KR20060019134A - 대나무 유래의 미생물을 이용한 발효액 및 그의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대나무의 껍질, 줄기, 잎, 뿌리 등을 채취하여 이를 발효시켜서 얻은 대나무 발효액, 그의 제조 방법 및 이 발효액의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 죽순 등에 유래하는 자연 서식 미생물을 이용하여 발효액을 제조하는 방법, 이 발효액의 다양한 산업적 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 발효액은 천연물에서 유래한 것으로 부작용이 없으며 여러 가지 유익한 기능성을 나타내므로 의약 또는 식품 성분 등 다양하게 이용할 수 있다.

대나무, 발효액

Description

대나무 유래의 미생물을 이용한 발효액 및 그의 제조 방법{Fermentation liquor using microorganisms from bamboo, and process for preparing the same}

도 1은 본 발명에 따른 발효액의 비브리오균(Vibrio vulnificus)에 대한 항균효과를 나타내는 사진.

도 2는 본 발명에 따른 발효액의 에어로모나스균(Aeromonas hydrophila)에 대한 항균효과를 나타내는 사진.

도 3은 본 발명에 따른 발효액의 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균효과를 나타내는 사진.

본 발명은 대나무 껍질, 줄기, 잎, 뿌리 등을 채취하여 이를 자연적으로 또는 인위적으로 발효시켜서 얻은 대나무 발효액, 그의 제조 방법 및 이 발효액의 용도에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리, 죽순 등에 유래하는 자연 서식 미생물(예, 세균, 곰팡이)로부터 제조된 발효액, 그의 제조 방법 및 이 발효액의 다양한 산업적 용도에 관한 것이다.

대나무는 화본과 식물로 우리나라를 위시한 동남아시아에 주로 분포하고 있 으며, 우리나라에 자생하고 있는 대표적인 종류는 왕대(참대), 맹종죽, 조릿대, 신의대 등을 들 수 있다. 대나무는 예로부터 고혈압, 발한, 중풍 등의 치료를 위한 민간약으로 활용이 되어 왔을 뿐만 아니라 대나무의 방부효과도 민간에 널리 알려져서 김치를 담근 후 대나무 잎으로 덥거나, 동치미에 조릿대 잎을 띄워서 보관기간을 연장하는데 사용하였다. 또한 대나무 성분이 민간 약제 및 건강음료로 사용되고 있는 점을 고려할 때, 식품 보존제로 사용이 가능할 것으로 보인다. 대나무의 항균성에 관한 연구로는 주로 김치의 젖산균에 대한 대나무의 항균효과를 보고했지만 대나무 열수 추출물의 당 Brix에 대한 농도로 표시하여 대나무 종류별 정확한 항균 효과로 보기 어렵다.

대나무를 이용한 산업적 응용의 구체적인 예로는, 대나무 추출물을 이용하여육류제품을 가공하는 방법이 등록 특허공보 제1999-187719호에 개시되어 있고 죽내피 추출물을 함유한 미백화장료가 특허공개공보 2000-0007943호에 개시되어 있다.

그러나, 대나무의 유리한 특성을 산업적으로 최대한으로 활용할 수 있는 묘안에 대해서 여전히 많은 방안들이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 대나무에서 기능성을 나타내는 물질을 탐색하고자 예의 연구한 결과, 대나무의 껍질, 줄기, 죽순, 뿌리, 잎을 채취하여 여기에 부착된 유익한 세균 및 곰팡이 등의 자연미생물을 발효시켜 본 결과, 이 발효액이 다양한 기능성을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 죽순, 뿌리를 채취하여 이로부터 곰팡이 등 미생물을 자연 증식시키거나 또는 상기 재료를 깨끗이 세척한 다음 여기에 세균류, 진균류 또는 이들의 복합균을 첨가하여 미생물을 증식시킨 다음 이를 발효시켜서 얻은 대나무 발효액 및 그의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발효액의 다양한 산업적인 용도, 예들 들면 상기 발효액을 포함한 숙취해소용 음료, 위장관 치료제, 가축 및 어류 양식용 사료첨가제 및 어병억제제를 제공하는데 있다.

본 발명은, 일면에 있어서, 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 죽순, 뿌리를 채취하여 이로부터 세균, 곰팡이 등의 미생물을 자연 증식시키거나 또는 상기 재료를 깨끗이 세척한 다음 여기에 세균류, 진균류 또는 이들의 복합균을 첨가하여 미생물을 증식시킨 다음 이를 발효시켜서 얻은 대나무 발효액, 및 그의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에 따른 대나무 발효액은

a) 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리 또는 죽순을 채취하여 여기에 증자시킨 고두밥을 첨가하여 미생물을 자연 증식시키거나 또는 상기 재료들을 깨끗이 세척한 다음 여기에 고두밥을 첨가하고 세균류, 진균류, 또는 이들의 복합균을 접종하여 미생물을 증식시키는 단계,

b) 상기 고두밥에 당원을 첨가하여 당화시킨 다음 이를 발효시켜 발효원액을 제조하는 단계, 및

c) 상기 발효원액을 살균한 냉각 지하수 또는 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 뿌 리 또는 죽순을 끓인 물로 희석하여 숙성시켜 발효액을 제조하는 단계에 의해 얻어진다.

이하, 상기 발효액의 구체적인 제조 방법에 대해서 설명한다.

상기 단계 a)에서 사용되는 대나무는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 조릿대, 솜대, 맹종죽, 왕대, 오죽 등의 껍질, 줄기, 잎, 죽순, 뿌리를 이용할 수 있다. 이러한 재료는 적당한 크기로 절단하여 취급이 용이하도록 전처리하여도 좋다. 상기 대나무 재료는 단독 또는 혼합하여 사용할 수 있고, 이를 약간 경사진 바닥의 비닐 위에 직경 약 50cm의 범위로 분산시켜 배치하고 그 위에 증자시킨 고두밥(예, 맵쌀 밥)을 골고루 얹은 다음 7~20 일 동안 15~60 ℃의 온도에서 미생물을 증식시킨다. 그 후 당액으로서 흑설탕 등을 상기 고두밥에 대하여 약 1:0.1~5 배의 비율로 첨가하여, 상기 미생물을 증식시킨 조건과 동일 또는 유사한 조건하에서 3~15일 동안 발효시켜 자연스럽게 우러나오는 발효원액을 수집한다. 고두밥에 당액을 첨가하여 당화시켜서 당화된 고두밥을 발효시키는 공정에 있어서, 당액의 원료는 흑설탕, 설탕, 키토올리고당, 엿기름, 벌꿀, 포도당, 과당, 유당, 플락토올리고당 등을 사용하여도 되고 이들의 혼합물을 사용하여도 좋다. 이어서, 상기 발효액은 상기 대나무의 껍질, 줄기, 뿌리, 잎, 죽순 등을 수거하여 약 2시간 정도 끓인 후 이를 4 ℃로 냉각시킨 추출수로 일정비로 희석하여 숙성시켜 발효액을 얻는다. 희석배수는 1:10~1000배의 범위 내에서 수행할 수 있으며, 약 100배 정도 희석하는 것이 바람직하다. 숙성 조건은 특별히 한정할 필요는 없으나, 보통 실온 내지 45℃에서 수행하는 것이 좋으며, 숙성 기간은 1주 내지 2개월 정도 수행하는 것이 바람직하 다. 희석액으로서 상기 끓인 대나무 재료 추출수 대신에 비등시킨 다음 4℃로 냉각시킨 지하수를 사용하는 것도 가능하다. 이 발효액을 필터(예, 0.2㎛)로 여과시켜 미생물 등의 고형물질과 이물질을 제거한다. 추가로, 필요에 따라서, 여액을 100℃ 까지 약 2 시간 정도 끓여 잔여 미생물을 살균시킨 다음 자연 냉각시켜 목적하는 용도에 사용할 수 있다. 상기 멸균 과정은 순간멸균, 고압 순간 멸균, 초음파 처리 등 다른 물리적 방법으로 수행하여도 좋다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서 상기 미생물을 증식시키는 과정은 자연 상태에 존재하는 미생물을 발효시키는 시스템을 채용한 것을 예로 들어 설명한 것이나, 별법으로 대나무의 재료를 깨끗이 세척한 후 여기에 발효 등의 유익한 기능을 제공하는 것으로 알려진 세균, 진균 등의 각종 미생물 또는 복합 미생물 제제 또는 효모 등을 첨가하여 발효시키는 방식 역시 바람직한 결과를 초래할 수 있다.

이와 같이 미생물 균주를 인위적으로 첨가하여 발효 과정을 수행하는 경우에는 단독의 미생물 또는 미생물군을 사용하는 것보다는 유익한 기능을 하는 것으로 알려진 다양한 미생물들을 복합적으로 사용하는 것이 더욱 바람직한 결과를 초래할 수 있다.

상기 발효 과정에 참가할 수 있는 미생물은 발효 등의 유익한 기능을 제공하는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면 이들에 제한되지 않고, 세균, 진균류를 포함하며, 바람직하게는, 유산균, 광합성균, 바실러스균, 효모, 방선균 또는 이들의 혼합 미생물을 들 수 있다.

유산균 또는 복합 유산균의 예로서는, 이들에 제한되지 않고, 스트렙토코커 스 락티스(Streptococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 스트렙토코커스 락티스(Streptococcus lactis), 페디오코쿠스 아시드락티시이(Pediococcus acidlacticii), 페디오코쿠스 세레비시에(Pediococcus cerevisiae) 등, FDA 등재목록에 있는 GRAS(Generally Regarded As Safe) 미생물에 포함되는 유산균주를 배양 발효시킬 수 있다. 유산균은 기질의 섬유소 분해능이 뛰어나고, 인체, 동물 및 어류의 면역기능을 강화하는 것으로 알려져 있다.

광합성균으로서는 스테아로 써모필러스균(Bacillus stearothermophilus), 로도슈도모나스 캅술라타(Rhodopseudomonas capsulata)를 들 수 있으며, 바실러스 속의 균의 예로서는 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 나토(Bacillus natto), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 등을 들 수 있고, 방선균의 예로서는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 진균의 예로는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 칸디다 세이크(Candida sake), 모르티에렐라 엘롱가타(Mortierella elongata), 뮤코 시르시넬로이데스(Mucor circinelloides), 아스퍼길루스 속(Aspergillus sp.), 예컨대 아스퍼길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스퍼길루스 오리재(Aspergillus oryzae), 페니실리움 왁스마니(Penicillium waksmani), 트리코데르마 리그노럼(Tricoderma lignorum), 리조푸스 속(Rhizopus sp.), 예컨대 리조푸스 올리고스포루스(Rhizopus oligosporus) 등을 들 수 있다.

이러한 미생물 또는 복합 미생물 제제는 단지 설명할 목적으로 예를 들어 설명한 것이며, 유익한 것으로 알려진 다양한 미생물을 제한 없이 본 발명에 적용할 수 있음은 본 발명의 특징에 비추어 당업자에게 자명하다. 미생물의 입수는 자연 상태에 존재하는 균을 사용해도 좋으며, 상업적으로도 입수 가능한 것을 사용해도 좋고, 미생물 기탁기관으로부터 분양 받아서 사용해도 좋다.

대나무 재료를 사용하여 미생물을 자연적으로 증식시키는 경우에 물론 유익한 균종 외에도 잡균의 번식이나 오염 가능성은 전혀 배제할 수는 없으나, 수차례의 시험 결과 어떠한 잡균의 존재도 검출되지 않았으며, 이러한 결과는 대나무의 고유한 항균 작용에 의해 잡균이 서식하지 못하게 되고, 간혹 잡균이 침투하게 되더라도 먼저 증식하여 우세하게 된 유익한 세균이나 진균류가 분비하는 효소나 길항 물질의 작용에 의해 잡균의 증식이 억제되거나 방해되는 것으로 보인다.

이와 같이 제조된 발효액은 pH 5 이하의 강산성을 띠고 있으며, 대나무의 재료로부터 유래하는 고유의 항균 작용으로 인하여 잡균이 서식하지 못하므로 인체에 해롭지 않고, 더욱이 상기 발효액에 대해서는 고온 멸균 처리하여도 기능 상에 문제가 발생하지 않으므로 물리적 방식으로 추가 멸균하여 안정성을 확보하는 것이 가능하다. 물론, 멸균처리를 하지 않은 원액에 대해서 독성 실험을 한 결과에 의하더라도 전혀 독성을 나타내지 않은 것으로 밝혀졌다.

본 발명은, 다른 일면에 있어서, 상기한 바의 방법에 의해 얻어지는 대나무 발효액을 포함하는 위장관 질환의 치료용 제약 조성물 또는 기능성 식품 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 후술하는 시험예로부터 확인할 수 있는 바와 같이 인체의 장을 정화하고, 소화율을 향상시키고 면역력을 강화시킬 뿐만 아니라 장내 유익균총을 증식시키는 기능을 하며 소화기능, 위궤양, 숙취해소, 및 소화기 개선 작용을 나타내므로 위장관 질환의 개선 또는 소화 촉진을 위한 의약 조성물로서 사용될 수 있다. 대상이 되는 질환의 예로는 이들에 제한되지는 않고, 위암, 소화불량, 위염 숙취 또는 위궤양 등의 기타 소화기 장애를 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화할 수 있다. 일반적으로는, 유효 성분을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등를 가하고, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 또한 이것을 사용전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 만들 수 있는 건조품으로 할 수도 있다.

본 발명의 제약 조성물은 경구제나, 주사제, 점적용제 등의 비경구제 중의 어떠한 것에 의해서도 투여할 수 있다.

의약용 담체는, 상기 투여형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있고, 경구제의 경우는, 예를 들어 전분, 유당, 백당, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 콘 스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다.

한편, 비경구제의 경우는 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효성분인 대나무 발효액을 포함하는 조성물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜서 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 가함으로써 조제된다.

본 발명의 의약 조성물은 제제 형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법은 특히 한정할 필요는 없고, 내용, 외용 및 주사에 의해 투여할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여량은, 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당 예컨대 10㎍∼200 ㎎/㎏이다. 물론 투여량은, 각종 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.

본 발명은, 추가의 일면에 있어서, 상기 대나무 발효액을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품 조성물, 및 음료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 대나무 발효액은 소화기능, 위궤양, 숙취해소, 및 소화기 개선 작용을 나타내는 다양한 약리 활성 및 생리 활성 물질을 포함하므로 이를 복용이 간편한 기능성 식품 또는 음료수 조성물의 유효 성분으로서 유용하게 사용될 수 있으며, 유효 성분으로서 대나무 발효액의 함량은 예컨대 조성물의 전체 중량을 기준으로 0.01~20%의 범위로 설정할 수 있다.

식품의 보조 성분들, 이들의 배합비 등은 당업계에 통상적으로 사용되는 것들을 특별한 기술적 어려움이 없이 채용할 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물의 제형은, 예를 들면 정제, 캡슐, 과자류 또는 드링크제 등의 음료수의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 원하는 조성물의 형태에 따라 통상의 보조제, 예를 들면 아스파탐, 사카린, 펙틴, 구아검, 탈지분유 및 올리고당으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가해도 좋다.

본 발명의 식품 조성물에 있어서 감미료로는 통상적으로 사용되는 아스파탐, 사카린, 말리톨, 솔비톨, 자일리톨을 사용할 수 있다. 이들은 본 발명의 식품 조성물의 전체 중량을 기준으로 약 0.1-20 중량 %로 사용하는 것이 적절하다.

본 발명에 따른 음료 조성물은 원하는 조성물의 형태에 따라 음료용 첨가제, 예를 들면 감미료, 아스파탐, 사카린, 펙틴, 구아검, 탈지분유, 말리톨, 솔비톨, 자일리톨, 올리고당, 구연산, 비타민 등을 첨가하여 기호도나 미감을 증대시키는 것이 좋다. 이들은 본 발명의 음료 조성물의 전체 중량을 기준으로 약 0.01-20 중량%로 사용하는 것이 적절하다.

음료수는, 예를 들면, 대나무 발효액을 0.01-20% 중량으로 넣고 구연산을 0.01-2%, 사과산 0.01-2%, 타우린 0.1~2%, 비타민 C 0.01-2%, 비타민 B1 0.01-2%, 바이오틴 0.01-2%, 액상과당 0.01-2% 등을 넣고 단맛은 아스파탐을 0.01-2%를 넣어 기능성 음료수로 제조할 수 있다.

본 발명은, 더욱 추가의 일면에 있어서, 상기 대나무 발효액을 유효성분으로 함유하는 가축 및 어류의 사료 첨가제 조성물 및 어병억제제을 제공한다.

본 발명의 사료 조성물 및 어병억제제는 어류양식용 또는 가축 사료에 혼합하여 사용하는 것이 편리하며, 사료의 중량을 기준으로 0.01% 내지 10.00%의 비율로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다. 그러나, 배합 비율은 사용 목적에 따라 변화시킬 수 있으며, 예를 들어, 개체의 성장 단계, 면역력, 생리적 상태 등에 따라 다소 변화시킬 수 있음은 자명하다.

근래 국민의 소득 수준 향상과 더불어 육류 제품 소비량이 증가하고 있으나, 농산물 수입 개방화에 따라 값이 싸고 질이 낮은 수입품의 대량 유통으로 인하여 수입 농산물과의 경쟁력에서 불리한 위치에 있어 국내 양식 및 축산물 산업은 붕괴 위험에 처해 있는 실정이다. 따라서, 우리 정서에 알맞고 소비자들에게 친근감을 주면서도 기능성이 강화된 고품질 축산 및 어류 양식 제품의 개발이 절실히 요구되고 있다.

더욱이, 1990년대 이후 보편화된 어류양식은 최근 들어 사료 값의 상승과 많은 질병발생으로 어려움을 겪고 있으며, 이를 극복하기 위한 노력이 계속되고 있다. 아직까지 양식에 사용되고 있는 사료의 대부분은 자연에서 어획되는 전갱이, 고등어 등의 생사료를 그대로 사용하거나 생사료에 배합사료를 혼합한 모이스트 펠렛(MP)을 사용함으로서 사료의 효율성 저하 및 환경오염 등 많은 문제를 안고 있으며, 이러한 문제를 해결할 수 있는 획기적인 사료의 개발은 이루어지고 있지 않은 실정임에 비추어 본 발명에 따른 대나무 발효액은 비브리오균을 포함한 어병의 발생을 근본적으로 차단할 수 있으므로 어병치료제 또는 사료의 첨가제 성분으로 효 율적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 사료 조성물에 포함된 대나무 발효액은 가축 및 어류의 장을 정화하고, 소화율을 향상시켜 성장을 촉진하여 생산성을 증대시키고 어류 및 동물의 장내에서 유익균총을 증식시켜 질병을 예방할 뿐 아니라, 병원균 번식을 억제하고 어류 및 가축의 육질을 개선하는 등의 직접적인 효과 뿐만 아니라 질병의 발생억제에 따른 관리비의 저감이 가능하고 친환경적인 양식 산업을 촉진할 수 있을 것으로 기대된다.

<실시예>

이하, 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 대나무 잎 유래의 미생물을 이용한 발효액의 제조

전남북 지역에서 자생하는 솜대(Phyllostachys nigra var. henonis) 밭에 떨어져 있는 대나무 잎 2 kg을 모아서 약간 경사진 바닥의 비닐 위에 직경 50cm의 범위로 분산시켜 배치하고 그 위에 증자시킨 맵쌀 밥 5kg을 골고루 얹은 다음 15일 동안 31 ℃ 전후에서 방치하여 미생물을 증식시켰다. 그 후 당액으로서 흑설탕 5kg을 첨가하여 동일한 조건에서 1주일 동안 발효시켜 우러나온 발효원액 800 ml을 수집하였다. 별도로 상기 대나무 잎을 수거하여 2시간 동안 끓인 후 이를 4℃로 냉각시킨 물로 상기 발효액을 100배 희석하여 이를 실온에서 30일 동안 숙성시켜 발 효액(pH 2.75) 80ℓ를 얻었다. 이 발효액을 0.2㎛의 필터로 여과시켜 고형분과 이물질을 제거하고 여액을 100℃로 2시간 동안 끓여 미생물을 사멸시킨 다음 자연 냉각시켜 사용할 때 까지 밀봉한 다음 실온에 보관하였다.

실시예 2: 발효액의 미생물학적 분석

실시예 1에서 제조된 멸균전 상태의 발효액을 멸균 생리 식염수로 단계별 희석하여 Miles & Misra법(참고문헌: Miles, A.A. and Misra S.S.(1938, The estimate of bactericidal power of the blood. J. Hygiene, 38, 732-749)에 따라 각 희석액 25㎕를 Brain heart infusion agar(Difco, BHIA) 평판위에 접종하여 25 ℃에서 2일간 배양한 다음 살아난 균의 집락을 계수하여 산정하였다.

1 ml당 총균수는 3.6 x 10⁴ cfu/ml로서 비교적 적은 숫자의 균이 검출되었다. BHIA에서 자라난 집락 9개를 선택하여 동정한 결과 3종류의 균(BA-01, BA-02, BA-03)이 검출되었다. 이중 BA-01균이 66.7%로 가장 많고, BA-02는 22.2%, BA-03는 11.1%의 비율로 검출되었다. 분리균의 성상은 모두 그람양성균으로 OF에서 포도당을 이용하지 못했으며 산과 gas의 생성도 없었다. 운동성은 양성이었지만 BA-03균주는 운동성이 아주 미약하였다. 한편 catalase는 양성이었지만 oxidase, indole 및 황화수소의 생산은 모두 음성이었고 Rapid STR kit로 검사한 프로필은 각각 30000, 70000 및 61,000이었다.

각 균주의 16S RNA 부분염기서열에 기초한 분자계통학적 분석에 의하면 대나 무 발효액의 배양에 관여한 미생물들은 표준 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 균주와 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 균주와 각각 98% 및 96%의 유연결과를 가지는 것으로 계통학적으로 이들 종에 속하는 것으로 확인되었다. 한편, 발효에 관여한 진균류는 Phizopus 속에 속하는 것으로 확인되었고, 이를 2004. 8. 12일자로 대전광역시 소재 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하고 기탁번호 KCTC 10684BP를 부여 받았다. 이들 세균 및 곰팡이류는 모두 유익한 균주로 확인된 종들이다.

실시예 3: 미생물을 이용한 발효액의 제조

실시예 2에서 확인된 미생물들을 깨끗이 세척한 대나무 잎과 고두밥의 배지에 첨가함으로써 실시예 1의 과정을 반복하여 미생물을 증식시킨 후 대나무 발효액을 제조하였다.

실시예 4: 미생물을 이용한 발효액의 제조

복합 유산균 제품인 불가리스(판매원: 남양유업), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) strain Nara-B2 (대전시 목원대학교 미생물생태자원 연구소 보유), 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) strain Nara-B3 (대전시 목원대학교 미생물생태자원 연구소 보유) 및 누룩을 전체 용량이 200ml 정도 되게 혼합한 후, 깨끗이 세척한 대나무 잎과 고두밥의 배지에 첨가한 후 실시예 1의 과정을 반복하여 미생물을 증식시킨 후 대나무 발효액을 제조하였다.

실시예 5: 약학적 제제

제형의 형태(캅셀제)

유효성분(실시예 1의 발효물 동결건조품) 50 mg

락토오스 50 mg

전분 15 mg

스테아르산 마그네슘 2 mg

결정성 셀룰로오스 10 mg

캅셀들은 통상의 방법에 의해 제조하였으며 상기한 성분들을 원료로서 함유하였다. 상기 제제는 연질캅셀 또는 정제로도 제조할 수 있으며, 정제들은 통상의 장용피(예, 히드록시프로필메틸세룰로오스 프탈레이트), 당 코팅 또는 필름(에틸 세룰로오스)를 필요시 가할 수 있다.

실시예 6: 음료수의 제조

실시예 1에서 얻은 대나무 발효액 1 ℓ를 넣고, 여기에 구연산 20g, 아스파탐 17 g 및 비타민 C 30 g을 첨가하한 후 나머지를 정제수로 첨가하여 음료수 10 ℓ를 제조하여 저온 살균하였다. 음료수의 대조군은 동충하초 (종근당건강)을 사용하였다. 결과적으로 본 발명 음료수는 종래의 음료수 제품과 색깔, 풍미, 입안 감촉, 단맛 그리고 종합평가 면에서 차이가 없었다.

시험예 1: 급성독성시험

실시예 1에서 얻은 대나무 발효액을 실험동물에 대한 급성 독성 실험을 수행하고 그 독성유무를 관찰하였다. 실험용 동물은 생후 5-7주된 약 130g의 특이한 병변이 없는 수컷(specific pathogenic free male) sprague-dawely rat 50마리를 사용하였고 본 발명의 발효액과 음성대조군으로서 증류수를 사용하여 시험하였다. 먼저, 상기 래트들을 온도 22±2℃, 상대습도 53±2 % 및 형광등 조명(09:00 점등-18:00 소등)의 명암사이클, 150-300 Lux의 조도 조건을 갖춘 실험실 사육 상자에서 약 1주일 정도의 기간에 걸쳐 순화시킨 다음, 건강한 동물들만을 선택하여 평균체중이 일치하도록 각 군으로 나누고 일일 1회 20ml/kg의 양으로 14일 동안 강제 경구투여한 다음, 일반상태의 변화, 중독증상, 운동성, 외관, 자율신경, 체중변화 및 사망동물의 유무에 관하여 점검하였다.

실험 결과에 의하면, 실험기간 동안 체중에 있어서 5% 이내의 변화를 보였으나 유의성은 없었고, 시료의 양을 시험동물에 투여가능한 최대량인 kg당 20ml의 최고 농도를 선정하였음에도 사망동물이 관찰되지 않아 개략의 치사량 산출은 불가하였으므로 LD₅₀은 20ml/kg B.W. 이상인 것으로 나타났고, 특이한 일반증상이나 부검시 특이한 병변이 관찰되지 않았으므로 이를 종합적으로 판단해보면 상기 조성물은 독성이 없는 것으로 판명되었다.

시험예 2: 발효액의 어병세균에 대한 증식 억제 효과

본 실험에 사용한 균의 유래는 하기 표 1에 나타냈다. 병원균은 BHIA에 25℃ 에서 1일간 배양한 다음 멸균 생리식염수에 현탁시켜 5 x 10⁸ cell/ml와 5 x 10⁵ cell/ml의 균액을 제조하였다. 0.45㎛ 멤브레인 필터로 여과 멸균한 발효액 2.5 ml과 2배의 농도로 고압 증기 멸균한 Brain Heart Infusion Broth(Difco) 2.5 ml을 혼합한 배양액 속에 각 균액을 0.1 ml 씩 접종한 다음 25℃에 배양하면서 일정 시간 후 각각 0.3 ml을 채취하였다. 채취한 배양액은 멸균생리식염수로 10단계 희석시킨 다음 BHIA에 접종하여 25℃에서 1일간 배양하여 자라난 집락을 계수하였다.

균주명	입수처
비브리오균(Vibrio vulnificus)	ATCC 27562
에어로모나스균(Aeromonas hydrophila)	ATCC 7966
대장균(Escherichia coli)	ATCC 25922

어병 세균의 in vitro에서 발육억제 효과는 고농도인 10⁷을 접종한 경우 4균주 모두 접종 3시간 후부터 감소하기 시작하여 24시간 후에는 1/10~1/100으로 감소하였지만 본 발명의 대나무 발효액을 첨가하지 않은 대조군은 100~10,000배로 증가하여 고농도의 경우 어느 정도 균의 증식이 억제됨을 확인하였다. 이러한 발육억제 효과는 균의 종류에 따라 차이가 있었는데 패혈증 유발균인 비브리오균(도 1), 식중독 유발균인 에어로모나스균(도 2), 슈도모나스균(도면으로 나타내지 않음) 보다는 장내세균인 대장균(도 3)에 대한 억제 효과가 약한 것으로 나타났다. 한편, 저농도인 10⁴를 접종하였을 때에는 모든 균이 시간이 경과함에 따라 균의 증식이 억제되어 접종 24시간 후에는 검출되지 않았고, 특히 Vibrio, 와 Aeromonas 균에 대한 억제효과가 뛰어나 접종 3~6시간 후에는 검출되지 않았다. 그러나 대조군에서는 접 종 24시간 후에는 접종 농도의 10,000~1,000,000배로 균이 증식되었다. 따라서 본 발효액은 고농도의 어병세균에 대한 발육억제 효과는 약한 반면, 세균의 농도가 저농도인 경우에는 균의 종류에 관계없이 발육을 억제하는 것으로 나타났다.

시험예 3: 생쥐의 혈중 알코올 농도에 미치는 효과시험

체중 50g의 웅성 생쥐 20마리를 2군으로 나누고, 대조군은 생쥐에 알코올(40%, 15 ml/kg B.W)을 1시간 간격으로 2회 투여한 다음 1시간 후 동일량의 증류수를 투여하였으며, 다시 1시간이 경과한 후에 채혈하였다. 시험군은 대조군과 동일한 방식으로 알코올을 투여한 다음 1시간 후에 실시예 1에서 제조된 대나무 발효액을 동량으로 투여하였다.

상기 각 생쥐의 혈액을 채취한 후 혈정을 분리한 다음 알코올 반응 혼합액(glycine buffer reagent, Sigma Co.) 3ml에 혈청 10㎕를 가한 다음 분광광도계를 사용하여 340 nm에서 흡광도를 측정하고 그 결과를 다음의 표 2에 나타냈다.

알코올 농도의 변화

구분	알코올함량(mg/dL, 평균값)
대조군	83.26
본 발명	66.36

상기 표 2의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 발효액을 처리한 경우 대조군에 비하여 혈중 알코올 농도가 약 20% 정도 낮게 나타났다. 이와 같은 결과는 상기 대나무 발효액의 숙취해소제로서 가능성을 나타낸다.

시험예 4: 숙취해소에 대한 임상시험

상기 실시예 6에서 제조된 음료의 숙취해소에 미치는 효과를 검사하기 위하여 30대∼60대의 평소 주량이 소주 2병 전후인 남,녀 자원자 60명을 선발하여 3개군으로 나누어 다음 표 3에 나타낸 항목에 대하여 검사 방식을 설명하고 A 그룹에 대해서는 알코올 도수가 48%인 양주를 200cc를 30분에 걸쳐서 마시게 한 바로 직후 본 발명의 발효액 200cc를 마시게 하고 혈중 알코올 농도를 매 30분 단위로 측정하였다. B 그룹은 A 그룹과 동일한 방식으로 양주를 마시게 하고 곧바로 동일한 양의 물을 마시게 하였다. C 그룹은 양주를 마시기 전에 동일 양의 발효액을 섭취하게 하였다. 측정 결과를 다음의 표 3에 나타내었다.

시험군	음주후 경과시간에 따른 혈중알코올 농도
	0분	30분	60분	90분	120분
A	0.10	0.09	0.07	0.05	0.04
B	0.11	0.10	0.09	0.08	0.08
C	0.09	0.08	0.07	0.06	0.04

위 결과로부터 알수 있는 바와 같이, 본 발명의 발효액 음료를 마신 경우에는 대조군에 비하여 약 23% 정도(90분 경과 기준) 개선된 알코올 분해 효과를 나타내었다.

시험예 5: 대나무 발효액의 위장질환 개선 효과

실험동물은 생후 6-8주된 약 150g의 특이한 병변이 없는 수컷(specific pathogenic free male) 스프라그-다울리 쥐를 한국화학연구소 안정성 연구부로부터 구입하여 실험에 사용하였다. 사료와 물은 자유롭게 먹게 하며, 사육실의 온도는 21~24 ℃ , 상대 습도는 40~60%로 유지하였다. 또한 사육실의 밤과 낮이 12시간마다 반복되도록 조절하였다.

랫트는 흉부를 절개한 후 심장의 정맥을 이용해 PBS로 체내의 혈액을 제거한 뒤 4% 파라포름알데히드(Para-formaldehyde)로 관류 고정하였다. 고정된 쥐의 위를 적출하여 microcryocut를 이용하여 3-5㎛두께의 동결절편을 제작하였다. 준비된 위 절편은 PBS로 여러 번 씻어주었다. 30% 과산화 수소로 전처리하여 씻어준 후 vectastain ABC kit의 normal goat serum을 0.5% BSA/PBS에 섞어 1시간 동안 반응시켜 비특이적 단백질의 결합을 막았다. TH 일차(primary) 항체와 0.5% BSA/PBS (1:10000) 희석하여 실온에서 1시간에서 2시간 정도 반응시켰다. 시료를 PBS로 3회 세척한 후, 이차 항체(biotinylated anti-rabbit IgG in 1% BSA/ PBS)를 이용하여 1시간 동안 반응시킨 다음 1% BSA/ PBS로 두 번 씻어냈다. 사용하기 30분 전에 vectastain ABC kit (1:50)를 희석하여 50분 동안 반응시킨 후 PBS로 2번 씻고, 50ml DAB 용액과 0.2M PB 용액에 30% hydrogen peroxide 12㎕를 첨가한 용액으로 5분간 염색시켜 0.1M PB로 5분간 반응을 동시에 정지시킨 다음, 광학 현미경으로 관찰하였다. 그리고 위에서의 세포 계수(counting)는 각각 처리된 4개의 염색된 절편을 선택하여 400에서 전 층을 대상으로 조직절편의 단위면적당 TH가 발현된 세포의 수를 측정하였고 계수 결과는 윌콕슨의 순위합 검정 (Wilcoxson rank sum test)를 이용하였다.

Eisenhofer 등 (Eisenhofer E., Hansson G., Harta S., Hoffman G.. Non-neuronal dopamine in the gastrointestinal system. Clinical and Exp. Pharm. & Phys. Supplement 26:14-22, 1999.)에 따르면 위(Stomach)에서 dopamine이 생성되고 TH activity를 가진다고 보고하였다. 그리고 Elsenhofer 등이 위에서의 도파민(dopamine)은 위장관(gastrointestinal tract)의 보호물질로 작용하며 면역조직화학(Immunohistochemistry)과 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 이용하여 위에서의 TH-IR 세포들이 존재함을 보고하였다.

실시예 1에 따른 대나무 발효액을 복강에 처리했을 때 위에서의 TH 반응 양상 변화를 관찰하였다. 먼저 대조군을 살펴보면 TH-IR 세포들이 점막근판 (Muscularis mucosae)에서 주로 나타났으며 위선 (Gastric glands)에서는 갈색의 씨앗 모양을 하고 있는 한 두 개의 TH-IR 세포들을 관찰하였다.

반면에 시료를 처리한 조직들에서는 대조군에 비해 점막근판에서 더 많이 발현됨을 확인하였고 발현영역이 위선까지 더 넓어짐을 확인하였다. 그리고 위 조직에 나타난 TH-IR 세포를 일정한 단위면적에서 cell counting을 하여 비교해 본 결과, 대조군에 비한 실험군들의 TH-IR 세포들의 수가 더 많이 나타났으며 최대 2.5배 이상의 숫적 증가를 확인하였다.

시험예 6: 본 발명 제품의 임상 시험

상기 실시예 6에서 제조된 기능성 음료의 효과를 검사하기 위하여 20대∼70대의 남,녀 자원자 250명을 5개군으로 나누어 다음 표 4에 나타낸 항목에 대하여 검사 방식을 설명하고 익숙할 수 있도록 연습시킨 후 1일 평균 600cc를 물 대용으로 음용하는 방식으로 임상 검사를 실시하였다.

평가 기준은 4 단계로 나누고 점수가 높을수록 좋은 결과를 나타내는 것으로 정하였다. 즉, 1: 차이가 없음, 2: 다소 개선됨, 3: 상당히 개선됨, 4: 현저히 개선됨. 제시된 값은 평균치이다.

평가 항목	시험 기간
	1주일	2주일	1개월	2개월	4개월
만성적인 거부감 또는 속쓰림의 완화	1.21	1.60	2.07	2.47	3.12
식욕부진 개선	1.70	2.03	2.52	2.95	3.32

위의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 기능성 음료 조성물은 생체의 신진 대사를 활성화시키고, 위장관의 상태를 개선시키는 등 여러 가지 기능성을 가짐을 알 수 있다.

시험예 7: 돼지에 대한 성장촉진 시험

생후 1개월된 100두의 랜드레이스(Landrace)종 돼지에 대해서 본 발명의 대나무 발효액의 성장 촉진 기능 여부를 시험하였다. 시험을 개시한지 1 개월 동안은 젖먹이 사료를 공급하고, 그 후 2개월 동안은 육성돈 사료를 공급하였으며, 나머지 5개월까지는 비육돈 사료를 공급하였다. 대조군에 대해서는 일반사료를, 시험군에 대해서는 본 발명의 대나무 발효물을 0.50중량%로 첨가한 사료를 공급하였다. 시험결과를 다음의 표 5에 나타낸다.

돼지에 대한 성장 촉진 시험 결과

구 분	대조군	본 발명
시험기간	4개월	4개월
1두당 평균 중량	73.28 kg	76.88 kg
1두당 평균 사료량	250.27 kg	242.62 kg

위 결과로부터 알수 있는 바와 같이, 성장 촉진 효과를 나타내는 1두당 평균 중량을 보면, 대조군에 있어서는 73.28kg, 대나무 발효액을 첨가한 집단에서는 76.88 kg으로 현저한 차이를 나타내었다.

지금까지 설명된 바와 같이 본 발명에 따른 대나무 발효액은 자연 상태에 존재하는 곰팡이 등의 미생물을 발효시켜 제조한 것이므로 인체에 해가 없고, 다양한 기능성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 대나무 발효액은 잡균의 서식을 억제하는 기능을 함으로써 가축 및 어류 양식과 같이 환경오염의 영향을 크게 받는 양식, 축산 분야에서 사용될 수 있으며, 상기 발효액은 인체의 신진 대사를 활성화시키고, 위장관의 상태를 개선시키는 기능을 나타내므로 숙취해소제 등으로도 사용할 수 있다.

Claims (4)

1. a) 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리 또는 죽순을 채취하여 여기에 증자시킨 고두밥을 첨가하여 미생물을 자연 증식시키거나 또는 상기 재료들을 깨끗이 세척한 다음 여기에 고두밥을 첨가하고 세균류, 진균류, 또는 이들의 복합균을 접종하여 미생물을 증식시키는 단계,

   b) 상기 고두밥에 당원을 첨가하여 당화시킨 다음 이를 발효시켜 발효원액을 제조하는 단계, 및

   c) 상기 발효원액을 살균 냉각시킨 지하수 또는 대나무의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리 또는 죽순을 끓인 물로 희석하여 숙성시켜 발효액을 제조하는 단계에 의해 얻어짐을 특징으로 하는 대나무 발효액의 제조 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 세균류, 진균류 또는 이들의 복합균이 유산균, 광합성균, 바실러스균, 방선균, 진균류 및 이들의 복합균을 포함하는 군 중에서 선택된 것인 대나무 발효액의 제조 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 의해 제조됨을 특징으로 하는 대나무 발효액.
4. 제3항에 따른 대나무 발효액을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 어병억제제 조성물 또는 양식용 또는 가축용 사료첨가제 조성물.

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