JPH04187640A - 経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮免疫機能促進剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経
皮免疫機能促進剤に関する。

より詳細には、本発明は、百日咳菌ＬＰＳを含む、経口
・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮免疫機能促進
剤に関する。

［従来の技術］ 生物には、生体の内部環境が外来性及び内因性の異物に
よって撹乱されるのを防ぎ、生体の恒常性を維持するた
めの免疫機能が備わっている。従って、免疫機能の低下
は健康の悪化、各種疾病の発病、老化促進の原因となり
、その活性化は健康向上、各種疾病の発病阻止、治癒、
老化防止乙こつながる。

このため、免疫機能を活性化させる物質の提供が要請さ
れており、現在、ＰＳ−Ｋ　［別名クレスチン（呉羽化
学株式会社の登録商標）コ、レンチナン（味の素株式会
社の登録商標）、ヘスタチン（日本化薬株式会社の登録
商標）、ソニフイラン（科研製薬株式会社の登録商標）
　、０Ｋ−４３２［キャンサー　ケモセラピー　レボ−
トウ　バー）つ１（ＣａｎｃｅｒＣｈｅｍｏｔｈｅｒ−
ａｐｙ　　Ｒｅｐｏｒｔｓ　　Ｐａｒｔｌ）、ｖｏｌ。

５８、Ｎ０１１．１０頁（１９７２）、別名ビシバニー
ル（中外製薬株式会社の登録商標）コ、大腸菌ＬＰＳ等
が知られている。

［発明が解決しようとする課題］ 従来の免疫機能活性化剤のうちで、ＰＳ−Ｋ、レンチナ
ン、ヘスタチン、ソニフイランにはＴＮＦ産生能がない
ので、それらの免疫機能活性化能は低い。

一方、０Ｋ−４３２にはＴＮＦ産生能があるが、大量投
与が必要であることから、発幼、悪寒、血圧低下、血小
板減少等の副作用の発生が避けられず、従って化学療法
係数が小さい。更に、簡便な経口投与や経皮投与では効
果がないので、投与上の便宜に欠ける。

又、大腸ＷＬＰＳ等の菌界源ＬＰＳの中には、マクロフ
ァージ活性化能を有するものがあることが知られている
が、いずれも静脈投与によるものであり、経口ないし経
皮投与によってもそれらがマクロファージ活性化能を発
揮するとの発表、或はその可能性を暗示する発表は未だ
ない。従来の菌界源ＬＰＳは静脈投与てないとマクロフ
ァージ活性化能を示さないというのが当業界での常識で
あると言える。

ここてｒＴＮＦ」とは、マクロファージにより産生され
る腫瘍障害因子（Ｔ　ｕ　ｍ　ａ　ｒＮｅｃｒｏｓｉｓ
　　Ｆａｃｔｏｒ）の総称［ザジャーナル　オブ　バイ
オロジカル　ケミストリー（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ
　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌ。

Ｃ，ｈｅｍ、、２６０．２３４５−２３５４頁（１９８
５年）コてあり、マクロファージの活性が高まるにつれ
てその産生量は増していく。

「マクロファージ」は、免疫担当細胞の一種であり、動
物体内のほとんど全ての組織に分布し、粒子状の異物や
体内の老廃細胞などを捕食して消化する大型のアメーバ
状細胞の総称である。

本発明：、ｔ、これら従来技術の欠点が解消された、高
い免疫機能活性化能を有す、化学療法係数が大きくかつ
生産コストの低い、経口あるいは経皮で投与可能な経口
・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮免疫機能促進
剤を提供するために創案されたものである。薬剤を注射
剤としててはなく、経口あるいは経皮で投与できること
による患者への利点は言うまでもない。注射に伴う苦痛
から解放されるにととまらず、自宅での投薬が可能にな
ることに伴う便利さは測り知れない。特に経口投与の場
合には副作用が事実上皆無になるという効果も極めて高
く評価されるものである。又、皮膚にはマクロファージ
が多いので、皮膚塗布剤とし・で投与するとより高い効
果が得られる。

更に、本発明の経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口
・経皮免疫機能促進剤の免疫機能促進能は、インドメタ
シン（１９８６年に廣用書店より発行された第１１改訂
「日本薬局方解説書」のＣ−２１２〜２１７頁）、イブ
プロフェン（同Ｃ−１８４〜１８９頁）、フェニルブタ
シン（同Ｃ−１３３９１３４３頁）、メフェナム酸（同
Ｃ−１５９４〜１５９７頁）等その他のプロスタグラン
ジン産生抑制剤の投与により更に高まることも確認され
た。

従って、本発明の目的は、高い免疫機能活性化能を持つ
、化学療法係数が大きくかつ生産コストの低い経口・経
皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮免疫機能促進剤を
提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明の経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮
免疫機能促進剤に含まれる百日咳菌ＬＰＳは、例えば、
フナコシ薬品から市販されているものでも、或は、公知
の百日咳菌、例えば、東浜株Ｉ相菌の死菌体から、例え
ば、下記文献記載の公知方法によりＦＡ製することもて
きる。

ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）等著の「ジエイ、イミ
ュノル（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．）　、７４４　、５５
　　（１９５５）　　； ウエストファル（Ｗｅｓｔｐｈａｌ）等著の「ツェト、
ナツールフォルシュ（Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ）Ｊ
、７６．１４８１９５２）。

調製された百日咳菌ＬＰＳはそのまま、或いは任意の程
度に濃縮した形で提供できる。又、保存性を高めるため
に、凍結乾燥や噴霧乾燥なとの任意の手段により乾燥粉
末として提供することもてきる。これらはいずれも常法
で生産できる。

免疫活性化能の測定 本発明の経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮
免疫機能促進剤の免疫活性化能は、マクロファージ活性
を通しての内因性ＴＮＦ産生促進能により確認した。

内因性ＴＮＦ産生促進能 動物体内にＴＮＦを産生させるためには、産生前駆（ブ
ライミング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが
必要であることは、カーズウエル（Ｃａｒｓｗｅｌｌ）
らにより、プロシーディング　オブ　ナショナル　アカ
デミ−サイエンス　オブ　ニーニスニー　（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、）７２．３６６６〜３６
７０頁（１９７５年）に報告されており、その後、各段
階で使用出来る薬剤の検討もすすめられている。ブライ
ミング段階開始のために投与される薬剤が「ブライマー
」　（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガリング
段階開始のために投与される薬剤が「トリガー」　（内
因性ＴＮＦ産生剤）である。

本発明の経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮
免疫機能促進剤はブライマーとして機能する。

ＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９細胞［プロシーディング　オ
ブ　ナショナル　アカデミ−サイエンス　オブ　ニーニ
スニーニス、　３６６６〜３６７０頁コに対する細胞毒
性を基にして、次のようにして測定する。

Ｌ９２９細胞を、５％仔牛脂児血清を加えたイーグルミ
ニマムエツセンシャル培地（以下、Ｍ　ＥＭ培地と表す
）で育成し、８Ｘ１０’個の細胞が１００μ良の同上培
地に含まれる様にし、９６穴の平底プレートで育種する
。育種条件は３７℃、２時間、５％ＣＯ２，１００％Ｈ
２０であり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。

その後、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１μｇ　
／　ｍ　Ｑとなるように加え、培養液の液量を１５０μ
鼠とする。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈した
ものを５０μ免加える（このｗＡ稀釈率を適宜調製し、
ＥＤ５１１を求める事ができる）。更に、最終液量２０
０μλとなったＬ９２９細胞を上記条件で１８時間培養
する。

細胞障害活性を測定するには、まず全培地を除去し、つ
いて０．１％クリスタルバイオレットを含む１％メチル
アルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバイ
オレットは全有核細胞を染色するが、死細胞は染色後に
プレート底面より水洗で除去されるので、生存細胞の結
果から細胞障害活性を直接測定できる。この染色度を０
Ｄ５９θ。、ての吸光度を指標として測定し、対照群に
対する染色度と比較する事で細胞障害活性を測定する。

活性の定義は次の様に行う。

Ｌ９２９細胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）を
求める。対照としてウサギＴＮＳ　［腫瘍障害血清（Ｔ
ｕｍｏｒ　　ＮｅｃｒｏｓｉｓＳｅｔｕｍ）コを使用し
、このウサギＴＮＳの活性ｎ（単位／ｍ艷）を２．４Ｘ
１０６単位／　ｍ　ｇ　／ｍλのＴＮＦ−αを用いて決
定する。このウサギＴＮＳのＥＤｓｓ　　を与える稀釈
率（Ｃ）を求める。

検体活性（単位／　ｍ　Ｑ、）は　−Ｘｎ　　で計算す
る。

提供できる剤の製造方法 本発明の免疫機能活性化剤、動物用免疫機能活性化剤は
医薬或は動物薬製造の常法に従って、経口薬或は経皮薬
として単独で、或いは仙薬との配合物として処方できる
。

例えば、常法の製剤技術により、散剤、顆粒剤、火剤、
錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液剤、貼付則、軟膏剤
、リニメント剤、ローション剤、末剤等の形態て提供て
きる。又、動物用としては、更に、飼料添加剤、プレミ
ックス製剤、飲水添加剤として調製することもてきる。

飼料添加剤とする場合には、粉剤か顆粒剤とすることが
好ましい。

又、プレミックス製剤とは、飼料との混合を容易にする
ために澱粉なとの飼料成分て希釈されたものを指す。本
発明の経口・経皮免疫機能促進剤、動物用経口・経皮免
疫機能促進剤を飼料添加剤、プレミックス製剤として添
加できる飼料は市販されている飼料のいずれてもよい。

又、ミネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含
む飼料であってもよい。

これら製剤には、所望ならば、保存性、均質性を保持す
るために、常法により、賦形剤、保存剤、緩衝剤等の添
加剤を加えることもてきる。更に、矯味剤、矯臭剤、着
色剤を含めることもてきる。

賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプンを使用できる
。保存剤としては、例えば、バラオキシ安息香酸メチル
、バラオキシ安息香酸エチル、バラオキシ安息香酸プロ
ピル等のバラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢酸
ナトリウム、フェノール、メチルバラヘン、エチルバラ
ヘン、プロピルバラヘン等を使用できる。緩衝剤として
は、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用で
きる。

以下、製造例、実施例、実験例により本発明を例示する
。

製造例】　（百日咳ＷＬＰＳの製造） 千葉県血清研究所から入手した試験用百日咳菌液（２，
０Ｘ１０１”細胞／ｍλ）を死菌体として用いた。

上記死菌体を２５ｍｇ　（乾燥［［／ｍλとなるように
滅菌水に懸濁した。これに等量の９０％熱フェノール液
（６８〜７０℃）を添加し、６８℃で１時間振盪しなが
ら抽出した。８，０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離し
て水層を分取した。残りのフェノール層に、上記水層と
等量の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得られた水
層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、ロータ
リーエバポレータで１／１ｏに濃縮した。これを８゜０
００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を分取し、
酢酸ナトリウムを少量加え、０〜４℃の冷エタノールを
６倍量加えて一２０℃で一晩放置した。４．０００ｇ、
４℃で３０分間遠心分離して回収した沈殿物をエタノー
ルで２回・次いてアセトンで１回遠心洗浄し、アスピレ
ータで乾燥させた。

残ざを、２０ｍｇ／ｍｌＬとなるように蒸留水に懸濁し
、米国ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）社製のソニファイ
ア１８５型で超音波処理（出力コン）　ｒ：ｌ　−ル５
．１５分、室温）に付した。次いて２゜５００ｇ、４℃
で１０分間遠心分離し、上清を分取した。

この上清を４℃で、米国シグマ（Ｓ　ｊ　ｇｍｈ）社製
の核酸分解酵素ＤＮａｓｅ　　１．ＲｎａｓｅＡて１δ
〜１６時間処理した（Ｉ＆終的には１０μｇ／ｍｕのＤ
Ｎａｓｅ　　　＋　と、２０４ｇ／ｍｌＬのＲｎａｓｅ
Ａを使用した）。更に同し濃度の核酸分解酵素を加えて
３７℃で２時間加温した。次いて２．５００ｇ、４℃で
１０分間遠心分離し、上溝を分取した。

この上清を米国ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）社のアクロデ
ィスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を使い、孔径０，２μｍで
ｗ１遇した。濾液を分子篩にかけ［樹脂：米国ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）社製セファロース（Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、カラムサイズ＝内径５ｃｍＸ
長さ１００ｃｍ、緩衝液＝１０ｍＭのトリス−ＨＣｔＬ
、１０ｍＭのＮａｃＱ（ｐＨ７，５）、流速＝約３ｍ＆
／ｃｍ２／時）、生化学工業社製のＬＳ−１キツトを用
いてリムラス活性陽性画分を調べて合わせ、上記ゲルマ
ン社のアクロディスクを使い、孔径０．２ｕｍで濾過し
た。濾液をイオン交換にかけ［装置：米国ファルマシア
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社！！ＦＰＬＣ，樹脂：米国フ
ァルマシア社製モノＱ　　ＨＲｌ　０／１０、緩衝液＝
１０ｍＭのトリス−ＨＣＡ＋１０ｍＭのＮａＣ１（ｐＨ
７，５）で１５分洗浄し、次いて、ＮａＣＩＬ量を１６
５ｍＭに増加して３０分洗浄し、次いて、２０分かけて
、ＮａＣλ量が１６５ｍＭからＩＭの濃度勾配になるよ
うにＮａＣＩＬ量を増加させながら洗浄し、次いて、Ｉ
ＭのＮａＣａ量で３０洗浄する、流速＝　２　ｍ　ｌ／
分］、生化学工業社製のＬＳ−１キツトを用いてリムラ
ス活性陽性画分を調べて合わせた。

合わせた画分をカラムて脱塩し［樹脂：米国ファルマシ
ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製セファデックスＧ−２５
フアイン（ｆｉｎｅ）、カラムサイズ＝内径２　ｃ　ｍ
　Ｘ長さ２５ｃｍ、溶出液＝蒸留水コ、次いて凍結乾燥
した。

この凍結乾燥標品（４，５０ｍｇ）に混入している可能
性の最も高い物質は核酸である。そこで、紫外吸収曲線
（２００〜４００　ｎ　ｍ　）をとり、２６０ｎｍての
吸光度を求めた。吸光度１のときの核ｒ１１濃度が５０
μｇ　／　ｍ　ＩＬであることを用いて上記吸光度から
核酸濃度を算出したら１％以下であった。又、ＳＤＳ電
気泳動ては蛋白質は明確には検出されなかった。従って
、検出感度を考慮すると、上記凍結乾燥標品に混入して
いる蛋白質は高々０〜３％と推定される。従って、上記
凍結乾燥標品の純度は９６％以上と推定された。

百日咳菌ＬＰＳの物性 分子量 上記凍結乾燥標品を蒸留水に溶解してＩｍｇ／ｍＱ、溶
液を調製し、その４μ９を１．５ｒｒｌＬのトレフチュ
ーブに入れた。これに、別途、１　ｍ　ＭのＥＤＴＡに
２．５％ＳＤＳ、５％メルカプトエタノール、１０　ｍ
　Ｍ　トリス塩酸（ｐＨ８，０）を加えて調製したＳＤ
Ｓ処理液１μ込を加え、二の混液を３分間沸騰水に浸し
た。ファルマシア社製のファストシステム（Ｐｈａｓｔ
　　Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、電極との間に５ＤＳ−バ
ッファー　ストリップ（Ｂｕｆｆｅｒ　　５ｔｒｉｐ）
（ファルマシア社製）が介在せられた１μ艷の上記混液
をゲル［ファルマシア社製のファスト　ゲル　グラデイ
エンド　（Ｐｈａｓｔ　　Ｇｅｌ　　Ｇｒａｄｉｅｎｔ
　　８−２５）りこ塗付し、最大電圧２５０ｖ、最大電
流１０ｍＡにセットして泳動を開始させた。

泳動終了後、クマシー染色と銀染色における挙動を観察
した。

クマシー染色では、染色液としてファルマシア製の０．
１％ファスト　ゲル　ブルー　（Ｐｈａｓｔ　　Ｇｅｌ
　　Ｂｌｕｅ）　　Ｒを、脱色液として、メタノール：
酢酸：蒸留水（容量比３：１：６）混液を使用し、次の
順序で染色・脱色を行った。

１〕５０℃で８分間染色 ２）５０℃で５分間膜色 ３）５０℃で８分間染色 ４）５０℃で１０分分間膜 ５〕５０℃で５分間保！ｔ（グリセロール、酢酸、蒸留
水の容量比５：１０：８５混液） ６）乾燥 銀染色は、次の順序で行った。

１〕５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比５：１：４混液）で処理２）５０℃で２分間
、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留水の容量比１０：５
：８５混液）で処理３）５０℃で４分間、洗浄液（エタ
ノール、酢酸蒸留水の容量比１０：５：８５混液）で処
理４）５０℃で６分間、増感液（８３％グルタルジアル
デヒド）で処理 ５）５０℃で３分間、洗浄液（エタノール、酢酸蒸留水
の容量比１０：５：８５混液）で処理６）５０℃で５分
間、洗／Ｉｌ液（エタノール、酢酸蒸留水の容量比１０
：５：８５混液）で処理７〕５０℃で２分間、洗浄液（
脱イオン水）で処理 ８）５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）で処理 ９）４０℃で１３分間、０．２５ｗ／ｖ％硝酸銀で処理 １０）３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １１１３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １２１３０℃で３０秒間、現像液（０，０４ｖ／ｖ％ホ
ルムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄液
）て処理 １３１３０℃で４分間、現像液（０，０４ｖ／ｖ％ホル
ムアルデヒ）”＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄渣
）で処理 １４＋５０℃で２分間、反応停止液（５％ｖ　／　ｖ％
酢酸）で処理 １５］５０℃で３分間、保護液（酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比１０：８：８５混液）で処理 １６）乾燥 ＬＰＳは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を刊用して染色帯を観察したら、複数Ｈ察された
クマシー染色帯のうち、分子量６．０００±１．０００
．９，０００±１，０００の位置に染色強度が最高の染
色帯が観察された。

リン含有量 チェンートリバラ（Ｃｂｅｎ−Ｔｏｒ　１ｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナｌノティカル　ケミストリ（Ａｎ
ａｌｙｔ、ｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ｖｏｌ、２
８．１７５６〜１７５８頁（１９５６年）に準拠して次
の通りに行った。

前記凍結乾燥標品な蒸留水に溶解して、５４又は１００
μｇのＬＰＳ　（大腸菌ＬＰＳ換算ｊｌ＞を含む２０μ
λの溶液を調製し、小試験管に入れた。

２０μ艷の５０　ｖ　／　ｖ％硫酸を添加し、１６０℃
で２時間加熱した。次いて、２０μ化の１０ｖ／Ｖ％過
塩素酸を添加した後にガスバーナーで１分間加熱して灰
化させた。その後に０．５ｍ１Ｌの蒸留水、次いて０．
５ｍＱ、の反応試薬（１ｍ艷の６ＮｆＲ酸、２ｍ−蒸留
水、２ｍｆｔ（Ｄ２．５ｖ／ｗ％モリブデン酸アンモニ
ウム及びＩ　ｍ　１（１）　１０　ｖ　／　ｗ％のアス
コルビン酸を混合して調製し、その０゜５ｍ１ｌＪ使用
）を添加して室温で３０分間放置した後に、８２０μｍ
ての吸光度（ＯＤ　１１２１１ｎ−）を測定した。なお
、検量線作製用の試料としては、リン酸二水素カリウム
（和光純薬社製）を蒸留水で希釈し、リン重量としてそ
れぞれ０８ｇ、０゜２５μｇ、１．０μｇ、２．５μｇ
を含む０．５ｍａの溶液を５ｌｌＩ製して使用した。な
お、リン１ｇはリン酸二水素カリウム４．３９ｇに相当
する。

得られた結果を次表１に示す。

表　　　１ 注：百日咳菌ＬＰＳのデータは、無機リンの混入（例え
ば、リン酸緩衝液に由来する）による誤差を避けるため
に、加熱処理をしていない対照のデータを減したＩＧで
ある。

分子量を８，０００に仮定して、上表の結果に基づいて
１分子当たりのリン数を次式により計算すると約５にな
る。

エルソンーモルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法（
東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ、４の３７７
〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。

前記凍結乾燥標品を蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍ−溶液
を５ｌＩＩＩ！シ、その１００μλをスクリューキャッ
プ付きスピッツ（イワキガラス社！りに入れ、これにＩ
　ＯＯｕ琵の８ＮＨＣ交を添加して１１０℃で１６６時
間加熱た。４ＮＮａＯＨを約２００μ気添加してｐＨ７
とした。その１００μλを分取し、別のスクリューキャ
ップ付きスピッツに入れ、２００μ地の下記試薬Ａを加
えた後に、１０５℃で１．５時間加熱し、次いで流水で
冷却した。次いて、１００μ２を分取し、６７０μ免の
９６％エタノールを加え、更に、６７μｉの下記試薬Ｂ
を加えた後に室温で１時間放置し、５３５ｎｍで吸光度
を測定した。検量線作製用試料としては０．２０〜２０
０μｇ／ｍ免のＮ−アセチルグルコサミン（和光純薬社
製）を使用した。

（試薬Ａ）７５μ覧のアセチルアセトンと２．５ｍ艷の
１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製。

（試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルヘンズアルデヒドと
３０　ｍ　Ｑの濃塩酸と３０ｍ５Ｌの９６％エタノール
を混合して調製。

結果、百日咳菌ＬＰＳ　（仮定分子量ｓ、ｏｏｏ）のへ
キソサミン数は１６±２／分子だった。

脂肪酸含有量 ９０μ交の百日咳菌ＬＰＳ蒸留水溶液（１ｍｇ／　ｍ　
Ｑ＞に］０μ兄の内部標準（０，５５ｍＭのマルガリン
酸）を加えた。１．０ｍｌの０，５Ｍナトリウムメチラ
ートを加えて脂肪酸エステルの加水分解とエステル化を
行った。室温で１時間放置後に９６０μ艷の０．５ＮＨ
ＣＩｌを加えて中相した。

これに２ｍｌのヘキサンを加えて１５分間激し、く攪拌
した。次いて、１，０００ｇで５分間遠心分離を行いヘ
キサン層を分取した。窒素カスでヘキサンを蒸発させて
、約２０μ鱈こなるまで濃縮した。

このサンプルをガスクロマトグラフィー［本体：呂律社
製のＧＣ８ＡＰＦ、キャビラリー力ラム：スペルコ（Ｓ
ｐｅｌｃｏ）社（カナダ）製ＦＳＣＡＰ　　５ｐ２３３
０、キセリャーガス：窒素］に付して脂肪酸量を測定し
た。脂肪酸量測定の基準としてｉｉ、第一化学薬品社製
の合成リビｌ”　Ａである大ｔｉｉｍ型ＬＡ−１５−Ｐ
Ｐ（分子量２，０００で、１分子中の脂肪酸数は６であ
ることが知られている）を用いた。

結果、百日咳菌ＬＰＳ　（仮定分子量８，０００）の脂
肪酸数は約５７分子だった。

上記ガスクロマトグラフィーで観察されたチャートを添
付図面第１図に示す。

第１図において、図示されている主要ピーク番号に対応
する保持時間（分）は次の通りであった。

第１図：ビーク番号　　保持時間（分）１　　　　　　
　２．４３３ ２　　　　　　　３．０２８ ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ　アール（Ｓｈａｂｙ　
　Ｒ，）等著、アナリティ力ルバイオケム（Ａｎａｌｙ
ｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、）、５Ｂ（１）、１
２３〜１２９頁（１９７４年）コに準拠して次の通りに
行った。

５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｍ交のエタノール、
４５ｍλの氷酢酸、５０ｍλの製塩Ｗ＜全て和光純薬社
Ｉりを合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した。その５００
　ｕａ＋こ、１．０５ｍｇ／ｍ９．の百日咳菌ＬＰＳを
含む蒸留水２５０μ交を合わせ、１００℃の沸騰水浴中
で３０分間加熱後に冷水（２３℃）中で３０分間冷却し
、ついて日立分光光度計３２０を使って４２０．４７０
．６３０．６５０ｎｍでの紫外部吸収を測定した（それ
ぞれＡ４２１１．Ａ４７Ｌ１．Ａ６３１１．Ａ６５１１
とする）。標準試料としては、１２７ｇｇ／ｍ隻のＫＤ
Ｏアンモニウム塩Ｅ米国シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ’）社
製フを含む蒸留水２５０μ９を使用した。

検体試料、標準試料それぞれについて、次式の値を求め
た。

Ｓ　＝　Ａ　４２１１　　Ａ　ａ−ｔｅ　＋　Ａ　６３
ｅ　　Ａ　ａｓ１１結果、百日咳菌ＬＰＳには２±１／
分子量８千のＫＤＯが含まれると推定された。

以下は、本発明のＬＰＳを含む製剤の処方例である。な
お、ＬＰＳ量は、リムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換
算量である。

実施例１　（錠剤） 百日咳菌ＬＰＳ　　　　　　、０．０４ｇ６％ＲＰＣ乳
糖　　　　　　　１７８ｇステアリン酸タルク　　　　
　　　　８ｇバレイショデンブン　　　　　　１４ｇ以
上を混和し、打錠して、Ｏ，１ｍｇの百日咳菌ＬＰＳを
含む０．５ｇの錠剤４００個を調製した。

実施例２（内用液剤） 百日咳菌ＬＰＳ　　　　　　　　　１ｍｇ精製水　　　
　　　　　　　１００ｍｆＬ実施例３（軟膏剤） 百日咳菌ＬＰＳ　　　　　　　　Ｏ，１ｇ精製ラノリン
　　　　　　　　　８０ｇ０００ｇ 実験例１（内因性ＴＮＦ産生促進能の測定）■各群３匹
のマウス（７週齢のメスＣ３Ｈ／Ｈｅ平均体重２５ｇ）
に、ブライマーとしての、製造例１て得られた百日咳Ｌ
ＰＳを１ｍｆＬ当たりそれぞれ０μｇ（Ａ群）、１μｇ
（Ｂ群）、１０μｇ（Ｃ群）含む蒸留水を３日間自由こ
こ摂取させた。

■３日目に各マウスに０μｇ（Ａ−１群、８〜１群、Ｃ
−１群）か１００μｇ（Ａ−２群、Ｂ−２群、Ｃ−２群
）の前記百日咳！ＬＰＳを溶解した２００μ免の蒸留水
をゾンデて強制投与した。

■その３時間後にトリガーとして０Ｋ−４３２をＩＫＥ
Ｅクリニッシュ　アインハイト（Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ　
　Ｅｉｎｈｅｉｔ、）系単位であり、ＩＫＥはＯ，Ｉｍ
ｇの乾燥細菌を含む製剤量にあたるコを溶解した生理的
含塩水０．２ｍ交を尾静脈より投与した。トリガー投与
の２時間後に血清を採取し、Ｌ９２９細胞に対する毒性
に基づいてＴＮＦ活性を測定した。結果を、各群３匹の
平均として次表２に示す。

」ス 第２図は、表２の結果をグラフ化したものである。

表２及び第２図から次の点が明白である。

■Ａ、ＢＳＣＡ群において、それぞれ１群と２群のデー
タを比較することにより、本発明の百日咳菌ＬＰＳは無
投与群に比較して、指数級数的にＴＮＦ産生能を高める
。

■飲料水に配合して摂取させる場合には、経口投与とい
うよりは、舌の皮膚を通しての経皮投与というべきもの
であるから、Ａ−１群とＢ−１群あるいはＣ−１群との
比較により、本発明の百日咳菌ＬＰＳは経皮投与によっ
ても有音なＴＮＦ産生促進能を有する。

の測定） 上記実験例１において、飲料水摂取にかえて、０．５ｗ
／ｖ％のカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とＩｗ
／ｖ％のツイーン２０が溶解されている２　００　ｍ　
Ｌの生理的食塩水にインドメタシン１．５ｍｇを懸濁し
て足のつけねの皮下に投与した。その５時間後にゾンデ
て百日咳菌ＬＰＳを投与し、以下、実験例１と同様に処
理して、各群２匹の平均として、次表３に示す結果を得
た。

第３図は、表３の結果をグラフ化したものである。

表３及び第３図から、本発明の百日咳菌ＬＰＳのＴＮＦ
産生促進能が、インドメタシンの併用により飛躍的に向
上することが明白である。

投与量、投与間隔、毒性値 本発明の百日咳菌ＬＰＳを免疫機能活性化剤として、或
いは、動物用免疫機能活性化剤として投与するさいの量
、投与間隔は、免疫機能活性化剤の木質上、当然、担当
医師或いは獣医師により、患者の年齢、症状、産生ＴＮ
Ｆ量から推定できる投与効果を勘案して個別に決定され
るが、１００％純度の精製標品の場合は人間の成人（６
０ｋｇ）で、経口投与で１μｇ〜１００ｍｇ、経皮投与
て］００ｎｇ〜１　ｍ　ｇが１日１回の投与量の一応の
目安となる。なお、動物では、牛、馬等の大型動物は上
記の量の６０分のＩを体重１ｋｇ当たりの量の目安とし
、豚、大、猫等の中型、小型の動物ではその２倍量を体
重１ｋｇ当たりの量の目安とし、鶏等の鳥類では更にそ
の２倍量を体重１ｋｇ当たりの量の目安とし投与できる
。

百日咳ｍＬｐｓ＜製造例３）の毒性値ＬＤｓｓ（１群２
匹の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウス、平均体重４５ｇ、における
平均値）は次の通りであった。

［発明の効果コ 本発明により、高い免疫機能活性化能を持つ、化学療法
係数が大きくかつ生産コストの低い、しかも経口ないし
経皮での投与が可能な免疫機能促進剤、動物用免疫機能
促進剤が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の百日咳菌ＬＰＳをガスクロマトグラ
フィーにかけて得られる、分子中における脂肪酸の存在
を示すピークを図示したチャートである。 第２図は、本発明の百日咳菌ＬＰＳの免疫機能促進能を
示すグラフである。 第３図は、本発明の百日咳菌ＬＰＳの免疫機能促進能が
、プロスタグランジン産生抑制剤の併用により向上する
ことを示すグラフである。

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）百日咳菌ＬＰＳを含む経口免疫機能促進剤。
2. （２）百日咳菌ＬＰＳが次の物性を有するものである、
   請求項１記載の経口免疫機能促進剤。 分子量＝６，０００±１，０００ ９，０００±１，０００ （ＳＤＳ電気泳動法） リン数＝５／分子量８千 ヘキソサミン数＝１６±２／分子量８千 脂肪酸数＝５／分子量８千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量８千
3. （３）免疫機能がマクロファージ活性化能である、請求
   項１又は２記載の経口免疫機能促進剤。
4. （４）マクロファージ活性化能が内因性ＴＮＦ産生促進
   能である、請求項３記載の経口免疫機能促進剤。
5. （５）プロスタグランジン産生抑制剤を含む、請求項１
   〜４のいずれかの項に記載の経口免疫機能促進剤。
6. （６）プロスタグランジン産生抑制剤がインドメタシン
   である、請求項５記載の経口免疫機能促進剤。
7. （７）百日咳菌ＬＰＳを含む経皮免疫機能促進剤。
8. （８）百日咳菌ＬＰＳが次の物性を有するものである、
   請求項７記載の経皮免疫機能促進剤。 分子量＝６，０００±１，０００ ９，０００±１，０００ （ＳＤＳ電気泳動法） リン数＝５／分子量８千 ヘキソサミン数＝１６±２／分子量８千 脂肪酸数＝５／分子量８千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量８千
9. （９）免疫機能がマクロファージ活性化能である、請求
   項７又は８記載の経皮免疫機能促進剤。
10. （１０）マクロファージ活性化能が内因性ＴＮＦ産生促
    進能である、請求項９記載の経皮免疫機能促進剤。
11. （１１）プロスタグランジン産生抑制剤を含む、請求項
    ７〜１０のいずれかの項に記載の経皮免疫機能促進剤。
12. （１２）プロスタグランジン産生抑制剤がインドメタシ
    ンである、請求項１１記載の経口免疫機能促進剤。
13. （１３）百日咳菌ＬＰＳを含む動物用経口免疫機能促進
    剤。
14. （１４）百日咳菌ＬＰＳが次の物性を有するものである
    、請求項１３記載の動物用経口免疫機能促進剤。 分子量＝６，０００±１，０００ ９，０００±１，０００ （ＳＤＳ電気泳動法） リン数＝５／分子量８千 ヘキソサミン数＝１６±２／分子量８千 脂肪酸数＝５／分子量８千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量８千
15. （１５）免疫機能がマクロファージ活性化能である、請
    求項１３又は１４記載の動物用経口免疫機能促進剤。
16. （１６）マクロファージ活性化能が内因性ＴＮＦ産生促
    進能である、請求項１５記載の動物用経口免疫機能促進
    剤。
17. （１７）プロスタグランジン産生抑制剤を含む、請求項
    １３〜１６のいずれかの項に記載の動物用経口免疫機能
    促進剤。
18. （１８）プロスタグランジン産生抑制剤がインドメタシ
    ンである、請求項１７記載の経口免疫機能促進剤。
19. （１９）百日咳菌ＬＰＳを含む動物用経皮免疫機能促進
    剤。
20. （２０）百日咳菌ＬＰＳが次の物性を有するものである
    、請求項１９記載の動物用経皮免疫機能促進剤。 分子量＝６，０００±１，０００ ９，０００±１，０００ （ＳＤＳ電気泳動法） リン数＝５／分子量８千 ヘキソサミン数＝１６±２／分子量８千 脂肪酸数＝５／分子量８千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量８千
21. （２１）免疫機能がマクロファージ活性化能である、請
    求項１９又は２０記載の動物用経皮免疫機能促進剤。
22. （２２）マクロファージ活性化能が内因性ＴＮＦ産生促
    進能である、請求項２１記載の動物用経皮免疫機能促進
    剤。
23. （２３）プロスタグランジン産生抑制剤を含む、請求項
    １７〜２２のいずれかの項に記載の動物用経皮免疫機能
    促進剤。
24. （２４）プロスタグランジン産生抑制剤がインドメタシ
    ンである、請求項２３記載の動物用経皮免疫機能促進剤
    。