttet som standard limulus-aktiv substans. Resultatene er vist i Tabell 20.

Tabell 20

Komponentinnhold i fermentert soyabønnemelk-myseekstrakt ____________________________________________

Komponenter (mg/g) ____________________________________________

Protein 112

Sukker 537

Nukleinsyre Upåvisbar

Limulus-aktiv substans 10 _____________________________________________

Eksempel 19

Immunpotenserende virkning av fermentert soyabønnemelk-myseekstrakt

En akutt myelogen leukemicellelinje, THP-1 (1 x 10<6>/250 μL, RPMI1640-medium inneholdende 10% føtalt kalveserum) benyttet som humane makrofager, ble anbrakt i en 48-brønns plate dyrket i forkultur i 30 minutter. Deretter ble 250 μL av mediet (sluttvolum 500 μL) tilsatt slik at sluttkonsentrasjonen av hver prøve var 100 til 10000 ng/mL. Prøvene ble forsynt med en gruppe inneholdende polymyksin B (12,5 μg/mL) (ingen gruppe inneholdt bare polymyksin B ved 100 ng/mL). Etter dyrkning i 4 timer ble kultursupernatanter og cellene oppsamlet. TNF-aktiviteten i supernatanten ble målt ved en cytotoksisitetstest under bruk av L-929.

Resultatene er vist i Tabell 21. Makrofagene produserte TNF selv i nærvær av polymyksin B med det fermenterte soyabønnemelk-myseekstraktet, men ved nærvær av polymyksin B kunne ikke makrofagene produsere TNF med det lavmolekylære lipopolysakkarid. Ut fra dette er det klart at det fermenterte soyabønnemelk-myseekstraktet har en biologisk aktivitet som er forskjellig fra den for det lavmolekylære lipopolysakkarid.

Tabell 21

TNF-produksjon fra makrofager med fermentert soyabønnemelk-myseekstrakt og inhiberende virkning av polymyksin B (TNF-induksjonsaktivitet av fermentert soyabønnemelk-myseekstrakt) __________________________________________________________________________ TNF induksjonsaktivitet av fermentert soyabønnemelk-myseekstrakt og inhiberende effekt av polymyksin B (TNF-aktivitet) __________________________________________________________________________________________________ Prøve- Fermentert Fermentert Lavmolekylært Lavmolekylært Limulus- Limuluskonsentrasjon soyabønnemelk- soyabønnemelk- lipopolysakkarid lipopolysakkarid positiv positiv (ng/mL) myseekstrakt myseekstrakt med tilsetning av uten tilsetning av glykolipid glykolipid med tilsetning uten tilsetning polymyksin B polymyksin B med til- uten tilav polymyksin B av polymyksin B setning av setning av polymyksin B av polymyksin B __________________________________________________________________________________________________

0 0 0 0 0 0 0

100 N.D. 0,45 0 0,39 0 3,27

1000 0,38 4,6 0 0,42 0,5 11,3

10000 11,1 11,1 0 0,28 14,4 25,3 _______________________________________________________________________________________ N.D.: Ikke foretatt

G. Eksempler relatert til fermentert rispulverekstrakt

Eksempel 20

Fremstilling av fermentert rispulverekstrakt

(2) Et tørket rispulver (20 g) ble tilsatt til (1).

(3) (2) ble sterilisert ved autoklavering.

(4) Fremstilling av inokulum: En koloni Pantoea agglomerans isolert fra hvetemel ble tilsatt til 5 mL 2% rispulvermedium som på forhånd var fremstilt med samme sammensetning, og fermentert ved 37 ºC over natten (15 timer) ved forsiktig omrøring for å fremstille podematerialet for fermenteringen av rispulveret.

(5) Hele mengden (4) ble tilsatt til (3) og fermentert ved 37 ºC i 72 timer ved forsiktig omrøring.

(6) Den fermenterte rispulverløsningen av (5) ble ekstrahert ved oppvarming til 120 ºC i 20 minutter i autoklav. Denne ble sentrifugert (Kubota 8800, 2000 rpm, 10 minutter), og supernatanten ble oppsamlet for å gi et fermentert rispulverekstrakt.

(7) Måling av innholdet av limulus-aktiv substans med limulus-test: For måling ble Toxi-color systemet levert av Seikagaku Corporation benyttet, og Seikagaku Corporation Et-1 ble benyttet som standard limulus-aktiv substans. Innholdet av den limulus-aktive substans i det fermenterte rispulverekstrakt ble målt til 1,7 μg/mL.

Eksempel 21

Immunpotenserende virkning av fermentert rispulverekstrakt

En akutt myelogen leukemicellelinje, THP-1 (1 x 10<6>/250 μL, RPMI1640 medium inneholdende 10% føtalt kalveserum) benyttet som humane makrofager, ble anbrakt i en 48-brønns plate og dyrket i forkultur i 30 minutter. Deretter ble 250 μL av mediet (sluttvolum 500 μL) tilsatt slik at sluttkonsentrasjonen i hver prøve var 1 til 10.000 ng/mL. Prøvene ble forsynt med en gruppe inneholdende polymyksin B (12,5 μg/mL). Etter dyrkning i 4 timer ble kultursupernatanter og cellene oppsamlet. TNF-aktiviteten i supernatantene ble målt med en cytotoksisitets-test ved bruk av L-929. Resultatene er vist i Tabell 22. Makrofagene produserte TNF selv i nærvær av polymyksin B med det fermenterte rispulver ekstrakt, men i nærvær av polymyksin B, kunne makrofagene ikke produsere TNF med det lavmolekylære lipopolysakkarid. Fra dette er det åpenbart at det fermenterte rispulverekstrakt har en biologisk aktivitet som er forskjellig fra den for det lavmolekylære lipopolysakkarid og det limulus-positive glykolipid.

Tabell 22

TNF-produksjon fra makrofager med fermentert rispulverekstrakt, og inhiberende effekt av polymyksin B (TNF induksjonsaktivitet av fermentert rispulverekstrakt). ______________________________________________________________________________ Prøve- Fermentert ris- Fermentert ris- Limulus- Limuluskonsentrasjon pulverekstrakt pulverekstrakt positiv positiv (ng/mL) med tilsetning av uten tilsetning glykolipid med glykolipid polymyksin B av polymyksin B tilsetning av uten polymyksin B tilsetning av polymyksin B _______________________________________________________________________________________

0 0 0 0 0 1 0 0 0 0,1 10 0 0 0 2,2 100 0 0,1 0 6,1

1000 0,1 0,6 0 23,9

10000 0,5 2,4 0 29,3

______________________________________________________________________________

H. Eksempler relatert til fermentert brunalgeekstrakt

Eksempel 22

Fremstilling av fermentert brunalge-mekabuekstrakt

(2) Et tørket brunalge-mekabu (20 g) ble tilsatt til (1).

(3) (2) ble sterilisert ved autoklavering.

(4) Fremstilling av inokulum: En koloni av Pantoea agglomerans isolert fra hvetemel, ble tilsatt til 5 mL 2% brunalge-mekabumedium på forhånd fremstilt i samme sammensetning, og fermentert ved 37 ºC over natten (15 timer) ved forsiktig omrøring for å fremstille podematerialet for fermenteringen av brunalgemekabu.

(5) Hele mengden av (4) ble tilsatt til (3) og fermentert ved 37 ºC i 72 timer ved forsiktig omrøring.

(6) Den fermenterte brunalge-mekabuløsningen av (5) ble ekstrahert ved oppvarming til 120 ºC i 20 minutter i autoklav. Denne ble sentrifugert (Kubota 8800, 2000 rpm, 10 minutter), og supernatantene oppsamlet for å fremstille et fermentert brunalge-mekabuekstrakt.

(7) Måling av limulus-aktivt substansinnhold ved limulus-test. For måling ble det benyttet et Toxi-color system levert av Seikagaku Corporation, og Seikagaku Corporation Et-1 ble benyttet som en standard limulus-aktiv substans. Innholdet av den limulus-aktive substans i det fermenterte brunalge-mekabuekstrakt ble målt til 132 μg/mL.

Eksempel 23

Immunpotenserende virkning av fermentert brunalge-mekabuekstrakt

En akutt myelogen leukemicellelinje, THP-1 (1 x 10<6>/250 μL, RPMI1640 medium inneholdende 10% føtalt kalveserum) benyttet som humane makrofager, ble anbrakt i en 48-brønns plate og dyrket i forkultur i 30 minutter. Deretter ble 250 μL av mediet (sluttvolum 500 μL) tilsatt slik at sluttkonsentrasjonen i hver prøve var 1 til 10.000 ng/mL. Prøvene ble forsynt med en gruppe inneholdende polymyksin B (12,5 μg/mL). Etter dyrkning i 4 timer ble kultursupernatanter og cellene oppsamlet. TNF-aktiviteten i supernatantene ble målt med en cytotoksisitets-test ved bruk av L-929. Resultatene er vist i Tabell 23. Makrofagene produserte TNF selv i nærvær av polymyksin B med det fermenterte brunalgemakabuekstrakt, men i nærvær av polymyksin B kunne makrofagene ikke produsere TNF med det lavmolekylære lipopolysakkarid. Ut fra dette er det åpenbart at det fermenterte brunalge-mekabuekstrakt har en biologisk aktivitet som er forskjellig fra den for den lavmolekylære lipopolysakkarid og det limuluspositive glykolipid.

Tabell 23

TNF-produksjon fra makrofager med fermentert brunalgemekabu-ekstrakt og inhiberende effekt av polymyksin B (TNF induksjonsaktivitet av fermentert brunalgemekabu-ekstrakt) ____________________________________________________________________________ Prøve- Fermentert Fermentert Limulus- Limuluskonsentrasjon brunalge-mekabu- brunalge-mekabu- positiv positiv (ng/mL) ekstrakt ekstrakt glykolipid med glykolipid uten med tilsetning av uten tilsetning tilsetning av tilsetning av polymyksin B av polymyksin B polymyksin B polymyksin B ______________________________________________________________________________________

0 0 0 0 0 1 0 0 0 0,1 10 0 0 0 2,2 100 0 3,2 0 6,1 1000 2,4 14,4 0 13,9 10000 18,7 31,8 0 29,3 _______________________________________________________________________________________

Industriell anvendelighet

I henhold til foreliggende oppfinnelse blir det mulig billig å fremstille fermentert planteekstrakt som er et trygt immunpotenserende middel. Det fermenterte planteekstrakt som oppnås på denne måte kan anvendes i farmasøytika, farmasøytika for dyr, kvasi-medikamenter, kosmetika, næringsmidler, funksjonell mat, fôrmidler og bademidler for pattedyr, inklusivt mennesker (nærmere bestemt husdyr, kjæledyr, etc.), fugl (nærmere bestemt burhøns, selskapsfugler, etc.), amfibier, reptiler, fisk (nærmere bestemt oppdrettsfisk, gullfisk, etc.) og invertebrater.